Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

בדיקות ציטוטוקסיות עם קווי תאים של דגי זברה

Published: January 6, 2023 doi: 10.3791/64860
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 2, 2, 1, 3, 2, 3
1Graduate Program in Genetics, Department of Genetics, Federal University of Paraná (UFPR), 2Safety of Product Department, Grupo Boticário, 3Department of Genetics, Federal University of Paraná (UFPR)

Summary

פרוטוקול זה מציג מבחני ציטוטוקסיות נפוצים (Alamar Blue [AB], CFDA-AM, Neutral Red ו-MTT assays) המותאמים להערכת ציטוטוקסיות בעוברים של דגי זברה (ZEM2S) ובקווי תאי כבד (ZFL) בלוחות של 96 בארות.

Abstract

קווי תאי דגים הפכו יותר ויותר בשימוש במחקרי רעילות אקולוגית, ומבחני ציטוטוקסיות הוצעו כשיטות לחיזוי רעילות חריפה של דגים. לפיכך, פרוטוקול זה מציג מבחני ציטוטוקסיות ששונו כדי להעריך את כדאיות התא בדגי זברה (Danio rerio), עובר (ZEM2S) וקווי תאי כבד (ZFL) בלוחות 96 בארות. נקודות הקצה של ציטוטוקסיות שהוערכו הן שלמות מיטוכונדריאלית (מבחני Alamar Blue [AB] ו-MTT), שלמות הממברנה באמצעות פעילות אסטראז (בדיקת CFDA-AM), ושלמות הממברנה הליזוזומלית (בדיקת אדום נייטרלי [NR]). לאחר חשיפת חומרי הבדיקה בצלחת 96 בארות, מבוצעות בדיקות ציטוטוקסיות; כאן, AB ו- CFDA-AM מתבצעים בו זמנית, ואחריו NR על אותה צלחת, בעוד בדיקת MTT מבוצעת על צלחת נפרדת. הקריאות עבור בדיקות אלה נלקחות על ידי פלואורסצנטיות עבור AB ו- CFDA-AM, וספיגה עבור MTT ו- NR. ניתן להשתמש במבחני ציטוטוקסיות המבוצעים עם קווי תאי דגים אלה כדי לחקור את הרעילות החריפה של חומרים כימיים על דגים.

Introduction

חומרים כימיים צריכים להיבדק לגבי בטיחותם לבריאות האדם והסביבה. סמנים ביולוגיים מולקולריים ותאיים נלקחים בחשבון יותר ויותר בהערכות בטיחות כדי לחזות השפעות על אורגניזמים חיים על ידי סוכנויות רגולטוריות ו / או חקיקה (למשל, REACH, OECD, US EPA)1,2, שכן הם יכולים להקדים את התוצאה השלילית in vivo (למשל, הפרעה אנדוקרינית, תגובה חיסונית, רעילות חריפה, פוטוטוקסיות)3,4,5,6,7 . בהקשר זה, ציטוטוקסיות נלקחה כמדד לחיזוי רעילות חריפהשל דגים 5,8; עם זאת, יכולים להיות לה יישומים רבים אחרים במחקרי רעילות אקולוגית, כגון הגדרת ריכוזים תת-ציטוטוקסיים של חומרים כימיים כדי לחקור את מערך ההשפעות המגוון ביותר שלהם על דגים (למשל, השפעות משבשות אנדוקריניות).

במערכות תרבית תאים (מערכות במבחנה ), ציטוטוקסיות של חומרים כימיים יכולה להיקבע על ידי שיטות שונות בסוגי נקודות הקצה. לדוגמה, שיטה ציטוטוקסית יכולה להתבסס על נקודת קצה הקשורה למורפולוגיה ספציפית שנצפתה במהלך תהליך המוות של התא, בעוד ששיטה אחרת יכולה לקבוע ציטוטוקסיות על ידי מדידת מוות תאי, כדאיות ופונקציונליות, מורפולוגיה, מטבוליזם של אנרגיה והתקשרות תאים והתפשטות. חומרים כימיים יכולים להשפיע על כדאיות התא באמצעות מנגנונים שונים, ולכן הערכת ציטוטוקסיות המכסה נקודות קצה שונות של כדאיות התא נחוצה כדי לחזות השפעות כימיות9.

MTT ו- Alamar Blue (AB) הם מבחנים הקובעים את ההשפעות על כדאיות התא בהתבסס על פעילות מטבולית של תאים. בדיקת MTT מעריכה את הפעילות של האנזים המיטוכונדריאלי סוקצינאט דהידרוגנאז10. ההפחתה של 3-[4,5-dimethylthiazol-2yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) לכחול formazan מתרחשת רק בתאים בני קיימא, והצפיפות האופטית שלו עומדת ביחס ישר למספר התאים הקיימים10. בדיקת AB היא אינדיקטור רגיש להפחתת חמצון, המתווך על ידי אנזימים מיטוכונדריאליים המפליאים ומשנים את צבעם בעת הפחתת רזזורין לרסורופין על ידי תאים חיים11; עם זאת, אנזימים ציטוסוליים ומיקרוזומליים תורמים גם הם להפחתת AB ו- MTT12. אנזימים אלה עשויים לכלול מספר רדוקטאזים, כגון אלכוהול ואלדהיד אוקסידוקטאז, NAD(P)H: quinone oxidoreductase, flavin reductase, NADH dehydrogenase, ו cytochromes11.

בדיקת אדום נייטרלי (NR) היא בדיקת כדאיות תאים המבוססת על שילוב צבע זה בליזוזומים של תאים בני קיימא13. ספיגת NR תלויה ביכולת התאים לשמור על שיפועי pH. שיפוע הפרוטון בתוך הליזוזומים שומר על pH נמוך יותר מהציטופלסמה. ב-pH פיזיולוגי תקין, ה-NR מציג מטען נטו של כאפס, המאפשר לו לחדור לקרומי התא. לכן, הצבע הופך טעון ונשמר בתוך הליזוזומים. כתוצאה מכך, ככל שכמות ה-NR השמור גדולה יותר, כך גדל מספר התאים בני הקיימא14. חומרים כימיים הפוגעים בפני השטח של התא או בקרומים הליזוזומליים פוגעים בספיגה של צבע זה.

בדיקת CFDA-AM היא בדיקת כדאיות תאים פלואורומטרית המבוססת על שימור 5-carboxyfluorescein diacetate acetoxymethyl ester (CFDA-AM)15. 5-CFDA-AM, מצע אסטראז, מומר לקרבוקסיפלואורסצאין, חומר פלואורסצנטי שהוא קוטבי ובלתי חדיר על ידי ממברנות של תאים חיים15; לכן, הוא נשמר בצד הפנימי של קרום התא שלם, המציין תאים קיימא.

