Summary
Denne protokol præsenterer almindeligt anvendte cytotoksicitetsassays (Alamar Blue [AB], CFDA-AM, Neutral Red og MTT-assays) tilpasset til vurdering af cytotoksicitet i zebrafiskembryo (ZEM2S) og lever (ZFL) cellelinjer i 96-brøndplader.
Abstract
Fiskecellelinjer er i stigende grad blevet anvendt i økotoksicitetsundersøgelser, og cytotoksicitetsanalyser er blevet foreslået som metoder til at forudsige akut toksicitet hos fisk. Således præsenterer denne protokol cytotoksicitetsassays modificeret til evaluering af cellelevedygtighed i zebrafisk (Danio rerio), embryo (ZEM2S) og lever (ZFL) cellelinjer i 96-brøndplader. De evaluerede cytotoksicitetsendepunkter er mitokondrieintegritet (Alamar Blue [AB] og MTT-assays), membranintegritet via esteraseaktivitet (CFDA-AM-assay) og lysosomal membranintegritet (Neutral Red [NR] assay). Efter eksponering af teststofferne i en plade med 96 huller udføres cytotoksicitetsassays her udføres AB og CFDA-AM samtidigt, efterfulgt af NR på samme plade, mens MTT-analysen udføres på en separat plade. Udlæsningerne for disse assays foretages ved fluorescens for AB og CFDA-AM og absorbans for MTT og NR. De cytotoksiske assays udført med disse fiskecellelinjer kan anvendes til at undersøge den akutte toksicitet af kemiske stoffer på fisk.
Introduction
Kemiske stoffer skal testes med hensyn til deres sikkerhed for menneskers sundhed og miljøet. Molekylære og cellulære biomarkører er i stigende grad blevet taget i betragtning i sikkerhedsvurderinger for at forudsige virkninger på levende organismer af regulerende organer og/eller lovgivning (f.eks. REACH, OECD, US EPA)1,2, da de kan gå forud for in vivo-bivirkningen (f.eks. hormonforstyrrende virkninger, immunologisk respons, akut toksicitet, fototoksicitet)3,4,5,6,7 . I denne sammenhæng er cytotoksicitet blevet anvendt som en måling til forudsigelse af akut toksicitet for fisk 5,8; Det kan dog have mange andre anvendelser i økotoksicitetsundersøgelser, såsom definition af subcytotoksiske koncentrationer af kemiske stoffer for at studere deres mest forskelligartede sæt virkninger på fisk (f.eks. hormonforstyrrende virkninger).
I cellekultursystemer (in vitro-systemer ) kan cytotoksiciteten af kemiske stoffer bestemmes ved metoder, der er forskellige i typerne af endepunkter. For eksempel kan en cytotoksicitetsmetode baseres på et endepunkt relateret til specifik morfologi observeret under celledødsprocessen, mens en anden kan bestemme cytotoksicitet ved måling af celledød, levedygtighed og funktionalitet, morfologi, energimetabolisme og cellebinding og -proliferation. Kemiske stoffer kan påvirke cellernes levedygtighed gennem forskellige mekanismer, og derfor er det nødvendigt at foretage en cytotoksicitetsvurdering, der dækker forskellige endepunkter for cellelevedygtighed, for at forudsige kemiske virkninger9.
MTT og Alamar Blue (AB) er assays, der bestemmer effekter på cellelevedygtighed baseret på cellemetabolisk aktivitet. MTT-analysen evaluerer aktiviteten af mitokondrieenzymet succinatdehydrogenase10. Reduktionen af gullig 3-[4,5-dimethylthiazol-2yl]-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) til formazanblåt forekommer kun i levedygtige celler, og dens optiske densitet er direkte proportional med antallet af levedygtige celler10. AB-analysen er en følsom oxidationsreduktionsindikator, medieret af mitokondrieenzymer, der fluorescerer og ændrer farve ved reduktion af resazurin til resorufin af levende celler11; cytosoliske og mikrosomale enzymer bidrager imidlertid også til reduktionen af AB og MTT12. Disse enzymer kan omfatte flere reduktaser, såsom alkohol og aldehydoxidoreduktaser, NAD (p) H: quinonoxidoreduktase, flavinreduktase, NADH-dehydrogenase og cytokromer11.
Det neutrale røde (NR) assay er et cellelevedygtighedsassay baseret på inkorporeringen af dette farvestof i lysosomerne i levedygtige celler13. Optagelsen af NR afhænger af cellernes evne til at opretholde pH-gradienter. Protongradienten inde i lysosomerne opretholder en pH, der er lavere end cytoplasmaet. Ved normal fysiologisk pH præsenterer NR en nettoladning på ca. nul, hvilket gør det muligt at trænge ind i cellemembraner. Således bliver farvestoffet ladet og bevares inde i lysosomerne. Jo større mængden af tilbageholdt NR er, desto større er antallet af levedygtige celler14. Kemiske stoffer, der beskadiger celleoverfladen eller lysosomale membraner, forringer optagelsen af dette farvestof.
CFDA-AM-analysen er et fluorometrisk cellelevedygtighedsassay baseret på tilbageholdelse af 5-carboxyfluoresceindiacetatacetoxymethylester (CFDA-AM)15. 5-CFDA-AM, et esterasesubstrat, omdannes til carboxyfluorescein, et fluorescerende stof, der er polært og ikke-permeabelt af membraner i levende celler15; Således bevares den i indersiden af en intakt cellemembran, hvilket indikerer levedygtige celler.
For nylig blev tre cytotoksicitetsassays (CFDA-AM-, NR- og AB-assays) kombineret i en valideret ISO (International Organization for Standardization) retningslinje (ISO 21115: 2019)16 og OECD (Organization for Economic Co-operation and Development) testmetode (OECD TG 249) for at evaluere akut toksicitet for fisk ved hjælp af RTgill-W1-cellelinjen (permanent cellelinje fra regnbueørred [Oncorhynchus mykiss] gill) i 24-brøndplader17 . Selvom der findes en cellebaseret metode til at forudsige akut toksicitet for fisk, er der investeret i at udvikle lignende metoder med andre fiskearter og øge metodens gennemstrømning. Nogle eksempler omfatter udvikling af ZFL-cellelinjer transfekteret med reportergener for specifikke toksicitetsveje18,19, fototoksicitetstest i RTgill-W1-cellelinje 20 og anvendelse af ZFL- og ZF4-cellelinjer (zebrafisk fibroblastisk afledt af 1 dag gamle embryoner) til vurdering af toksicitet ved flere cytotoksicitetsassays21.
Danio rerio (zebrafisk) er en af de vigtigste fiskearter, der anvendes i akvatiske toksicitetsundersøgelser. Således kan cellebaserede metoder med zebrafiskcellelinjer til test af fisketoksicitet være yderst nyttige. ZFL-cellelinjen er en zebrafiskepitelhepatocytcellelinje, der præsenterer de vigtigste egenskaber ved leverparenkymale celler og kan metabolisere xenobiotika 7,22,23,24,25. I mellemtiden er ZEM2S-cellelinjen en embryonal zebrafisk fibroblastisk cellelinje afledt af blastula-stadiet, der kan bruges til at undersøge udviklingseffekter på fisk26,27. Således beskriver denne protokol fire cytotoksicitetsassays (MTT-, AB-, NR- og CFDA-AM-assays) med modifikationer, der skal udføres med ZFL- og ZEM2S-cellelinjer i 96-brøndplader.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: Se materialetabellen for listen over materialer, der anvendes i denne protokol, og tabel 1 for sammensætningen af opløsninger og medier, der anvendes i denne protokol.
1. Forberedelse af ZFL- og ZEM2S-celler
- Der indledes med en T75-kolbe ZFL- eller ZEM2S-celler med 80 % sammenløb, dyrket i det respektive komplette substrat ved 28 °C uden CO2.
- Dyrkningsmediet fjernes fra kolben, og cellerne vaskes ved tilsætning af 10 ml 1x fosfatbufret saltvand (PBS) (0,01 M). Tilsæt 3 ml 1x trypsin (0,05% v/v; 0,5 mM trypsin-EDTA) til dyrkningskolberne. Der inkuberes ved 28 °C i 3 min.
- Bank let på kolben for at frigøre cellerne, og stop derefter trypsinfordøjelsen ved at tilsætte 3 ml komplet dyrkningsmedium til kolben.
- Overfør cellesuspensionen til et 15 ml konisk centrifugeglas og centrifuger ved 100 × g i 5 minutter.
- Efter centrifugeringen fjernes supernatanten forsigtigt, der tilsættes 1 ml komplet substrat til ZFL- eller ZEM2S-celler, og pelletpen resuspenderes med en mikropipette.
2. Celletælling ved udelukkelse af trypanblåt farvestof
- Tilsæt 10 μL af cellesuspensionen og 10 μL trypanblåt farvestof til et mikrorør for at tælle cellerne og evaluere deres levedygtighed. Bland cellesuspensionen og farvestoffet ved hjælp af en pipette.
- Overfør derefter 10 μL af denne blanding (cellesuspension + trypanblå) til et Neubauer-kammer og tæl cellerne i de fire store firkanter (kvadranter Q), der er placeret i hjørnerne af kammeret, idet levedygtige celler betragtes som dem, der ikke optager trypanblå. Bestem antallet af levedygtige celler ved hjælp af ligning (1):
(1) - Det endelige celletal i cellesuspensionen beregnes ved at gange celletallet bestemt ved ligning (1) med to (fortyndingsfaktoren som følge af anvendelse af trypanblåt).
BEMÆRK: Alternativt kan et automatiseret celletællingssystem (f.eks . En cytomer med celletælling og levedygtighedsfunktion) anvendes.
(1)3. Cellebelægning i plader med 96 brønde
- Beregn det cellesuspensionsvolumen, der er nødvendigt for at opnå det antal celler, der kræves for at udføre cytotoksicitetsanalyserne. Antallet af levedygtige celler for hver cellelinje er angivet nedenfor:
- Plade 60.000 levedygtige ZEM2S-celler pr. Brønd; Brug således seks millioner celler til hele pladen i 20 ml komplet medium (200 μL / brønd, 96-brøndplade).
- Plade 40.000 levedygtige ZFL-celler pr. Brønd; Brug således fire millioner celler til hele pladen i 20 ml komplet medium (200 μL / brønd, 96-brøndplade).
- Derefter overføres det respektive volumen af cellesuspensionen til et reagensreservoir (sterilt) og fyldes op med det komplette dyrkningsmedium for ZFL eller ZEM2S til 20 ml. Bland opløsningen forsigtigt op og ned med en multikanalpipette.
BEMÆRK: Pas på ikke at danne skum eller bobler. - Der tilsættes 200 μL af cellesuspensionen til hvert hul i en gennemsigtig polystyrenplade med 96 brønde ved hjælp af multikanalmikropipetten. Pladerne inkuberes ved 28 °C i 24 timer.
BEMÆRK: Pladen skal have mindst tre huller uden celler til blindprøvestyringen, og der må kun tilsættes hele medier til disse huller. Kanteffekten (forårsaget af højere fordampning i kantbrøndene) forekommer almindeligvis i 96-brønds pladeanalyser og kan påvirke levedygtigheden af cellerne i kantbrøndene på pladen28. Denne effekt kan være højere eller lavere afhængigt af 96-brønds plademærke og design28. Selvom vi ikke bemærkede nogen cellevækst/levedygtighedsforstyrrelse for ZFL og ZEM2S i kantbrøndene, foreslår vi, at pladen forsegles med parafilm eller klæbende tætningsfolie for at forhindre denne effekt, eller at cellerne kun dyrkes i de 60 indvendige brønde og fylder kantbrøndene med PBS.
4. Eksponering af celler for testkemikalie
- Kassér forsigtigt de brugte medier fra brøndene ved hjælp af en multikanals mikropipette.
- Udsæt cellerne for at teste kemikalier i forskellige koncentrationer. Der fremstilles opløsninger af testkemikaliekoncentrationerne i dyrkningsmediet for ZFL eller ZEM2S uden føtalt bovint serum (FBS) (eksponeringsmedier). Derefter tilsættes 100 μL pr. hul af disse opløsninger i teknisk tredobbelt (dvs. tre huller/testkemikaliekoncentration).
- Til kontrol anbringes kontrolgrupperne på samme plade som testkemikaliet i tekniske tredobbelte eksemplarer (tre huller/kontrolgruppe). For blindprøvekontrollen (B) tilsættes således 100 μL af eksponeringsmediet i de cellefrie huller, for den negative kontrol (NC) tilsættes 100 μL af eksponeringsmediet til hullerne med celler, og for den positive kontrol (PC) udsættes cellerne for en opløsning af 1% Triton X-100 fremstillet i eksponeringsmediet. I nogle tilfælde bør en opløsningsmiddelkontrol (SC) inkluderes i pladen, idet en klart ikke-cytotoksisk koncentration betragtes som en endelig opløsningsmiddelkoncentration.
BEMÆRK: Det anbefales at bruge 0,5% DMSO som opløsningsmiddel; DMSO kan anvendes op til 1% som opløsningsmiddel i disse cellelinjer uden at overskride cytotoksicitetstærsklen på 10% relateret til den negative kontrol. - Pladerne inkuberes ved 28 °C i 24 timer. Forsegl pladerne med parafilm eller klæbende tætningsfolie for at forhindre fordampning af dyrkningsmediet.
BEMÆRK: Visse kemikalier kan have iboende baggrundsabsorbans eller fluorescens, der kan forstyrre absorbansen eller fluorescensen af indikatorfarvestoffet/-farverne (f.eks. kan forbindelser med farve påvirke absorbansen, serumalbumin29 og forbindelser, der interfererer med reduktionsenzymer30,31). I dette tilfælde skal pladen omfatte en yderligere kontrol ved tilsætning af testkemiske opløsninger i hullerne uden celler. Dette er for at verificere den mulige interferens af den kemiske autoabsorbans/autofluorescens med farvestofferne. Hvis der opdages interferens, bør man vurdere, om det kan udelukkes for at opnå en korrekt forudsigelse af cytotoksicitet.
5. Cytotoksicitetsanalyser
BEMÆRK: Forbered alle opløsninger i henhold til tabel 1. Alle trin beskrevet nedenfor (figur 1) udføres under sterile forhold. Brug af en pipette til at kassere eksponeringsmediet anbefales ikke, fordi cellerne let kan løsne sig fra brøndene efter kemisk behandling.
- AB- og CFDA-AM-analyser
- Efter 24 timers kemisk testeksponering kasseres eksponeringsmediet forsigtigt ved at hælde indholdet i en opsamlingsbakke.
- Pladen vaskes med 200 μL PBS. Fjern forsigtigt PBS ved at hælde det i en opsamlingsbakke for at undgå at miste celler.
- Der tilsættes 100 μL pr. hul AB/CFDA-AM-opløsning. Pladen inkuberes i 30 minutter i mørke ved 28 °C.
- Fluorescensen i en fluorescenspladelæser måles ved 530 nm (excitation) og 595 nm (emission) for AB og ved 493 nm (excitation) og 541 nm (emission) for CFDA-AM.
- NR-analyse
BEMÆRK: Trinnene for NR-analysen udføres umiddelbart efter AB- og CFDA-AM-assays (figur 1).- NR-arbejdsløsningen (40 μg/ml) centrifugeres ved 600 × g i 10 minutter.
BEMÆRK: Udfældning af NR i røret må ikke overføres til pladerne. Efter centrifugering af NR-arbejdsløsningen opsamles supernatanten således ved hjælp af en pipette uden at opsuge NR-bundfaldet. Supernatanten overføres til en reagensbeholder. - Fjern forsigtigt AB/CFDA-AM-opløsningen ved at hælde indholdet i en opsamlingsbakke.
- Der tilsættes 100 μL pr. hul i NR-arbejdsløsningen ved hjælp af en multikanalmikropipette. Pladen inkuberes ved 28 °C i 3 timer.
BEMÆRK: Efter 3 timers inkubation skal du observere, om NR-nedbør forekom i pladerne ved hjælp af et mikroskop. NR-udfældninger kan forstyrre kvantificeringen af cellelevedygtigheden, og de bør derfor ikke være til stede. - Fjern forsigtigt NR-opløsningen ved at hælde indholdet i en opsamlingsbakke. Hullerne vaskes ved at tilsætte 150 μL PBS pr. hul.
- Der tilsættes 150 μL pr. hul NR-ekstraktionsopløsning, og pladen inkuberes på en pladeryster i 10 minutter til forsigtig omrystning. Absorbansen måles ved 540 nm i en pladelæser.
BEMÆRK: Der foretages endnu en aflæsning ved 690 nm for at udelukke optagelse af fingeraftryk i baggrunden.
- NR-arbejdsløsningen (40 μg/ml) centrifugeres ved 600 × g i 10 minutter.
- MTT-analyse
BEMÆRK: MTT-analysen skal udføres separat fra de ovenfor beskrevne assays (i en ny plade) (figur 2).- Fjern forsigtigt eksponeringsmediet ved at hælde indholdet i en opsamlingsbakke.
- Der tilsættes 100 μL MTT-arbejdsløsning pr. hul ved hjælp af en mikropipette med flere kanaler. Pladen inkuberes ved 28 °C i 4 timer.
- Kassér MTT-opløsningen ved at hælde indholdet i en opsamlingsbakke.
- Der tilsættes 100 μL pr. hul DMSO for at ekstrahere formazankrystallerne, og pladen inkuberes på en pladeryster i 10 minutter. Absorbansen måles ved 570 nm ved hjælp af en pladelæser.
BEMÆRK: Der foretages endnu en aflæsning ved 690 nm for at udelukke optagelse af fingeraftryk i baggrunden. Det er vigtigt at bemærke, at testkemikalier kan interferere med MTT, som skal evalueres for at sikre kvaliteten af de genererede data32. Til dette formål skal cellefrie huller, der indeholder testkoncentrationerne og MTT (0,5 mg/ml), eksponeres, efterfulgt af inkubation for at observere enhver farveændring i hullerne, der kan øge absorbansen og føre til falske levedygtighedsresultater. Kemikalier, der interagerer med MTT, skal undgås i denne test.
6. Beregning af cellelevedygtighed/cytotoksicitet
BEMÆRK: Den opnåede råabsorbans eller fluorescens anvendes til at beregne cellelevedygtighed som en procentdel relateret til den negative kontrol (for testkemikalier fremstillet direkte i eksponeringsmedier) eller opløsningsmiddelkontrol (for testkemikalier fremstillet ved hjælp af opløsningsmidler, såsom DMSO). Før cellelevedygtighedsprocenten bestemmes, skal rådataene normaliseres af den tomme kontrol.
- Den gennemsnitlige absorbans eller fluorescens beregnes for hver kemisk testkoncentration og kontrolgruppe (tre huller/behandling).
- For at bestemme cellelevedygtighedsprocenten i forhold til kontrol (negativ eller opløsningsmiddel) skal du bruge ligning (2):
(2)
BEMÆRK: Absorbansenheder (abs) eller fluorescensenheder (fluo) repræsenterer gennemsnittet af absorbans eller fluorescens målt i de tre huller pr. koncentration; Tom repræsenterer brønde uden celler.
(2)Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 3 viser pladerne i AB-, CFDA-AM-, NR- og MTT-assays. For AB-analysen (figur 3A) viser de tomme brønde og brønde med ingen eller et reduceret antal levedygtige celler blå farve og lav fluorescens, mens brøndene med et stort antal levedygtige celler er lyserøde og præsenterer høje fluorescensværdier på grund af omdannelsen af resazurin (AB) til resorufin (lyserødt stof) af de levedygtige celler. For CFDA-AM-analysen er der ingen synlig forskel i farven på brøndene på pladen; fluorescensen er imidlertid højere i brønde, der indeholder levedygtige celler på grund af tilbageholdelse af CFDA-AM og efterfølgende omdannelse til carboxyfluorescein (fluorescerende stof).
For NR-analysen (figur 3B) skal blindprøvehullerne være gennemsigtige med meget lave absorbansværdier, da der ikke er celler til at tilbageholde NR-farvestoffet. I nogle tilfælde er de tomme brønde ikke gennemsigtige, hvilket indikerer forekomsten af NR-nedbør på pladen; I dette tilfælde bør dette ikke betragtes som et gyldigt eksperiment. Meget cytotoksiske koncentrationer af testkemikalierne og PC er gennemsigtige eller har en meget lyserød farve med lave absorbansværdier, mens brønde indeholdende levedygtige celler bevarer NR-farvestoffet og har en mørk lyserød farve og høje absorbansværdier.
For MTT-analysen (figur 3C) skal blindprøvehullerne være gennemsigtige og med meget lav absorbans, da der ikke er celler til at omdanne MTT til formazan. Meget cytotoksiske koncentrationer af testkemikalierne og PC er gennemsigtige eller har en meget lys violet farve med lave absorbansværdier, mens brønde indeholdende levedygtige celler omdanner MTT (gul) til formazan (violet stof) og præsenterer en mørkere violet farve med høje absorbansværdier.
Figur 4A viser en repræsentativ grafik over cellernes levedygtighed efter beregningen ved hjælp af gennemsnittet af fluorescens- eller absorbansværdier pr. gruppe. Grafikken kan plottes med input af levedygtighedsprocentværdier, beregnet ved hjælp af levedygtighedsberegningsformlen præsenteret i protokolafsnit 6 ved hjælp af dataanalysesoftware. Levedygtigheden af celler, der eksponeres for SC, bør ikke være 10 % lavere end i NC17. Testkemikaliernes cellelevedygtighedsprocent beregnes i forhold til NC eller SC afhængigt af deres opløselighed. I dette tilfælde anvendes forskellige koncentrationer af DMSO som teststof, og cellelevedygtigheden er relateret til NC, som defineres som 100% levedygtighed.
Cellelevedygtighedsdataene kan anvendes til at beregne testkemikaliernes halvmaksimale hæmmende koncentration (IC50) ved logaritmisk transformation og interpoleret standardkurve ved ikke-lineær regression efter passende replikater33,34,35. Figur 4B viser IC50, beregnet ud fra levedygtighedsprocenten vist i figur 4A. IC50 blev opnået med mindst tre tekniske replikater og tre eksperimentelle replikater under anvendelse af nominelle koncentrationer i AB-assayet. Analyserne blev udført med fem forskellige koncentrationer af teststofferne; Der kan dog kræves et højere antal koncentrationer afhængigt af forsøgstypen. For eksempel anbefales otte testkoncentrationer til range-finding testen, som normalt udføres for at bestemme endelige testkoncentrationer af et kemisk stof til et forsøg. Da levedygtighedsanalyserne har forskellige cytotoksiske endepunkter, anbefaler vi at beregne IC50 for hvert assay, der udføres separat, for at identificere forskelle i følsomhed forårsaget af forskellige virkningsmekanismer for de kemiske stoffer eller forskelle i følsomhed mellem cellelinjer. Forskellene i IC50-værdier af testede kemikalier i forskellige cellelinjer kan også variere afhængigt af den anvendte type dyrkningsmedium, da forskelle i sammensætning relateret til proteiner og lipider kan påvirke den kemiske biotilgængelighed36. Derudover kan cytotoksiciteten af mange kemikalier evalueres gennem disse assays. IC50 for andre kemikalier, der er evalueret i ZFL- og ZEM2S-cellelinjer, er vist i figur 4B-H.
Figur 1: Skematisk protokol for AB-, CFDA-AM- og NR-assays udført i den samme 96-brøndplade. Forkortelser: AB = Alamar Blue; CFDA-AM = 5-carboxyfluoresceindiacetatacetoxymethylester; NR = neutral rød; PBS = fosfatbufret saltvand. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Skematisk protokol for MTT-analysen udført i en plade med 96 brønde. Forkortelse: MTT = 3-[4,5-dimethylthiazol-2yl]-2,5-diphenyltetrazoliumbromid. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Repræsentative resultater af AB-, CFDA-AM-, NR- og MTT-assays. Billederne viser farveforskellene i brøndene for kontroller og testkoncentrationer i (A) AB og CFDA-AM, (B) NR og (C) MTT-assays. Forkortelser: AB = Alamar Blue; CFDA-AM = 5-carboxyfluoresceindiacetatacetoxymethylester; NR = neutral rød; PBS = fosfatbufret saltvand B = tomme brønde (cellefrie brønde); SC = opløsningsmiddelkontrol (0,5% DMSO); NC = negativ kontrol (celler i dyrkningsmedium); PC = positiv kontrol (1% Triton X-100). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Beregning af data om cellelevedygtighed og levedygtighed for forskellige testkemikalier. Beregningen af cellelevedygtighed ved hjælp af udlæsningsdataene kan udtrykkes som procentdelen (%) af cellelevedygtigheden relateret til NC eller SC (A). Et kemikalies cytotoksicitet kan vurderes ved at anvende levedygtighedsdata til at interpolere en standardkurve ved ikke-lineær regression for forskellige testkemikalier (B-H). Data er repræsenteret som gennemsnit af cellelevedygtighed (prikker) og standardafvigelse (søjler) for tre tekniske replikater og tre eksperimentelle replikater (AB-assay). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: MTT-assay udført i ZFL- og ZEM2S-celler dyrket i tilstedeværelse (10%) og fravær (0%, fuldstændig FBS-berøvet) af FBS i 24 timer. (A) ZFL-celler ved 0% og 10% FBS viser ingen signifikant forskel i cellelevedygtighed ved Kruskall-Wallis-test (p = 0,2286). (B) ZEM2S-celler ved 0% og 10% FBS viser ingen signifikant forskel i cellelevedygtighed ved Mann-Whitney-test (p = 0,3429). Et signifikansniveau på p < 0,05 blev overvejet. Data udtrykkes som median og interkvartilt interval af tre tekniske replikater. Forkortelser: n.s. = ingen signifikant forskel; FBS = føtalt kvægserum; MTT = 3-[4,5-dimethylthiazol-2yl]-2,5-diphenyltetrazoliumbromid. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: MTT- og NR-assays udført i ZFL- og ZEM2S-celler behandlet (24 timer) med DMSO i forskellige koncentrationer (0,1%, 0,5% og 1%) og negativ kontrol. DMSO-behandlede ZFL-celler ved nogen testet koncentration viste ikke en signifikant forskel i cellelevedygtighed relateret til NC ved (A) MTT-assay (p = 0,074) og (B) NR-assay (p = 0,216). DMSO-behandlede ZEM2S-celler viste ikke en signifikant forskel i cellelevedygtighed relateret til NC ved (C) MTT-assay (p = 0,422) og (D) NR-assay (p = 0,287). Et signifikansniveau på p < 0,05 i Kruskall-Wallis-testen blev overvejet. Data udtrykkes som median og interkvartilt interval af tre tekniske replikater. Forkortelser: n.s. = ingen signifikant forskel; NC = negativ kontrol MTT = 3-[4,5-dimethylthiazol-2yl]-2,5-diphenyltetrazoliumbromid; NR = Neutral rød. Klik her for at se en større version af denne figur.
Tabel 1: Opløsninger og medier, der anvendes i denne protokol. Klik her for at downloade denne tabel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Cytotoksicitetsanalyser anvendes i vid udstrækning til in vitro-toksicitetsevaluering, og denne protokolartikel præsenterer fire almindeligt anvendte cytotoksicitetsassays, der er modificeret til at blive udført i zebrafiskcellelinjer (dvs. celletæthed for 96-brøndplade, inkubationstid i MTT-assayet, FBS-udtømning under den kemiske eksponeringstilstand og maksimal acceptabel koncentration for SC). Da disse analyser kvantificerer cytotoksicitet ved hjælp af forskellige endepunkter for cellelevedygtighed (metabolisk funktion, lysosomal membranintegritet og cellemembranintegritet), giver kombinationen heraf en nøjagtig evaluering af kemisk cytotoksicitet i zebrafiskcellelinjer. Denne protokol anbefaler også dyrkning af ZFL- og ZEM2S-cellelinjer i en CO2 -fri tilstand på grund af deres kulturmediesammensætning, der tilstrækkeligt kan buffere kultursystemet og opretholde pH ved 7,4 (fysiologisk pH). Kulturmediesammensætningen og det CO2 -frie miljø, der foreslås i denne protokol for begge cellelinjer, er bredt rapporteret i litteraturen. ZFL-cellelinjen dyrkes normalt i L-15- og RPMI-medier med eller uden tilsætning af natriumbicarbonat og uden CO2 37,38,39,40,41,42,43. I mellemtiden dyrkes ZEM2S-cellelinjen i henhold til instruktioner fra bioressourcecentret, og dets kulturmedier er formuleret til CO2 -frie kulturer; således kan CO2 og luftblanding være skadelige for celler, når der anvendes denne type kulturmedier44.
Den kemiske eksponering i et dyrkningsmedium uden tilsætning af FBS blev udført på baggrund af offentliggjorte undersøgelser, der viser, at de kemiske stoffers biotilgængelighed i in vitro-assays påvirkes signifikant af deres binding til serumproteiner. For eksempel viste Chen et al.45, at tilstedeværelsen af serumproteiner i RTgill-W1-analysen kunne reducere biotilgængeligheden af et kationisk overfladeaktivt stof (C12-benzalkonium) op til tre og en halv gange. Det kemikalie, der var bundet til FBS, varierede generelt fra 47% til 90% i kulturmediet45. For at undgå dette problem evaluerede vi således cellelevedygtigheden af ZFL- og ZEM2S-celler i kulturer, der var fuldstændig berøvet FBS i 24 timer ved hjælp af MTT-assayet. Resultaterne viste ingen signifikant forskel i cellelevedygtighed fra ZFL- eller ZEM2S-kulturer med (10%) og uden (0%) FBS, hvilket indikerer, at disse zebrafiskcellelinjer kan underkastes kemisk behandling i kulturmedier berøvet FBS (figur 5). Det er vigtigt at fremhæve, at faldende mængde FBS kan medføre andre konsekvenser i kemisk biotilgængelighed. For eksempel har lipofile kemikalier højere sorption til plastlabware og plader, hvilket reducerer kemisk biotilgængelighed36. Tilstedeværelsen af FBS i dyrkningsmediet kan imidlertid nedsætte plastbindingen på grund af serumbestanddele, der konkurrerer med plasten om binding til kemikalierne46. Den bedste beslutning relateret til procentdelen af FBS-tilskud eller dets fuldstændige berøvelse kan afhænge af typen af testkemikaliet. For eksempel rapporterede Pomponio et al.46, at selvom kemikaliet amiodaron har en højere binding til plast i fravær af FBS, er dets biotilgængelighed endnu lavere, når der anvendes 10% FBS. For mono-N-desethylamiodaron er næsten samme mængde bundet til serummediet og til væggene46.
Organiske opløsningsmidler (f.eks. DMSO) anbefales generelt at blive anvendt op til 0,5% i in vitro-assays. Denne lave koncentration kan imidlertid forringe testning af højere koncentrationer af dårlige vandopløselige kemikalier. For at forhindre dette problem vurderede vi, om højere koncentrationer af DMSO var egnede til ZFL- og ZEM2S-cellelinjer, der ikke overskred cytotoksicitetstærsklen på 10%. Til dette blev ikke-behandlede celler (NC'er) og celler behandlet (24 timer) med forskellige koncentrationer af DMSO (0,1%, 0,5% og 1%) behandlet til MTT- og NR-assays. Resultaterne viste ingen signifikant forskel i cellelevedygtighed fra behandlingsgruppen sammenlignet med NC'er (figur 6), hvilket indikerer, at der under disse særlige forhold kan anvendes koncentrationer af DMSO op til 1%. Andre fiskecellelinjer understøtter også DMSO-koncentrationer højere end 0,5%, hvilket ikke er en særegenhed ved ZFL- og ZEM2S-cellelinjer. For eksempel er maksimale opløsningsmiddelkoncentrationer på op til 2% DMSO (uden cytotoksisk virkning observeret) blevet anvendt i cytotoksicitetsassays ved anvendelse af CHSE-214 (cellelinje afledt af Oncorhynchus tshawytscha-embryo)47, RTG-2 (Oncorhynchus mykiss gonadal cellelinje)48,49,50 og PLHC-1 (Poeciliopsis lucida hepatocellulært carcinomcellelinje)48 Celler. Den maksimale opløsningsmiddelkoncentration på 1% DMSO er også blevet anvendt i cytotoksicitetsassays ved anvendelse af RTL-W1 (Oncorhynchus mykiss gonadal cellelinje)51 og CCO (Ictalurus punctatus ovariecellelinje)52 celler. Ifølge Mori og Wakabayashi47 kan fiskecellelinjer have en lavere følsomhed over for DMSO end pattedyrs cellelinjer. Det er dog vigtigt at fremhæve, at den maksimalt acceptable koncentration på 1% DMSO udelukkende blev defineret for cytotoksicitet, og dette bør evalueres omhyggeligt for andre endepunkter (f.eks. genotoksicitet, epigenetik, proteinkodende genekspressionsanalyse) i ZFL- og ZEM2S-cellelinjer.
MTT- og AB-assays er baseret på metabolisk aktivitet for at bestemme cellelevedygtighed. Selvom MTT-analysen er den mest anvendte levedygtighedsanalyse, kan den sammenlignet med AB-analysen være lidt mindre følsom og overvurdere cellelevedygtigheden i nogle tilfælde53. Den højere følsomhed af AB-analysen kan være relateret til målemetoden, da fluorescensmåling er mere følsom end kolorimetrisk måling15. Ikke desto mindre er både AB- og MTT-assays analyser af høj kvalitet til identifikation af cytotoksiske kemiske stoffer, og deres genererede data er blevet brugt til at klassificere farlige kemiske stoffer i henhold til deres iboende cytotoksiske potentiale53.
Ideen om at udføre AB-, CFDA-AM- og NR-analysen på samme plade var baseret på OECD TG 249 (RTgill-W1-assay)17; Imidlertid blev der foretaget ændringer for at udføre disse analyser i 96-brøndplader såvel som at være egnede til zebrafiskcellelinjer. Assays i 96-brønd plader, i stedet for 24-brønd plader, kan være fordelagtigt for high-throughput cytotoksicitet test i fiskecellelinjer. Derudover bruger RTgill-W1-analysen kun L-15-kulturmedium, mens ZFL- og ZEM2S-cellelinjerne dyrkes i et medium indeholdende D-glucose. Dyrkningsmediet gør det muligt at udføre MTT-analysen i disse cellelinjer, da cellelinjer dyrket i glukosefrit medium (f.eks. kun L-15) straks kan reducere MTT-reduktionen i celler og forringe ydeevnen af dette assay54. Denne protokol gør det muligt let at udføre fire forskellige levedygtighedsanalyser i to zebrafiskcellelinjer.
Denne protokol kan bruges til at undersøge virkningerne af kemiske stoffer på fisk ved hjælp af in vitro-modeller . Forskellige cellelinjer kan have forskellige følsomheder til at estimere kemiske virkninger, selvom de er fra samme gruppe hvirveldyr, såsom fisk. Ved at sammenligne ZFL- og ZF4-cellelinjer med fiskeembryoner viste Langu-Mitea et al.21 f.eks., at ZFL er i stand til at generere lignende resultater sammenlignet med toksicitetstesten for fiskeembryoner. Tanneberger et al.5 viste, at de permanente fiskecellelinjer GSF, PLHC, RTG-2, RTgill-W1 og R1 har forskellige følsomheder ved forudsigelse af kemisk toksicitet sammenlignet med in vivo (voksne fisk). Selv om RTgill-W1 (permanent fiskegællecellelinje) for nylig blev valideret som en alternativ metode til at forudsige akut toksicitet hos fisk, bør anvendeligheden af andre cellelinjer i økotoksicitetsundersøgelser undersøges. Brug af cellelinjer fra forskellige fiskearter og vævsoprindelse samt udviklingsstadier (ZEM2S: embryo; ZFL: voksen lever) kan bidrage væsentligt til økotoksicitetsundersøgelser, da det kan behandle virkninger relateret til specifikke stadier af fiskeudvikling og målorganer. Derfor bør kemiske virkninger undersøges ved hjælp af forskellige cellekulturer, der afspejler forskellige målsteder i fisk (f.eks. lever, gonader, gill, hjerne) og ikke kun i en enkelt cellelinje55.
Disse protokoller kan have forskellige anvendelser i økotoksicitetsundersøgelser, og deres anvendelse er ikke nødvendigvis begrænset til at forudsige akut toksicitet hos fisk. For eksempel kan de anvendes til at definere subcytotoksiske koncentrationer til at udføre andre in vitro toksicitetstest for fisk, såsom evaluering af hormonforstyrrende virkninger på fisk. Derudover kan in vitro cytotoksicitetsdata også hjælpe med at udvikle og forbedre fysiologisk baseret toksikokinetisk (PBTK) modellering. Da PBTK fokuserer på fordelingen af et kemikalie i en organisme under hensyntagen til de forskellige organer (såsom gill, lever eller tarm)56, kan brug af cellelinjer fra forskellige fiskearter og vævsoprindelse være en nyttig informationskilde til denne model. Resultaterne af in vitro-bioassays (f.eks. cytotoksicitetsassays) giver inputdata, der repræsenterer biologiske processer i PBTK-modellen, og bidrager til in vitro til in vivo-ekstrapolering 21,56.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt.
Acknowledgments
Til minde om Dr. Márcio Lorencini, medforfatter af dette arbejde, en fremragende forsker inden for kosmetik og dedikeret til at fremme kosmetisk forskning i Brasilien. Forfatterne er taknemmelige for flerbrugerlaboratoriet i fysiologiafdelingen (UFPR) for tilgængelighed af udstyr og for den økonomiske støtte fra koordineringen til forbedring af personale på videregående uddannelser (CAPES, Brasilien) (finanskode 001) og Grupo Boticario.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-CFDA, AM (5-Carboxyfluorescein Diacetate, Acetoxymethyl Ester) | Invitrogen | C1345 | |
| Cell culture plate, 96 well plate | Sarstedt | 83.3924 | Surface: Standard, flat base |
| DMEM | Gibco | 12800-017 | Powder, high glucose, pyruvate |
| FBS - Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions | Gibco | 12657-029 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mix, powder | Gibco | 21700026 | Powder |
| HEPES (1 M) | Gibco | 15630080 | |
| Leibovitz's L-15 Medium | Gibco | 41300021 | Powder |
| Neutral red | Sigma-Aldrich | N4638 | Powder, BioReagent, suitable for cell culture |
| Orbital shaker | Warmnest | KLD-350-BI | 22 mm rotation diameter |
| Dulbeccos PBS (10X) with calcium and magnesium | Invitrogen | 14080055 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| Resazurin sodium salt | Sigma-Aldrich | R7017 | Powder, BioReagent, suitable for cell culture |
| RPMI 1640 Medium | Gibco | 31800-014 | Powder |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | Powder, bioreagent for molecular biology |
| Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide 98% | Sigma-Aldrich | M2128 | |
| Trypan blue stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red | Gibco | 15400054 | |
| ZEM2S cell line | ATCC | CRL-2147 | This cell line was kindly donated by Professor Dr. Michael J. Carvan (University of Wisconsin, Milwaukee, USA) |
| ZFL cell line | BCRJ | 256 |
References
- ECHA. Non-Animal Approaches-Current Status of Regulatory Applicability Under the REACH, CLP and Biocidal Products Regulations. ECHA. , Available at <87ebb68f-2038-f597-fc33-f4003e9e7d7d (2017).
- Alternative Methods Accepted by US Agencies. National Toxicology Program, and US Department of Health and Human Services. , Available from: https://ntp.niehs.nih.gov/whatwestudy/niceatm/accept-methods/index.html (2022).
- Schirmer, K. Proposal to improve vertebrate cell cultures to establish them as substitutes for the regulatory testing of chemicals and effluents using fish. Toxicology. 224 (3), 163-183 (2006).
- Scholz, S., et al. Alternatives to in vivo tests to detect endocrine disrupting chemicals (EDCs) in fish and amphibians-screening for estrogen, androgen and thyroid hormone disruption. Critical Reviews in Toxicology. 43 (1), 45-72 (2013).
- Tanneberger, K., et al. Predicting fish acute toxicity using a fish gill cell line-based toxicity assay. Environmental Science & Technology. 47 (2), 1110-1119 (2013).
- Roesler, R., Lorencini, M., Pastore, G. Brazilian cerrado antioxidant sources: cytotoxicity and phototoxicity in vitro. Food Science and Technology. 30, 814-821 (2010).
- Ruyra, A., et al. Zebrafish liver (ZFL) cells are able to mount an anti-viral response after stimulation with Poly (I:C). Comparative Biochemistry and Physiology. Part B, Biochemistry & Molecular Biology. 182, 55-63 (2015).
- Natsch, A., Laue, H., Haupt, T., von Niederhäusen, V., Sanders, G. Accurate prediction of acute fish toxicity of fragrance chemicals with the RTgill-W1 cell assay. Environmental Toxicology and Chemistry. 37 (3), 931-941 (2018).
- Freshney, R. I.
- Mosmann, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. Journal of Immunological Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).
- O'Brien, J., Wilson, I., Orton, T., Pognan, F. Investigation of the Alamar Blue (resazurin) fluorescent dye for the assessment of mammalian cell cytotoxicity. European Journal of Biochemistry. 267 (17), 5421-5426 (2000).
- Gonzalez, R. J., Tarloff, J. B. Evaluation of hepatic subcellular fractions for Alamar blue and MTT reductase activity. Toxicology In Vitro. 15 (3), 257-259 (2001).
- Borenfreund, E., Puerner, J. A. Toxicity determined in vitro by morphological alterations and neutral red absorption. Toxicology Letters. 24 (2-3), 119-124 (1985).
- Repetto, G., del Peso, A., Zurita, J. L. Neutral red uptake assay for the estimation of cell viability/cytotoxicity. Nature Protocols. 3 (7), 1125-1131 (2008).
- Kamiloglu, S., Sari, G., Ozdal, T., Capanoglue, E. Guidelines for cell viability assays. Food Frontiers. 1 (3), 332-349 (2020).
- Water Quality-Determination of Acute Toxicity of Water Samples and Chemicals to a Fish Gill Cell Line (RTgill-W1) (ISO 21115:2019). International Organization for Standardization. , Available from: https://www.iso.org/standar/69933.html (2019).
- Organisation for Economic Co-operation and Development. Test Guideline No. 249: Fish Cell Line Acute Toxicity-The RTgill-W1 Cell Line Assay. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 2. Effects on Biotic Systems. , OECD Publishing. Paris. (2021).
- Lungu-Mitea, S., Lundqvist, J. Potentials and pitfalls of transient in vitro reporter bioassays: interference by vector geometry and cytotoxicity in recombinant zebrafish cell lines. Archives of Toxicology. 94 (8), 2769-2784 (2020).
- Lungu-Mitea, S., Han, Y., Lundqvist, J. Development, scrutiny, and modulation of transient reporter gene assays of the xenobiotic metabolism pathway in zebrafish hepatocytes. Cell Biology and Toxicology. , 1-23 (2021).
- Schirmer, K., Chan, A. G., Greenberg, B. M., Dixon, D. G., Bols, N. C. Methodology for demonstrating and measuring the photocytotoxicity of fluoranthene to fish cells in culture. Toxicology In Vitro. 11 (1-2), 107-119 (1997).
- Lungu-Mitea, S., et al. Modeling bioavailable concentrations in zebrafish cell lines and embryos increases the correlation of toxicity potencies across test systems. Environmental Science & Technology. 55 (1), 447-457 (2021).
- Cavalcante, D. G. S. M., et al. Cytotoxic, biochemical and genotoxic effects of biodiesel produced by different routes on ZFL cell line. Toxicology In Vitro. 28 (6), 1117-1125 (2014).
- Meng, Q., Yeung, K., Chan, K. M. Toxic effects of octocrylene on zebrafish larvae and liver cell line (ZFL). Aquatic Toxicology. 236, 105843 (2021).
- Kwok, M. L., Chan, K. M. Oxidative stress and apoptotic effects of copper and cadmium in the zebrafish liver cell line ZFL. Toxicology Reports. 7, 822-835 (2020).
- Yang, J., Chan, K. M. Evaluation of the toxic effects of brominated compounds (BDE-47, 99, 209, TBBPA) and bisphenol A (BPA) using a zebrafish liver cell line, ZFL. Aquatic Toxicology. 159, 138-147 (2015).
- Bradford, C. S., Sun, L., Collodi, P., Barnes, D. W. Cell cultures from zebrafish embryos and adult tissues. Journal of Tissue Culture Methods. 16 (2), 99-107 (1994).
- He, S., et al. Genetic and transcriptome characterization of model zebrafish cell lines. Zebrafish. 3 (4), 441-453 (2006).
- Mansoury, M., Hamed, M., Karmustaji, R., Al Hannan, F., Safrany, S. T. The edge effect: A global problem. The trouble with culturing cells in 96-well plates. Biochemistry and Biophysics Reports. 26, 100987 (2021).
- Funk, D., Schrenk, H. -H., Frei, E. Serum albumin leads to false-positive results in the XTT and the MTT assay. BioTechniques. 43 (2), 178 (2007).
- Dayeh, V. R., Bols, N. C., Tanneberger, K., Schirmer, K., Lee, L. E. J. The use of fish-derived cell lines for investigation of environmental contaminants: An update following OECD's fish toxicity testing framework no. 171. Current Protocols in Toxicology. 1, (2013).
- Stepanenko, A. A., Dmitrenko, V. V. Pitfalls of the MTT assay: Direct and off-target effects of inhibitors can result in over/underestimation of cell viability. Gene. 574 (2), 193-203 (2015).
- Ulukaya, E., Colakogullari, M., Wood, E. J. Interference by anti-cancer chemotherapeutic agents in the MTT-tumor chemosensitivity assay. Chemotherapy. 50 (1), 43-50 (2004).
- Sebaugh, J. L. Guidelines for accurate EC50/IC50 estimation. Pharmaceutical Statistics. 10 (2), 128-134 (2011).
- Weimer, M., et al. The impact of data transformations on concentration-response modeling. Toxicology Letters. 213 (2), 292-298 (2012).
- Green, J. W., Holbech, T. A., Henrik, Chapter 4: Analysis of Continuous Data (Regression). Statistical Analysis of Ecotoxicity Studies. , John Wiley & Sons, Inc. (2018).
- Proença, S., et al. Effective exposure of chemicals in in vitro cell systems: A review of chemical distribution models. Toxicology In Vitro. 73, 105133 (2021).
- Guidony, N. S., et al. ABC proteins activity and cytotoxicity in zebrafish hepatocytes exposed to triclosan. Environmental Pollution. 271, 116368 (2021).
- da Silva, N. D. G., et al. Interference of goethite in the effects of glyphosate and Roundup® on ZFL cell line. Toxicology In Vitro. 65, 104755 (2020).
- Yang, Y., et al. Temperature is a key factor influencing the invasion and proliferation of Toxoplasma gondii in fish cells. Experimental Parasitology. 217, 107966 (2020).
- Lopes, F. M., Sandrini, J. Z., Souza, M. M. Toxicity induced by glyphosate and glyphosate-based herbicides in the zebrafish hepatocyte cell line (ZF-L). Ecotoxicology and Environmental Safety. 162, 201-207 (2018).
- Lachner, D., Oliveira, L. F., Martinez, C. B. R. Effects of the water soluble fraction of gasoline on ZFL cell line: Cytotoxicity, genotoxicity and oxidative stress. Toxicology In Vitro. 30, 225-230 (2015).
- Morozesk, M., et al. Effects of multiwalled carbon nanotubes co-exposure with cadmium on zebrafish cell line: Metal uptake and accumulation, oxidative stress, genotoxicity and cell cycle. Ecotoxicology and Environmental Safety. 202, 110892 (2020).
- Dognani, G., et al. Nanofibrous membranes for low-concentration Cr VI adsorption: kinetic, thermodynamic and the influence on ZFL cells viability. Materials Research. , 24 (2021).
- ZEM2S (ATCC®CRL-2147™). American Type Culture Collection. , Available from: https://www.atcc.org/products/crl-2147 (2023).
- Chen, Y., et al. Acute toxicity of the cationic surfactant C12-benzalkonium in different bioassays: how test design affects bioavailability and effect concentrations. Environmental Toxicology and Chemistry. 33 (3), 606-615 (2014).
- Pomponio, G., et al. In vitro kinetics of amiodarone and its major metabolite in two human liver cell models after acute and repeated treatments. Toxicology In Vitro. 30, 36-51 (2015).
- Mori, M., Wakabayashi, M. Cytotoxicity evaluation of chemicals using cultured fish cells. Water Science and Technology. 42 (7-8), 277-282 (2000).
- Caminada, D., Escher, C., Fent, K. Cytotoxicity of pharmaceuticals found in aquatic systems: comparison of PLHC-1 and RTG-2 fish cell lines. Aquatic Toxicology. 79 (2), 114-123 (2006).
- Giltrap, M., et al. In vitro screening of organotin compounds and sediment extracts for cytotoxicity to fish cells. Environmental Toxicology and Chemistry. 30 (1), 154-161 (2011).
- Hollert, H., Duerr, M., Erdinger, L., Braunbeck, T. Cytotoxicity of settling particulate matter and sediments of the Neckar River (Germany) during a winter flood. Environmental Toxicology and Chemistry. 19 (3), 528-534 (2000).
- Pannetier, P., et al. Toxicity assessment of pollutants sorbed on environmental sample microplastics collected on beaches: Part I-adverse effects on fish cell line. Environmental Pollution. 248, 1088-1097 (2019).
- Ternjej, I., Srček, V. G., Mihaljević, Z., Kopjar, N. Cytotoxic and genotoxic effects of water and sediment samples from gypsum mining area in channel catfish ovary (CCO) cells. Ecotoxicology and Environmental Safety. 98, 119-127 (2013).
- Hamid, R., Rotshteyn, Y., Rabadi, L., Parikh, R., Bullock, P. Comparison of alamar blue and MTT assays for high throughput screening. Toxicology In Vitro. 18 (5), 703-710 (2004).
- Vistica, D. T., et al. Tetrazolium-based assays for cellular viability: a critical examination of selected parameters affecting formazan production. Cancer Research. 51 (10), 2515-2520 (1991).
- Knauer, K., Lampert, C., Gonzalez-Valero, J. Comparison of in vitro and in vivo acute fish toxicity in relation to toxicant mode of action. Chemosphere. 68 (8), 1435-1441 (2007).
- Stadnicka-Michalak, J., Tanneberger, K., Schirmer, K., Ashauer, R. Measured and modeled toxicokinetics in cultured fish cells and application to in vitro-in vivo toxicity extrapolation. PLoS One. 9 (3), 92303 (2014).
