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Essais de cytotoxicité avec des lignées cellulaires de poisson zèbre

Published: January 6, 2023 doi: 10.3791/64860
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 2, 2, 1, 3, 2, 3
1Graduate Program in Genetics, Department of Genetics, Federal University of Paraná (UFPR), 2Safety of Product Department, Grupo Boticário, 3Department of Genetics, Federal University of Paraná (UFPR)

Summary

Ce protocole présente des tests de cytotoxicité couramment utilisés (tests Alamar Blue [AB], CFDA-AM, Neutral Red et MTT) adaptés à l’évaluation de la cytotoxicité dans des lignées cellulaires d’embryons de poisson zèbre (ZEM2S) et de foie (ZFL) dans des plaques à 96 puits.

Abstract

Les lignées cellulaires de poissons sont de plus en plus utilisées dans les études d’écotoxicité, et des essais de cytotoxicité ont été proposés comme méthodes pour prédire la toxicité aiguë des poissons. Ainsi, ce protocole présente des tests de cytotoxicité modifiés pour évaluer la viabilité cellulaire dans des lignées cellulaires embryonnaires de poisson zèbre (Danio rerio) (ZEM2S) et de foie (ZFL) dans des plaques à 96 puits. Les paramètres de cytotoxicité évalués sont l’intégrité mitochondriale (tests Alamar Blue [AB] et MTT), l’intégrité de la membrane via l’activité estérase (test CFDA-AM) et l’intégrité de la membrane lysosomale (test rouge neutre [NR]). Après l’exposition des substances d’essai dans une plaque de 96 puits, les essais de cytotoxicité sont effectués; ici, AB et CFDA-AM sont effectués simultanément, suivis de NR sur la même plaque, tandis que le test MTT est effectué sur une plaque séparée. Les lectures de ces tests sont prises par fluorescence pour AB et CFDA-AM, et absorbance pour MTT et NR. Les essais de cytotoxicité effectués avec ces lignées cellulaires de poissons peuvent être utilisés pour étudier la toxicité aiguë des substances chimiques sur les poissons.

Introduction

Les substances chimiques doivent être testées en ce qui concerne leur sécurité pour la santé humaine et l’environnement. Les biomarqueurs moléculaires et cellulaires sont de plus en plus pris en compte dans les évaluations de l’innocuité pour prédire les effets sur les organismes vivants par les organismes de réglementation et/ou les lois (p. ex. REACH, OCDE, US EPA)1,2, car ils peuvent précéder le résultat indésirable in vivo (p. ex. perturbation endocrinienne, réponse immunologique, toxicité aiguë, phototoxicité)3,4,5,6,7 . Dans ce contexte, la cytotoxicité a été prise comme mesure pour prédire la toxicité aiguë chez les poissons 5,8; Cependant, il peut avoir de nombreuses autres applications dans les études d’écotoxicité, telles que la définition des concentrations sous-cytotoxiques de substances chimiques pour étudier leur ensemble le plus diversifié d’effets sur les poissons (par exemple, les effets perturbateurs endocriniens).

Dans les systèmes de culture cellulaire (systèmes in vitro ), la cytotoxicité des substances chimiques peut être déterminée par des méthodes différentes selon les types de paramètres. Par exemple, une méthode de cytotoxicité peut être basée sur un paramètre lié à la morphologie spécifique observée au cours du processus de mort cellulaire, tandis qu’une autre peut déterminer la cytotoxicité par la mesure de la mort, de la viabilité et de la fonctionnalité cellulaires, de la morphologie, du métabolisme énergétique et de la fixation et de la prolifération cellulaires. Les substances chimiques peuvent affecter la viabilité cellulaire par différents mécanismes, de sorte qu’une évaluation de la cytotoxicité couvrant différents paramètres de viabilité cellulaire est nécessaire pour prédire les effets chimiques9.

MTT et Alamar Blue (AB) sont des tests qui déterminent les effets sur la viabilité cellulaire en fonction de l’activité métabolique cellulaire. Le test MTT évalue l’activité de l’enzyme mitochondriale succinate déshydrogénase10. La réduction du bromure jaunâtre de 3-[4,5-diméthylthiazol-2yl]-2,5-diphényltétrazolium (MTT) en bleu de formazan ne se produit que dans les cellules viables, et sa densité optique est directement proportionnelle au nombre de cellules viables10. Le test AB est un indicateur sensible d’oxydoréduction médié par des enzymes mitochondriales qui deviennent fluorescentes et changent de couleur lors de la réduction de la résazurine en résorunine par les cellules vivantes11; cependant, les enzymes cytosoliques et microsomiques contribuent également à la réduction de AB et MTT12. Ces enzymes peuvent inclure plusieurs réductases, telles que l’alcool et l’aldéhyde oxydoréductases, la NAD(P)H: quinone oxydoréductase, la flavine réductase, la NADH déshydrogénase et les cytochromes11.

Le test Neutral Red (NR) est un test de viabilité cellulaire basé sur l’incorporation de ce colorant dans les lysosomes de cellules viables13. L’absorption de NR dépend de la capacité des cellules à maintenir les gradients de pH. Le gradient de protons à l’intérieur des lysosomes maintient un pH inférieur à celui du cytoplasme. À pH physiologique normal, le NR présente une charge nette d’environ zéro, ce qui lui permet de pénétrer dans les membranes cellulaires. Ainsi, le colorant se charge et est retenu à l’intérieur des lysosomes. Par conséquent, plus la quantité de NR retenue est importante, plus le nombre de cellules viables14 est élevé. Les substances chimiques qui endommagent la surface cellulaire ou les membranes lysosomales nuisent à l’absorption de ce colorant.

Le test CFDA-AM est un test de viabilité cellulaire fluorométrique basé sur la rétention de l’ester d’acétoxyméthyle de diacétate de 5-carboxyfluorescéine (CFDA-AM)15. Le 5-CFDA-AM, un substrat d’estérase, est converti en carboxyfluorescéine, une substance fluorescente polaire et non perméable par les membranes des cellules vivantes15 ; Ainsi, il est retenu dans la face interne d’une membrane cellulaire intacte, indiquant des cellules viables.

Récemment, trois essais de cytotoxicité (essais CFDA-AM, NR et AB) ont été combinés dans une ligne directrice validée ISO (Organisation internationale de normalisation) (ISO 21115:2019)16 et une méthode d’essai de l’OCDE (OCDE TG 249) pour évaluer la toxicité aiguë des poissons à l’aide de la lignée cellulaire RTgill-W1 (lignée cellulaire permanente de truite arc-en-ciel [Oncorhynchus mykiss] branchie) dans des plaques à 24 puits17 . Bien qu’il existe une méthode cellulaire pour prédire la toxicité aiguë des poissons, des efforts ont été investis dans le développement de méthodes similaires avec d’autres espèces de poissons et l’augmentation du débit de la méthode. Quelques exemples incluent le développement de lignées cellulaires ZFL transfectées avec des gènes rapporteurs pour des voies de toxicité spécifiques18,19, des tests de phototoxicité dans la lignée cellulaire RTgill-W1 20 et l’utilisation de lignées cellulaires ZFL et ZF4 (poisson zèbre fibroblastique dérivé d’embryons âgés de 1 jour) pour évaluer la toxicité par plusieurs tests de cytotoxicité21.

Danio rerio (poisson zèbre) est l’une des principales espèces de poissons utilisées dans les études de toxicité aquatique; Ainsi, les méthodes cellulaires avec des lignées cellulaires de poisson zèbre pour les tests de toxicité des poissons peuvent être extrêmement utiles. La lignée cellulaire ZFL est une lignée cellulaire hépatocytes épithéliales de poisson zèbre qui présente les principales caractéristiques des cellules parenchymateuses du foie et peut métaboliser les xénobiotiques 7,22,23,24,25. Pendant ce temps, la lignée cellulaire ZEM2S est une lignée cellulaire fibroblastique embryonnaire de poisson zèbre dérivée du stade blastula qui peut être utilisée pour étudier les effets sur le développement des poissons26,27. Ainsi, ce protocole décrit quatre tests de cytotoxicité (tests MTT, AB, NR et CFDA-AM), avec des modifications à effectuer avec des lignées cellulaires ZFL et ZEM2S dans des plaques à 96 puits.

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Protocol

REMARQUE : Voir le tableau des matériaux pour la liste des matériaux utilisés dans ce protocole et le tableau 1 pour la composition des solutions et des milieux utilisés dans ce protocole.

1. Préparation des cellules ZFL et ZEM2S

  1. Commencer avec une fiole T75 de cellules ZFL ou ZEM2S avec 80% de confluence, cultivée dans le milieu complet respectif à 28 °C sans CO2.
  2. Retirer le milieu de culture de la fiole et laver les cellules en ajoutant 10 mL de 1x solution saline tamponnée au phosphate (PBS) (0,01 M). Ajouter 3 mL de 1x trypsine (0,05 % v/v; 0,5 mM trypsine-EDTA) dans les fioles de culture. Incuber à 28 °C pendant 3 min.
  3. Tapoter doucement la fiole pour libérer les cellules, puis arrêter la digestion de la trypsine en ajoutant 3 mL de milieu de culture complet dans la fiole.
  4. Transférer la suspension cellulaire dans un tube à centrifuger conique de 15 ml et centrifuger à 100 × g pendant 5 min.
  5. Après la centrifugation, retirer délicatement le surnageant, ajouter 1 mL de milieu complet pour les cellules ZFL ou ZEM2S et remettre la pastille en suspension à l’aide d’une micropipette.

2. Comptage des cellules par exclusion du colorant bleu trypan

  1. Ajouter 10 μL de suspension cellulaire et 10 μL de colorant bleu de trypan à un microtube pour compter les cellules et évaluer leur viabilité. Mélanger la suspension cellulaire et le colorant à l’aide d’une pipette.
  2. Ensuite, transférer 10 μL de ce mélange (suspension cellulaire + bleu de trypan) dans une chambre de Neubauer et compter les cellules dans les quatre grands carrés (quadrants Q) placés aux coins de la chambre, en considérant les cellules viables comme celles qui n’absorbent pas le bleu de trypan. Déterminer le nombre de cellules viables à l’aide de l’équation (1) :
    Equation 1 (1)
  3. Calculer le nombre final de cellules dans la suspension cellulaire en multipliant le nombre de cellules déterminé à l’aide de l’équation (1) par deux (le facteur de dilution dû à l’utilisation du bleu de trypan).
    REMARQUE : Alternativement, un système automatisé de comptage cellulaire (par exemple, un cytomère avec fonction de comptage cellulaire et de viabilité) peut être utilisé.

3. Placage cellulaire dans des plaques de 96 puits

  1. Calculer le volume de suspension cellulaire nécessaire pour obtenir le nombre de cellules nécessaires pour effectuer les essais de cytotoxicité. Le nombre de cellules viables pour chaque lignée cellulaire est indiqué ci-dessous:
    1. Plaquer 60 000 cellules ZEM2S viables par puits; ainsi, pour la plaque entière, utiliser six millions de cellules dans 20 mL de milieu complet (200 μL/puits, plaque de 96 puits).
    2. Plaque 40 000 cellules ZFL viables par puits; ainsi, pour la plaque entière, utiliser quatre millions de cellules dans 20 mL de milieu complet (200 μL/puits, plaque de 96 puits).
  2. Après cela, transférez le volume respectif de la suspension cellulaire dans un réservoir de réactif (stérile) et remplissez avec le milieu de culture complet pour ZFL ou ZEM2S à 20 mL. À l’aide d’une pipette multicanal, mélanger doucement la solution de haut en bas.
    REMARQUE: Veillez à ne pas former de mousse ou de bulles.
  3. Ajouter 200 μL de la suspension cellulaire à chaque puits d’une plaque transparente de polystyrène à 96 puits à l’aide de la micropipette multicanal. Incuber les plaques à 28 °C pendant 24 h.
    NOTE: La plaque doit avoir au moins trois puits sans cellules pour le contrôle de l’ébauche, et seul un média complet doit être ajouté à ces puits. L’effet de bord (causé par une évaporation plus élevée dans les puits de bord) se produit couramment dans les essais sur plaque de 96 puits et peut affecter la viabilité des cellules dans les puits de bord de la plaque28. Cet effet peut être supérieur ou inférieur selon la marque et la conception de la plaque à 96 puits28. Bien que nous n’ayons pas remarqué de perturbation de la croissance et de la viabilité des cellules pour ZFL et ZEM2S dans les puits de bord, nous suggérons de sceller la plaque avec du parafilm ou une feuille d’étanchéité adhésive pour éviter cet effet, ou de cultiver les cellules uniquement dans les 60 puits intérieurs et de remplir les puits de bord avec du PBS.

4. Exposition des cellules à la substance d’essai

  1. Jetez soigneusement les milieux usés des puits à l’aide d’une micropipette multicanaux.
  2. Exposer les cellules à tester des produits chimiques à différentes concentrations. Préparer les solutions des concentrations chimiques d’essai dans les milieux de culture pour ZFL ou ZEM2S sans sérum fœtal bovin (FBS) (milieux d’exposition). Ensuite, ajouter 100 μL par puits de ces solutions en triple technique (c.-à-d. concentration de trois puits/produit chimique d’essai).
  3. Pour les témoins, placer les groupes témoins sur la même plaque que la substance d’essai en triple technique (trois puits/groupe témoin). Ainsi, pour le témoin blanc (B), ajouter 100 μL du milieu d’exposition dans les puits sans cellules, pour le témoin négatif (NC), ajouter 100 μL du milieu d’exposition dans des puits avec cellules, et pour le témoin positif (PC), exposer les cellules à une solution de Triton X-100 à 1% préparée dans le milieu d’exposition. Dans certains cas, un témoin de solvant (SC) doit être inclus dans la plaque, en considérant une concentration clairement non cytotoxique comme concentration finale de solvant.
    REMARQUE: Il est recommandé d’utiliser 0,5% de DMSO comme solvant; Le DMSO peut être utilisé jusqu’à 1% comme solvant dans ces lignées cellulaires sans dépasser le seuil de cytotoxicité de 10% lié au témoin négatif.
  4. Incuber les plaques à 28 °C pendant 24 h. Scellez les plaques avec un parafilm ou une feuille d’étanchéité adhésive pour empêcher l’évaporation du milieu de culture.
    REMARQUE : Certains produits chimiques peuvent avoir une absorbance de fond intrinsèque ou une fluorescence qui peut interférer avec l’absorbance ou la fluorescence du ou des colorants indicateurs (p. ex., les composés colorés peuvent influencer l’absorbance, l’albumine sérique29 et les composés interférant avec les enzymes de réduction30,31). Dans ce cas, la plaque doit comporter un contrôle supplémentaire en ajoutant des solutions chimiques d’essai dans les puits sans cellules. Il s’agit de vérifier l’interférence possible de l’auto-absorbance/autofluorescence chimique avec les colorants. Si une interférence est détectée, il convient d’évaluer si elle peut être exclue pour obtenir une prédiction correcte de la cytotoxicité.

5. Essais de cytotoxicité

REMARQUE : Préparez toutes les solutions conformément au tableau 1. Toutes les étapes décrites ci-dessous (Figure 1) sont réalisées dans des conditions stériles. L’utilisation d’une pipette pour jeter le milieu d’exposition n’est pas recommandée, car les cellules peuvent facilement se détacher des puits après traitement chimique.

  1. Tests AB et CFDA-AM
    1. Après 24 heures d’exposition au produit chimique d’essai, jeter soigneusement le milieu d’exposition en versant le contenu dans un bac de collecte.
    2. Lavez la plaque avec 200 μL de PBS. Retirez soigneusement le PBS en le versant dans un bac de collecte pour éviter de perdre des cellules.
    3. Ajouter 100 μL par puits de solution AB/CFDA-AM. Incuber la plaque pendant 30 min dans l’obscurité à 28 °C.
    4. Mesurer la fluorescence dans un lecteur de plaque de fluorescence à 530 nm (excitation) et 595 nm (émission) pour AB, et à 493 nm (excitation) et 541 nm (émission) pour CFDA-AM.
  2. Essai NR
    REMARQUE : Les étapes du test NR sont effectuées immédiatement après les tests AB et CFDA-AM (Figure 1).
    1. Centrifuger la solution de travail NR (40 μg/mL) à 600 × g pendant 10 min.
      NOTE: La précipitation de NR dans le tube ne doit pas être transférée aux plaques. Ainsi, après centrifugation de la solution de travail NR, recueillir le surnageant à l’aide d’une pipette sans aspirer les précipités NR. Transférer le surnageant dans un réservoir de réactif.
    2. Retirez délicatement la solution AB/CFDA-AM en versant le contenu dans un bac de collecte.
    3. Ajouter 100 μL par puits de la solution de travail NR à l’aide d’une micropipette multicanal. Incuber la plaque à 28 °C pendant 3 h.
      NOTE: Après l’incubation de 3 heures, observez si des précipitations NR se sont produites dans les plaques à l’aide d’un microscope. Les précipités NR peuvent interférer avec la quantification de la viabilité cellulaire, ils ne doivent donc pas être présents.
    4. Retirez délicatement la solution NR en versant le contenu dans un bac de collecte. Lavez les puits en ajoutant 150 μL de PBS par puits.
    5. Ajouter 150 μL par puits de la solution d’extraction NR et incuber la plaque sur un agitateur à plaques pendant 10 min pour agiter doucement. Mesurer l’absorbance à 540 nm dans un lecteur de plaques.
      NOTA: Une deuxième lecture à 690 nm doit être effectuée pour exclure toute absorbance des empreintes digitales de fond dans la plaque.
  3. Dosage MTT
    NOTE: Le test MTT doit être effectué séparément des tests décrits ci-dessus (dans une nouvelle plaque) (Figure 2).
    1. Retirez délicatement le milieu d’exposition en versant le contenu dans un bac de collecte.
    2. Ajouter 100 μL de solution de travail MTT par puits à l’aide d’une micropipette multicanal. Incuber la plaque à 28 °C pendant 4 h.
    3. Jetez la solution MTT en versant le contenu dans un bac de collecte.
    4. Ajouter 100 μL par puits de DMSO pour extraire les cristaux de formazan, en incubant la plaque sur un agitateur à plaques pendant 10 min. Mesurer l’absorbance à 570 nm à l’aide d’un lecteur de plaques.
      NOTA: Une deuxième lecture à 690 nm doit être effectuée pour exclure toute absorbance des empreintes digitales de fond dans la plaque. Il est important de noter que les produits chimiques d’essai peuvent interférer avec le MTT, qui doit être évalué pour assurer la qualité des données générées32. Pour cela, les puits acellulaires contenant les concentrations d’essai et le MTT (0,5 mg / mL) doivent être exposés, suivis d’une incubation pour observer tout changement de couleur dans les puits qui pourrait augmenter l’absorbance et conduire à de faux résultats de viabilité. Les produits chimiques qui interagissent avec le MTT doivent être évités dans ce test.

6. Calcul de la viabilité cellulaire/cytotoxicité

NOTA: L’absorbance brute ou la fluorescence acquise est utilisée pour calculer la viabilité cellulaire en pourcentage lié au témoin négatif (pour les produits chimiques d’essai préparés directement dans les milieux d’exposition) ou au contrôle du solvant (pour les produits chimiques d’essai préparés à l’aide de solvants, tels que le DMSO). Avant de déterminer le pourcentage de viabilité de la cellule, les données brutes doivent être normalisées par le contrôle vide.

  1. Calculer l’absorbance ou la fluorescence moyenne pour chaque concentration de la substance d’essai et groupe témoin (trois puits/traitement).
  2. Pour déterminer le pourcentage de viabilité cellulaire par rapport au témoin (négatif ou solvant), utilisez l’équation (2) :
    Equation 2 (2)
    NOTA : Les unités d’absorbance (abs) ou de fluorescence (fluo) représentent la moyenne d’absorbance ou de fluorescence mesurée dans les trois puits par concentration; Blank représente des puits sans cellules.

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Representative Results

La figure 3 montre les plaques des tests AB, CFDA-AM, NR et MTT. Pour le test AB (figure 3A), les puits blancs et les puits sans cellules viables ou avec un nombre réduit de cellules viables présentent une couleur bleue et une faible fluorescence, tandis que les puits avec un nombre élevé de cellules viables sont rosâtres et présentent des valeurs de fluorescence élevées en raison de la transformation de la résazurine (AB) en résorunine (substance rosâtre) par les cellules viables. Pour le test CFDA-AM, il n’y a pas de différence visible dans la couleur des puits sur la plaque; cependant, la fluorescence est plus élevée dans les puits contenant des cellules viables en raison de la rétention de CFDA-AM et de la conversion ultérieure en carboxyfluorescéine (substance fluorescente).

Pour le test NR (figure 3B), les puits blancs doivent être transparents avec des valeurs d’absorbance très faibles puisqu’il n’y a pas de cellules pour retenir le colorant NR. Dans certains cas, les puits blancs ne sont pas transparents, ce qui indique la présence de précipitations NR sur la plaque; Dans ce cas, cela ne devrait pas être considéré comme une expérience valide. Les concentrations hautement cytotoxiques des produits chimiques d’essai et du PC sont transparentes ou présentent une couleur rose très clair avec de faibles valeurs d’absorbance, tandis que les puits contenant des cellules viables conservent le colorant NR et présentent une couleur rose foncé et des valeurs d’absorbance élevées.

Pour le test MTT (Figure 3C), les puits blancs doivent être transparents et avec une très faible absorbance car il n’y a pas de cellules pour convertir le MTT en formazan. Les concentrations hautement cytotoxiques des produits chimiques d’essai et du PC sont transparentes ou présentent une couleur violet très claire avec de faibles valeurs d’absorbance, tandis que les puits contenant des cellules viables transforment le MTT (jaune) en formazan (substance violette), présentant une couleur violette plus foncée avec des valeurs d’absorbance élevées.

La figure 4A montre un graphique représentatif de la viabilité cellulaire après le calcul, en utilisant les moyennes des valeurs de fluorescence ou d’absorbance par groupe. Le graphique peut être tracé à l’aide de l’entrée des valeurs en pourcentage de viabilité, calculées par la formule de calcul de la viabilité présentée dans la section 6 du protocole, à l’aide d’un logiciel d’analyse de données. La viabilité des cellules exposées au SC ne doit pas être inférieure de 10 % à celle de la NC17. Le pourcentage de viabilité cellulaire des produits chimiques d’essai est calculé par rapport au NC ou au SC, en fonction de leur solubilité. Dans ce cas, différentes concentrations de DMSO sont utilisées comme substance d’essai et la viabilité cellulaire est liée à la NC, qui est définie comme une viabilité à 100%.

Les données sur la viabilité cellulaire peuvent être utilisées pour calculer la demi-concentration inhibitrice maximale (IC50) des produits chimiques d’essai par transformation logarithmique, et la courbe standard interpolée par régression non linéaire après répétitions appropriées33,34,35. La figure 4B montre le CI50, calculé à partir du pourcentage de viabilité indiqué à la figure 4A. L’IC50 a été obtenu avec au moins trois répétitions techniques et trois répétitions expérimentales en utilisant des concentrations nominales dans le test AB. Les analyses ont été effectuées avec cinq concentrations différentes des substances d’essai; Cependant, un plus grand nombre de concentrations peut être nécessaire selon le type d’expérience. Par exemple, huit concentrations d’essai sont recommandées pour l’essai de détermination de la portée, qui est généralement effectué pour déterminer les concentrations finales d’essai d’une substance chimique pour une expérience. Comme les essais de viabilité ont des paramètres de cytotoxicité différents, nous recommandons de calculer la CI50 pour chaque essai effectué séparément afin d’identifier les différences de sensibilité causées par différents mécanismes d’action des substances chimiques ou les différences de sensibilité entre les lignées cellulaires. Les différences dans les valeurs de CI50 des produits chimiques testés dans différentes lignées cellulaires peuvent également varier en fonction du type de milieu de culture utilisé, car les différences de composition liées aux protéines et aux lipides peuvent avoir un impact sur la biodisponibilité chimique36. En outre, la cytotoxicité de nombreux produits chimiques peut être évaluée grâce à ces essais. La CI50 des autres produits chimiques évalués dans les lignées cellulaires ZFL et ZEM2S est représentée à la figure 4B-H.

Figure 1
Figure 1 : Protocole schématique des essais AB, CFDA-AM et NR effectués dans la même plaque de 96 puits. Abréviations : AB = Alamar Blue; CFDA-AM = ester diacétate d’acétoxyméthyle de diacétate de 5-carboxyfluorescéine; NR = rouge neutre; PBS = solution saline tamponnée au phosphate. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Protocole schématique de l’essai MTT réalisé dans une plaque de 96 puits. Abréviation : MTT = bromure de 3-[4,5-diméthylthiazol-2yl]-2,5-diphényltétrazolium. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Résultats représentatifs des tests AB, CFDA-AM, NR et MTT. Les images montrent les différences de couleur dans les puits pour les témoins et les concentrations d’essai dans les tests (A) AB et CFDA-AM, (B) NR et (C) MTT. Abréviations : AB = Alamar Blue; CFDA-AM = ester diacétate d’acétoxyméthyle de diacétate de 5-carboxyfluorescéine; NR = rouge neutre; PBS = solution saline tamponnée au phosphate; B = puits vierges (puits sans cellules); SC = contrôle des solvants (0,5 % de DMSO); NC = témoin négatif (cellules dans le milieu de culture); PC = contrôle positif (1% Triton X-100). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4: Calcul de la viabilité cellulaire et des données de viabilité pour différents produits chimiques d’essai. Le calcul de la viabilité cellulaire à l’aide des données de lecture peut être exprimé en pourcentage (%) de viabilité cellulaire lié au NC ou au SC (A). La cytotoxicité d’un produit chimique peut être évaluée en utilisant les données de viabilité pour interpoler une courbe standard par régression non linéaire pour différents produits chimiques d’essai (B-H). Les données sont représentées sous forme de moyenne de viabilité cellulaire (points) et d’écart-type (barres) de trois réplicas techniques et de trois réplicas expérimentaux (essai AB). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Dosage MTT réalisé sur des cellules ZFL et ZEM2S cultivées en présence (10%) et en absence (0%, complètement privées de FBS) de FBS pendant 24 h. (A) Les cellules ZFL à 0% et 10% FBS ne montrent aucune différence significative dans la viabilité cellulaire par test de Kruskall-Wallis (p = 0,2286). (B) Les cellules ZEM2S à 0% et 10% FBS ne montrent aucune différence significative dans la viabilité cellulaire par le test de Mann-Whitney (p = 0,3429). Un seuil de signification de p < 0,05 a été considéré. Les données sont exprimées sous forme de médiane et d’intervalle interquartile de trois répétitions techniques. Abréviations : n.s. = aucune différence significative; FBS = sérum fœtal bovin; MTT = bromure de 3-[4,5-diméthylthiazol-2yl]-2,5-diphényltétrazolium. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : Tests MTT et NR réalisés sur des cellules ZFL et ZEM2S traitées (24 h) avec du DMSO à différentes concentrations (0,1 %, 0,5 % et 1 %) et un témoin négatif. Les cellules ZFL traitées par DMSO à n’importe quelle concentration testée n’ont pas montré de différence significative dans la viabilité cellulaire liée à la NC par le test MTT (p = 0,074) et (B) NR (p = 0,216). Les cellules ZEM2S traitées par DMSO n’ont pas montré de différence significative dans la viabilité cellulaire liée à la NC par le test MTT (C = 0,422) et le test NR (D (p = 0,287). Un seuil de signification de p < 0,05 dans le test de Kruskall-Wallis a été considéré. Les données sont exprimées sous forme de médiane et d’intervalle interquartile de trois répétitions techniques. Abréviations : n.s. = aucune différence significative; NC = témoin négatif; MTT = bromure de 3-[4,5-diméthylthiazol-2yl]-2,5-diphényltétrazolium; NR = Rouge neutre. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tableau 1 : Solutions et supports utilisés dans ce protocole. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

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Discussion

Les essais de cytotoxicité sont largement utilisés pour l’évaluation de la toxicité in vitro, et cet article de protocole présente quatre tests de cytotoxicité couramment utilisés modifiés pour être effectués dans des lignées cellulaires de poisson zèbre (c.-à-d. densité cellulaire pour la plaque de 96 puits, temps d’incubation dans le test MTT, déplétion FBS pendant les conditions d’exposition chimique et concentration maximale acceptable pour le SC). Comme ces tests quantifient la cytotoxicité selon différents paramètres de viabilité cellulaire (fonction métabolique, intégrité de la membrane lysosomale et intégrité de la membrane cellulaire), leur combinaison fournit une évaluation précise de la cytotoxicité chimique dans les lignées cellulaires de poisson zèbre. Ce protocole recommande également la culture de lignées cellulaires ZFL et ZEM2S dans un état exempt de CO2, en raison de leur composition de milieu de culture qui peut tamponner adéquatement le système de culture, en maintenant le pH à 7,4 (pH physiologique). La composition des milieux de culture et l’environnement exempt de CO2 proposés dans ce protocole pour les deux lignées cellulaires sont largement rapportés dans la littérature. La lignée cellulaire ZFL est généralement cultivée en milieu L-15 et RPMI avec ou sans ajout de bicarbonate de sodium et sans CO2 37,38,39,40,41,42,43. Pendant ce temps, la lignée cellulaire ZEM2S est cultivée selon les instructions du centre de bioressources, et son milieu de culture est formulé pour les cultures sans CO2; ainsi, le CO2 et le mélange d’air peuvent être préjudiciables aux cellules lors de l’utilisation de ce type de milieu de culture44.

L’exposition chimique dans un milieu de culture sans ajout de FBS a été réalisée sur la base d’études publiées, montrant que la biodisponibilité des substances chimiques dans les essais in vitro est significativement affectée par leur liaison aux protéines sériques. Par exemple, Chen et coll.45 ont montré que la présence de protéines sériques dans le test RTgill-W1 pouvait réduire la biodisponibilité d’un tensioactif cationique (C12-benzalkonium) jusqu’à trois fois et demie. Le produit chimique lié au FBS variait généralement de 47 % à 90 % dans le milieude culture 45. Ainsi, pour éviter ce problème, nous avons évalué la viabilité cellulaire des cellules ZFL et ZEM2S dans des cultures complètement privées de FBS pendant 24 heures en utilisant le test MTT. Les résultats n’ont montré aucune différence significative dans la viabilité cellulaire des cultures ZFL ou ZEM2S avec (10%) et sans FBS (0%), indiquant que ces lignées cellulaires de poisson zèbre peuvent être soumises à un traitement chimique dans des milieux de culture privés de FBS (Figure 5). Il est important de souligner que la diminution de la quantité de FBS pourrait avoir d’autres conséquences sur la biodisponibilité chimique. Par exemple, les produits chimiques lipophiles ont une sorption plus élevée sur les articles de laboratoire et les plaques en plastique, ce qui réduit la biodisponibilité chimique36. Cependant, la présence de FBS dans le milieu de culture peut diminuer la liaison plastique en raison des constituants sériques en concurrence avec le plastique pour la liaison aux produits chimiques46. La meilleure décision liée au pourcentage de supplémentation en FBS ou à sa privation complète pourrait dépendre du type de produit chimique testé. Par exemple, Pomponio et coll.46 ont signalé que, bien que l’amiodarone chimique ait une liaison plus élevée au plastique en l’absence de FBS, sa biodisponibilité est encore plus faible lorsqu’elle utilise 10 % de FBS. Pour la mono-N-déséthylamiodarone, presque la même quantité est liée au milieu sérique et aux parois46.

Il est généralement recommandé d’utiliser des solvants organiques (p. ex. le DMSO) jusqu’à 0,5 % dans les essais in vitro. Cependant, cette faible concentration peut nuire à l’essai de concentrations plus élevées de produits chimiques solubles dans l’eau pauvres. Pour éviter ce problème, nous avons évalué si des concentrations plus élevées de DMSO convenaient aux lignées cellulaires ZFL et ZEM2S ne dépassant pas le seuil de cytotoxicité de 10%. Pour cela, des cellules non traitées (NC) et des cellules traitées (24 h) avec différentes concentrations de DMSO (0,1%, 0,5% et 1%) ont été traitées pour les tests MTT et NR. Les résultats n’ont montré aucune différence significative dans la viabilité cellulaire du groupe de traitement par rapport aux NC (Figure 6), ce qui indique que, dans ces conditions particulières, des concentrations de DMSO allant jusqu’à 1% peuvent être utilisées. D’autres lignées cellulaires de poissons supportent également des concentrations de DMSO supérieures à 0,5%, ce qui n’est pas une particularité des lignées cellulaires ZFL et ZEM2S. Par exemple, des concentrations maximales de solvant allant jusqu’à 2 % de DMSO (sans effet cytotoxique observé) ont été appliquées dans des essais de cytotoxicité utilisant CHSE-214 (lignée cellulaire dérivée d’un embryon d’Oncorhynchus tshawytscha)47, RTG-2 (lignée cellulaire gonadique Oncorhynchus mykiss)48,49,50 et PLHC-1 (lignée cellulaire de carcinome hépatocellulaire Poeciliopsis lucida)48 Cellules. La concentration maximale de solvant de 1 % de DMSO a également été utilisée dans des essais de cytotoxicité utilisant des cellules RTL-W1 (Oncorhynchus mykiss gonadal cell line)51 et CCO (lignée cellulaire ovarienne Ictalurus punctatus)52. Selon Mori et Wakabayashi47, les lignées cellulaires de poissons peuvent avoir une sensibilité plus faible au DMSO que les lignées cellulaires de mammifères. Cependant, il est important de souligner que la concentration maximale acceptable de 1 % de DMSO a été définie exclusivement pour la cytotoxicité, et que cela devrait être soigneusement évalué pour d’autres paramètres (p. ex. génotoxicité, épigénétique, analyse de l’expression génique codant pour les protéines) dans les lignées cellulaires ZFL et ZEM2S.

Les tests MTT et AB sont basés sur l’activité métabolique pour déterminer la viabilité cellulaire. Bien que le test MTT soit le test de viabilité le plus utilisé, par rapport au test AB, il peut être légèrement moins sensible, surestimant la viabilité cellulaire dans certains cas53. La sensibilité plus élevée du test AB peut être liée à la méthode de mesure, car la mesure de fluorescence est plus sensible que la mesure colorimétrique15. Néanmoins, les essais AB et MTT sont des essais de haute qualité pour identifier les substances chimiques cytotoxiques, et leurs données générées ont été utilisées pour classer les substances chimiques dangereuses en fonction de leur potentiel cytotoxique intrinsèque53.

L’idée d’effectuer les essais AB, CFDA-AM et NR sur la même plaque était basée sur la ligne directrice 249 de l’OCDE (test RTgill-W1)17; Cependant, des modifications ont été apportées pour effectuer ces essais dans des plaques de 96 puits, ainsi que pour convenir aux lignées cellulaires de poisson zèbre. Les essais dans des plaques à 96 puits, au lieu de plaques à 24 puits, peuvent être avantageux pour les essais de cytotoxicité à haut débit dans les lignées cellulaires de poissons. De plus, le test RTgill-W1 utilise uniquement un milieu de culture L-15, tandis que les lignées cellulaires ZFL et ZEM2S sont cultivées dans un milieu contenant du D-glucose. Le milieu de culture permet d’effectuer le test MTT dans ces lignées cellulaires, car les lignées cellulaires cultivées dans un milieu sans glucose (par exemple, uniquement L-15) peuvent immédiatement diminuer la réduction du MTT dans les cellules et altérer la performance de ce test54. Ce protocole permet d’effectuer facilement quatre tests de viabilité différents dans deux lignées cellulaires de poisson zèbre.

Ce protocole peut être utilisé pour étudier les effets des substances chimiques sur les poissons en utilisant des modèles in vitro . Différentes lignées cellulaires peuvent avoir des sensibilités différentes pour estimer les effets chimiques, même si elles appartiennent au même groupe de vertébrés, tels que les poissons. Par exemple, en comparant les lignées cellulaires ZFL et ZF4 avec des embryons de poisson, Langu-Mitea et al.21 ont démontré que ZFL est capable de générer des résultats similaires à ceux de l’essai de toxicité sur les embryons de poissons. Tanneberger et al.5 ont montré que les lignées cellulaires permanentes de poissons GSF, PLHC, RTG-2, RTgill-W1 et R1 ont des sensibilités différentes dans la prédiction de la toxicité chimique chez les poissons par rapport aux poissons in vivo (poissons adultes). Bien que RTgill-W1 (lignée cellulaire branchiale permanente de poisson) ait récemment été validée comme méthode alternative pour prédire la toxicité aiguë chez les poissons, l’applicabilité d’autres lignées cellulaires dans les études d’écotoxicité devrait être étudiée. Utilisation de lignées cellulaires de différentes espèces de poissons et origines tissulaires ainsi que de stades de développement (ZEM2S: embryon; ZFL : foie adulte) peut contribuer de manière significative aux études d’écotoxicité, car il peut traiter des effets liés à des stades spécifiques du développement des poissons et aux organes cibles. Ainsi, les effets chimiques devraient être étudiés à l’aide de différentes cultures cellulaires reflétant différents sites cibles chez les poissons (par exemple, foie, gonades, branchies, cerveau), et pas seulement dans une seule lignée cellulaire55.

Ces protocoles peuvent avoir différentes applications dans les études d’écotoxicité, et leur utilisation ne se limite pas nécessairement à la prédiction de la toxicité aiguë des poissons. Par exemple, ils peuvent être appliqués pour définir des concentrations sous-cytotoxiques afin d’effectuer d’autres tests de toxicité in vitro sur les poissons, tels que l’évaluation des effets perturbateurs endocriniens sur les poissons. En outre, les données de cytotoxicité in vitro peuvent également aider à développer et à améliorer la modélisation toxicocinétique physiologique (PBTK). Comme PBTK se concentre sur la distribution d’un produit chimique dans un organisme en tenant compte des différents organes (tels que les branchies, le foie ou l’intestin)56, l’utilisation de lignées cellulaires de différentes espèces de poissons et origines tissulaires peut être une source d’information utile pour ce modèle. Les résultats des essais biologiques in vitro (p. ex. essais de cytotoxicité) fournissent des données d’entrée représentant les processus biologiques dans le modèle PBTK et contribuent à l’extrapolation in vitro à in vivo 21,56.

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Disclosures

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Acknowledgments

En mémoire du Dr Márcio Lorencini, coauteur de cet ouvrage, excellent chercheur dans le domaine des cosmétiques et dévoué à la promotion de la recherche cosmétique au Brésil. Les auteurs remercient le Laboratoire multi-utilisateurs du Département de physiologie (UFPR) pour la disponibilité des équipements et le soutien financier de la Coordination pour l’amélioration du personnel de l’enseignement supérieur (CAPES, Brésil) (Code financier 001) et du Grupo Boticario.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5-CFDA, AM (5-Carboxyfluorescein Diacetate, Acetoxymethyl Ester) Invitrogen C1345
Cell culture plate, 96 well plate Sarstedt 83.3924 Surface: Standard, flat base
DMEM Gibco 12800-017 Powder, high glucose, pyruvate
FBS - Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions Gibco 12657-029
Ham's F-12 Nutrient Mix, powder Gibco 21700026 Powder
HEPES (1 M) Gibco 15630080
Leibovitz's L-15 Medium Gibco 41300021 Powder
Neutral red  Sigma-Aldrich N4638 Powder, BioReagent, suitable for cell culture
Orbital shaker  Warmnest KLD-350-BI 22 mm rotation diameter
Dulbeccos PBS (10X) with calcium and magnesium Invitrogen 14080055
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Gibco 15140122
Resazurin sodium salt  Sigma-Aldrich R7017 Powder, BioReagent, suitable for cell culture
RPMI 1640 Medium Gibco 31800-014 Powder
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S5761 Powder,  bioreagent for molecular biology
Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide  98% Sigma-Aldrich M2128
Trypan blue stain (0.4%) Gibco 15250-061
Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red Gibco 15400054
ZEM2S cell line ATCC CRL-2147 This cell line was kindly donated by Professor Dr. Michael J.
Carvan (University of Wisconsin, Milwaukee, USA)
ZFL cell line BCRJ 256

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Sciences de l’environnement numéro 191
Essais de cytotoxicité avec des lignées cellulaires de poisson zèbre
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