לאחרונה, שלוש בדיקות ציטוטוקסיות (CFDA-AM, NR ו- AB assays) שולבו בהנחיית ISO (ארגון התקינה הבינלאומי) מאומתת (ISO 21115:2019)16 ובשיטת הבדיקה של OECD (הארגון לשיתוף פעולה ופיתוח כלכלי) (OECD TG 249) להערכת רעילות חריפה של דגים באמצעות קו התאים RTgill-W1 (קו תאים קבוע מפורל הקשת [Oncorhynchus mykiss] gill) בצלחות 24 בארות17 . למרות שקיימת שיטה מבוססת תאים לחיזוי רעילות חריפה של דגים, הושקעו מאמצים בפיתוח שיטות דומות עם מיני דגים אחרים ובהגדלת התפוקה של השיטה. כמה דוגמאות כוללות פיתוח של קווי תאי ZFL הנגועים בגנים של כתב עבור מסלולי רעילות ספציפיים18,19, בדיקות פוטוטוקסיות בקו תאי RTgill-W120, והשימוש בקווי תאים ZFL ו- ZF4 (פיברובלסטי של דגי זברה שמקורם בעוברים בני יום אחד) כדי להעריך רעילות על ידי מספר בדיקות ציטוטוקסיות21.

דג זברה (Danio rerio) הוא אחד ממיני הדגים העיקריים המשמשים בחקר רעילות ימית; לכן, שיטות מבוססות תאים עם שורות תאים של דגי זברה לבדיקת רעילות דגים עשויות להיות שימושיות ביותר. קו תאי ZFL הוא קו תאי הפטוציטים אפיתל של דג זברה המציג את המאפיינים העיקריים של תאים פרנכימליים בכבד ויכול לעכל קסנוביוטיקה 7,22,23,24,25. בינתיים, קו התאים ZEM2S הוא קו תאים פיברובלסטי עוברי של דג זברה הנגזר משלב הבלסטולה שניתן להשתמש בו כדי לחקור השפעות התפתחותיות על דגים26,27. לפיכך, פרוטוקול זה מתאר ארבע בדיקות ציטוטוקסיות (מבחני MTT, AB, NR ו- CFDA-AM), עם שינויים שיש לבצע עם קווי תאים ZFL ו- ZEM2S בלוחות 96 בארות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הערה: עיין בטבלת החומרים לקבלת רשימת החומרים המשמשים בפרוטוקול זה ובטבלה 1 עבור הרכב הפתרונות והמדיה המשמשים בפרוטוקול זה.

1. הכנת תאי ZFL ו- ZEM2S

  1. התחל עם בקבוק T75 של תאי ZFL או ZEM2S עם מפגש של 80%, בתרבית בתווך המלא המתאים ב 28 ° C ללא CO2.
  2. הסר את מדיום התרבית מן הבקבוק ולשטוף את התאים על ידי הוספת 10 מ"ל של 1x פוספט חוצץ מלוחים (PBS) (0.01 M). הוסף 3 מ"ל של 1x טריפסין (0.05% v/v; 0.5 mM טריפסין-EDTA) לצלוחיות התרבית. יש לדגור בטמפרטורה של 28°C למשך 3 דקות.
  3. טפחו בעדינות על הבקבוק כדי לשחרר את התאים, ולאחר מכן עצרו את עיכול הטריפסין על ידי הוספת 3 מ"ל של מדיום תרבית שלם לצלוחית.
  4. מעבירים את מתלה התא לצינור צנטריפוגה חרוטי 15 מ"ל וצנטריפוגה ב 100 × גרם למשך 5 דקות.
  5. לאחר צנטריפוגה, בזהירות להסיר את supernatant, להוסיף 1 מ"ל של מדיום מלא עבור תאי ZFL או ZEM2S, ולהשעות מחדש את הגלולה באמצעות micropipette.

2. ספירת תאים על ידי הרחקת צבע כחול טריפאן

  1. הוסף 10 μL של תרחיף התא ו 10 μL של צבע כחול טריפאן למיקרו-צינורית כדי לספור את התאים ולהעריך את הכדאיות שלהם. מערבבים את תרחיף התא וצובעים בעזרת פיפטה.
  2. לאחר מכן, העבירו 10 μL של תערובת זו (תרחיף תאים + טריפאן כחול) לתא נויבאואר וספרו את התאים בארבעת הריבועים הגדולים (רבעים Q) הממוקמים בפינות התא, בהתחשב בכך שתאים בני קיימא הם אלה שאינם תופסים טריפאן כחול. קבע את מספר התאים בני קיימא באמצעות משוואה (1):
    Equation 1 (1)
  3. חשב את מספר התא הסופי בתרחיף התא על-ידי הכפלת מספר התא שנקבע באמצעות משוואה (1) בשניים (גורם הדילול עקב השימוש בכחול טריפאן).
    הערה: לחלופין, ניתן להשתמש במערכת ספירת תאים אוטומטית (למשל, ציטומר עם פונקציית ספירת תאים ויכולת כדאיות).

3. ציפוי תאים בצלחות 96 בארות

  1. חשב את נפח תרחיף התא הדרוש כדי לקבל את מספר התאים הדרושים לביצוע בדיקות ציטוטוקסיות. מספר התאים בני קיימא עבור כל קו תא מצוין להלן:
    1. צלחת 60,000 תאי ZEM2S קיימא לכל באר; לכן, עבור הצלחת כולה, להשתמש שישה מיליון תאים ב 20 מ"ל של תווך שלם (200 μL / באר, צלחת 96 באר).
    2. צלחת 40,000 תאי ZFL קיימא לכל באר; לכן, עבור הצלחת כולה, להשתמש ארבעה מיליון תאים ב 20 מ"ל של תווך שלם (200 μL / טוב, צלחת 96 באר).
  2. לאחר מכן, להעביר את נפח המתאים של תרחיף התא למאגר מגיב (סטרילי) ולמלא עם המדיום תרבית מלאה עבור ZFL או ZEM2S ל 20 מ"ל. בעזרת פיפטה רב ערוצית, מערבבים את התמיסה בעדינות למעלה ולמטה.
    הערה: יש להקפיד לא ליצור קצף או בועות.
  3. הוסף 200 μL של תרחיף התא לכל באר של צלחת פוליסטירן שקופה 96 באר באמצעות micropipette רב ערוצי. לדגור את הצלחות ב 28 ° C במשך 24 שעות.
    הערה: על הלוח להכיל לפחות שלוש בארות ללא תאים לבקרה הריקה, ויש להוסיף רק מדיה שלמה לבארות אלה. אפקט הקצה (הנגרם על ידי אידוי גבוה יותר בבארות הקצה) מתרחש בדרך כלל במבחני לוחות של 96 בארות ויכול להשפיע על הכדאיות של התאים בבארות הקצה של הצלחת28. השפעה זו יכולה להיות גבוהה או נמוכה יותר בהתאם למותג הצלחת 96 בארות ועיצוב28. למרות שלא הבחנו בהפרעה כלשהי בצמיחת תאים / כדאיות עבור ZFL ו- ZEM2S בבארות הקצה, אנו מציעים לאטום את הצלחת עם רדיד איטום פרפילם או דבק כדי למנוע השפעה זו, או לטפח את התאים רק ב -60 הבארות הפנימיות ולמלא את בארות הקצה עם PBS.

4. חשיפה של תאים לבדיקת כימיקלים

  1. בזהירות להשליך את התקשורת בילה מן הבארות באמצעות micropipette רב ערוצי.
  2. חשוף את התאים לבדיקת כימיקלים בריכוזים שונים. הכינו את התמיסות של הריכוזים הכימיים לבדיקה בתרבית עבור ZFL או ZEM2S ללא נסיוב בקר עוברי (FBS) (מדיית חשיפה). לאחר מכן, הוסף 100 μL לכל באר של תמיסות אלה בטריפליקט טכני (כלומר, שלוש בארות / ריכוז כימי בדיקה).
  3. עבור בקרות, מקם את קבוצות הבקרה על אותה צלחת כמו כימיקל הבדיקה בטריפליקטים טכניים (שלוש בארות/קבוצת ביקורת). כך, עבור הבקרה הריקה (B), הוסף 100 μL של מדיית החשיפה בבארות נטולות תאים, עבור הבקרה השלילית (NC), הוסף 100 μL של מדיית החשיפה לבארות עם תאים, ועבור הבקרה החיובית (PC), חשוף את התאים לתמיסה של 1% Triton X-100 שהוכנה במדיית החשיפה. במקרים מסוימים, בקרת ממס (SC) צריכה להיכלל בצלחת, בהתחשב בריכוז לא ציטוטוקסי בעליל כריכוז ממס סופי.
    הערה: מומלץ להשתמש ב-0.5% DMSO כממס; DMSO יכול לשמש עד 1% כממס בשורות תאים אלה מבלי לחרוג מסף ציטוטוקסיות של 10% הקשורים לבקרה השלילית.
  4. לדגור את הצלחות ב 28 ° C במשך 24 שעות. אטמו את הצלחות עם רדיד אלומיניום פרפילם או דבק כדי למנוע אידוי בינוני של התרבית.
    הערה: כימיקלים מסוימים עשויים להיות בעלי ספיגת רקע פנימית או פלואורסצנטיות שעלולים להפריע לספיגה או לפלואורסצנטיות של צבעי האינדיקטור (למשל, תרכובות עם צבע עשויות להשפיע על הספיגה, אלבומיןבסרום 29 ותרכובות המפריעות לאנזימי חיזור30,31). במקרה זה, הצלחת חייבת לכלול בקרה נוספת על ידי הוספת פתרונות כימיים בדיקה בבארות ללא תאים. זאת כדי לאמת את ההפרעה האפשרית של הספיגה האוטומטית הכימית / אוטופלואורסצנטיות עם הצבעים. אם מזוהה הפרעה, יש להעריך אם ניתן לשלול אותה כדי לקבל חיזוי נכון של ציטוטוקסיות.

5. בדיקות ציטוטוקסיות

הערה: הכינו את כל הפתרונות לפי טבלה 1. כל השלבים המתוארים להלן (איור 1) מתבצעים בתנאים סטריליים. השימוש בפיפטה כדי להשליך את אמצעי החשיפה אינו מומלץ, מכיוון שהתאים יכולים להתנתק בקלות מהבארות לאחר טיפול כימי.

  1. מבחני AB ו- CFDA-AM
    1. לאחר 24 שעות של חשיפה לכימיקלים בבדיקה, יש להשליך בזהירות את מדיית החשיפה על-ידי מזיגת התוכן למגש איסוף.
    2. לשטוף את הצלחת עם 200 μL של PBS. הסר בזהירות את PBS על ידי מזיגת אותו לתוך מגש איסוף כדי למנוע אובדן תאים.
    3. הוסף 100 μL לכל באר של תמיסת AB/CFDA-AM. לדגור על הצלחת במשך 30 דקות בחושך ב 28 ° C.
    4. מדוד את הפלואורסצנטיות בקורא לוחות פלואורסצנטיים ב- 530 ננומטר (עירור) ו- 595 ננומטר (פליטה) עבור AB, וב- 493 ננומטר (עירור) ו- 541 ננומטר (פליטה) עבור CFDA-AM.
  2. בדיקת NR
    הערה: השלבים עבור בדיקת NR מתבצעים מיד לאחר מבחני AB ו-CFDA-AM (איור 1).
    1. צנטריפוגה את פתרון העבודה NR (40 מיקרוגרם / מ"ל) ב 600 × גרם למשך 10 דקות.
      הערה: אין להעביר משקעים של NR בצינור ללוחות. לכן, לאחר צנטריפוגה של פתרון העבודה NR, לאסוף את supernatant באמצעות פיפטה מבלי לשאוף את משקעי NR. מעבירים את הסופרנאטנט למאגר מגיבים.
    2. הסר בזהירות את תמיסת AB/CFDA-AM על-ידי מזיגת התוכן למגש איסוף.
    3. הוסף 100 μL לכל באר של פתרון העבודה NR באמצעות מיקרופיפטה רב ערוצית. לדגור את הצלחת ב 28 ° C במשך 3 שעות.
      הערה: לאחר הדגירה של 3 שעות, בדוק אם משקעים NR התרחשו בלוחות באמצעות מיקרוסקופ. משקעי NR עלולים להפריע לכימות יכולת הקיום של התא, ולכן הם לא אמורים להיות נוכחים.
    4. הסר בזהירות את תמיסת NR על-ידי מזיגת התוכן למגש איסוף. לשטוף את הבארות על ידי הוספת 150 μL של PBS לכל באר.
    5. מוסיפים 150 μL לכל באר של תמיסת מיצוי NR ודגרים על הצלחת על שייקר צלחת למשך 10 דקות לניעור עדין. מדוד את הספיגה ב- 540 ננומטר בקורא לוחות.
      הערה: יש לבצע קריאה שנייה ב- 690 ננומטר כדי לא לכלול ספיגת טביעות אצבע ברקע בלוחית.
  3. בדיקת MTT
    הערה: בדיקת MTT חייבת להתבצע בנפרד מהבדיקות המתוארות לעיל (בלוח חדש) (איור 2).
    1. הסר בזהירות את המדיה החשופה על-ידי מזיגת התוכן למגש איסוף.
    2. הוסף 100 μL של פתרון עבודה MTT לכל באר באמצעות מיקרופיפטה רב ערוצית. לדגור את הצלחת ב 28 ° C במשך 4 שעות.
    3. השליכו את תמיסת MTT על ידי יציקת התוכן למגש איסוף.
    4. מוסיפים 100 μL לכל באר של DMSO כדי לחלץ את גבישי הפורמזן, ודוגרים את הצלחת על שייקר צלחת במשך 10 דקות. מדוד את הספיגה ב- 570 ננומטר באמצעות קורא לוחות.
      הערה: יש לבצע קריאה שנייה ב- 690 ננומטר כדי לא לכלול ספיגת טביעות אצבע ברקע בלוחית. חשוב לציין כי כימיקלים לבדיקה עלולים להפריע ל- MTT, אשר יש להעריך כדי להבטיח את איכות הנתונים שנוצרו32. לשם כך יש לחשוף בארות נטולות תאים המכילות את ריכוזי הבדיקה ו-MTT (0.5 מ"ג/מ"ל), ולאחר מכן לדגור כדי לצפות בכל שינוי צבע בבארות שעלול להגביר את הספיגה ולהוביל לתוצאות כדאיות שווא. יש להימנע מכימיקלים המקיימים אינטראקציה עם MTT בבדיקה זו.

6. חישוב כדאיות התא / ציטוטוקסיות

הערה: הספיגה הגולמית או הפלואורסצנטיות הנרכשת משמשת לחישוב כדאיות התא כאחוז הקשור לבקרה שלילית (עבור כימיקלים לבדיקה שהוכנו ישירות באמצעי חשיפה) או בקרת ממס (עבור כימיקלים לבדיקה שהוכנו באמצעות ממסים, כגון DMSO). לפני קביעת אחוז הכדאיות של התא, הנתונים הגולמיים חייבים להיות מנורמלים על-ידי הפקד הריק.

  1. חישוב ממוצע הספיגה או הפלואורסצנטיות עבור כל קבוצת בדיקה של ריכוז כימי וקבוצת ביקורת (שלוש בארות/טיפול).
  2. כדי לקבוע את אחוז הכדאיות של התא ביחס לבקרה (שלילית או ממס), השתמש במשוואה (2):
    Equation 2 (2)
    הערה: יחידות ספיגה (ABS) או פלואורסצנטיות (fluo) מייצגות את ממוצע הספיגה או הפלואורסצנטיות הנמדד בשלוש הבארות לכל ריכוז; ריק מייצג בארות ללא תאים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

איור 3 מראה את הלוחות של מבחני AB, CFDA-AM, NR ו-MTT. עבור בדיקת AB (איור 3A), הבארות והבארות הריקות ללא או מספר מופחת של תאים בני קיימא מראות צבע כחול ופלואורסצנטיות נמוכה, בעוד שהבארות עם מספר גבוה של תאים בני קיימא הן ורדרדות ומציגות ערכי פלואורסצנטיות גבוהים עקב הפיכת רסזורין (AB) לרסורופין (חומר ורדרד) על-ידי התאים בני הקיימא. עבור בדיקת CFDA-AM, אין הבדל נראה לעין בצבע הבארות על הצלחת; עם זאת, הפלואורסצנטיות גבוהה יותר בבארות המכילות תאים ברי קיימא עקב שימור CFDA-AM והמרה לאחר מכן לקרבוקסיפלואורסצאין (חומר פלואורסצנטי).

עבור בדיקת NR (איור 3B), הבארות הריקות חייבות להיות שקופות עם ערכי ספיגה נמוכים מאוד, מאחר שאין תאים שישמרו על צבע ה-NR. במקרים מסוימים, הבארות הריקות אינן שקופות, דבר המעיד על התרחשות משקעים NR על הצלחת; במקרה זה, אין לראות בכך ניסוי תקף. ריכוזים ציטוטוקסיים גבוהים של כימיקלים לבדיקה ושל PC הם שקופים או מציגים צבע ורוד בהיר מאוד עם ערכי ספיגה נמוכים, בעוד בארות המכילות תאים קיימא שומרות על צבע NR ומציגות צבע ורוד כהה וערכי ספיגה גבוהים.

עבור בדיקת MTT (איור 3C), הבארות הריקות חייבות להיות שקופות ועם ספיגה נמוכה מאוד, מאחר שאין תאים להמרת MTT לפורמזן. ריכוזים ציטוטוקסיים גבוהים של כימיקלים לבדיקה ושל PC הם שקופים או מציגים צבע סגול בהיר מאוד עם ערכי ספיגה נמוכים, בעוד בארות המכילות תאים ברי קיימא הופכות את MTT (צהוב) לפורמזן (חומר סגול), ומציגות צבע סגול כהה יותר עם ערכי ספיגה גבוהים.

איור 4A מציג גרף מייצג של כדאיות התא לאחר החישוב, תוך שימוש בממוצעים של ערכי פלואורסצנטיות או ספיגה לקבוצה. ניתן להתוות את הגרפיקה עם קלט של ערכי אחוזי כדאיות, המחושבים לפי נוסחת חישוב הכדאיות המוצגת בסעיף 6 של פרוטוקול, באמצעות תוכנת ניתוח נתונים. הכדאיות של תאים שנחשפו ל-SC לא צריכה להיות נמוכה ב-10% מאשר ב-NC17. אחוז הכדאיות של התאים עבור כימיקלים הבדיקה מחושב הקשור NC או SC, בהתאם למסיסות שלהם. במקרה זה, ריכוזים שונים של DMSO משמשים כחומר בדיקה ואת הכדאיות התא קשורה NC, אשר מוגדר כ 100% כדאיות.

ניתן להשתמש בנתוני כדאיות התא כדי לחשב את ריכוז המעכב החצי מקסימלי של כימיקלים לבדיקה (IC50) על ידי טרנספורמציה לוגריתמית, ועקומה סטנדרטית אינטרפולציה על ידי רגרסיה לא ליניארית לאחר העתקים מתאימים33,34,35. איור 4B מציג את IC50, המחושב מאחוז הכדאיות המוצג באיור 4A. IC50 התקבל עם לפחות שלושה עותקים טכניים ושלושה שכפולים ניסיוניים באמצעות ריכוזים נומינליים במבחן AB. הניתוחים בוצעו עם חמישה ריכוזים שונים של חומרי הבדיקה; עם זאת, ייתכן שיהיה צורך במספר גבוה יותר של ריכוזים בהתאם לסוג הניסוי. לדוגמה, שמונה ריכוזי בדיקה מומלצים לבדיקת מציאת טווח, המבוצעת בדרך כלל כדי לקבוע ריכוזי בדיקה סופיים של חומר כימי לניסוי. מכיוון שלמבחני הכדאיות יש נקודות קצה ציטוטוקסיות שונות, אנו ממליצים לחשב את IC50 עבור כל בדיקה המבוצעת בנפרד כדי לזהות הבדלים ברגישות הנגרמים על ידי מנגנוני פעולה שונים של החומרים הכימיים או הבדלים ברגישות בין שורות תאים. ההבדלים בערכי IC50 של כימיקלים שנבדקו בקווי תאים שונים עשויים להשתנות גם בהתאם לסוג מדיום התרבית בו נעשה שימוש, שכן הבדלים בהרכב הקשורים לחלבונים ושומנים יכולים להשפיע על הזמינות הביולוגית הכימית36. בנוסף, ציטוטוקסיות של כימיקלים רבים ניתן להעריך באמצעות בדיקות אלה. IC50 של כימיקלים אחרים המוערכים בקווי תאים ZFL ו-ZEM2S מוצג באיור 4B-H.

Figure 1
איור 1: פרוטוקול סכמטי של מבחני AB, CFDA-AM ו-NR שבוצעו באותה צלחת של 96 בארות. קיצורים: AB = Alamar Blue; CFDA-AM = 5-carboxyfluorescein diacetate אצטוקסימתיל אסטר; NR = אדום נייטרלי; PBS = מלח חוצץ פוספט. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: פרוטוקול סכמטי של בדיקת MTT המבוצע בלוח של 96 בארות. קיצור: MTT = 3-[4,5-dimethylthiazol-2yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: תוצאות מייצגות של מבחני AB, CFDA-AM, NR ו-MTT. התמונות מראות את הבדלי הצבעים בבארות עבור בקרות וריכוזי בדיקות במבחני (A) AB ו-CFDA-AM, (B) NR ו-(C) MTT. קיצורים: AB = Alamar Blue; CFDA-AM = 5-carboxyfluorescein diacetate אצטוקסימתיל אסטר; NR = אדום נייטרלי; PBS = מלח חוצץ פוספט; B = בארות ריקות (בארות ללא תאים); SC = בקרת ממס (0.5% DMSO); NC = שליטה שלילית (תאים בתווך תרבית); PC = שליטה חיובית (1% Triton X-100). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: חישוב נתוני כדאיות התא ונתוני הכדאיות של כימיקלים שונים לבדיקה. חישוב כדאיות התא באמצעות נתוני הקריאה יכול לבוא לידי ביטוי כאחוז (%) של כדאיות התא הקשורים ל- NC או SC (A). ניתן להעריך את ציטוטוקסיות של כימיקל על ידי שימוש בנתוני הכדאיות כדי לבצע אינטרפולציה של עקומה סטנדרטית על ידי רגרסיה לא ליניארית עבור כימיקלים שונים לבדיקה (B-H). הנתונים מיוצגים כממוצע של כדאיות התא (נקודות) וסטיית תקן (פסים) של שלושה משכפלים טכניים ושלושה משכפלים ניסיוניים (מבחן AB). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: בדיקת MTT שבוצעה בתאי ZFL ו-ZEM2S בתרבית בנוכחות (10%) ובהיעדר (0%, משוללי FBS לחלוטין) במשך 24 שעות. (A) תאי ZFL ב-0% וב-10% FBS לא מראים הבדל משמעותי בכדאיות התא בבדיקת Kruskall-Wallis (p = 0.2286). (B) תאי ZEM2S ב-0% וב-10% FBS לא מראים הבדל משמעותי בכדאיות התא בבדיקת מאן-ויטני (p = 0.3429). נלקחה בחשבון רמת מובהקות של p < 0.05. הנתונים מבוטאים כטווח חציוני ובין רבעוני של שלושה עותקים טכניים. קיצורים: n.s. = אין הבדל משמעותי; FBS = נסיוב בקר עוברי; MTT = 3-[4,5-dimethylthiazol-2yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 6
איור 6: בדיקות MTT ו-NR שבוצעו בתאי ZFL ו-ZEM2S שטופלו (24 שעות) ב-DMSO בריכוזים שונים (0.1%, 0.5% ו-1%) ובבקרה שלילית. תאי ZFL שטופלו ב-DMSO בכל ריכוז שנבדק לא הראו הבדל משמעותי בכדאיות התא הקשור ל-NC על ידי (A) בדיקת MTT (p = 0.074) ו-(B) בדיקת NR (p = 0.216). תאי ZEM2S שטופלו ב-DMSO לא הראו הבדל משמעותי בכדאיות התאים הקשורים ל-NC על ידי בדיקת (C) MTT (p = 0.422) ו-(D) בדיקת NR (p = 0.287). נלקחה בחשבון רמת מובהקות של p < 0.05 במבחן קרוסקל-ואליס. הנתונים מבוטאים כטווח חציוני ובין רבעוני של שלושה עותקים טכניים. קיצורים: n.s. = אין הבדל משמעותי; NC = שליטה שלילית; MTT = 3-[4,5-dimethylthiazol-2yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide; NR = אדום נייטרלי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה 1: פתרונות ומדיה המשמשים בפרוטוקול זה. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מבחני ציטוטוקסיות נמצאים בשימוש נרחב להערכת רעילות חוץ גופית, ומאמר פרוטוקול זה מציג ארבע בדיקות ציטוטוקסיות נפוצות ששונו לביצוע בשורות תאים של דגי זברה (כלומר, צפיפות תאים עבור צלחת 96 בארות, זמן דגירה במבחן MTT, דלדול FBS במהלך מצב החשיפה לכימיקלים, וריכוז מרבי מקובל עבור SC). מכיוון שבדיקות אלה מכמתות ציטוטוקסיות לפי נקודות קצה שונות של כדאיות התא (תפקוד מטבולי, שלמות קרום ליזוזומלי ושלמות קרום התא), השילוב ביניהן מספק הערכה מדויקת של ציטוטוקסיות כימית בשורות תאים של דגי זברה. פרוטוקול זה ממליץ גם על תרבית של קווי תאים ZFL ו- ZEM2S במצב נטול CO2, בשל הרכב המדיה התרבית שלהם שיכול לאגור כראוי את מערכת התרבית, תוך שמירה על pH של 7.4 (pH פיזיולוגי). הרכב המדיה התרבית והסביבה נטולת CO2 המוצעים בפרוטוקול זה עבור שני קווי התאים מדווחים בהרחבה בספרות. קו תאי ZFL בדרך כלל מתורבת במדיה L-15 ו- RPMI עם או בלי תוספת של סודיום ביקרבונט וללא CO2 37,38,39,40,41,42,43. בינתיים, קו תאי ZEM2S מתורבת על פי הוראות מרכז המשאבים הביולוגיים, ומדיית התרבית שלו מנוסחת עבור תרביות נטולותCO2; לכן, CO2 ותערובת אוויר יכול להיות מזיק לתאים בעת שימוש בסוג זה של מדיה תרבית44.

החשיפה הכימית במדיום תרבית ללא הוספת FBS בוצעה על סמך מחקרים שפורסמו, והראו כי זמינותם הביולוגית של החומרים הכימיים במבחני מבחנה מושפעת באופן משמעותי מהקישור שלהם לחלבוני הסרום. לדוגמה, Chen et al.45 הראו כי נוכחותם של חלבוני סרום בבדיקת RTgill-W1 יכולה להפחית את הזמינות הביולוגית של חומר פעילי שטח קטיוני (C12-benzalkonium) עד פי שלושה וחצי. הכימיקל הקשור ל- FBS נע בדרך כלל בין 47% ל -90% בתווך התרבית45. לכן, כדי להימנע מבעיה זו, הערכנו את כדאיות התאים של תאי ZFL ו- ZEM2S בתרביות שנשללו לחלוטין מ- FBS במשך 24 שעות באמצעות בדיקת MTT. התוצאות לא הראו הבדל משמעותי בכדאיות התאים מתרביות ZFL או ZEM2S עם (10%) וללא (0%) FBS, מה שמצביע על כך שקווי התאים האלה של דגי זברה יכולים להיות נתונים לטיפול כימי במדיה תרבית משוללת FBS (איור 5). חשוב להדגיש כי הפחתת כמות FBS עלולה לגרום להשלכות אחרות בזמינות ביולוגית כימית. לדוגמה, כימיקלים ליפופיליים הם בעלי יכולת ספיגה גבוהה יותר לכלי מעבדה וצלחות פלסטיק, מה שמקטין את הזמינות הביולוגית הכימית36. עם זאת, נוכחותו של FBS במדיום התרבות יכולה להפחית את קשירת הפלסטיק עקב מרכיבי הסרום המתחרים עם הפלסטיק על קשירה לכימיקלים46. ההחלטה הטובה ביותר הקשורה לאחוז תוספת FBS או חסך מוחלט שלה עשוי להיות תלוי בסוג של כימיקל הבדיקה. לדוגמה, Pomponio et al.46 דיווחו כי למרות כימיקל amiodarone יש מחייב גבוה יותר פלסטיק בהיעדר FBS, הזמינות הביולוגית שלה היא אפילו נמוכה יותר בעת שימוש 10% FBS. עבור mono-N-desethylamiodarone, כמעט אותה כמות קשורה למדיום הסרום ולקירות46.

ממסים אורגניים (למשל, DMSO) מומלצים בדרך כלל לשימוש של עד 0.5% בבדיקות מבחנה. עם זאת, ריכוז נמוך זה עלול לפגוע בבדיקת ריכוזים גבוהים יותר של כימיקלים מסיסים במים ירודים. כדי למנוע בעיה זו, הערכנו אם ריכוזים גבוהים יותר של DMSO מתאימים לקווי תאים ZFL ו- ZEM2S שאינם עולים על סף ציטוטוקסיות של 10%. לשם כך, תאים לא מטופלים (NCs) ותאים שטופלו (24 שעות) עם ריכוזים שונים של DMSO (0.1%, 0.5% ו -1%) עובדו עבור בדיקות MTT ו- NR. התוצאות לא הראו הבדל משמעותי בכדאיות התאים מקבוצת הטיפול בהשוואה ל- NCs (איור 6), מה שמצביע על כך שבתנאים מסוימים אלה, ניתן להשתמש בריכוזים של DMSO עד 1%. קווי תאי דגים אחרים תומכים גם הם בריכוזי DMSO גבוהים מ-0.5%, שאינם ייחודיים לקווי התאים ZFL ו-ZEM2S. לדוגמה, ריכוזי ממס מקסימליים של עד 2% DMSO (ללא השפעה ציטוטוקסית) יושמו במבדקי ציטוטוקסיות באמצעות CHSE-214 (קו תאים הנגזר מעובר Oncorhynchus tshawytscha)47, RTG-2 (Oncorhynchus mykiss gonadal cell line)48,49,50 ו-PLHC-1 (Poeciliopsis lucida hepatocellular carcinoma cell line)48 תאים. ריכוז הממס המרבי של 1% DMSO שימש גם בבדיקות ציטוטוקסיות באמצעות RTL-W1 (Oncorhynchus mykiss gonadal cell line)51 ו-CCO (Ictalurus punctatus ovary cell line)52 תאים. לדברי מורי וואקבאיאשי47, קווי תאי דגים עשויים להיות בעלי רגישות נמוכה יותר ל- DMSO מאשר קווי תאים של יונקים. עם זאת, חשוב להדגיש כי הריכוז המרבי המקובל של 1% DMSO הוגדר באופן בלעדי עבור ציטוטוקסיות, ויש להעריך זאת בזהירות עבור נקודות קצה אחרות (למשל, גנוטוקסיות, אפיגנטיקה, ניתוח ביטוי גנים מקודדי חלבונים) בקווי תאים ZFL ו- ZEM2S.

מבחני MTT ו- AB מבוססים על פעילות מטבולית כדי לקבוע את כדאיות התא. למרות שבדיקת MTT היא בדיקת הכדאיות הנפוצה ביותר, בהשוואה לבדיקת AB היא יכולה להיות מעט פחות רגישה, הערכת יתר של כדאיות התא במקרים מסוימים53. הרגישות הגבוהה יותר של בדיקת AB עשויה להיות קשורה לשיטת המדידה, שכן מדידת פלואורסצנטיות רגישה יותר ממדידה קולורימטרית15. עם זאת, הן מבחני AB והן מבחני MTT הם מבדקים באיכות גבוהה לזיהוי חומרים כימיים ציטוטוקסיים, והנתונים שנוצרו בהם שימשו לסיווג חומרים כימיים מסוכנים על פי הפוטנציאל ציטוטוקסי הפנימי שלהם53.

הרעיון לבצע את בדיקת AB, CFDA-AM ו-NR באותה צלחת התבסס על בדיקת TG 249 של ה-OECD (RTgill-W1)17; עם זאת, נעשו שינויים כדי לבצע בדיקות אלה בצלחות 96 באר, כמו גם כדי להתאים קווי תאים של דגי זברה. בדיקות בצלחות של 96 בארות, במקום בצלחות של 24 בארות, יכולות להיות יתרון לבדיקת ציטוטוקסיות בתפוקה גבוהה בשורות תאי דגים. בנוסף, בדיקת RTgill-W1 משתמשת רק בתווך תרבית L-15, בעוד שקווי התאים ZFL ו- ZEM2S מתורבתים בתווך המכיל D-גלוקוז. מדיום התרבית מאפשר לבצע את בדיקת MTT בקווי תאים אלה, שכן קווי תאים בתרבית בתווך נטול גלוקוז (למשל, רק L-15) עלולים להפחית באופן מיידי את הפחתת MTT בתאים ולפגוע בביצועים של בדיקה זו54. פרוטוקול זה מאפשר לבצע בקלות ארבע בדיקות כדאיות שונות בשני קווי תאים של דגי זברה.

פרוטוקול זה יכול לשמש לחקר ההשפעות של חומרים כימיים על דגים באמצעות מודלים במבחנה . קווי תאים שונים עשויים להיות בעלי רגישויות שונות להערכת השפעות כימיות, למרות שהם מאותה קבוצה של בעלי חוליות, כגון דגים. לדוגמה, השוואת קווי תאים ZFL ו- ZF4 עם עוברי דגים, Langu-Mitea et al.21 הראו כי ZFL מסוגל לייצר תוצאות דומות בהשוואה לבדיקת רעילות עוברי דגים. טנברגר ועמיתיו הראו כי לקווי תאי הדגים הקבועים GSF, PLHC, RTG-2, RTgill-W1 ו-R1 יש רגישויות שונות בניבוי רעילות דגים כימיים בהשוואה ל-in vivo (דגים בוגרים). למרות ש-RTgill-W1 (קו תאי זימים קבוע של דגים) אומת לאחרונה כשיטה חלופית לחיזוי רעילות חריפה של דגים, יש לחקור את הישימות של קווי תאים אחרים במחקרי רעילות אקולוגית. שימוש בקווי תאים ממיני דגים שונים וממקורות רקמה שונים וכן בשלבי התפתחות (ZEM2S: עובר; ZFL: כבד בוגר) עשוי לתרום באופן משמעותי למחקרי רעילות אקולוגית, שכן הוא יכול לטפל בהשפעות הקשורות לשלבים ספציפיים של התפתחות דגים ואיברי מטרה. לפיכך, השפעות כימיות צריכות להיחקר באמצעות תרביות תאים שונות המשקפות אתרי מטרה שונים בדגים (למשל, כבד, גונדות, זמיר, מוח), ולא רק בקו תא בודד55.

לפרוטוקולים אלה יכולים להיות יישומים שונים במחקרי רעילות אקולוגית, והשימוש בהם אינו מוגבל בהכרח לחיזוי רעילות חריפה של דגים. לדוגמה, ניתן ליישם אותם כדי להגדיר ריכוזים תת-ציטוטוקסיים כדי לבצע בדיקות רעילות אחרות של דגים במבחנה, כגון הערכת השפעות משבשות אנדוקריניות על דגים. בנוסף, נתוני ציטוטוקסיות חוץ גופית יכולים גם לעזור לפתח ולשפר מודלים טוקסיקוקינטיים מבוססי פיזיולוגיה (PBTK). מכיוון ש-PBTK מתמקד בהתפלגות של כימיקל באורגניזם בהתחשב באיברים השונים (כגון הזמיר, הכבד או המעי)56, שימוש בקווי תאים ממיני דגים שונים וממקורות רקמה שונים יכול להיות מקור מידע שימושי עבור מודל זה. התוצאות של בדיקות ביולוגיות במבחנה (למשל, מבחני ציטוטוקסיות) מספקות נתוני קלט המייצגים תהליכים ביולוגיים במודל PBTK ותורמות לאקסטרפולציה in vitro to in vivo 21,56.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין ניגוד עניינים.

Acknowledgments

לזכרו של ד"ר מרסיו לורנצ'יני, מחבר שותף של עבודה זו, חוקר מעולה בתחום הקוסמטיקה ומוקדש לקידום המחקר הקוסמטי בברזיל. המחברים אסירי תודה למעבדה מרובת המשתמשים במחלקה לפיזיולוגיה (UFPR) על זמינות הציוד ועל התמיכה הכספית של התיאום לשיפור כוח האדם להשכלה גבוהה (CAPES, ברזיל) (קוד כספים 001) ו- Grupo Boticario.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5-CFDA, AM (5-Carboxyfluorescein Diacetate, Acetoxymethyl Ester) Invitrogen C1345
Cell culture plate, 96 well plate Sarstedt 83.3924 Surface: Standard, flat base
DMEM Gibco 12800-017 Powder, high glucose, pyruvate
FBS - Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions Gibco 12657-029
Ham's F-12 Nutrient Mix, powder Gibco 21700026 Powder
HEPES (1 M) Gibco 15630080
Leibovitz's L-15 Medium Gibco 41300021 Powder
Neutral red  Sigma-Aldrich N4638 Powder, BioReagent, suitable for cell culture
Orbital shaker  Warmnest KLD-350-BI 22 mm rotation diameter
Dulbeccos PBS (10X) with calcium and magnesium Invitrogen 14080055
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Gibco 15140122
Resazurin sodium salt  Sigma-Aldrich R7017 Powder, BioReagent, suitable for cell culture
RPMI 1640 Medium Gibco 31800-014 Powder
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S5761 Powder,  bioreagent for molecular biology
Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide  98% Sigma-Aldrich M2128
Trypan blue stain (0.4%) Gibco 15250-061
Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red Gibco 15400054
ZEM2S cell line ATCC CRL-2147 This cell line was kindly donated by Professor Dr. Michael J.
Carvan (University of Wisconsin, Milwaukee, USA)
ZFL cell line BCRJ 256

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. ECHA. Non-Animal Approaches-Current Status of Regulatory Applicability Under the REACH, CLP and Biocidal Products Regulations. ECHA. , Available at <87ebb68f-2038-f597-fc33-f4003e9e7d7d (2017).
  2. Alternative Methods Accepted by US Agencies. National Toxicology Program, and US Department of Health and Human Services. , Available from: https://ntp.niehs.nih.gov/whatwestudy/niceatm/accept-methods/index.html (2022).
  3. Schirmer, K. Proposal to improve vertebrate cell cultures to establish them as substitutes for the regulatory testing of chemicals and effluents using fish. Toxicology. 224 (3), 163-183 (2006).
  4. Scholz, S., et al. Alternatives to in vivo tests to detect endocrine disrupting chemicals (EDCs) in fish and amphibians-screening for estrogen, androgen and thyroid hormone disruption. Critical Reviews in Toxicology. 43 (1), 45-72 (2013).
  5. Tanneberger, K., et al. Predicting fish acute toxicity using a fish gill cell line-based toxicity assay. Environmental Science & Technology. 47 (2), 1110-1119 (2013).
  6. Roesler, R., Lorencini, M., Pastore, G. Brazilian cerrado antioxidant sources: cytotoxicity and phototoxicity in vitro. Food Science and Technology. 30, 814-821 (2010).
  7. Ruyra, A., et al. Zebrafish liver (ZFL) cells are able to mount an anti-viral response after stimulation with Poly (I:C). Comparative Biochemistry and Physiology. Part B, Biochemistry & Molecular Biology. 182, 55-63 (2015).
  8. Natsch, A., Laue, H., Haupt, T., von Niederhäusen, V., Sanders, G. Accurate prediction of acute fish toxicity of fragrance chemicals with the RTgill-W1 cell assay. Environmental Toxicology and Chemistry. 37 (3), 931-941 (2018).
  9. Freshney, R. I. Cytotoxicity. Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique. , (2005).
  10. Mosmann, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. Journal of Immunological Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).
  11. O'Brien, J., Wilson, I., Orton, T., Pognan, F. Investigation of the Alamar Blue (resazurin) fluorescent dye for the assessment of mammalian cell cytotoxicity. European Journal of Biochemistry. 267 (17), 5421-5426 (2000).
  12. Gonzalez, R. J., Tarloff, J. B. Evaluation of hepatic subcellular fractions for Alamar blue and MTT reductase activity. Toxicology In Vitro. 15 (3), 257-259 (2001).
  13. Borenfreund, E., Puerner, J. A. Toxicity determined in vitro by morphological alterations and neutral red absorption. Toxicology Letters. 24 (2-3), 119-124 (1985).
  14. Repetto, G., del Peso, A., Zurita, J. L. Neutral red uptake assay for the estimation of cell viability/cytotoxicity. Nature Protocols. 3 (7), 1125-1131 (2008).
  15. Kamiloglu, S., Sari, G., Ozdal, T., Capanoglue, E. Guidelines for cell viability assays. Food Frontiers. 1 (3), 332-349 (2020).
  16. Water Quality-Determination of Acute Toxicity of Water Samples and Chemicals to a Fish Gill Cell Line (RTgill-W1) (ISO 21115:2019). International Organization for Standardization. , Available from: https://www.iso.org/standar/69933.html (2019).
  17. Organisation for Economic Co-operation and Development. Test Guideline No. 249: Fish Cell Line Acute Toxicity-The RTgill-W1 Cell Line Assay. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 2. Effects on Biotic Systems. , OECD Publishing. Paris. (2021).
  18. Lungu-Mitea, S., Lundqvist, J. Potentials and pitfalls of transient in vitro reporter bioassays: interference by vector geometry and cytotoxicity in recombinant zebrafish cell lines. Archives of Toxicology. 94 (8), 2769-2784 (2020).
  19. Lungu-Mitea, S., Han, Y., Lundqvist, J. Development, scrutiny, and modulation of transient reporter gene assays of the xenobiotic metabolism pathway in zebrafish hepatocytes. Cell Biology and Toxicology. , 1-23 (2021).
  20. Schirmer, K., Chan, A. G., Greenberg, B. M., Dixon, D. G., Bols, N. C. Methodology for demonstrating and measuring the photocytotoxicity of fluoranthene to fish cells in culture. Toxicology In Vitro. 11 (1-2), 107-119 (1997).
  21. Lungu-Mitea, S., et al. Modeling bioavailable concentrations in zebrafish cell lines and embryos increases the correlation of toxicity potencies across test systems. Environmental Science & Technology. 55 (1), 447-457 (2021).
  22. Cavalcante, D. G. S. M., et al. Cytotoxic, biochemical and genotoxic effects of biodiesel produced by different routes on ZFL cell line. Toxicology In Vitro. 28 (6), 1117-1125 (2014).
  23. Meng, Q., Yeung, K., Chan, K. M. Toxic effects of octocrylene on zebrafish larvae and liver cell line (ZFL). Aquatic Toxicology. 236, 105843 (2021).
  24. Kwok, M. L., Chan, K. M. Oxidative stress and apoptotic effects of copper and cadmium in the zebrafish liver cell line ZFL. Toxicology Reports. 7, 822-835 (2020).
  25. Yang, J., Chan, K. M. Evaluation of the toxic effects of brominated compounds (BDE-47, 99, 209, TBBPA) and bisphenol A (BPA) using a zebrafish liver cell line, ZFL. Aquatic Toxicology. 159, 138-147 (2015).
  26. Bradford, C. S., Sun, L., Collodi, P., Barnes, D. W. Cell cultures from zebrafish embryos and adult tissues. Journal of Tissue Culture Methods. 16 (2), 99-107 (1994).
  27. He, S., et al. Genetic and transcriptome characterization of model zebrafish cell lines. Zebrafish. 3 (4), 441-453 (2006).
  28. Mansoury, M., Hamed, M., Karmustaji, R., Al Hannan, F., Safrany, S. T. The edge effect: A global problem. The trouble with culturing cells in 96-well plates. Biochemistry and Biophysics Reports. 26, 100987 (2021).
  29. Funk, D., Schrenk, H. -H., Frei, E. Serum albumin leads to false-positive results in the XTT and the MTT assay. BioTechniques. 43 (2), 178 (2007).
  30. Dayeh, V. R., Bols, N. C., Tanneberger, K., Schirmer, K., Lee, L. E. J. The use of fish-derived cell lines for investigation of environmental contaminants: An update following OECD's fish toxicity testing framework no. 171. Current Protocols in Toxicology. 1, (2013).
  31. Stepanenko, A. A., Dmitrenko, V. V. Pitfalls of the MTT assay: Direct and off-target effects of inhibitors can result in over/underestimation of cell viability. Gene. 574 (2), 193-203 (2015).
  32. Ulukaya, E., Colakogullari, M., Wood, E. J. Interference by anti-cancer chemotherapeutic agents in the MTT-tumor chemosensitivity assay. Chemotherapy. 50 (1), 43-50 (2004).
  33. Sebaugh, J. L. Guidelines for accurate EC50/IC50 estimation. Pharmaceutical Statistics. 10 (2), 128-134 (2011).
  34. Weimer, M., et al. The impact of data transformations on concentration-response modeling. Toxicology Letters. 213 (2), 292-298 (2012).
  35. Green, J. W., Holbech, T. A., Henrik, Chapter 4: Analysis of Continuous Data (Regression). Statistical Analysis of Ecotoxicity Studies. , John Wiley & Sons, Inc. (2018).
  36. Proença, S., et al. Effective exposure of chemicals in in vitro cell systems: A review of chemical distribution models. Toxicology In Vitro. 73, 105133 (2021).
  37. Guidony, N. S., et al. ABC proteins activity and cytotoxicity in zebrafish hepatocytes exposed to triclosan. Environmental Pollution. 271, 116368 (2021).
  38. da Silva, N. D. G., et al. Interference of goethite in the effects of glyphosate and Roundup® on ZFL cell line. Toxicology In Vitro. 65, 104755 (2020).
  39. Yang, Y., et al. Temperature is a key factor influencing the invasion and proliferation of Toxoplasma gondii in fish cells. Experimental Parasitology. 217, 107966 (2020).
  40. Lopes, F. M., Sandrini, J. Z., Souza, M. M. Toxicity induced by glyphosate and glyphosate-based herbicides in the zebrafish hepatocyte cell line (ZF-L). Ecotoxicology and Environmental Safety. 162, 201-207 (2018).
  41. Lachner, D., Oliveira, L. F., Martinez, C. B. R. Effects of the water soluble fraction of gasoline on ZFL cell line: Cytotoxicity, genotoxicity and oxidative stress. Toxicology In Vitro. 30, 225-230 (2015).
  42. Morozesk, M., et al. Effects of multiwalled carbon nanotubes co-exposure with cadmium on zebrafish cell line: Metal uptake and accumulation, oxidative stress, genotoxicity and cell cycle. Ecotoxicology and Environmental Safety. 202, 110892 (2020).
  43. Dognani, G., et al. Nanofibrous membranes for low-concentration Cr VI adsorption: kinetic, thermodynamic and the influence on ZFL cells viability. Materials Research. , 24 (2021).
  44. ZEM2S (ATCC®CRL-2147™). American Type Culture Collection. , Available from: https://www.atcc.org/products/crl-2147 (2023).
  45. Chen, Y., et al. Acute toxicity of the cationic surfactant C12-benzalkonium in different bioassays: how test design affects bioavailability and effect concentrations. Environmental Toxicology and Chemistry. 33 (3), 606-615 (2014).
  46. Pomponio, G., et al. In vitro kinetics of amiodarone and its major metabolite in two human liver cell models after acute and repeated treatments. Toxicology In Vitro. 30, 36-51 (2015).
  47. Mori, M., Wakabayashi, M. Cytotoxicity evaluation of chemicals using cultured fish cells. Water Science and Technology. 42 (7-8), 277-282 (2000).
  48. Caminada, D., Escher, C., Fent, K. Cytotoxicity of pharmaceuticals found in aquatic systems: comparison of PLHC-1 and RTG-2 fish cell lines. Aquatic Toxicology. 79 (2), 114-123 (2006).
  49. Giltrap, M., et al. In vitro screening of organotin compounds and sediment extracts for cytotoxicity to fish cells. Environmental Toxicology and Chemistry. 30 (1), 154-161 (2011).
  50. Hollert, H., Duerr, M., Erdinger, L., Braunbeck, T. Cytotoxicity of settling particulate matter and sediments of the Neckar River (Germany) during a winter flood. Environmental Toxicology and Chemistry. 19 (3), 528-534 (2000).
  51. Pannetier, P., et al. Toxicity assessment of pollutants sorbed on environmental sample microplastics collected on beaches: Part I-adverse effects on fish cell line. Environmental Pollution. 248, 1088-1097 (2019).
  52. Ternjej, I., Srček, V. G., Mihaljević, Z., Kopjar, N. Cytotoxic and genotoxic effects of water and sediment samples from gypsum mining area in channel catfish ovary (CCO) cells. Ecotoxicology and Environmental Safety. 98, 119-127 (2013).
  53. Hamid, R., Rotshteyn, Y., Rabadi, L., Parikh, R., Bullock, P. Comparison of alamar blue and MTT assays for high throughput screening. Toxicology In Vitro. 18 (5), 703-710 (2004).
  54. Vistica, D. T., et al. Tetrazolium-based assays for cellular viability: a critical examination of selected parameters affecting formazan production. Cancer Research. 51 (10), 2515-2520 (1991).
  55. Knauer, K., Lampert, C., Gonzalez-Valero, J. Comparison of in vitro and in vivo acute fish toxicity in relation to toxicant mode of action. Chemosphere. 68 (8), 1435-1441 (2007).
  56. Stadnicka-Michalak, J., Tanneberger, K., Schirmer, K., Ashauer, R. Measured and modeled toxicokinetics in cultured fish cells and application to in vitro-in vivo toxicity extrapolation. PLoS One. 9 (3), 92303 (2014).

Tags

מדעי הסביבה גיליון 191
בדיקות ציטוטוקסיות עם קווי תאים של דגי זברה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rodrigues de Souza, I., Wilke Sivek, … More

Rodrigues de Souza, I., Wilke Sivek, T., Vaz de Oliveira, J. B., Di Pietro Micali Canavez, A., de Albuquerque Vita, N., Cigaran Schuck, D., Rodrigues de Souza, I., Cestari, M. M., Lorencini, M., Leme, D. M. Cytotoxicity Assays with Zebrafish Cell Lines. J. Vis. Exp. (191), e64860, doi:10.3791/64860 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter