Summary
Dit protocol presenteert veelgebruikte cytotoxiciteitstests (Alamar Blue [AB], CFDA-AM, Neutral Red en MTT-assays) aangepast voor de beoordeling van cytotoxiciteit in zebravisembryo's (ZEM2S) en lever (ZFL) cellijnen in 96-well platen.
Abstract
Viscellijnen worden steeds vaker gebruikt in ecotoxiciteitsstudies en cytotoxiciteitstests zijn voorgesteld als methoden om acute toxiciteit van vissen te voorspellen. Dit protocol presenteert dus cytotoxiciteitstests die zijn aangepast om de levensvatbaarheid van cellen te evalueren in zebravis (Danio rerio) embryo (ZEM2S) en lever (ZFL) cellijnen in 96-well platen. De geëvalueerde cytotoxiciteitseindpunten zijn mitochondriale integriteit (Alamar Blue [AB] en MTT-assays), membraanintegriteit via esterase-activiteit (CFDA-AM-assay) en lysosomale membraanintegriteit (Neutral Red [NR] assay). Na de blootstelling van de teststoffen in een plaat met 96 putten worden de cytotoxiciteitstests uitgevoerd; hier worden AB en CFDA-AM gelijktijdig uitgevoerd, gevolgd door NR op dezelfde plaat, terwijl de MTT-test op een afzonderlijke plaat wordt uitgevoerd. De uitlezingen voor deze testen worden genomen door fluorescentie voor AB en CFDA-AM, en absorptie voor MTT en NR. De cytotoxiciteitstests die met deze viscellijnen worden uitgevoerd, kunnen worden gebruikt om de acute toxiciteit van chemische stoffen op vissen te bestuderen.
Introduction
Chemische stoffen moeten worden getest op hun veiligheid voor de menselijke gezondheid en het milieu. Moleculaire en cellulaire biomarkers worden in toenemende mate overwogen in veiligheidsbeoordelingen om effecten op levende organismen te voorspellen door regelgevende instanties en/of wetgevingen (bijv. REACH, OESO, US EPA)1,2, omdat ze kunnen voorafgaan aan de in vivo nadelige uitkomst (bijv. endocriene verstoring, immunologische respons, acute toxiciteit, fototoxiciteit)3,4,5,6,7 . In deze context is cytotoxiciteit als een meting genomen om de acute toxiciteit bij vissente voorspellen 5,8; Het kan echter vele andere toepassingen hebben in ecotoxiciteitsstudies, zoals het definiëren van subcytotoxische concentraties van chemische stoffen om hun meest uiteenlopende reeks effecten op vissen te bestuderen (bijv. Hormoonontregelende effecten).
In celkweeksystemen (in vitro systemen) kan de cytotoxiciteit van chemische stoffen worden bepaald door methoden die verschillen in de soorten eindpunten. Een cytotoxiciteitsmethode kan bijvoorbeeld worden gebaseerd op een eindpunt dat verband houdt met specifieke morfologie die wordt waargenomen tijdens het celdoodproces, terwijl een andere cytotoxiciteit kan bepalen door de meting van celdood, levensvatbaarheid en functionaliteit, morfologie, energiemetabolisme en celaanhechting en -proliferatie. Chemische stoffen kunnen de levensvatbaarheid van cellen beïnvloeden via verschillende mechanismen, dus cytotoxiciteitsbeoordeling met betrekking tot verschillende eindpunten van de levensvatbaarheid van cellen is noodzakelijk om chemische effectente voorspellen 9.
MTT en Alamar Blue (AB) zijn testen die effecten op de levensvatbaarheid van cellen bepalen op basis van celstofwisselingsactiviteit. De MTT-test evalueert de activiteit van het mitochondriale enzym succinaatdehydrogenase10. De reductie van geelachtig 3-[4,5-dimethylthiazol-2yl]-2,5-difenyltetrazoliumbromide (MTT) tot formazanblauw komt alleen voor in levensvatbare cellen en de optische dichtheid is recht evenredig met het aantal levensvatbare cellen10. De AB-test is een gevoelige oxidatie-reductie-indicator, gemedieerd door mitochondriale enzymen die fluoresceren en van kleur veranderen bij het reduceren van resazurine tot resorufine door levende cellen11; cytosolische en microsomale enzymen dragen echter ook bij aan de reductie van AB en MTT12. Deze enzymen kunnen verschillende reductasen omvatten, zoals alcohol en aldehydeoxidoreductasen, NAD (P) H: chinonoxidoreductase, flavinereductase, NADH-dehydrogenase en cytochromen11.
De Neutral Red (NR) assay is een cel levensvatbaarheidstest gebaseerd op de opname van deze kleurstof in de lysosomen van levensvatbare cellen13. De opname van NR hangt af van het vermogen van de cellen om pH-gradiënten te behouden. De protongradiënt in de lysosomen handhaaft een pH lager dan het cytoplasma. Bij normale fysiologische pH presenteert de NR een nettolading van ongeveer nul, waardoor het celmembranen kan binnendringen. De kleurstof wordt dus geladen en wordt vastgehouden in de lysosomen. Bijgevolg, hoe groter de hoeveelheid behouden NR, hoe groter het aantal levensvatbare cellen14. Chemische stoffen die het celoppervlak of de lysosomale membranen beschadigen, belemmeren de opname van deze kleurstof.
De CFDA-AM-test is een fluorometrische levensvatbaarheidstest voor cellen op basis van de retentie van 5-carboxyfluoresceïnediacetaat acetoxymethylester (CFDA-AM)15. 5-CFDA-AM, een esterasesubstraat, wordt omgezet in carboxyfluoresceïne, een fluorescerende stof die polair en niet-permeabel is door membranen van levende cellen15; Het wordt dus vastgehouden in de binnenkant van een intact celmembraan, wat wijst op levensvatbare cellen.
Onlangs werden drie cytotoxiciteitstests (CFDA-AM, NR en AB-assays) gecombineerd in een gevalideerde ISO-richtlijn (International Organization for Standardization) (ISO 21115: 2019) 16 en OESO-testmethode (Organisatie voor Economische Samenwerking en Ontwikkeling) (OESO TG 249) om de acute toxiciteit van vissen te evalueren met behulp van de RTgill-W1-cellijn (permanente cellijn van regenboogforel [Oncorhynchus mykiss] kieuw) in 24-putplaten17 . Hoewel er een bestaande celgebaseerde methode is om de acute toxiciteit van vissen te voorspellen, zijn er inspanningen geleverd om vergelijkbare methoden met andere vissoorten te ontwikkelen en de doorvoer van de methode te vergroten. Enkele voorbeelden zijn de ontwikkeling van ZFL-cellijnen getransfecteerd met reportergenen voor specifieke toxiciteitsroutes18,19, fototoxiciteitstests in de RTgill-W1-cellijn 20 en het gebruik van ZFL- en ZF4-cellijnen (zebravisfibroblast afgeleid van embryo's van 1 dag oud) om toxiciteit te beoordelen door middel van verschillende cytotoxiciteitstests21.
Danio rerio (zebravis) is een van de belangrijkste vissoorten die worden gebruikt in aquatische toxiciteitsstudies; Celgebaseerde methoden met zebraviscellijnen voor het testen van vistoxiciteit kunnen dus uiterst nuttig zijn. De ZFL-cellijn is een zebravisepitheelhepatocytencellijn die de belangrijkste kenmerken van leverparenchymale cellen presenteert en xenobiotica kan metaboliseren 7,22,23,24,25. Ondertussen is de ZEM2S-cellijn een embryonale zebravis fibroblastische cellijn afgeleid van het blastulastadium die kan worden gebruikt om ontwikkelingseffecten op vissen te onderzoeken26,27. Dit protocol beschrijft dus vier cytotoxiciteitstests (MTT-, AB-, NR- en CFDA-AM-assays), met modificaties die moeten worden uitgevoerd met ZFL- en ZEM2S-cellijnen in 96-putplaten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING: Zie de materiaaltabel voor de lijst van materialen die in dit protocol worden gebruikt en tabel 1 voor de samenstelling van de in dit protocol gebruikte oplossingen en media.
1. ZFL- en ZEM2S-cellen voorbereiden
- Begin met een T75-kolf van ZFL- of ZEM2S-cellen met 80% confluentie, gekweekt in het betreffende volledige medium bij 28 °C zonder CO2.
- Haal het kweekmedium uit de kolf en was de cellen door toevoeging van 10 ml 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) (0,01 M). Voeg 3 ml 1x trypsine (0,05% v/v; 0,5 mM trypsine-EDTA) toe aan de kweekkolven. Incubeer bij 28 °C gedurende 3 min.
- Tik zachtjes op de kolf om de cellen vrij te maken en stop vervolgens de trypsinevertering door 3 ml volledig kweekmedium aan de kolf toe te voegen.
- Breng de celsuspensie over in een conische centrifugebuis van 15 ml en centrifugeer gedurende 5 minuten op 100 × g .
- Verwijder na het centrifugeren voorzichtig het supernatant, voeg 1 ml volledig medium toe voor ZFL- of ZEM2S-cellen en resuspensie van de pellet met behulp van een micropipette.
2. Celtelling door trypan blauwe kleurstofuitsluiting
- Voeg 10 μL van de celsuspensie en 10 μL trypanblauwe kleurstof toe aan een microbuis om de cellen te tellen en hun levensvatbaarheid te evalueren. Meng de celsuspensie en verf met behulp van een pipet.
- Breng vervolgens 10 μL van dit mengsel (celsuspensie + trypan blauw) over naar een Neubauer-kamer en tel de cellen in de vier grote vierkanten (kwadranten Q) die op de hoeken van de kamer zijn geplaatst, waarbij levensvatbare cellen worden beschouwd als cellen die geen trypanblauw opnemen. Bepaal het aantal levensvatbare cellen met behulp van vergelijking (1):
(1) - Bereken het uiteindelijke celnummer in de celsuspensie door het celnummer bepaald met behulp van vergelijking (1) te vermenigvuldigen met twee (de verdunningsfactor als gevolg van het gebruik van trypanblauw).
OPMERKING: Als alternatief kan een geautomatiseerd celtellingsysteem (bijv. een cytomeer met celtelling en levensvatbaarheidsfunctie) worden gebruikt.
(1)3. Celbeplating in 96-putplaten
- Bereken het celsuspensievolume dat nodig is om het aantal cellen te verkrijgen dat nodig is om de cytotoxiciteitstests uit te voeren. Het aantal levensvatbare cellen voor elke cellijn wordt hieronder aangegeven:
- Plaat 60.000 levensvatbare ZEM2S-cellen per put; gebruik dus voor de hele plaat zes miljoen cellen in 20 ml volledig medium (200 μL/put, 96-well plaat).
- Plaat 40.000 levensvatbare ZFL-cellen per put; gebruik dus voor de hele plaat vier miljoen cellen in 20 ml volledig medium (200 μL/put, 96-well plaat).
- Breng daarna het respectieve volume van de celsuspensie over naar een reagensreservoir (steriel) en vul met het volledige kweekmedium voor ZFL of ZEM2S tot 20 ml. Meng de oplossing met behulp van een meerkanaalspipet voorzichtig op en neer.
OPMERKING: Zorg ervoor dat u geen schuim of bubbels vormt. - Voeg 200 μL van de celsuspensie toe aan elke put van een transparante polystyreen 96-well plaat met behulp van de meerkanaals micropipette. Incubeer de platen bij 28 °C gedurende 24 uur.
OPMERKING: De plaat moet ten minste drie putjes zonder cellen hebben voor de blancocontrole en er mogen alleen volledige media aan deze putjes worden toegevoegd. Het randeffect (veroorzaakt door hogere verdamping in de randputten) komt vaak voor in 96-well plaattesten en kan de levensvatbaarheid van de cellen in de randputten van de plaat28 beïnvloeden. Dit effect kan hoger of lager zijn, afhankelijk van het merk en ontwerp28 van de 96-putplaat. Hoewel we geen verstoring van de celgroei / levensvatbaarheid voor ZFL en ZEM2S in de randputten hebben opgemerkt, raden we aan de plaat af te dichten met parafilm of zelfklevende afdichtingsfolie om dit effect te voorkomen, of de cellen alleen in de 60 binnenputten te kweken en de randputten met PBS te vullen.
4. Blootstelling van cellen aan teststof
- Gooi de gebruikte media voorzichtig uit de putten weg met behulp van een meerkanaals micropipette.
- Stel de cellen bloot aan het testen van chemicaliën in verschillende concentraties. Bereid de oplossingen van de concentraties van de teststof in de kweekmedia voor ZFL of ZEM2S zonder foetaal runderserum (FBS) (blootstellingsmedia). Voeg vervolgens 100 μL per put van deze oplossingen toe in technisch drievoud (d.w.z. drie putten/concentratie van de teststof).
- Plaats voor controles de controlegroepen op dezelfde plaat als de teststof in technische drievouden (drie putjes/controlegroep). Voeg voor de blancocontrole (B) dus 100 μL van de blootstellingsmedia in de celvrije putten toe, voor de negatieve controle (NC), voeg 100 μL van de blootstellingsmedia toe aan putten met cellen en stel voor de positieve controle (PC) de cellen bloot aan een oplossing van 1% Triton X-100 bereid in de blootstellingsmedia. In sommige gevallen moet een oplosmiddelcontrole (SC) in de plaat worden opgenomen, rekening houdend met een duidelijk niet-cytotoxische concentratie als uiteindelijke oplosmiddelconcentratie.
OPMERKING: Het wordt aanbevolen om 0,5% DMSO als oplosmiddel te gebruiken; DMSO kan tot 1% als oplosmiddel in deze cellijnen worden gebruikt zonder de cytotoxiciteitsdrempel van 10% gerelateerd aan de negatieve controle te overschrijden. - Incubeer de platen bij 28 °C gedurende 24 uur. Sluit de platen af met parafilm of zelfklevende afdichtingsfolie om verdamping van kweekmedium te voorkomen.
OPMERKING: Bepaalde chemische stoffen kunnen intrinsieke achtergrondabsorptie of fluorescentie hebben die de absorptie of fluorescentie van de indicatorkleurstof(en) kunnen verstoren (verbindingen met kleur kunnen bijvoorbeeld de absorptie beïnvloeden, serumalbumine29 en verbindingen die interfereren met reductie-enzymen30,31). In dit geval moet de plaat een extra controle bevatten door teststofoplossingen toe te voegen in de putten zonder cellen. Dit is om de mogelijke interferentie van de chemische zelfabsorptie/autofluorescentie met de kleurstoffen te verifiëren. Als interferentie wordt gedetecteerd, moet men evalueren of het kan worden uitgesloten om een juiste voorspelling van cytotoxiciteit te verkrijgen.
5. Cytotoxiciteitstests
OPMERKING: Bereid alle oplossingen volgens tabel 1. Alle hieronder beschreven stappen (figuur 1) worden uitgevoerd onder steriele omstandigheden. Het gebruik van een pipet om de blootstellingsmedia weg te gooien wordt niet aanbevolen, omdat de cellen na chemische behandeling gemakkelijk van de putten kunnen loskomen.
- AB en CFDA-AM assays
- Gooi na 24 uur blootstelling aan de teststof de blootstellingsmedia voorzichtig weg door de inhoud in een opvangbak te gieten.
- Was de plaat met 200 μL PBS. Verwijder de PBS voorzichtig door deze in een opvangbak te gieten om te voorkomen dat cellen verloren gaan.
- Voeg 100 μL per putje AB/CFDA-AM oplossing toe. Incubeer de plaat gedurende 30 minuten in het donker bij 28 °C.
- Meet de fluorescentie in een fluorescentieplaatlezer bij 530 nm (excitatie) en 595 nm (emissie) voor AB, en bij 493 nm (excitatie) en 541 nm (emissie) voor CFDA-AM.
- NR-test
OPMERKING: De stappen voor de NR-test worden onmiddellijk na de AB- en CFDA-AM-testen uitgevoerd (figuur 1).- Centrifugeer de NR-werkoplossing (40 μg/ml) bij 600 × g gedurende 10 minuten.
OPMERKING: Precipitatie van NR in de buis mag niet worden overgebracht op de platen. Dus, na centrifugatie van de NR-werkoplossing, verzamelt u het supernatant met behulp van een pipet zonder de NR-neerslag op te zuigen. Breng het supernatant over in een reagensreservoir. - Verwijder de AB/CFDA-AM-oplossing voorzichtig door de inhoud in een opvangbak te gieten.
- Voeg 100 μL per put van de NR-werkoplossing toe met behulp van een meerkanaals micropipette. Incubeer de plaat bij 28 °C gedurende 3 uur.
OPMERKING: Na de incubatie van 3 uur, observeer of NR-neerslag in de platen is opgetreden met behulp van een microscoop. NR-precipitaten kunnen de kwantificering van de levensvatbaarheid van de cel verstoren, dus ze mogen niet aanwezig zijn. - Verwijder de NR-oplossing voorzichtig door de inhoud in een opvangbak te gieten. Was de putjes door 150 μL PBS per put toe te voegen.
- Voeg 150 μL per put van de NR-extractieoplossing toe en incubeer de plaat gedurende 10 minuten op een plaatschudder om zachtjes te schudden. Meet de absorptie bij 540 nm in een plaatlezer.
OPMERKING: Een tweede uitlezing bij 690 nm moet worden uitgevoerd om eventuele achtergrondabsorptie van vingerafdrukken in de plaat uit te sluiten.
- Centrifugeer de NR-werkoplossing (40 μg/ml) bij 600 × g gedurende 10 minuten.
- MTT-test
OPMERKING: De MTT-bepaling moet afzonderlijk van de hierboven beschreven tests (in een nieuwe plaat) worden uitgevoerd (figuur 2).- Verwijder de belichtingsmedia voorzichtig door de inhoud in een opvangbak te gieten.
- Voeg 100 μL MTT-werkoplossing per put toe met behulp van een meerkanaals micropipette. Incubeer de plaat bij 28 °C gedurende 4 uur.
- Gooi de MTT-oplossing weg door de inhoud in een opvangbak te gieten.
- Voeg 100 μL per put DMSO toe om de formazankristallen te extraheren en incubeer de plaat gedurende 10 minuten op een plaatschudder. Meet de absorptie bij 570 nm met behulp van een plaatlezer.
OPMERKING: Een tweede uitlezing bij 690 nm moet worden uitgevoerd om eventuele achtergrondabsorptie van vingerafdrukken in de plaat uit te sluiten. Het is belangrijk op te merken dat teststoffen kunnen interfereren met MTT, dat moet worden geëvalueerd om de kwaliteit van de gegenereerde gegevens te waarborgen32. Hiervoor moeten celvrije putten met de testconcentraties en MTT (0,5 mg / ml) worden blootgesteld, gevolgd door incubatie om elke kleurverandering in de putten te observeren die de absorptie kan verhogen en tot valse levensvatbaarheidsresultaten kan leiden. Chemische stoffen die interageren met MTT moeten in deze test worden vermeden.
6. Berekening van de levensvatbaarheid/cytotoxiciteit van cellen
OPMERKING: De verkregen ruwe absorptie of fluorescentie wordt gebruikt om de levensvatbaarheid van de cellen te berekenen als een percentage dat verband houdt met de negatieve controle (voor teststoffen die rechtstreeks in blootstellingsmedia worden bereid) of de oplosmiddelcontrole (voor teststoffen bereid met oplosmiddelen, zoals DMSO). Voordat het levensvatbaarheidspercentage van de cel wordt bepaald, moeten de onbewerkte gegevens worden genormaliseerd door het lege besturingselement.
- Bereken de gemiddelde absorptie of fluorescentie voor elke concentratie van de teststof en elke controlegroep (drie putjes/behandeling).
- Om het levensvatbaarheidspercentage van de cel ten opzichte van de controle (negatief of oplosmiddel) te bepalen, gebruikt u vergelijking (2):
(2)
OPMERKING: Absorptie (abs) of fluorescentie (fluo) eenheden vertegenwoordigen het gemiddelde van absorptie of fluorescentie gemeten in de drie putten per concentratie; Leeg staat voor putten zonder cellen.
(2)Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 3 toont de platen van de AB-, CFDA-AM-, NR- en MTT-assays. Voor de AB-test (figuur 3A) vertonen de lege putten en putten met geen of een verminderd aantal levensvatbare cellen een blauwe kleur en een lage fluorescentie, terwijl de putten met een groot aantal levensvatbare cellen roze zijn en hoge fluorescentiewaarden vertonen als gevolg van de transformatie van resazurine (AB) in resorufine (roze substantie) door de levensvatbare cellen. Voor de CFDA-AM-test is er geen zichtbaar verschil in de kleur van de putten op de plaat; de fluorescentie is echter hoger in putten met levensvatbare cellen als gevolg van het vasthouden van CFDA-AM en de daaropvolgende omzetting in carboxyfluoresceïne (fluorescerende stof).
Voor de NR-bepaling (figuur 3B) moeten de blancoputten transparant zijn met zeer lage absorptiewaarden, aangezien er geen cellen zijn om de NR-kleurstof vast te houden. In sommige gevallen zijn de lege putten niet transparant, wat wijst op het optreden van NR-neerslag op de plaat; In dit geval moet dit niet als een geldig experiment worden beschouwd. Zeer cytotoxische concentraties van de teststoffen en PC zijn transparant of vertonen een zeer lichtroze kleur met lage absorptiewaarden, terwijl putten met levensvatbare cellen de NR-kleurstof behouden en een donkerroze kleur en hoge absorptiewaarden vertonen.
Voor de MTT-test (figuur 3C) moeten de blanco putten transparant zijn en een zeer lage absorptie hebben, omdat er geen cellen zijn om MTT om te zetten in formazan. Zeer cytotoxische concentraties van de teststoffen en PC zijn transparant of vertonen een zeer lichte violette kleur met lage absorptiewaarden, terwijl putten met levensvatbare cellen de MTT (geel) omzetten in formazan (violette substantie), met een donkerdere violette kleur met hoge absorptiewaarden.
Figuur 4A toont een representatieve grafiek van de levensvatbaarheid van cellen na de berekening, met behulp van de gemiddelden van fluorescentie- of absorptiewaarden per groep. De grafiek kan worden uitgezet met de invoer van levensvatbaarheidspercentagewaarden, berekend met behulp van de levensvatbaarheidsberekeningsformule die wordt gepresenteerd in protocolsectie 6, met behulp van gegevensanalysesoftware. De levensvatbaarheid van cellen die aan de SC worden blootgesteld, mag niet 10% lager zijn dan in de NC17. Het levensvatbaarheidspercentage van de cellen voor de teststoffen wordt berekend op basis van de NC of SC, afhankelijk van hun oplosbaarheid. In dit geval worden verschillende concentraties DMSO als teststof gebruikt en is de levensvatbaarheid van de cel gerelateerd aan NC, wat wordt gedefinieerd als 100% levensvatbaarheid.
De gegevens over de levensvatbaarheid van de cellen kunnen worden gebruikt om de halfmaximale remmende concentratie (IC50) van de teststoffen te berekenen door logaritmische transformatie, en geïnterpoleerde standaardcurve door niet-lineaire regressie na geschikte replicaties33,34,35. Figuur 4B toont de IC50, berekend op basis van het levensvatbaarheidspercentage in figuur 4A. De IC50 werd verkregen met ten minste drie technische replicaties en drie experimentele replicaten met behulp van nominale concentraties in de AB-test. De analyses werden uitgevoerd met vijf verschillende concentraties van de teststoffen; Afhankelijk van het type experiment kan echter een hoger aantal concentraties nodig zijn. Er worden bijvoorbeeld acht testconcentraties aanbevolen voor de bereikbepalingstest, die gewoonlijk wordt uitgevoerd om de uiteindelijke testconcentraties van een chemische stof voor een experiment te bepalen. Aangezien de levensvatbaarheidstests verschillende cytotoxiciteitseindpunten hebben, raden we aan de IC50 voor elke test afzonderlijk te berekenen om verschillen in gevoeligheid te identificeren die worden veroorzaakt door verschillende werkingsmechanismen van de chemische stoffen of verschillen in gevoeligheid tussen cellijnen. De verschillen in IC50-waarden van geteste chemicaliën in verschillende cellijnen kunnen ook variëren afhankelijk van het type kweekmedium dat wordt gebruikt, omdat verschillen in samenstelling gerelateerd aan eiwitten en lipiden van invloed kunnen zijn op de chemische biologische beschikbaarheid36. Bovendien kan de cytotoxiciteit van veel chemicaliën worden geëvalueerd door middel van deze testen. De IC50 van andere chemicaliën die zijn geëvalueerd in ZFL- en ZEM2S-cellijnen is weergegeven in figuur 4B-H.
Figuur 1: Schematisch protocol van de AB-, CFDA-AM- en NR-assays uitgevoerd in dezelfde 96-well plaat. Afkortingen: AB = Alamar Blue; CFDA-AM = 5-carboxyfluoresceïnediacetaat acetoxymethylester; NR = Neutraal Rood; PBS = fosfaat gebufferde zoutoplossing. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Schematisch protocol van de MTT-test uitgevoerd in een 96-well plaat. Afkorting: MTT = 3-[4,5-dimethylthiazol-2yl]-2,5-difenyltetrazoliumbromide. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Representatieve resultaten van de AB-, CFDA-AM-, NR- en MTT-assays. De afbeeldingen tonen de kleurverschillen in de putten voor controles en testconcentraties in (A) AB en CFDA-AM, (B) NR en (C) MTT assays. Afkortingen: AB = Alamar Blue; CFDA-AM = 5-carboxyfluoresceïnediacetaat acetoxymethylester; NR = Neutraal Rood; PBS = fosfaat gebufferde zoutoplossing; B = lege putten (celvrije putten); SC = oplosmiddelcontrole (0,5% DMSO); NC = negatieve controle (cellen in kweekmedium); PC = positieve controle (1% Triton X-100). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Berekening van gegevens over de levensvatbaarheid en levensvatbaarheid van cellen voor verschillende teststoffen. De berekening van de levensvatbaarheid van cellen met behulp van de uitleesgegevens kan worden uitgedrukt als het percentage (%) van de levensvatbaarheid van de cel gerelateerd aan de NC of SC (A). De cytotoxiciteit van een chemische stof kan worden beoordeeld door de levensvatbaarheidsgegevens te gebruiken om een standaardcurve te interpoleren door niet-lineaire regressie voor verschillende teststoffen (B-H). De gegevens worden weergegeven als gemiddelde van de levensvatbaarheid van cellen (dots) en standaarddeviatie (staven) van drie technische replicaties en drie experimentele replicaties (AB-assay). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: MTT-test uitgevoerd in ZFL- en ZEM2S-cellen gekweekt in aanwezigheid (10%) en afwezigheid (0%, volledig FBS-beroofd) van FBS gedurende 24 uur. (A) ZFL-cellen met 0% en 10% FBS vertonen geen significant verschil in levensvatbaarheid van cellen door kruskall-wallis-test (p = 0,2286). (B) ZEM2S-cellen bij 0% en 10% FBS vertonen geen significant verschil in levensvatbaarheid van cellen door de Mann-Whitney-test (p = 0,3429). Er werd uitgegaan van een significantieniveau van p < 0,05. De gegevens worden uitgedrukt als mediaan- en interkwartielbereik van drie technische replicaties. Afkortingen: n.s. = geen significant verschil; FBS = foetaal runderserum; MTT = 3-[4,5-dimethylthiazol-2yl]-2,5-difenyltetrazoliumbromide. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: MTT- en NR-testen uitgevoerd in ZFL- en ZEM2S-cellen behandeld (24 uur) met DMSO in verschillende concentraties (0,1%, 0,5% en 1%) en negatieve controle. DMSO-behandelde ZFL-cellen bij elke geteste concentratie vertoonden geen significant verschil in levensvatbaarheid van cellen gerelateerd aan NC door de (A) MTT-test (p = 0,074) en (B) NR-assay (p = 0,216). DMSO-behandelde ZEM2S-cellen vertoonden geen significant verschil in cel levensvatbaarheid gerelateerd aan NC door de (C) MTT-test (p = 0,422) en (D) NR-assay (p = 0,287). Een significantieniveau van p < 0,05 in de Kruskall-Wallis-test werd overwogen. De gegevens worden uitgedrukt als mediaan- en interkwartielbereik van drie technische replicaties. Afkortingen: n.s. = geen significant verschil; NC = negatieve controle; MTT = 3-[4,5-dimethylthiazol-2yl]-2,5-difenyltetrazoliumbromide; NR = Neutraal Rood. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Tabel 1: Oplossingen en media die in dit protocol worden gebruikt. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Cytotoxiciteitstests worden veel gebruikt voor in vitro toxiciteitsevaluatie en dit protocolartikel presenteert vier veelgebruikte cytotoxiciteitstests die zijn aangepast om te worden uitgevoerd in zebraviscellijnen (d.w.z. celdichtheid voor 96-putplaat, incubatietijd in de MTT-test, FBS-depletie tijdens de chemische blootstellingsconditie en maximaal aanvaardbare concentratie voor de SC). Aangezien deze testen cytotoxiciteit kwantificeren door verschillende eindpunten van de levensvatbaarheid van cellen (metabole functie, lysosomale membraanintegriteit en celmembraanintegriteit), biedt de combinatie daarvan een nauwkeurige evaluatie van chemische cytotoxiciteit in zebraviscellijnen. Dit protocol beveelt ook de cultuur van ZFL- en ZEM2S-cellijnen aan in een CO2-vrije toestand, vanwege hun kweekmediasamenstelling die het kweeksysteem adequaat kan bufferen en de pH op 7,4 (fysiologische pH) kan houden. De samenstelling van de kweekmedia en de CO2-vrije omgeving die in dit protocol voor beide cellijnen wordt voorgesteld, worden breed gerapporteerd in de literatuur. De ZFL-cellijn wordt meestal gekweekt in L-15- en RPMI-media met of zonder toevoeging van natriumbicarbonaat en zonder CO2 37,38,39,40,41,42,43. Ondertussen wordt de ZEM2S-cellijn gekweekt volgens de instructies van het bioresourcecentrum en zijn de kweekmedia geformuleerd voor CO2-vrije culturen; CO2 en luchtmengsel kunnen dus schadelijk zijn voor cellen bij gebruik van dit type kweekmedia44.
De chemische blootstelling in een kweekmedium zonder toevoeging van FBS werd uitgevoerd op basis van gepubliceerde studies, waaruit bleek dat de biologische beschikbaarheid van de chemische stoffen in in vitro assays significant wordt beïnvloed door hun binding aan serumeiwitten. Chen et al.45 toonden bijvoorbeeld aan dat de aanwezigheid van serumeiwitten in de RTgill-W1-test de biologische beschikbaarheid van een kationische oppervlakteactieve stof (C12-benzalkonium) tot drieënhalf keer kon verminderen. De aan FBS gebonden chemische stof varieerde over het algemeen van 47% tot 90% in het kweekmedium45. Om dit probleem te voorkomen, evalueerden we de levensvatbaarheid van ZFL- en ZEM2S-cellen in culturen die volledig verstoken waren van FBS gedurende 24 uur met behulp van de MTT-test. De resultaten toonden geen significant verschil in levensvatbaarheid van cellen van ZFL- of ZEM2S-culturen met (10%) en zonder (0%) FBS, wat aangeeft dat deze zebraviscellijnen kunnen worden onderworpen aan chemische behandeling in kweekmedia zonder FBS (figuur 5). Het is belangrijk om te benadrukken dat het verminderen van de hoeveelheid FBS andere gevolgen kan hebben voor de biologische beschikbaarheid van chemicaliën. Lipofiele chemicaliën hebben bijvoorbeeld een hogere sorptie op plastic labware en platen, waardoor de biologische beschikbaarheid van chemicaliën wordt verminderd36. De aanwezigheid van FBS in kweekmedium kan echter de plasticbinding verminderen omdat serumbestanddelen concurreren met het plastic voor binding aan de chemicaliën46. De beste beslissing met betrekking tot het percentage FBS-suppletie of de volledige deprivatie ervan kan afhangen van het type teststof. Pomponio et al.46 meldden bijvoorbeeld dat hoewel de chemische amiodaron een hogere binding aan plastic heeft in afwezigheid van FBS, de biologische beschikbaarheid nog lager is bij gebruik van 10% FBS. Voor mono-N-desethylamiodaron is bijna dezelfde hoeveelheid gebonden aan het serummedium en aan de wanden46.
Organische oplosmiddelen (bijv. DMSO) worden over het algemeen aanbevolen om tot 0,5% te worden gebruikt in in vitro assays. Deze lage concentratie kan echter het testen van hogere concentraties van slechte in water oplosbare chemicaliën belemmeren. Om dit probleem te voorkomen, evalueerden we of hogere concentraties DMSO geschikt waren voor ZFL- en ZEM2S-cellijnen die de cytotoxiciteitsdrempel van 10% niet overschreden. Hiervoor werden niet-behandelde cellen (NC's) en cellen behandeld (24 uur) met verschillende concentraties DMSO (0,1%, 0,5% en 1%) verwerkt voor de MTT- en NR-assays. De resultaten toonden geen significant verschil in levensvatbaarheid van de cellen ten opzichte van de behandelingsgroep in vergelijking met NC's (figuur 6), wat aangeeft dat, onder deze specifieke omstandigheden, concentraties van DMSO tot 1% kunnen worden gebruikt. Andere viscellijnen ondersteunen ook DMSO-concentraties hoger dan 0,5%, wat geen bijzonderheid is van ZFL- en ZEM2S-cellijnen. Maximale oplosmiddelconcentraties tot 2% DMSO (zonder cytotoxisch effect waargenomen) zijn bijvoorbeeld toegepast in cytotoxiciteitstests met CHSE-214 (cellijn afgeleid van Oncorhynchus tshawytscha embryo)47, RTG-2 (Oncorhynchus mykiss gonadale cellijn)48,49,50 en PLHC-1 (Poeciliopsis lucida hepatocellulair carcinoom cellijn)48 Cellen. De maximale oplosmiddelconcentratie van 1% DMSO is ook gebruikt in cytotoxiciteitstests met RTL-W1 (Oncorhynchus mykiss gonadale cellijn)51 en CCO (Ictalurus punctatus ovariumcellijn)52 cellen. Volgens Mori en Wakabayashi47 kunnen viscellijnen een lagere gevoeligheid voor DMSO hebben dan zoogdiercellijnen. Het is echter belangrijk om te benadrukken dat de maximaal aanvaardbare concentratie van 1% DMSO uitsluitend is gedefinieerd voor cytotoxiciteit, en dit moet zorgvuldig worden geëvalueerd voor andere eindpunten (bijv. Genotoxiciteit, epigenetica, eiwitcoderende genexpressieanalyse) in ZFL- en ZEM2S-cellijnen.
De MTT- en AB-testen zijn gebaseerd op metabole activiteit om de levensvatbaarheid van cellen te bepalen. Hoewel de MTT-test de meest gebruikte levensvatbaarheidstest is, kan deze in vergelijking met de AB-test iets minder gevoelig zijn, waardoor de levensvatbaarheid van de cel in sommige gevallen wordt overschat53. De hogere gevoeligheid van de AB-test kan verband houden met de meetmethode, omdat fluorescentiemeting gevoeliger is dan colorimetrische meting15. Niettemin zijn zowel de AB- als de MTT-assays hoogwaardige assays om cytotoxische chemische stoffen te identificeren, en hun gegenereerde gegevens zijn gebruikt om gevaarlijke chemische stoffen te classificeren op basis van hun intrinsieke cytotoxische potentieel53.
Het idee om de AB-, CFDA-AM- en NR-test in dezelfde plaat uit te voeren was gebaseerd op TG 249 (RTgill-W1-test)17 van de OESO; Er werden echter wijzigingen aangebracht om deze testen uit te voeren in 96-putplaten, en om geschikt te zijn voor zebraviscellijnen. Assays in 96-well platen, in plaats van 24-well platen, kunnen voordelig zijn voor high-throughput cytotoxiciteitstesten in viscellijnen. Bovendien gebruikt de RTgill-W1-test alleen L-15-kweekmedium, terwijl de ZFL- en ZEM2S-cellijnen worden gekweekt in een medium dat D-glucose bevat. Het kweekmedium maakt het mogelijk om de MTT-test in deze cellijnen uit te voeren, omdat cellijnen gekweekt in glucosevrij medium (bijv. Alleen L-15) de MTT-reductie in cellen onmiddellijk kunnen verminderen en de prestaties van deze testkunnen verminderen 54. Met dit protocol kunnen vier verschillende levensvatbaarheidstests eenvoudig worden uitgevoerd in twee zebraviscellijnen.
Dit protocol kan worden gebruikt om de effecten van chemische stoffen op vissen te bestuderen met behulp van in vitro modellen. Verschillende cellijnen kunnen verschillende gevoeligheden hebben om chemische effecten te schatten, ook al behoren ze tot dezelfde groep gewervelde dieren, zoals vissen. Door bijvoorbeeld ZFL- en ZF4-cellijnen te vergelijken met visembryo's, toonden Langu-Mitea et al.21 aan dat ZFL in staat is om vergelijkbare resultaten te genereren in vergelijking met de toxiciteitstest voor visembryo's. Tanneberger et al.5 toonden aan dat de permanente viscellijnen GSF, PLHC, RTG-2, RTgill-W1 en R1 verschillende gevoeligheden hebben bij het voorspellen van chemische vistoxiciteit in vergelijking met in vivo (volwassen vissen). Hoewel RTgill-W1 (permanente viskieuwcellijn) onlangs werd gevalideerd als een alternatieve methode om acute toxiciteit bij vissen te voorspellen, moet de toepasbaarheid van andere cellijnen in ecotoxiciteitsstudies worden onderzocht. Het gebruik van cellijnen van verschillende vissoorten en weefseloorsprongen en ontwikkelingsstadia (ZEM2S: embryo; ZFL: volwassen lever) kan aanzienlijk bijdragen aan ecotoxiciteitsstudies, omdat het effecten kan aanpakken die verband houden met specifieke stadia van visontwikkeling en doelorganen. Chemische effecten moeten dus worden onderzocht met behulp van verschillende celculturen die verschillende doellocaties in vissen weerspiegelen (bijv. Lever, geslachtsklieren, kieuw, hersenen), en niet alleen in een enkele cellijn55.
Deze protocollen kunnen verschillende toepassingen hebben in ecotoxiciteitsstudies en het gebruik ervan is niet noodzakelijkerwijs beperkt tot het voorspellen van acute toxiciteit bij vissen. Ze kunnen bijvoorbeeld worden toegepast om subcytotoxische concentraties te definiëren om andere in vitro vistoxiciteitstests uit te voeren, zoals het evalueren van hormoonontregelende effecten op vissen. Daarnaast kunnen de in vitro cytotoxiciteitsgegevens ook helpen bij het ontwikkelen en verbeteren van fysiologisch gebaseerde toxicokinetische (PBTK) modellering. Aangezien PBTK zich richt op de verspreiding van een chemische stof in een organisme, rekening houdend met de verschillende organen (zoals de kieuw, lever of darm)56, kan het gebruik van cellijnen van verschillende vissoorten en weefseloorsprongen een nuttige bron van informatie zijn voor dit model. De resultaten van in vitro bioassays (bijv. cytotoxiciteitstests) leveren inputgegevens die biologische processen in het PBTK-model vertegenwoordigen en dragen bij aan in vitro naar in vivo extrapolatie21,56.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenverstrengeling.
Acknowledgments
Ter nagedachtenis aan Dr. Márcio Lorencini, een co-auteur van dit werk, een uitstekende onderzoeker op het gebied van cosmetica en toegewijd aan het bevorderen van cosmetisch onderzoek in Brazilië. De auteurs zijn dankbaar voor het Multi-user Laboratory in de afdeling Fysiologie (UFPR) voor de beschikbaarheid van apparatuur en voor de financiële steun van de Coördinatie voor de Verbetering van het Personeel van het Hoger Onderwijs (CAPES, Brazilië) (Finance Code 001) en de Grupo Boticario.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-CFDA, AM (5-Carboxyfluorescein Diacetate, Acetoxymethyl Ester) | Invitrogen | C1345 | |
| Cell culture plate, 96 well plate | Sarstedt | 83.3924 | Surface: Standard, flat base |
| DMEM | Gibco | 12800-017 | Powder, high glucose, pyruvate |
| FBS - Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions | Gibco | 12657-029 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mix, powder | Gibco | 21700026 | Powder |
| HEPES (1 M) | Gibco | 15630080 | |
| Leibovitz's L-15 Medium | Gibco | 41300021 | Powder |
| Neutral red | Sigma-Aldrich | N4638 | Powder, BioReagent, suitable for cell culture |
| Orbital shaker | Warmnest | KLD-350-BI | 22 mm rotation diameter |
| Dulbeccos PBS (10X) with calcium and magnesium | Invitrogen | 14080055 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| Resazurin sodium salt | Sigma-Aldrich | R7017 | Powder, BioReagent, suitable for cell culture |
| RPMI 1640 Medium | Gibco | 31800-014 | Powder |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | Powder, bioreagent for molecular biology |
| Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide 98% | Sigma-Aldrich | M2128 | |
| Trypan blue stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red | Gibco | 15400054 | |
| ZEM2S cell line | ATCC | CRL-2147 | This cell line was kindly donated by Professor Dr. Michael J. Carvan (University of Wisconsin, Milwaukee, USA) |
| ZFL cell line | BCRJ | 256 |
References
- ECHA. Non-Animal Approaches-Current Status of Regulatory Applicability Under the REACH, CLP and Biocidal Products Regulations. ECHA. , Available at <87ebb68f-2038-f597-fc33-f4003e9e7d7d (2017).
- Alternative Methods Accepted by US Agencies. National Toxicology Program, and US Department of Health and Human Services. , Available from: https://ntp.niehs.nih.gov/whatwestudy/niceatm/accept-methods/index.html (2022).
- Schirmer, K. Proposal to improve vertebrate cell cultures to establish them as substitutes for the regulatory testing of chemicals and effluents using fish. Toxicology. 224 (3), 163-183 (2006).
- Scholz, S., et al. Alternatives to in vivo tests to detect endocrine disrupting chemicals (EDCs) in fish and amphibians-screening for estrogen, androgen and thyroid hormone disruption. Critical Reviews in Toxicology. 43 (1), 45-72 (2013).
- Tanneberger, K., et al. Predicting fish acute toxicity using a fish gill cell line-based toxicity assay. Environmental Science & Technology. 47 (2), 1110-1119 (2013).
- Roesler, R., Lorencini, M., Pastore, G. Brazilian cerrado antioxidant sources: cytotoxicity and phototoxicity in vitro. Food Science and Technology. 30, 814-821 (2010).
- Ruyra, A., et al. Zebrafish liver (ZFL) cells are able to mount an anti-viral response after stimulation with Poly (I:C). Comparative Biochemistry and Physiology. Part B, Biochemistry & Molecular Biology. 182, 55-63 (2015).
- Natsch, A., Laue, H., Haupt, T., von Niederhäusen, V., Sanders, G. Accurate prediction of acute fish toxicity of fragrance chemicals with the RTgill-W1 cell assay. Environmental Toxicology and Chemistry. 37 (3), 931-941 (2018).
- Freshney, R. I.
- Mosmann, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. Journal of Immunological Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).
- O'Brien, J., Wilson, I., Orton, T., Pognan, F. Investigation of the Alamar Blue (resazurin) fluorescent dye for the assessment of mammalian cell cytotoxicity. European Journal of Biochemistry. 267 (17), 5421-5426 (2000).
- Gonzalez, R. J., Tarloff, J. B. Evaluation of hepatic subcellular fractions for Alamar blue and MTT reductase activity. Toxicology In Vitro. 15 (3), 257-259 (2001).
- Borenfreund, E., Puerner, J. A. Toxicity determined in vitro by morphological alterations and neutral red absorption. Toxicology Letters. 24 (2-3), 119-124 (1985).
- Repetto, G., del Peso, A., Zurita, J. L. Neutral red uptake assay for the estimation of cell viability/cytotoxicity. Nature Protocols. 3 (7), 1125-1131 (2008).
- Kamiloglu, S., Sari, G., Ozdal, T., Capanoglue, E. Guidelines for cell viability assays. Food Frontiers. 1 (3), 332-349 (2020).
- Water Quality-Determination of Acute Toxicity of Water Samples and Chemicals to a Fish Gill Cell Line (RTgill-W1) (ISO 21115:2019). International Organization for Standardization. , Available from: https://www.iso.org/standar/69933.html (2019).
- Organisation for Economic Co-operation and Development. Test Guideline No. 249: Fish Cell Line Acute Toxicity-The RTgill-W1 Cell Line Assay. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 2. Effects on Biotic Systems. , OECD Publishing. Paris. (2021).
- Lungu-Mitea, S., Lundqvist, J. Potentials and pitfalls of transient in vitro reporter bioassays: interference by vector geometry and cytotoxicity in recombinant zebrafish cell lines. Archives of Toxicology. 94 (8), 2769-2784 (2020).
- Lungu-Mitea, S., Han, Y., Lundqvist, J. Development, scrutiny, and modulation of transient reporter gene assays of the xenobiotic metabolism pathway in zebrafish hepatocytes. Cell Biology and Toxicology. , 1-23 (2021).
- Schirmer, K., Chan, A. G., Greenberg, B. M., Dixon, D. G., Bols, N. C. Methodology for demonstrating and measuring the photocytotoxicity of fluoranthene to fish cells in culture. Toxicology In Vitro. 11 (1-2), 107-119 (1997).
- Lungu-Mitea, S., et al. Modeling bioavailable concentrations in zebrafish cell lines and embryos increases the correlation of toxicity potencies across test systems. Environmental Science & Technology. 55 (1), 447-457 (2021).
- Cavalcante, D. G. S. M., et al. Cytotoxic, biochemical and genotoxic effects of biodiesel produced by different routes on ZFL cell line. Toxicology In Vitro. 28 (6), 1117-1125 (2014).
- Meng, Q., Yeung, K., Chan, K. M. Toxic effects of octocrylene on zebrafish larvae and liver cell line (ZFL). Aquatic Toxicology. 236, 105843 (2021).
- Kwok, M. L., Chan, K. M. Oxidative stress and apoptotic effects of copper and cadmium in the zebrafish liver cell line ZFL. Toxicology Reports. 7, 822-835 (2020).
- Yang, J., Chan, K. M. Evaluation of the toxic effects of brominated compounds (BDE-47, 99, 209, TBBPA) and bisphenol A (BPA) using a zebrafish liver cell line, ZFL. Aquatic Toxicology. 159, 138-147 (2015).
- Bradford, C. S., Sun, L., Collodi, P., Barnes, D. W. Cell cultures from zebrafish embryos and adult tissues. Journal of Tissue Culture Methods. 16 (2), 99-107 (1994).
- He, S., et al. Genetic and transcriptome characterization of model zebrafish cell lines. Zebrafish. 3 (4), 441-453 (2006).
- Mansoury, M., Hamed, M., Karmustaji, R., Al Hannan, F., Safrany, S. T. The edge effect: A global problem. The trouble with culturing cells in 96-well plates. Biochemistry and Biophysics Reports. 26, 100987 (2021).
- Funk, D., Schrenk, H. -H., Frei, E. Serum albumin leads to false-positive results in the XTT and the MTT assay. BioTechniques. 43 (2), 178 (2007).
- Dayeh, V. R., Bols, N. C., Tanneberger, K., Schirmer, K., Lee, L. E. J. The use of fish-derived cell lines for investigation of environmental contaminants: An update following OECD's fish toxicity testing framework no. 171. Current Protocols in Toxicology. 1, (2013).
- Stepanenko, A. A., Dmitrenko, V. V. Pitfalls of the MTT assay: Direct and off-target effects of inhibitors can result in over/underestimation of cell viability. Gene. 574 (2), 193-203 (2015).
- Ulukaya, E., Colakogullari, M., Wood, E. J. Interference by anti-cancer chemotherapeutic agents in the MTT-tumor chemosensitivity assay. Chemotherapy. 50 (1), 43-50 (2004).
- Sebaugh, J. L. Guidelines for accurate EC50/IC50 estimation. Pharmaceutical Statistics. 10 (2), 128-134 (2011).
- Weimer, M., et al. The impact of data transformations on concentration-response modeling. Toxicology Letters. 213 (2), 292-298 (2012).
- Green, J. W., Holbech, T. A., Henrik, Chapter 4: Analysis of Continuous Data (Regression). Statistical Analysis of Ecotoxicity Studies. , John Wiley & Sons, Inc. (2018).
- Proença, S., et al. Effective exposure of chemicals in in vitro cell systems: A review of chemical distribution models. Toxicology In Vitro. 73, 105133 (2021).
- Guidony, N. S., et al. ABC proteins activity and cytotoxicity in zebrafish hepatocytes exposed to triclosan. Environmental Pollution. 271, 116368 (2021).
- da Silva, N. D. G., et al. Interference of goethite in the effects of glyphosate and Roundup® on ZFL cell line. Toxicology In Vitro. 65, 104755 (2020).
- Yang, Y., et al. Temperature is a key factor influencing the invasion and proliferation of Toxoplasma gondii in fish cells. Experimental Parasitology. 217, 107966 (2020).
- Lopes, F. M., Sandrini, J. Z., Souza, M. M. Toxicity induced by glyphosate and glyphosate-based herbicides in the zebrafish hepatocyte cell line (ZF-L). Ecotoxicology and Environmental Safety. 162, 201-207 (2018).
- Lachner, D., Oliveira, L. F., Martinez, C. B. R. Effects of the water soluble fraction of gasoline on ZFL cell line: Cytotoxicity, genotoxicity and oxidative stress. Toxicology In Vitro. 30, 225-230 (2015).
- Morozesk, M., et al. Effects of multiwalled carbon nanotubes co-exposure with cadmium on zebrafish cell line: Metal uptake and accumulation, oxidative stress, genotoxicity and cell cycle. Ecotoxicology and Environmental Safety. 202, 110892 (2020).
- Dognani, G., et al. Nanofibrous membranes for low-concentration Cr VI adsorption: kinetic, thermodynamic and the influence on ZFL cells viability. Materials Research. , 24 (2021).
- ZEM2S (ATCC®CRL-2147™). American Type Culture Collection. , Available from: https://www.atcc.org/products/crl-2147 (2023).
- Chen, Y., et al. Acute toxicity of the cationic surfactant C12-benzalkonium in different bioassays: how test design affects bioavailability and effect concentrations. Environmental Toxicology and Chemistry. 33 (3), 606-615 (2014).
- Pomponio, G., et al. In vitro kinetics of amiodarone and its major metabolite in two human liver cell models after acute and repeated treatments. Toxicology In Vitro. 30, 36-51 (2015).
- Mori, M., Wakabayashi, M. Cytotoxicity evaluation of chemicals using cultured fish cells. Water Science and Technology. 42 (7-8), 277-282 (2000).
- Caminada, D., Escher, C., Fent, K. Cytotoxicity of pharmaceuticals found in aquatic systems: comparison of PLHC-1 and RTG-2 fish cell lines. Aquatic Toxicology. 79 (2), 114-123 (2006).
- Giltrap, M., et al. In vitro screening of organotin compounds and sediment extracts for cytotoxicity to fish cells. Environmental Toxicology and Chemistry. 30 (1), 154-161 (2011).
- Hollert, H., Duerr, M., Erdinger, L., Braunbeck, T. Cytotoxicity of settling particulate matter and sediments of the Neckar River (Germany) during a winter flood. Environmental Toxicology and Chemistry. 19 (3), 528-534 (2000).
- Pannetier, P., et al. Toxicity assessment of pollutants sorbed on environmental sample microplastics collected on beaches: Part I-adverse effects on fish cell line. Environmental Pollution. 248, 1088-1097 (2019).
- Ternjej, I., Srček, V. G., Mihaljević, Z., Kopjar, N. Cytotoxic and genotoxic effects of water and sediment samples from gypsum mining area in channel catfish ovary (CCO) cells. Ecotoxicology and Environmental Safety. 98, 119-127 (2013).
- Hamid, R., Rotshteyn, Y., Rabadi, L., Parikh, R., Bullock, P. Comparison of alamar blue and MTT assays for high throughput screening. Toxicology In Vitro. 18 (5), 703-710 (2004).
- Vistica, D. T., et al. Tetrazolium-based assays for cellular viability: a critical examination of selected parameters affecting formazan production. Cancer Research. 51 (10), 2515-2520 (1991).
- Knauer, K., Lampert, C., Gonzalez-Valero, J. Comparison of in vitro and in vivo acute fish toxicity in relation to toxicant mode of action. Chemosphere. 68 (8), 1435-1441 (2007).
- Stadnicka-Michalak, J., Tanneberger, K., Schirmer, K., Ashauer, R. Measured and modeled toxicokinetics in cultured fish cells and application to in vitro-in vivo toxicity extrapolation. PLoS One. 9 (3), 92303 (2014).
