Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

مقايسات السمية الخلوية مع خطوط خلايا الزرد

Published: January 6, 2023 doi: 10.3791/64860
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 2, 2, 1, 3, 2, 3
1Graduate Program in Genetics, Department of Genetics, Federal University of Paraná (UFPR), 2Safety of Product Department, Grupo Boticário, 3Department of Genetics, Federal University of Paraná (UFPR)

Summary

يقدم هذا البروتوكول مقايسات السمية الخلوية شائعة الاستخدام (مقايسات Alamar Blue [AB] ، CFDA-AM ، الأحمر المحايد ، و MTT) التي تم تكييفها لتقييم السمية الخلوية في جنين الزرد (ZEM2S) وخطوط خلايا الكبد (ZFL) في 96 لوحة بئر.

Abstract

أصبحت خطوط خلايا الأسماك تستخدم بشكل متزايد في دراسات السمية البيئية ، وتم اقتراح مقايسات السمية الخلوية كطرق للتنبؤ بالسمية الحادة للأسماك. وبالتالي ، يقدم هذا البروتوكول مقايسات السمية الخلوية المعدلة لتقييم صلاحية الخلية في جنين الزرد (Danio rerio) (ZEM2S) وخطوط خلايا الكبد (ZFL) في 96 لوحة بئر. نقاط نهاية السمية الخلوية التي تم تقييمها هي سلامة الميتوكوندريا (مقايسات Alamar Blue [AB] و MTT) ، وسلامة الغشاء عبر نشاط الإستراز (مقايسة CFDA-AM) ، وسلامة الغشاء الليزوزومي (مقايسة الأحمر المحايد [NR]). بعد التعرض لمواد الاختبار في لوحة 96 بئرا ، يتم إجراء فحوصات السمية الخلوية ؛ هنا ، يتم تنفيذ AB و CFDA-AM في وقت واحد ، متبوعا ب NR على نفس اللوحة ، بينما يتم إجراء اختبار MTT على لوحة منفصلة. يتم أخذ قراءات هذه المقايسات عن طريق مضان AB و CFDA-AM ، وامتصاص MTT و NR. يمكن استخدام مقايسات السمية الخلوية التي يتم إجراؤها باستخدام خطوط خلايا الأسماك هذه لدراسة السمية الحادة للمواد الكيميائية على الأسماك.

Introduction

يجب اختبار المواد الكيميائية فيما يتعلق بسلامتها لصحة الإنسان والبيئة. تم النظر بشكل متزايد في المؤشرات الحيوية الجزيئية والخلوية في تقييمات السلامة للتنبؤ بالتأثيرات على الكائنات الحية من قبل الوكالات التنظيمية و / أو التشريعات (على سبيل المثال ، REACH ، OECD ، US EPA)1,2 ، لأنها يمكن أن تسبق النتائج الضارة في الجسم الحي (على سبيل المثال ، اضطراب الغدد الصماء ، والاستجابة المناعية ، والسمية الحادة ، والسمية الضوئية)3،4،5،6،7 . في هذا السياق ، تم أخذ السمية الخلوية كقياس للتنبؤ بالسمية الحادة للأسماك 5,8 ؛ ومع ذلك ، يمكن أن يكون لها العديد من التطبيقات الأخرى في دراسات السمية البيئية ، مثل تحديد تركيزات المواد الكيميائية شبه السامة للخلايا لدراسة مجموعة آثارها الأكثر تنوعا على الأسماك (على سبيل المثال ، تأثيرات تعطيل الغدد الصماء).

في أنظمة زراعة الخلايا (في الأنظمة المختبرية ) ، يمكن تحديد السمية الخلوية للمواد الكيميائية بطرق مختلفة في أنواع نقاط النهاية. على سبيل المثال ، يمكن أن تستند طريقة السمية الخلوية إلى نقطة نهاية تتعلق بمورفولوجيا محددة لوحظت أثناء عملية موت الخلية ، بينما يمكن لطريقة أخرى تحديد السمية الخلوية عن طريق قياس موت الخلية ، وصلاحيتها ووظائفها ، والتشكل ، واستقلاب الطاقة ، وتعلق الخلية وتكاثرها. يمكن أن تؤثر المواد الكيميائية على صلاحية الخلية من خلال آليات مختلفة ، وبالتالي فإن تقييم السمية الخلوية الذي يغطي نقاط نهاية مختلفة لصلاحية الخلية ضروري للتنبؤ بالتأثيرات الكيميائية9.

MTT و Alamar Blue (AB) هي فحوصات تحدد التأثيرات على صلاحية الخلية بناء على نشاط التمثيل الغذائي للخلية. يقوم اختبار MTT بتقييم نشاط إنزيم الميتوكوندريا سكسينات ديهيدروجيناز10. يحدث اختزال بروميد 3- [4،5-ثنائي ميثيل ثيازول-2yl] -2،5-ثنائي فينيل تيترازوليوم (MTT) إلى اللون الأزرق الفورمازان فقط في الخلايا القابلة للحياة ، وتتناسب كثافته البصرية طرديا مع عدد الخلايا القابلة للحياة10. اختبار AB هو مؤشر حساس لتقليل الأكسدة ، بوساطة إنزيمات الميتوكوندريا التي تتألق وتغير لونها عند تقليل resazurin إلى resorufin بواسطة الخلايا الحية11 ؛ ومع ذلك ، تساهم الإنزيمات الخلوية والميكروسومية أيضا في تقليل AB و MTT12. قد تشمل هذه الإنزيمات العديد من الاختزالات، مثل مؤكسدات الكحول والألدهيد، NAD(P)H: كينون أوكسيدوريدوكتاز، اختزال الفلافين، نازعة هيدروجين NADH، والسيتوكرومات11.

مقايسة الأحمر المحايد (NR) هي مقايسة صلاحية الخلية بناء على دمج هذه الصبغة في الجسيمات الحالة للخلايا القابلة للحياة13. يعتمد امتصاص NR على قدرة الخلايا على الحفاظ على تدرجات الأس الهيدروجيني. يحافظ تدرج البروتون داخل الجسيمات الحالة على درجة حموضة أقل من السيتوبلازم. عند درجة الحموضة الفسيولوجية الطبيعية ، يقدم NR شحنة صافية تبلغ صفرا تقريبا ، مما يمكنه من اختراق أغشية الخلايا. وبالتالي ، تصبح الصبغة مشحونة ويتم الاحتفاظ بها داخل الليزوزومات. وبالتالي ، كلما زادت كمية NR المحتفظ بها ، زاد عدد الخلايا القابلة للحياة14. المواد الكيميائية التي تلحق الضرر بسطح الخلية أو الأغشية الليزوزومية تضعف امتصاص هذه الصبغة.

مقايسة CFDA-AM هي مقايسة صلاحية خلية فلورومترية تعتمد على الاحتفاظ ب 5-كربوكسي فلوريسئين ثنائي أسيتات أسيتوكسي ميثيل استر (CFDA-AM)15. يتم تحويل 5-CFDA-AM ، ركيزة استراز ، إلى كربوكسي فلوريسئين ، وهي مادة فلورية قطبية وغير منفذة بواسطة أغشية الخلايا الحية15 ؛ وبالتالي ، يتم الاحتفاظ به في الجانب الداخلي لغشاء الخلية السليم ، مما يشير إلى خلايا قابلة للحياة.

في الآونة الأخيرة ، تم دمج ثلاثة مقايسات للسمية الخلوية (مقايسات CFDA-AM ، NR ، و AB) في إرشادات ISO (المنظمة الدولية للتوحيد القياسي) (ISO 21115: 2019) 16 وطريقة اختبار OECD (منظمة التعاون الاقتصادي والتنمية (OECD TG 249) لتقييم السمية الحادة للأسماك باستخدام خط خلايا RTgill-W1 (خط الخلية الدائم من تراوت قوس قزح [Oncorhynchus mykiss] الخيشومية) في 24 لوحة بئر17 . على الرغم من وجود طريقة قائمة على الخلايا للتنبؤ بالسمية الحادة للأسماك ، فقد تم استثمار الجهود في تطوير طرق مماثلة مع أنواع الأسماك الأخرى وزيادة إنتاجية الطريقة. تتضمن بعض الأمثلة تطوير خطوط خلايا ZFL المنقولة بجينات المراسل لمسارات سمية محددة18,19 ، واختبارات السمية الضوئية في خط خلية RTgill-W1 20 ، واستخدام خطوط خلايا ZFL و ZF4 (الخلايا الليفية الزرد المشتقة من أجنة عمرها يوم واحد) لتقييم السمية من خلال العديد من فحوصات السمية الخلوية21.

دانيو ريريو (الزرد) هو أحد أنواع الأسماك الرئيسية المستخدمة في دراسات السمية المائية. وبالتالي ، قد تكون الطرق القائمة على الخلايا مع خطوط خلايا الزرد لاختبار سمية الأسماك مفيدة للغاية. خط خلية ZFL هو خط خلايا الكبد الظهارية الزرد الذي يقدم الخصائص الرئيسية لخلايا متني الكبد ويمكنه استقلاب xenobiotics7،22،23،24،25. وفي الوقت نفسه ، فإن خط خلية ZEM2S هو خط خلايا ليفية جنينية من الزرد مشتق من مرحلة البلاستولا التي يمكن استخدامها للتحقيق في الآثار التنموية على الأسماك26،27. وبالتالي ، يصف هذا البروتوكول أربعة مقايسات للسمية الخلوية (مقايسات MTT و AB و NR و CFDA-AM) ، مع إجراء تعديلات مع خطوط خلايا ZFL و ZEM2S في 96 لوحة بئر.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ملاحظة: انظر جدول المواد للحصول على قائمة المواد المستخدمة في هذا البروتوكول والجدول 1 لمعرفة تركيبة المحاليل والوسائط المستخدمة في هذا البروتوكول.

1. تحضير خلايا ZFL و ZEM2S

  1. ابدأ بقارورة T75 من خلايا ZFL أو ZEM2S مع التقاء 80٪ ، مستزرعة في الوسط الكامل المعني عند 28 درجة مئوية بدون ثاني أكسيد الكربون2.
  2. قم بإزالة وسط الاستزراع من القارورة واغسل الخلايا بإضافة 10 مل من 1x محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) (0.01 م). أضف 3 مل من 1x تربسين (0.05٪ v / v ؛ 0.5 mM trypsin-EDTA) إلى قوارير الاستزراع. احتضان في 28 درجة مئوية لمدة 3 دقائق.
  3. اضغط برفق على القارورة لتحرير الخلايا ، ثم أوقف هضم التربسين بإضافة 3 مل من وسط الاستزراع الكامل إلى القارورة.
  4. انقل تعليق الخلية إلى أنبوب طرد مركزي مخروطي سعة 15 مل وجهاز طرد مركزي عند 100 × جم لمدة 5 دقائق.
  5. بعد الطرد المركزي ، قم بإزالة المادة الطافية بعناية ، وأضف 1 مل من الوسط الكامل لخلايا ZFL أو ZEM2S ، وأعد تعليق الحبيبات باستخدام ماصة دقيقة.

2. عد الخلايا عن طريق استبعاد صبغة التريبان الزرقاء

  1. أضف 10 ميكرولتر من معلق الخلية و 10 ميكرولتر من صبغة التريبان الزرقاء إلى أنبوب دقيق لحساب الخلايا وتقييم صلاحيتها. امزج تعليق الخلية وصبغها باستخدام ماصة.
  2. بعد ذلك ، انقل 10 ميكرولتر من هذا الخليط (تعليق الخلية + تريبان الأزرق) إلى غرفة نيوباور وعد الخلايا في المربعات الأربعة الكبيرة (Quadrants Q) الموضوعة في زوايا الغرفة ، مع الأخذ في الاعتبار أن الخلايا القابلة للحياة هي تلك التي لا تمتص التريبان الأزرق. حدد عدد الخلايا القابلة للحياة باستخدام المعادلة (1):
    Equation 1 (1)
  3. احسب رقم الخلية النهائي في تعليق الخلية بضرب رقم الخلية المحدد باستخدام المعادلة (1) في اثنين (عامل التخفيف بسبب استخدام التريبان الأزرق).
    ملاحظة: بدلا من ذلك ، يمكن استخدام نظام عد الخلايا الآلي (على سبيل المثال ، cytomer مع وظيفة عد الخلايا وقابليتها للحياة).

3. طلاء الخلايا في لوحات 96 بئر

  1. احسب حجم تعليق الخلية اللازم للحصول على عدد الخلايا المطلوبة لإجراء مقايسات السمية الخلوية. يشار أدناه إلى عدد الخلايا القابلة للحياة لكل خط خلية:
    1. لوحة 60000 خلية ZEM2S قابلة للحياة لكل بئر ؛ وبالتالي ، بالنسبة للوحة بأكملها ، استخدم ستة ملايين خلية في 20 مل من الوسط الكامل (200 ميكرولتر / بئر ، لوحة 96 بئر).
    2. لوحة 40000 خلية ZFL قابلة للحياة لكل بئر ؛ وبالتالي ، بالنسبة للوحة بأكملها ، استخدم أربعة ملايين خلية في 20 مل من الوسط الكامل (200 ميكرولتر / بئر ، لوحة 96 بئر).
  2. بعد ذلك ، قم بنقل الحجم المعني لتعليق الخلية إلى خزان كاشف (معقم) واملأه بوسط الاستزراع الكامل ل ZFL أو ZEM2S إلى 20 مل. باستخدام ماصة متعددة القنوات ، امزج المحلول برفق لأعلى ولأسفل.
    ملاحظة: احرص على عدم تشكيل رغوة أو فقاعات.
  3. أضف 200 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى كل بئر من لوحة البوليسترين الشفافة ذات 96 بئرا باستخدام الماصة الدقيقة متعددة القنوات. احتضان الألواح عند 28 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
    ملاحظة: يجب أن تحتوي اللوحة على ثلاثة آبار على الأقل بدون خلايا للتحكم الفارغ ، ويجب إضافة الوسائط الكاملة فقط إلى هذه الآبار. يحدث تأثير الحافة (الناجم عن التبخر العالي في آبار الحافة) بشكل شائع في مقايسات صفيحة 96 بئرا ويمكن أن يؤثر على صلاحية الخلايا في آبار حافة اللوحة28. يمكن أن يكون هذا التأثير أعلى أو أقل اعتمادا على العلامة التجارية للوحة 96 بئرا والتصميم28. على الرغم من أننا لم نلاحظ أي اضطراب في نمو الخلايا / صلاحيتها ل ZFL و ZEM2S في آبار الحافة ، فإننا نقترح إغلاق اللوحة ببارافيلم أو رقائق مانعة للتسرب لاصقة لمنع هذا التأثير ، أو زراعة الخلايا فقط في 60 بئرا داخليا وملء آبار الحافة ب PBS.

4. تعرض الخلايا لاختبار المواد الكيميائية

  1. تخلص بعناية من الوسائط المستهلكة من الآبار باستخدام ماصة صغيرة متعددة القنوات.
  2. تعريض الخلايا لاختبار المواد الكيميائية بتركيزات مختلفة. تحضير محاليل اختبار التركيزات الكيميائية في أوساط الاستزراع ل ZFL أو ZEM2S بدون مصل بقري جنيني (FBS) (وسائط التعرض). ثم أضف 100 ميكرولتر لكل بئر من هذه المحاليل في ثلاث نسخ تقنية (أي ثلاثة آبار / اختبار التركيز الكيميائي).
  3. بالنسبة لعناصر التحكم ، ضع مجموعات التحكم على نفس اللوحة مثل مادة الاختبار الكيميائية في ثلاث نسخ تقنية (ثلاثة آبار / مجموعة تحكم). وبالتالي ، بالنسبة للتحكم الفارغ (B) ، أضف 100 ميكرولتر من وسائط التعرض في الآبار الخالية من الخلايا ، وللتحكم السلبي (NC) ، أضف 100 ميكرولتر من وسائط التعرض إلى الآبار ذات الخلايا ، وللتحكم الإيجابي (PC) ، قم بتعريض الخلايا لمحلول 1٪ Triton X-100 المحضر في وسائط التعرض. في بعض الحالات ، يجب تضمين التحكم في المذيبات (SC) في اللوحة ، مع الأخذ في الاعتبار التركيز غير السام للخلايا بشكل واضح كتركيز نهائي للمذيب.
    ملاحظة: يوصى باستخدام 0.5٪ DMSO كمذيب ؛ يمكن استخدام DMSO بنسبة تصل إلى 1٪ كمذيب في خطوط الخلايا هذه دون تجاوز عتبة السمية الخلوية البالغة 10٪ المتعلقة بالتحكم السلبي.
  4. احتضان الألواح عند 28 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. قم بإغلاق الألواح بورق بارافيلم أو رقائق لاصقة لمنع تبخر وسط الثقافة.
    ملاحظة: قد تحتوي بعض المواد الكيميائية على امتصاص داخلي للخلفية أو مضان قد يتداخل مع امتصاص أو مضان صبغة (صبغات) المؤشر (على سبيل المثال ، قد تؤثر المركبات ذات اللون على الامتصاص ، وألبومين المصل29 ، والمركبات التي تتداخل مع إنزيمات الاختزال30،31). في هذه الحالة ، يجب أن تتضمن اللوحة تحكما إضافيا عن طريق إضافة محاليل كيميائية للاختبار في الآبار بدون خلايا. هذا للتحقق من التداخل المحتمل للامتصاص الذاتي الكيميائي / التألق الذاتي مع الأصباغ. إذا تم الكشف عن التداخل ، ينبغي للمرء أن يقيم ما إذا كان يمكن استبعاده للحصول على التنبؤ الصحيح للسمية الخلوية.

5. مقايسات السمية الخلوية

ملاحظة: قم بإعداد جميع الحلول وفقا للجدول 1. يتم تنفيذ جميع الخطوات الموضحة أدناه (الشكل 1) في ظل ظروف معقمة. لا ينصح باستخدام ماصة للتخلص من وسائط التعرض ، لأن الخلايا يمكن أن تنفصل بسهولة عن الآبار بعد المعالجة الكيميائية.

  1. مقايسات AB و CFDA-AM
    1. بعد 24 ساعة من التعرض للمواد الكيميائية الاختبارية ، تخلص بعناية من وسائط التعريض عن طريق سكب المحتوى في درج التجميع.
    2. اغسل اللوحة ب 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني. قم بإزالة PBS بعناية عن طريق سكبه في صينية تجميع لتجنب فقدان الخلايا.
    3. أضف 100 ميكرولتر لكل بئر من محلول AB / CFDA-AM. احتضان الطبق لمدة 30 دقيقة في الظلام عند 28 درجة مئوية.
    4. قم بقياس التألق في قارئ لوحة مضان عند 530 نانومتر (إثارة) و 595 نانومتر (انبعاث) ل AB ، وعند 493 نانومتر (إثارة) و 541 نانومتر (انبعاث) ل CFDA-AM.
  2. مقايسة NR
    ملاحظة: يتم تنفيذ خطوات اختبار NR مباشرة بعد مقايسات AB و CFDA-AM (الشكل 1).
    1. جهاز طرد مركزي حل عمل NR (40 ميكروغرام / مل) عند 600 × جم لمدة 10 دقائق.
      ملاحظة: يجب عدم نقل ترسيب NR في الأنبوب إلى الألواح. وهكذا ، بعد الطرد المركزي لحل العمل NR ، اجمع المادة الطافية باستخدام ماصة دون استنشاق رواسب NR. نقل الطافية إلى خزان الكاشف.
    2. قم بإزالة محلول AB / CFDA-AM بعناية عن طريق سكب المحتوى في درج التجميع.
    3. أضف 100 ميكرولتر لكل بئر من حل العمل NR باستخدام ماصة دقيقة متعددة القنوات. احتضان اللوحة عند 28 درجة مئوية لمدة 3 ساعات.
      ملاحظة: بعد الحضانة لمدة 3 ساعات ، لاحظ ما إذا كان هطول الأمطار NR قد حدث في اللوحات باستخدام المجهر. قد تتداخل رواسب NR مع القياس الكمي لصلاحية الخلية ، وبالتالي ، لا ينبغي أن تكون موجودة.
    4. قم بإزالة محلول NR بعناية عن طريق سكب المحتوى في درج التجميع. اغسل الآبار بإضافة 150 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني لكل بئر.
    5. أضف 150 ميكرولتر لكل بئر من محلول استخراج NR واحتضن اللوحة على شاكر لوحة لمدة 10 دقائق للرج برفق. قم بقياس الامتصاص عند 540 نانومتر في قارئ اللوحة.
      ملاحظة: يجب إجراء قراءة ثانية عند 690 نانومتر لاستبعاد أي امتصاص لبصمات الأصابع في الخلفية في اللوحة.
  3. مقايسة MTT
    ملاحظة: يجب إجراء اختبار MTT بشكل منفصل عن المقايسات الموضحة أعلاه (في لوحة جديدة) (الشكل 2).
    1. قم بإزالة وسائط التعريض الضوئي بعناية عن طريق سكب المحتوى في درج التجميع.
    2. أضف 100 ميكرولتر من محلول عمل MTT لكل بئر باستخدام ماصة دقيقة متعددة القنوات. احتضان اللوحة عند 28 درجة مئوية لمدة 4 ساعات.
    3. تجاهل حل MTT عن طريق سكب المحتوى في درج التجميع.
    4. أضف 100 ميكرولتر لكل بئر من DMSO لاستخراج بلورات الفورمازان ، واحتضان اللوحة على شاكر لوحة لمدة 10 دقائق. قم بقياس الامتصاص عند 570 نانومتر باستخدام قارئ اللوحة.
      ملاحظة: يجب إجراء قراءة ثانية عند 690 نانومتر لاستبعاد أي امتصاص لبصمات الأصابع في الخلفية في اللوحة. من المهم ملاحظة أن المواد الكيميائية الاختبارية قد تتداخل مع MTT ، والتي يجب تقييمها لضمان جودة البيانات التي تم إنشاؤها32. لهذا الغرض ، يجب تعريض الآبار الخالية من الخلايا التي تحتوي على تركيزات الاختبار و MTT (0.5 مجم / مل) ، تليها الحضانة لمراقبة أي تغيير في اللون في الآبار قد يزيد من الامتصاص ويؤدي إلى نتائج جدوى خاطئة. يجب تجنب المواد الكيميائية التي تتفاعل مع MTT في هذا الاختبار.

6. حساب صلاحية الخلية / السمية الخلوية

ملاحظة: يتم استخدام الامتصاص الخام أو التألق المكتسب لحساب صلاحية الخلية كنسبة مئوية تتعلق بالتحكم السلبي (لمواد الاختبار الكيميائية المحضرة مباشرة في وسائط التعرض) أو التحكم في المذيبات (لمواد الاختبار الكيميائية المحضرة باستخدام المذيبات ، مثل DMSO). قبل تحديد النسبة المئوية لصلاحية الخلية ، يجب تسوية البيانات الأولية بواسطة عنصر التحكم الفارغ.

  1. احسب متوسط الامتصاص أو التألق لكل اختبار تركيز كيميائي ومجموعة تحكم (ثلاثة آبار / معالجة).
  2. لتحديد النسبة المئوية لصلاحية الخلية بالنسبة للتحكم (سالب أو مذيب) ، استخدم المعادلة (2):
    Equation 2 (2)
    ملاحظة: تمثل وحدات الامتصاص (abs) أو التألق (fluo) متوسط الامتصاص أو التألق المقاس في الآبار الثلاثة لكل تركيز؛ فارغ يمثل الآبار بدون خلايا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يوضح الشكل 3 لوحات مقايسات AB و CFDA-AM و NR و MTT. بالنسبة لمقايسة AB (الشكل 3A) ، تظهر الآبار والآبار الفارغة التي لا تحتوي على خلايا قابلة للحياة أو عدد أقل منها اللون الأزرق ومضان منخفض ، في حين أن الآبار التي تحتوي على عدد كبير من الخلايا القابلة للحياة تكون وردية اللون وتقدم قيما فلورية عالية بسبب تحول resazurin (AB) إلى resorufin (مادة وردية) بواسطة الخلايا القابلة للحياة. بالنسبة لفحص CFDA-AM ، لا يوجد فرق واضح في لون الآبار على اللوحة ؛ ومع ذلك ، فإن التألق أعلى في الآبار التي تحتوي على خلايا قابلة للحياة بسبب الاحتفاظ ب CFDA-AM والتحويل اللاحق إلى كربوكسي فلوريسئين (مادة فلورية).

بالنسبة لمقايسة NR (الشكل 3B) ، يجب أن تكون الآبار الفارغة شفافة مع قيم امتصاص منخفضة للغاية نظرا لعدم وجود خلايا للاحتفاظ بصبغة NR. في بعض الحالات ، تكون الآبار الفارغة غير شفافة ، مما يشير إلى حدوث هطول الأمطار NR على اللوحة ؛ في هذه الحالة ، لا ينبغي اعتبار هذه تجربة صالحة. تكون التركيزات السامة للخلايا العالية للمواد الكيميائية للاختبار والكمبيوتر الشخصي شفافة أو تقدم لونا ورديا فاتحا جدا مع قيم امتصاص منخفضة ، بينما تحتفظ الآبار التي تحتوي على خلايا قابلة للحياة بصبغة NR وتقدم لونا ورديا داكنا وقيم امتصاص عالية.

بالنسبة لمقايسة MTT (الشكل 3C) ، يجب أن تكون الآبار الفارغة شفافة وذات امتصاص منخفض للغاية حيث لا توجد خلايا لتحويل MTT إلى فورمازان. تكون التركيزات شديدة السمية للخلايا للمواد الكيميائية للاختبار والكمبيوتر الشخصي شفافة أو تقدم لونا بنفسجيا فاتحا جدا مع قيم امتصاص منخفضة ، بينما تقوم الآبار التي تحتوي على خلايا قابلة للحياة بتحويل MTT (أصفر) إلى فورمازان (مادة بنفسجية) ، مما يوفر لونا بنفسجيا أغمق مع قيم امتصاص عالية.

يوضح الشكل 4 أ رسما تمثيليا لصلاحية الخلية بعد الحساب ، باستخدام متوسطات قيم التألق أو الامتصاص لكل مجموعة. يمكن رسم الرسم بإدخال قيم النسبة المئوية للجدوى ، محسوبة بواسطة صيغة حساب الجدوى المقدمة في قسم البروتوكول 6 ، باستخدام برنامج تحليل البيانات. يجب ألا تكون صلاحية الخلايا المعرضة ل SC أقل بنسبة 10٪ مما كانت عليه في NC17. يتم حساب النسبة المئوية لصلاحية الخلية للمواد الكيميائية الاختبارية المتعلقة ب NC أو SC ، اعتمادا على قابليتها للذوبان. في هذه الحالة ، يتم استخدام تركيزات مختلفة من DMSO كمادة اختبار وترتبط صلاحية الخلية ب NC ، والتي يتم تعريفها على أنها قابلية للحياة بنسبة 100٪.

يمكن استخدام بيانات صلاحية الخلية لحساب نصف التركيز المثبط الأقصى للمواد الكيميائية الاختبارية (IC50) عن طريق التحويل اللوغاريتمي ، والمنحنى القياسي المقحم عن طريق الانحدار غير الخطي بعد النسخ المتماثل المناسب33،34،35. يوضح الشكل 4B IC50 ، محسوبا من النسبة المئوية للصلاحية الموضحة في الشكل 4A. تم الحصول على IC50 مع ما لا يقل عن ثلاث مكررات تقنية وثلاث مكررات تجريبية باستخدام تركيزات اسمية في مقايسة AB. أجريت التحليلات بخمسة تركيزات مختلفة من مواد الاختبار. ومع ذلك ، قد تكون هناك حاجة إلى عدد أكبر من التركيزات اعتمادا على نوع التجربة. على سبيل المثال ، يوصى بثمانية تركيزات اختبار لاختبار تحديد المدى ، والذي يتم إجراؤه عادة لتحديد تركيزات الاختبار النهائية لمادة كيميائية للتجربة. نظرا لأن مقايسات الجدوى لها نقاط نهاية مختلفة للسمية الخلوية ، فإننا نوصي بحساب IC50 لكل اختبار يتم إجراؤه بشكل منفصل لتحديد الاختلافات في الحساسية الناتجة عن آليات العمل المختلفة للمواد الكيميائية أو الاختلافات في الحساسية بين خطوط الخلايا. قد تختلف الاختلافات في قيم IC50 للمواد الكيميائية المختبرة في خطوط الخلايا المختلفة اعتمادا على نوع وسيط الاستزراع المستخدم ، لأن الاختلافات في التركيب المتعلقة بالبروتينات والدهون يمكن أن تؤثر على التوافر البيولوجي الكيميائي36. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تقييم السمية الخلوية للعديد من المواد الكيميائية من خلال هذه المقايسات. يظهر IC50 للمواد الكيميائية الأخرى التي تم تقييمها في خطوط خلايا ZFL و ZEM2S في الشكل 4B-H.

Figure 1
الشكل 1: البروتوكول التخطيطي لمقايسات AB و CFDA-AM و NR التي يتم إجراؤها في نفس لوحة 96 بئرا. الاختصارات: AB = العمار الأزرق. CFDA-AM = 5-كربوكسي فلوريسئين ثنائي أسيتات أسيتوكسي ميثيل استر ؛ NR = أحمر محايد ؛ PBS = محلول ملحي مخزن بالفوسفات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: بروتوكول تخطيطي لمقايسة MTT يتم إجراؤه في لوحة 96 بئرا. اختصار: MTT = 3- [4،5-ثنائي ميثيل ثيازول-2yl] -2،5-بروميد ثنائي فينيل تيترازوليوم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: النتائج التمثيلية لمقايسات AB و CFDA-AM و NR و MTT. تظهر الصور اختلافات اللون في الآبار للضوابط وتركيزات الاختبار في (A) AB و CFDA-AM و (B) NR و (C) مقايسات MTT. الاختصارات: AB = العمار الأزرق. CFDA-AM = 5-كربوكسي فلوريسئين ثنائي أسيتات أسيتوكسي ميثيل استر ؛ NR = أحمر محايد ؛ PBS = محلول ملحي مخزن بالفوسفات ؛ B = آبار فارغة (آبار خالية من الخلايا) ؛ SC = التحكم في المذيبات (0.5٪ DMSO) ؛ NC = التحكم السلبي (الخلايا في وسط الثقافة) ؛ PC = التحكم الإيجابي (1٪ Triton X-100). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: حساب بيانات صلاحية الخلية وصلاحيتها لمواد الاختبار الكيميائية المختلفة. يمكن التعبير عن حساب صلاحية الخلية باستخدام بيانات القراءة كنسبة مئوية (٪) من صلاحية الخلية المتعلقة ب NC أو SC (A). يمكن تقييم السمية الخلوية للمادة الكيميائية باستخدام بيانات الجدوى لاستيفاء منحنى قياسي عن طريق الانحدار غير الخطي لمواد كيميائية اختبار مختلفة (B-H). يتم تمثيل البيانات كمتوسط لصلاحية الخلية (النقاط) والانحراف المعياري (الأشرطة) لثلاث مكررات تقنية وثلاث مكررات تجريبية (مقايسة AB). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: اختبار MTT الذي تم إجراؤه في خلايا ZFL و ZEM2S المزروعة في وجود (10٪) وغياب (0٪ ، محروم تماما من FBS) من FBS لمدة 24 ساعة. (أ) لا تظهر خلايا ZFL عند 0٪ و 10٪ FBS أي فرق كبير في صلاحية الخلية بواسطة اختبار Kruskall-Wallis (p = 0.2286). (ب) لا تظهر خلايا ZEM2S عند 0٪ و 10٪ FBS أي فرق كبير في صلاحية الخلية من خلال اختبار مان ويتني (p = 0.3429). تم النظر في مستوى دلالة p < 0.05. يتم التعبير عن البيانات كنطاق متوسط وربيعي لثلاث نسخ تقنية مكررة. الاختصارات: n.s. = لا يوجد فرق كبير ؛ FBS = مصل الجنين البقري ؛ MTT = 3- [4،5-ثنائي ميثيل ثيازول-2yl] -2،5-بروميد ثنائي فينيل تيترازوليوم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6: فحوصات MTT و NR التي أجريت في خلايا ZFL و ZEM2S المعالجة (24 ساعة) باستخدام DMSO بتركيزات مختلفة (0.1٪ و 0.5٪ و 1٪) والتحكم السلبي. لم تظهر خلايا ZFL المعالجة ب DMSO عند أي تركيز تم اختباره فرقا كبيرا في صلاحية الخلية المتعلقة ب NC بواسطة (A) مقايسة MTT (p = 0.074) و (B) مقايسة NR (p = 0.216). لم تظهر خلايا ZEM2S المعالجة ب DMSO فرقا كبيرا في صلاحية الخلية المتعلقة ب NC بواسطة مقايسة MTT (C = 0.422) و (D) مقايسة NR (p = 0.287). تم النظر في مستوى دلالة p < 0.05 في اختبار Kruskall-Wallis. يتم التعبير عن البيانات كنطاق متوسط وربيعي لثلاث نسخ تقنية مكررة. الاختصارات: n.s. = لا يوجد فرق كبير ؛ NC = السيطرة السلبية ؛ MTT = 3- [4،5-ثنائي ميثيل ثيازول-2yl] -2،5-بروميد ثنائي فينيل تيترازوليوم ؛ NR = أحمر محايد. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1: الحلول والوسائط المستخدمة في هذا البروتوكول. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

تستخدم مقايسات السمية الخلوية على نطاق واسع لتقييم السمية في المختبر ، وتقدم مقالة البروتوكول هذه أربعة مقايسات سمية خلوية شائعة الاستخدام معدلة ليتم إجراؤها في خطوط خلايا الزرد (أي كثافة الخلية للوحة 96 بئرا ، ووقت الحضانة في مقايسة MTT ، واستنفاد FBS أثناء حالة التعرض الكيميائي ، والتركيز الأقصى المقبول ل SC). نظرا لأن هذه المقايسات تحدد السمية الخلوية من خلال نقاط نهاية مختلفة لصلاحية الخلية (وظيفة التمثيل الغذائي ، وسلامة الغشاء الليزوزومي ، وسلامة غشاء الخلية) ، فإن الجمع بينها يوفر تقييما دقيقا للسمية الخلوية الكيميائية في خطوط خلايا الزرد. يوصي هذا البروتوكول أيضا بزراعة خطوط خلايا ZFL و ZEM2S في حالة خالية من ثاني أكسيد الكربون ، نظرا لتكوين وسائط الثقافة التي يمكن أن تحمي نظام الثقافة بشكل كاف ، مع الحفاظ على درجة الحموضة عند 7.4 (درجة الحموضة الفسيولوجية). تم الإبلاغ على نطاق واسع عن تكوين وسائط الثقافة والبيئة الخالية من CO2 المقترحة في هذا البروتوكول لكلا خطي الخلية في الأدبيات. عادة ما يتم استزراع خط خلية ZFL في وسائط L-15 و RPMI مع أو بدون إضافة بيكربونات الصوديوم وبدون CO237،38،39،40،41،42،43. وفي الوقت نفسه ، يتم استزراع خط خلايا ZEM2S وفقا لتعليمات مركز الموارد الحيوية ، ويتم صياغة وسائط الاستزراع الخاصة به للثقافات الخالية من ثاني أكسيد الكربون ؛ وبالتالي ، يمكن أن يكون CO2 وخليط الهواء ضارا بالخلايا عند استخدام هذا النوع من وسائط الثقافة44.

تم إجراء التعرض الكيميائي في وسط استزراع دون إضافة FBS بناء على الدراسات المنشورة ، مما يدل على أن التوافر البيولوجي للمواد الكيميائية في المقايسات المختبرية يتأثر بشكل كبير بارتباطها ببروتينات المصل. على سبيل المثال ، أظهر Chen et al.45 أن وجود بروتينات المصل في اختبار RTgill-W1 يمكن أن يقلل من التوافر البيولوجي لخافض التوتر السطحي الكاتيوني (C12-benzalkonium) حتى ثلاثة أضعاف ونصف. تراوحت المادة الكيميائية المرتبطة ب FBS بشكل عام من 47٪ إلى 90٪ في وسط الاستزراع45. وبالتالي ، لتجنب هذه المشكلة ، قمنا بتقييم صلاحية الخلية لخلايا ZFL و ZEM2S في الثقافات المحرومة تماما من FBS لمدة 24 ساعة باستخدام اختبار MTT. أظهرت النتائج عدم وجود فرق كبير في صلاحية الخلية من مزارع ZFL أو ZEM2S مع (10٪) وبدون (0٪) FBS ، مما يشير إلى أن خطوط خلايا الزرد هذه يمكن أن تخضع للمعالجة الكيميائية في وسط الاستزراع المحروم من FBS (الشكل 5). من المهم تسليط الضوء على أن تقليل كمية FBS قد يسبب عواقب أخرى في التوافر البيولوجي الكيميائي. على سبيل المثال ، المواد الكيميائية المحبة للدهون لديها امتصاص أعلى للأدوات والألواح المعملية البلاستيكية ، مما يقلل من التوافر البيولوجي الكيميائي36. ومع ذلك ، فإن وجود FBS في وسط الاستزراع يمكن أن يقلل من ارتباط البلاستيك بسبب مكونات المصل التي تتنافس مع البلاستيك للربط بالمواد الكيميائية46. قد يعتمد أفضل قرار يتعلق بنسبة مكملات FBS أو الحرمان الكامل منها على نوع المادة الكيميائية الاختبارية. على سبيل المثال ، أفاد Pomponio et al.46 أنه على الرغم من أن مادة الأميودارون الكيميائية لها ارتباط أعلى بالبلاستيك في غياب FBS ، إلا أن توافرها البيولوجي يكون أقل عند استخدام 10٪ FBS. بالنسبة إلى mono-N-desethylamiodarone ، ترتبط نفس الكمية تقريبا بوسط المصل والجدران46.

يوصى عموما باستخدام المذيبات العضوية (مثل DMSO) بنسبة تصل إلى 0.5٪ في المقايسات المختبرية. ومع ذلك ، فإن هذا التركيز المنخفض يمكن أن يضعف اختبار تركيزات أعلى من المواد الكيميائية الفقيرة القابلة للذوبان في الماء. لمنع هذه المشكلة ، قمنا بتقييم ما إذا كانت التركيزات الأعلى من DMSO مناسبة لخطوط خلايا ZFL و ZEM2S التي لا تتجاوز عتبة السمية الخلوية البالغة 10٪. لهذا ، تمت معالجة الخلايا غير المعالجة (NCs) والخلايا المعالجة (24 ساعة) بتركيزات مختلفة من DMSO (0.1٪ و 0.5٪ و 1٪) لمقايسات MTT و NR. أظهرت النتائج عدم وجود فرق كبير في صلاحية الخلية من مجموعة المعالجة مقارنة ب NCs (الشكل 6) ، مما يشير إلى أنه في ظل هذه الظروف الخاصة ، يمكن استخدام تركيزات DMSO تصل إلى 1٪. تدعم خطوط خلايا الأسماك الأخرى أيضا تركيزات DMSO أعلى من 0.5٪ ، وهي ليست خصوصية لخطوط خلايا ZFL و ZEM2S. على سبيل المثال ، تم تطبيق تركيزات المذيبات القصوى التي تصل إلى 2٪ DMSO (مع عدم ملاحظة أي تأثير سام للخلايا) في مقايسات السمية الخلوية باستخدام CHSE-214 (خط الخلية المشتق من جنين Oncorhynchus tshawytscha)47 ، RTG-2 (خط خلايا الغدد التناسلية Oncorhynchus mykiss)48،49،50 ، و PLHC-1 (خط خلايا سرطان الخلايا الكبدية Poeciliopsis lucida)48 خلايا. كما تم استخدام الحد الأقصى لتركيز المذيب بنسبة 1٪ DMSO في مقايسات السمية الخلوية باستخدام RTL-W1 (خط خلايا الغدد التناسلية Oncorhynchus mykiss)51 و CCO (خط خلايا المبيض Ictalurus punctatus)52 خلية. وفقا لموري وواكاباياشي47 ، قد يكون لخطوط خلايا الأسماك حساسية أقل ل DMSO من خطوط خلايا الثدييات. ومع ذلك ، من المهم تسليط الضوء على أن التركيز الأقصى المقبول ل 1٪ DMSO تم تعريفه حصريا للسمية الخلوية ، ويجب تقييم ذلك بعناية لنقاط النهاية الأخرى (على سبيل المثال ، السمية الجينية ، علم التخلق ، تحليل التعبير الجيني المشفر للبروتين) في خطوط خلايا ZFL و ZEM2S.

تعتمد مقايسات MTT و AB على النشاط الأيضي لتحديد صلاحية الخلية. على الرغم من أن مقايسة MTT هي أكثر مقايسة الجدوى استخداما ، إلا أنه بالمقارنة مع مقايسة AB ، يمكن أن يكون أقل حساسية قليلا ، ويبالغ في تقدير صلاحية الخلية في بعض الحالات53. قد تكون الحساسية العالية لمقايسة AB مرتبطة بطريقة القياس ، حيث أن القياس الفلوري أكثر حساسية من القياس اللوني15. ومع ذلك ، فإن كلا من مقايسات AB و MTT هي مقايسات عالية الجودة لتحديد المواد الكيميائية السامة للخلايا ، وقد تم استخدام بياناتها الناتجة لتصنيف المواد الكيميائية الخطرة وفقا لإمكاناتها السامة للخلاياالجوهرية 53.

استندت فكرة إجراء مقايسة AB و CFDA-AM و NR في نفس اللوحة إلى OECD TG 249 (مقايسة RTgill-W1)17; ومع ذلك ، تم إجراء تعديلات لإجراء هذه المقايسات في 96 لوحة بئر ، وكذلك لتكون مناسبة لخطوط خلايا الزرد. يمكن أن تكون المقايسات في لوحات 96 بئرا ، بدلا من لوحات 24 بئرا ، مفيدة لاختبار السمية الخلوية عالية الإنتاجية في خطوط خلايا الأسماك. بالإضافة إلى ذلك ، يستخدم اختبار RTgill-W1 وسط ثقافة L-15 فقط ، بينما يتم زراعة خطوط خلايا ZFL و ZEM2S في وسط يحتوي على D-glucose. يتيح وسط المزرعة إجراء مقايسة MTT في خطوط الخلايا هذه ، حيث أن خطوط الخلايا المزروعة في وسط خال من الجلوكوز (على سبيل المثال ، L-15 فقط) قد تقلل على الفور من انخفاض MTT في الخلايا وتضعف أداء هذا الفحص54. يسمح هذا البروتوكول بإجراء أربعة مقايسات جدوى مختلفة بسهولة في خطين لخلايا الزرد.

يمكن استخدام هذا البروتوكول لدراسة آثار المواد الكيميائية على الأسماك باستخدام النماذج في المختبر . قد يكون لخطوط الخلايا المختلفة حساسيات مختلفة لتقدير التأثيرات الكيميائية ، على الرغم من أنها من نفس المجموعة من الفقاريات ، مثل الأسماك. على سبيل المثال ، بمقارنة خطوط خلايا ZFL و ZF4 مع أجنة الأسماك ، أظهر Langu-Mitea et al.21 أن ZFL قادر على توليد نتائج مماثلة مقارنة باختبار سمية جنين الأسماك. أظهر Tanneberger et al.5 أن خطوط خلايا الأسماك الدائمة GSF و PLHC و RTG-2 و RTgill-W1 و R1 لها حساسيات مختلفة في التنبؤ بسمية الأسماك الكيميائية مقارنة بالجسم الحي (الأسماك البالغة). على الرغم من أن RTgill-W1 (خط الخلايا الخيشومية السمكية الدائمة) قد تم التحقق منه مؤخرا كطريقة بديلة للتنبؤ بالسمية الحادة للأسماك ، إلا أنه ينبغي التحقيق في إمكانية تطبيق خطوط الخلايا الأخرى في دراسات السمية البيئية. استخدام خطوط الخلايا من أنواع الأسماك المختلفة وأصول الأنسجة وكذلك مراحل النمو (ZEM2S: الجنين; ZFL: الكبد البالغ) قد يساهم بشكل كبير في دراسات السمية البيئية ، لأنه يمكن أن يعالج الآثار المتعلقة بمراحل محددة من نمو الأسماك والأعضاء المستهدفة. وبالتالي ، يجب التحقيق في التأثيرات الكيميائية باستخدام مزارع خلايا مختلفة تعكس مواقع مستهدفة مختلفة في الأسماك (على سبيل المثال ، الكبد ، الغدد التناسلية ، الخياشيم ، الدماغ) ، وليس فقط في خط خلية واحدة55.

يمكن أن يكون لهذه البروتوكولات تطبيقات مختلفة في دراسات السمية البيئية ، ولا يقتصر استخدامها بالضرورة على التنبؤ بالسمية الحادة للأسماك. على سبيل المثال ، يمكن تطبيقها لتحديد التركيزات شبه السامة للخلايا لإجراء اختبارات سمية الأسماك الأخرى في المختبر ، مثل تقييم الآثار المسببة لاضطرابات الغدد الصماء على الأسماك. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن تساعد بيانات السمية الخلوية في المختبر أيضا في تطوير وتحسين نمذجة الحركية السمية القائمة على الفسيولوجية (PBTK). نظرا لأن PBTK يركز على توزيع مادة كيميائية في كائن حي مع مراعاة الأعضاء المختلفة (مثل الخياشيم أو الكبد أو الأمعاء)56 ، فإن استخدام خطوط الخلايا من أنواع مختلفة من الأسماك وأصول الأنسجة يمكن أن يكون مصدرا مفيدا للمعلومات لهذا النموذج. توفر نتائج المقايسات الحيوية في المختبر (على سبيل المثال ، مقايسات السمية الخلوية) بيانات إدخال تمثل العمليات البيولوجية في نموذج PBTK وتساهم في استقراء في المختبر 21,56.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

Acknowledgments

في ذكرى الدكتور مارسيو لورينسيني ، مؤلف مشارك في هذا العمل ، باحث ممتاز في مجال مستحضرات التجميل ومكرس لتعزيز أبحاث التجميل في البرازيل. يعرب المؤلفون عن امتنانهم للمختبر متعدد المستخدمين في قسم علم وظائف الأعضاء (UFPR) لتوافر المعدات وللدعم المالي المقدم من التنسيق من أجل تحسين موظفي التعليم العالي (CAPES ، البرازيل) (قانون المالية 001) و Grupo Boticario.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5-CFDA, AM (5-Carboxyfluorescein Diacetate, Acetoxymethyl Ester) Invitrogen C1345
Cell culture plate, 96 well plate Sarstedt 83.3924 Surface: Standard, flat base
DMEM Gibco 12800-017 Powder, high glucose, pyruvate
FBS - Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions Gibco 12657-029
Ham's F-12 Nutrient Mix, powder Gibco 21700026 Powder
HEPES (1 M) Gibco 15630080
Leibovitz's L-15 Medium Gibco 41300021 Powder
Neutral red  Sigma-Aldrich N4638 Powder, BioReagent, suitable for cell culture
Orbital shaker  Warmnest KLD-350-BI 22 mm rotation diameter
Dulbeccos PBS (10X) with calcium and magnesium Invitrogen 14080055
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Gibco 15140122
Resazurin sodium salt  Sigma-Aldrich R7017 Powder, BioReagent, suitable for cell culture
RPMI 1640 Medium Gibco 31800-014 Powder
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S5761 Powder,  bioreagent for molecular biology
Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide  98% Sigma-Aldrich M2128
Trypan blue stain (0.4%) Gibco 15250-061
Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red Gibco 15400054
ZEM2S cell line ATCC CRL-2147 This cell line was kindly donated by Professor Dr. Michael J.
Carvan (University of Wisconsin, Milwaukee, USA)
ZFL cell line BCRJ 256

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. ECHA. Non-Animal Approaches-Current Status of Regulatory Applicability Under the REACH, CLP and Biocidal Products Regulations. ECHA. , Available at <87ebb68f-2038-f597-fc33-f4003e9e7d7d (2017).
  2. Alternative Methods Accepted by US Agencies. National Toxicology Program, and US Department of Health and Human Services. , Available from: https://ntp.niehs.nih.gov/whatwestudy/niceatm/accept-methods/index.html (2022).
  3. Schirmer, K. Proposal to improve vertebrate cell cultures to establish them as substitutes for the regulatory testing of chemicals and effluents using fish. Toxicology. 224 (3), 163-183 (2006).
  4. Scholz, S., et al. Alternatives to in vivo tests to detect endocrine disrupting chemicals (EDCs) in fish and amphibians-screening for estrogen, androgen and thyroid hormone disruption. Critical Reviews in Toxicology. 43 (1), 45-72 (2013).
  5. Tanneberger, K., et al. Predicting fish acute toxicity using a fish gill cell line-based toxicity assay. Environmental Science & Technology. 47 (2), 1110-1119 (2013).
  6. Roesler, R., Lorencini, M., Pastore, G. Brazilian cerrado antioxidant sources: cytotoxicity and phototoxicity in vitro. Food Science and Technology. 30, 814-821 (2010).
  7. Ruyra, A., et al. Zebrafish liver (ZFL) cells are able to mount an anti-viral response after stimulation with Poly (I:C). Comparative Biochemistry and Physiology. Part B, Biochemistry & Molecular Biology. 182, 55-63 (2015).
  8. Natsch, A., Laue, H., Haupt, T., von Niederhäusen, V., Sanders, G. Accurate prediction of acute fish toxicity of fragrance chemicals with the RTgill-W1 cell assay. Environmental Toxicology and Chemistry. 37 (3), 931-941 (2018).
  9. Freshney, R. I. Cytotoxicity. Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique. , (2005).
  10. Mosmann, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. Journal of Immunological Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).
  11. O'Brien, J., Wilson, I., Orton, T., Pognan, F. Investigation of the Alamar Blue (resazurin) fluorescent dye for the assessment of mammalian cell cytotoxicity. European Journal of Biochemistry. 267 (17), 5421-5426 (2000).
  12. Gonzalez, R. J., Tarloff, J. B. Evaluation of hepatic subcellular fractions for Alamar blue and MTT reductase activity. Toxicology In Vitro. 15 (3), 257-259 (2001).
  13. Borenfreund, E., Puerner, J. A. Toxicity determined in vitro by morphological alterations and neutral red absorption. Toxicology Letters. 24 (2-3), 119-124 (1985).
  14. Repetto, G., del Peso, A., Zurita, J. L. Neutral red uptake assay for the estimation of cell viability/cytotoxicity. Nature Protocols. 3 (7), 1125-1131 (2008).
  15. Kamiloglu, S., Sari, G., Ozdal, T., Capanoglue, E. Guidelines for cell viability assays. Food Frontiers. 1 (3), 332-349 (2020).
  16. Water Quality-Determination of Acute Toxicity of Water Samples and Chemicals to a Fish Gill Cell Line (RTgill-W1) (ISO 21115:2019). International Organization for Standardization. , Available from: https://www.iso.org/standar/69933.html (2019).
  17. Organisation for Economic Co-operation and Development. Test Guideline No. 249: Fish Cell Line Acute Toxicity-The RTgill-W1 Cell Line Assay. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 2. Effects on Biotic Systems. , OECD Publishing. Paris. (2021).
  18. Lungu-Mitea, S., Lundqvist, J. Potentials and pitfalls of transient in vitro reporter bioassays: interference by vector geometry and cytotoxicity in recombinant zebrafish cell lines. Archives of Toxicology. 94 (8), 2769-2784 (2020).
  19. Lungu-Mitea, S., Han, Y., Lundqvist, J. Development, scrutiny, and modulation of transient reporter gene assays of the xenobiotic metabolism pathway in zebrafish hepatocytes. Cell Biology and Toxicology. , 1-23 (2021).
  20. Schirmer, K., Chan, A. G., Greenberg, B. M., Dixon, D. G., Bols, N. C. Methodology for demonstrating and measuring the photocytotoxicity of fluoranthene to fish cells in culture. Toxicology In Vitro. 11 (1-2), 107-119 (1997).
  21. Lungu-Mitea, S., et al. Modeling bioavailable concentrations in zebrafish cell lines and embryos increases the correlation of toxicity potencies across test systems. Environmental Science & Technology. 55 (1), 447-457 (2021).
  22. Cavalcante, D. G. S. M., et al. Cytotoxic, biochemical and genotoxic effects of biodiesel produced by different routes on ZFL cell line. Toxicology In Vitro. 28 (6), 1117-1125 (2014).
  23. Meng, Q., Yeung, K., Chan, K. M. Toxic effects of octocrylene on zebrafish larvae and liver cell line (ZFL). Aquatic Toxicology. 236, 105843 (2021).
  24. Kwok, M. L., Chan, K. M. Oxidative stress and apoptotic effects of copper and cadmium in the zebrafish liver cell line ZFL. Toxicology Reports. 7, 822-835 (2020).
  25. Yang, J., Chan, K. M. Evaluation of the toxic effects of brominated compounds (BDE-47, 99, 209, TBBPA) and bisphenol A (BPA) using a zebrafish liver cell line, ZFL. Aquatic Toxicology. 159, 138-147 (2015).
  26. Bradford, C. S., Sun, L., Collodi, P., Barnes, D. W. Cell cultures from zebrafish embryos and adult tissues. Journal of Tissue Culture Methods. 16 (2), 99-107 (1994).
  27. He, S., et al. Genetic and transcriptome characterization of model zebrafish cell lines. Zebrafish. 3 (4), 441-453 (2006).
  28. Mansoury, M., Hamed, M., Karmustaji, R., Al Hannan, F., Safrany, S. T. The edge effect: A global problem. The trouble with culturing cells in 96-well plates. Biochemistry and Biophysics Reports. 26, 100987 (2021).
  29. Funk, D., Schrenk, H. -H., Frei, E. Serum albumin leads to false-positive results in the XTT and the MTT assay. BioTechniques. 43 (2), 178 (2007).
  30. Dayeh, V. R., Bols, N. C., Tanneberger, K., Schirmer, K., Lee, L. E. J. The use of fish-derived cell lines for investigation of environmental contaminants: An update following OECD's fish toxicity testing framework no. 171. Current Protocols in Toxicology. 1, (2013).
  31. Stepanenko, A. A., Dmitrenko, V. V. Pitfalls of the MTT assay: Direct and off-target effects of inhibitors can result in over/underestimation of cell viability. Gene. 574 (2), 193-203 (2015).
  32. Ulukaya, E., Colakogullari, M., Wood, E. J. Interference by anti-cancer chemotherapeutic agents in the MTT-tumor chemosensitivity assay. Chemotherapy. 50 (1), 43-50 (2004).
  33. Sebaugh, J. L. Guidelines for accurate EC50/IC50 estimation. Pharmaceutical Statistics. 10 (2), 128-134 (2011).
  34. Weimer, M., et al. The impact of data transformations on concentration-response modeling. Toxicology Letters. 213 (2), 292-298 (2012).
  35. Green, J. W., Holbech, T. A., Henrik, Chapter 4: Analysis of Continuous Data (Regression). Statistical Analysis of Ecotoxicity Studies. , John Wiley & Sons, Inc. (2018).
  36. Proença, S., et al. Effective exposure of chemicals in in vitro cell systems: A review of chemical distribution models. Toxicology In Vitro. 73, 105133 (2021).
  37. Guidony, N. S., et al. ABC proteins activity and cytotoxicity in zebrafish hepatocytes exposed to triclosan. Environmental Pollution. 271, 116368 (2021).
  38. da Silva, N. D. G., et al. Interference of goethite in the effects of glyphosate and Roundup® on ZFL cell line. Toxicology In Vitro. 65, 104755 (2020).
  39. Yang, Y., et al. Temperature is a key factor influencing the invasion and proliferation of Toxoplasma gondii in fish cells. Experimental Parasitology. 217, 107966 (2020).
  40. Lopes, F. M., Sandrini, J. Z., Souza, M. M. Toxicity induced by glyphosate and glyphosate-based herbicides in the zebrafish hepatocyte cell line (ZF-L). Ecotoxicology and Environmental Safety. 162, 201-207 (2018).
  41. Lachner, D., Oliveira, L. F., Martinez, C. B. R. Effects of the water soluble fraction of gasoline on ZFL cell line: Cytotoxicity, genotoxicity and oxidative stress. Toxicology In Vitro. 30, 225-230 (2015).
  42. Morozesk, M., et al. Effects of multiwalled carbon nanotubes co-exposure with cadmium on zebrafish cell line: Metal uptake and accumulation, oxidative stress, genotoxicity and cell cycle. Ecotoxicology and Environmental Safety. 202, 110892 (2020).
  43. Dognani, G., et al. Nanofibrous membranes for low-concentration Cr VI adsorption: kinetic, thermodynamic and the influence on ZFL cells viability. Materials Research. , 24 (2021).
  44. ZEM2S (ATCC®CRL-2147™). American Type Culture Collection. , Available from: https://www.atcc.org/products/crl-2147 (2023).
  45. Chen, Y., et al. Acute toxicity of the cationic surfactant C12-benzalkonium in different bioassays: how test design affects bioavailability and effect concentrations. Environmental Toxicology and Chemistry. 33 (3), 606-615 (2014).
  46. Pomponio, G., et al. In vitro kinetics of amiodarone and its major metabolite in two human liver cell models after acute and repeated treatments. Toxicology In Vitro. 30, 36-51 (2015).
  47. Mori, M., Wakabayashi, M. Cytotoxicity evaluation of chemicals using cultured fish cells. Water Science and Technology. 42 (7-8), 277-282 (2000).
  48. Caminada, D., Escher, C., Fent, K. Cytotoxicity of pharmaceuticals found in aquatic systems: comparison of PLHC-1 and RTG-2 fish cell lines. Aquatic Toxicology. 79 (2), 114-123 (2006).
  49. Giltrap, M., et al. In vitro screening of organotin compounds and sediment extracts for cytotoxicity to fish cells. Environmental Toxicology and Chemistry. 30 (1), 154-161 (2011).
  50. Hollert, H., Duerr, M., Erdinger, L., Braunbeck, T. Cytotoxicity of settling particulate matter and sediments of the Neckar River (Germany) during a winter flood. Environmental Toxicology and Chemistry. 19 (3), 528-534 (2000).
  51. Pannetier, P., et al. Toxicity assessment of pollutants sorbed on environmental sample microplastics collected on beaches: Part I-adverse effects on fish cell line. Environmental Pollution. 248, 1088-1097 (2019).
  52. Ternjej, I., Srček, V. G., Mihaljević, Z., Kopjar, N. Cytotoxic and genotoxic effects of water and sediment samples from gypsum mining area in channel catfish ovary (CCO) cells. Ecotoxicology and Environmental Safety. 98, 119-127 (2013).
  53. Hamid, R., Rotshteyn, Y., Rabadi, L., Parikh, R., Bullock, P. Comparison of alamar blue and MTT assays for high throughput screening. Toxicology In Vitro. 18 (5), 703-710 (2004).
  54. Vistica, D. T., et al. Tetrazolium-based assays for cellular viability: a critical examination of selected parameters affecting formazan production. Cancer Research. 51 (10), 2515-2520 (1991).
  55. Knauer, K., Lampert, C., Gonzalez-Valero, J. Comparison of in vitro and in vivo acute fish toxicity in relation to toxicant mode of action. Chemosphere. 68 (8), 1435-1441 (2007).
  56. Stadnicka-Michalak, J., Tanneberger, K., Schirmer, K., Ashauer, R. Measured and modeled toxicokinetics in cultured fish cells and application to in vitro-in vivo toxicity extrapolation. PLoS One. 9 (3), 92303 (2014).

Tags

العلوم البيئية، العدد 191،
مقايسات السمية الخلوية مع خطوط خلايا الزرد
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rodrigues de Souza, I., Wilke Sivek, … More

Rodrigues de Souza, I., Wilke Sivek, T., Vaz de Oliveira, J. B., Di Pietro Micali Canavez, A., de Albuquerque Vita, N., Cigaran Schuck, D., Rodrigues de Souza, I., Cestari, M. M., Lorencini, M., Leme, D. M. Cytotoxicity Assays with Zebrafish Cell Lines. J. Vis. Exp. (191), e64860, doi:10.3791/64860 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter