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Ensaios de citotoxicidade com linhagens celulares de peixe-zebra

Published: January 6, 2023 doi: 10.3791/64860
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 2, 2, 1, 3, 2, 3
1Graduate Program in Genetics, Department of Genetics, Federal University of Paraná (UFPR), 2Safety of Product Department, Grupo Boticário, 3Department of Genetics, Federal University of Paraná (UFPR)

Summary

Este protocolo apresenta ensaios de citotoxicidade comumente utilizados (ensaios de Alamar Blue [AB], CFDA-AM, Neutral Red e MTT) adaptados para a avaliação da citotoxicidade em linhagens celulares de embrião de peixe-zebra (ZEM2S) e fígado (ZFL) em placas de 96 poços.

Abstract

As linhagens celulares de peixes têm se tornado cada vez mais utilizadas em estudos de ecotoxicidade, e ensaios de citotoxicidade têm sido propostos como métodos para prever a toxicidade aguda de peixes. Assim, este protocolo apresenta ensaios de citotoxicidade modificados para avaliar a viabilidade celular em linhagens celulares de peixe-zebra (Danio rerio) embrionário (ZEM2S) e fígado (ZFL) em placas de 96 poços. Os desfechos de citotoxicidade avaliados são a integridade mitocondrial (ensaios de Alamar Blue [AB] e MTT), a integridade da membrana via atividade da esterase (ensaio CFDA-AM) e a integridade da membrana lisossômica (ensaio Vermelho Neutro [NR]). Após a exposição das substâncias em estudo numa placa de 96 poços, são realizados os ensaios de citotoxicidade; aqui, AB e CFDA-AM são realizados simultaneamente, seguidos de NR na mesma placa, enquanto o ensaio MTT é realizado em uma placa separada. As leituras para esses ensaios são tomadas por fluorescência para AB e CFDA-AM, e absorbância para MTT e NR. Os ensaios de citotoxicidade realizados com estas linhagens celulares de peixes podem ser utilizados para estudar a toxicidade aguda de substâncias químicas em peixes.

Introduction

As substâncias químicas têm de ser testadas quanto à sua segurança para a saúde humana e para o ambiente. Biomarcadores moleculares e celulares têm sido cada vez mais considerados em avaliações de segurança para predizer efeitos em organismos vivos por agências reguladoras e/ou legislações (por exemplo, REACH, OCDE, EUA EPA)1,2, uma vez que podem preceder o desfecho adverso in vivo (por exemplo, desregulação endócrina, resposta imunológica, toxicidade aguda, fototoxicidade)3,4,5,6,7 . Nesse contexto, a citotoxicidade tem sido tomada como medida para predizer a toxicidade aguda dos peixes 5,8; no entanto, pode ter muitas outras aplicações em estudos de ecotoxicidade, como a definição de concentrações subcitotóxicas de substâncias químicas para estudar seu conjunto mais diversificado de efeitos em peixes (por exemplo, efeitos desreguladores endócrinos).

Em sistemas de cultura celular (sistemas in vitro ), a citotoxicidade de substâncias químicas pode ser determinada por métodos diferentes nos tipos de parâmetros. Por exemplo, um método de citotoxicidade pode ser baseado em um desfecho relacionado à morfologia específica observada durante o processo de morte celular, enquanto outro pode determinar a citotoxicidade pela medição da morte celular, viabilidade e funcionalidade, morfologia, metabolismo energético e fixação e proliferação celular. As substâncias químicas podem afetar a viabilidade celular por meio de diferentes mecanismos, portanto, a avaliação da citotoxicidade abrangendo diferentes desfechos de viabilidade celular é necessária para predizer os efeitos químicos9.

MTT e Alamar Blue (AB) são ensaios que determinam os efeitos sobre a viabilidade celular com base na atividade metabólica celular. O ensaio MTT avalia a atividade da enzima mitocondrial succinato desidrogenase10. A redução do brometo amarelado de 3-[4,5-dimetiltiazol-2il]-2,5-difeniltetrazólio (MTT) para o azul formazano ocorre apenas em células viáveis, e sua densidade óptica é diretamente proporcional ao número de células viáveis10. O ensaio AB é um indicador sensível de oxidação-redução, mediado por enzimas mitocondriais que fluorescem e mudam de cor ao reduzir a resazurina a resorufina por células vivas11; no entanto, enzimas citosólicas e microssômicas também contribuem para a redução de AB e MTT12. Essas enzimas podem incluir várias redutases, como álcool e aldeído oxidorredutases, NAD(P)H: quinona oxidorredutase, flavina redutase, NADH desidrogenase e citocromos11.

O ensaio de Vermelho Neutro (NR) é um ensaio de viabilidade celular baseado na incorporação desse corante nos lisossomos de células viáveis13. A absorção de NR depende da capacidade das células de manter gradientes de pH. O gradiente de prótons dentro dos lisossomos mantém um pH inferior ao citoplasma. Em pH fisiológico normal, o NR apresenta uma carga líquida de aproximadamente zero, o que lhe permite penetrar nas membranas celulares. Assim, o corante torna-se carregado e é retido dentro dos lisossomos. Consequentemente, quanto maior a quantidade de NR retido, maior o número de células viáveis14. Substâncias químicas que danificam a superfície celular ou membranas lisossômicas prejudicam a absorção desse corante.

O ensaio CFDA-AM é um ensaio de viabilidade celular fluorométrico baseado na retenção de éster acetato de acetato de 5-carboxifluoresceína acetoximetílico (CFDA-AM)15. A 5-CFDA-AM, substrato da esterase, é convertida em carboxifluoresceína, substância fluorescente polar e não permeável por membranas de células vivas15; assim, é retido no lado interno de uma membrana celular intacta, indicando células viáveis.

Recentemente, três ensaios de citotoxicidade (ensaios CFDA-AM, NR e AB) foram combinados em uma diretriz ISO (International Organization for Standardization) validada (ISO 21115:2019)16 e método de teste da OCDE (Organização para a Cooperação e Desenvolvimento Econômico) (OCDE TG 249) para avaliar a toxicidade aguda de peixes usando a linhagem celular RTgill-W1 (linhagem celular permanente da guelra da truta arco-íris [Oncorhynchus mykiss]) em placas de 24 poços17 . Embora exista um método baseado em células para prever a toxicidade aguda dos peixes, esforços têm sido investidos no desenvolvimento de métodos semelhantes com outras espécies de peixes e no aumento do rendimento do método. Alguns exemplos incluem o desenvolvimento de linhagens celulares ZFL transfectadas com genes repórteres para vias de toxicidade específicas18,19, testes de fototoxicidade na linhagem celular RTgill-W1 20 e o uso de linhagens celulares ZFL e ZF4 (fibroblásticos de peixe-zebra derivados de embriões de 1 dia de idade) para avaliar a toxicidade por vários ensaios de citotoxicidade21.

Danio rerio (peixe-zebra) é uma das principais espécies de peixes utilizadas em estudos de toxicidade aquática; assim, métodos baseados em células com linhagens celulares de peixe-zebra para testes de toxicidade de peixes podem ser extremamente úteis. A linhagem celular ZFL é uma linhagem celular epitelial de hepatócitos zebrafish que apresenta as principais características das células parenquimatosas hepáticas e pode metabolizar xenobióticos 7,22,23,24,25. Enquanto isso, a linhagem celular ZEM2S é uma linhagem celular fibroblástica embrionária de peixe-zebra derivada do estágio de blástula que pode ser usada para investigar os efeitos do desenvolvimento em peixes26,27. Assim, este protocolo descreve quatro ensaios de citotoxicidade (ensaios de MTT, AB, NR e CFDA-AM), com modificações a serem realizadas com linhagens celulares ZFL e ZEM2S em placas de 96 poços.

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Protocol

NOTA: Consulte a Tabela de Materiais para a lista de materiais utilizados neste protocolo e a Tabela 1 para a composição das soluções e meios utilizados neste protocolo.

1. Preparação das células ZFL e ZEM2S

  1. Comece por um balão T75 de células ZFL ou ZEM2S com 80% de confluência, cultivadas no respectivo meio completo a 28 °C sem CO2.
  2. Retirar o meio de cultura do balão e lavar as células adicionando 10 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS) 1x (0,01 M). Adicionar 3 mL de tripsina 1x (0,05% v/v; tripsina-EDTA 0,5 mM) aos frascos de cultura. Incubar a 28 °C durante 3 min.
  3. Bater suavemente no balão para libertar as células e, em seguida, parar a digestão da tripsina adicionando 3 ml de meio de cultura completo ao balão.
  4. Transfira a suspensão celular para um tubo de centrífuga cônico de 15 mL e centrífuga a 100 × g por 5 min.
  5. Após a centrifugação, remova cuidadosamente o sobrenadante, adicione 1 mL de meio completo para as células ZFL ou ZEM2S e ressuspenda o pellet usando uma micropipeta.

2. Contagem de células por exclusão de corante azul de tripano

  1. Adicionar 10 μL da suspensão celular e 10 μL de corante azul de tripano a um microtubo para contar as células e avaliar a sua viabilidade. Misture a suspensão celular e o corante usando uma pipeta.
  2. Em seguida, transfira 10 μL dessa mistura (suspensão celular + azul de tripano) para uma câmara de Neubauer e conte as células nos quatro grandes quadrados (Quadrantes Q) colocados nos cantos da câmara, considerando que as células viáveis são aquelas que não ocupam azul tripano. Determine o número de células viáveis usando a equação (1):
    Equation 1 (1)
  3. Calcular o número final de células na suspensão celular multiplicando o número de células determinado utilizando a equação (1) por dois (o factor de diluição devido à utilização de azul de tripano).
    NOTA: Alternativamente, um sistema automatizado de contagem de células (por exemplo, um citômero com função de contagem de células e viabilidade) pode ser usado.

3. Revestimento de células em placas de 96 poços

  1. Calcular o volume de suspensão celular necessário para obter o número de células necessárias para realizar os ensaios de citotoxicidade. O número de células viáveis para cada linhagem celular é indicado abaixo:
    1. Placa 60.000 células ZEM2S viáveis por poço; assim, para toda a placa, utilizar seis milhões de células em 20 mL de meio completo (200 μL/poço, placa de 96 poços).
    2. Placa 40.000 células ZFL viáveis por poço; assim, para toda a placa, utilizar quatro milhões de células em 20 mL de meio completo (200 μL/poço, placa de 96 poços).
  2. Depois disso, transferir o respectivo volume da suspensão celular para um reservatório reagente (estéril) e encher com o meio de cultura completo para ZFL ou ZEM2S até 20 mL. Usando uma pipeta multicanal, misture a solução suavemente para cima e para baixo.
    NOTA: Tome cuidado para não formar espuma ou bolhas.
  3. Adicionar 200 μL da suspensão celular a cada poço de uma placa transparente de poliestireno de 96 poços usando a micropipeta multicanal. Incubar as placas a 28 °C durante 24 h.
    NOTA: A placa deve ter pelo menos três poços sem células para o controle em branco, e apenas meios completos devem ser adicionados a esses poços. O efeito de borda (causado por maior evaporação nos poços de borda) geralmente ocorre em ensaios de placas de 96 poços e pode afetar a viabilidade das células nos poços de borda da placa28. Esse efeito pode ser maior ou menor, dependendo da marca e do design da placa de 96 poços28. Embora não tenhamos notado nenhum distúrbio de crescimento/viabilidade celular para ZFL e ZEM2S nos poços de borda, sugerimos selar a placa com parafilme ou folha de vedação adesiva para evitar esse efeito, ou cultivar as células apenas nos 60 poços internos e encher os poços de borda com PBS.

4. Exposição das células ao produto químico em estudo

  1. Descarte cuidadosamente a mídia gasta dos poços usando uma micropipeta multicanal.
  2. Expor as células a produtos químicos de teste em diferentes concentrações. Preparar as soluções das concentrações químicas em estudo nos meios de cultura para ZFL ou ZEM2S sem soro fetal bovino (FBS) (meio de exposição). Em seguida, adicione 100 μL por poço dessas soluções em triplicado técnico (ou seja, três poços/concentração química de teste).
  3. Para os controlos, colocar os grupos de controlo na mesma placa que o produto químico em estudo em triplicados técnicos (três alvéolos/grupo de controlo). Assim, para o controle em branco (B), adicione 100 μL do meio de exposição nos poços livres de células, para o controle negativo (NC), adicione 100 μL do meio de exposição aos poços com células e, para o controle positivo (PC), exponha as células a uma solução de 1% de Triton X-100 preparada no meio de exposição. Em alguns casos, um controle de solvente (SC) deve ser incluído na placa, considerando uma concentração claramente não citotóxica como uma concentração final de solvente.
    NOTA: Recomenda-se o uso de DMSO a 0,5% como solvente; O DMSO pode ser usado até 1% como solvente nessas linhagens celulares sem exceder o limiar de citotoxicidade de 10% relacionado ao controle negativo.
  4. Incubar as placas a 28 °C durante 24 h. Sele as placas com parafilme ou folha de vedação adesiva para evitar a evaporação do meio de cultura.
    NOTA: Certos produtos químicos podem ter absorvância de fundo intrínseca ou fluorescência que podem interferir com a absorvância ou fluorescência do(s) corante(s) indicador(es) (por exemplo, compostos com cor podem influenciar a absorvência, albumina sérica29 e compostos que interferem com enzimas de redução30,31). Neste caso, a placa deve incluir um controlo adicional, adicionando soluções químicas de ensaio nos poços sem células. Isto é para verificar a possível interferência da auto-absorvência/autofluorescência química com os corantes. Se a interferência for detectada, deve-se avaliar se ela pode ser excluída para obter uma previsão correta da citotoxicidade.

5. Ensaios de citotoxicidade

NOTA: Prepare todas as soluções de acordo com a Tabela 1. Todas as etapas descritas abaixo (Figura 1) são realizadas em condições estéreis. O uso de uma pipeta para descartar o meio de exposição não é recomendado, porque as células podem facilmente se desprender dos poços após o tratamento químico.

  1. Ensaios AB e CFDA-AM
    1. Após 24 h de exposição ao produto químico em estudo, deitar cuidadosamente fora o meio de exposição, despejando o conteúdo numa bandeja de recolha.
    2. Lave a placa com 200 μL de PBS. Remova cuidadosamente o PBS despejando-o em uma bandeja de coleta para evitar a perda de células.
    3. Adicionar 100 μL por poço de solução AB/CFDA-AM. Incubar a placa durante 30 min no escuro a 28 °C.
    4. Meça a fluorescência em um leitor de placas de fluorescência a 530 nm (excitação) e 595 nm (emissão) para AB, e a 493 nm (excitação) e 541 nm (emissão) para CFDA-AM.
  2. Ensaio NR
    NOTA: As etapas para o ensaio de NR são realizadas imediatamente após os ensaios AB e CFDA-AM (Figura 1).
    1. Centrifugar a solução de trabalho NR (40 μg/mL) a 600 × g por 10 min.
      NOTA: A precipitação de NR no tubo não deve ser transferida para as placas. Assim, após a centrifugação da solução de trabalho NR, coletar o sobrenadante usando uma pipeta sem aspirar os precipitados NR. Transfira o sobrenadante para um reservatório de reagente.
    2. Remova cuidadosamente a solução AB/CFDA-AM despejando o conteúdo em uma bandeja de coleta.
    3. Adicione 100 μL por poço da solução de trabalho NR usando uma micropipeta multicanal. Incubar a placa a 28 °C durante 3 h.
      NOTA: Após a incubação de 3 h, observe se ocorreu precipitação de NR nas placas utilizando um microscópio. Os precipitados NR podem interferir na quantificação da viabilidade celular, portanto, não devem estar presentes.
    4. Remova cuidadosamente a solução NR despejando o conteúdo em uma bandeja de coleta. Lave os poços adicionando 150 μL de PBS por poço.
    5. Adicionar 150 μL por poço da solução de extração NR e incubar a placa em um agitador de placas por 10 minutos para agitar suavemente. Medir a absorvância a 540 nm num leitor de placas.
      NOTA: Deve ser efectuada uma segunda leitura a 690 nm para excluir qualquer absorvância de impressões digitais de fundo na placa.
  3. Ensaio MTT
    NOTA: O ensaio MTT deve ser efectuado separadamente dos ensaios acima descritos (numa nova placa) (figura 2).
    1. Remova cuidadosamente a mídia de exposição despejando o conteúdo em uma bandeja de coleta.
    2. Adicione 100 μL de solução de trabalho MTT por poço usando uma micropipeta multicanal. Incubar a placa a 28 °C durante 4 h.
    3. Descarte a solução de MTT despejando o conteúdo em uma bandeja de coleta.
    4. Adicionar 100 μL por poço de DMSO para extrair os cristais formazan, incubando a placa em um agitador de placas por 10 min. Medir a absorvância a 570 nm utilizando um leitor de placas.
      NOTA: Deve ser efectuada uma segunda leitura a 690 nm para excluir qualquer absorvância de impressões digitais de fundo na placa. É importante ressaltar que os produtos químicos em estudo podem interferir no MTT, que deve ser avaliado para garantir a qualidade dos dados gerados32. Para isso, poços livres de células contendo as concentrações de teste e MTT (0,5 mg/mL) devem ser expostos, seguidos de incubação para observar qualquer mudança de cor nos poços que possa aumentar a absorvância e levar a falsos resultados de viabilidade. Os produtos químicos que interagem com o MTT devem ser evitados neste ensaio.

6. Cálculo da viabilidade/citotoxicidade celular

NOTA: A absorvância bruta ou a fluorescência adquirida é utilizada para calcular a viabilidade celular em percentagem relacionada com o controlo negativo (para produtos químicos de ensaio preparados directamente em meios de exposição) ou com o controlo de solventes (para produtos químicos de ensaio preparados com solventes, tais como DMSO). Antes de determinar a porcentagem de viabilidade da célula, os dados brutos devem ser normalizados pelo controle em branco.

  1. Calcular a absorvância ou fluorescência média para cada concentração química de ensaio e grupo de controlo (três alvéolos/tratamento).
  2. Para determinar a percentagem de viabilidade celular em relação ao controlo (negativo ou solvente), utilize a equação (2):
    Equation 2 (2)
    NOTA: As unidades de absorvância (abs) ou fluorescência (fluo) representam a média da absorbância ou fluorescência medida nos três poços por concentração; em branco representa poços sem células.

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Representative Results

A Figura 3 mostra as placas dos ensaios AB, CFDA-AM, NR e MTT. Para o ensaio AB (Figura 3A), os poços em branco e os poços com nenhum ou menor número de células viáveis apresentam coloração azul e baixa fluorescência, enquanto os poços com alto número de células viáveis são rosados e apresentam altos valores de fluorescência devido à transformação da resazurina (AB) em resorufina (substância rosada) pelas células viáveis. Para o ensaio CFDA-AM, não há diferença visível na cor dos poços na placa; no entanto, a fluorescência é maior em poços contendo células viáveis devido à retenção de CFDA-AM e subsequente conversão em carboxifluoresceína (substância fluorescente).

Para o ensaio de NR (Figura 3B), os poços em branco devem ser transparentes com valores de absorbância muito baixos, uma vez que não há células para reter o corante NR. Em alguns casos, os poços em branco não são transparentes, indicando a ocorrência de precipitação de NR na placa; neste caso, isso não deve ser considerado um experimento válido. As concentrações altamente citotóxicas dos produtos químicos em estudo e do PC são transparentes ou apresentam uma cor rosa muito clara com baixos valores de absorvância, enquanto os poços contendo células viáveis retêm o corante NR e apresentam uma cor rosa escura e altos valores de absorvência.

Para o ensaio de MTT (Figura 3C), os poços em branco devem ser transparentes e com absorvância muito baixa, pois não há células para converter MTT em formazan. As concentrações altamente citotóxicas dos produtos químicos em estudo e do PC são transparentes ou apresentam uma cor violeta muito clara com baixos valores de absorbância, enquanto poços contendo células viáveis transformam o MTT (amarelo) em formazan (substância violeta), apresentando uma cor violeta mais escura com altos valores de absorbância.

A Figura 4A mostra um gráfico representativo da viabilidade celular após o cálculo, utilizando as médias dos valores de fluorescência ou absorbância por grupo. O gráfico pode ser plotado com a entrada de valores percentuais de viabilidade, calculados pela fórmula de cálculo de viabilidade apresentada na seção 6 do protocolo, utilizando um software de análise de dados. A viabilidade das células expostas ao SC não deve ser 10% menor do que na NC17. A percentagem de viabilidade celular para os produtos químicos em estudo é calculada em relação ao NC ou SC, dependendo da sua solubilidade. Neste caso, são utilizadas diferentes concentrações de DMSO como substância de ensaio e a viabilidade celular está relacionada com NC, que é definida como 100% de viabilidade.

Os dados de viabilidade celular podem ser utilizados para calcular a meia concentração inibitória máxima (CI50) dos produtos químicos em estudo por transformação logarítmica e a curva padrão interpolada por regressão não linear após replicações apropriadas33,34,35. A Figura 4B mostra o CI50, calculado a partir do percentual de viabilidade mostrado na Figura 4A. O IC50 foi obtido com pelo menos três repetições técnicas e três repetições experimentais utilizando concentrações nominais no ensaio AB. As análises foram realizadas com cinco concentrações diferentes das substâncias em estudo; no entanto, um maior número de concentrações pode ser necessário, dependendo do tipo de experimento. Por exemplo, são recomendadas oito concentrações de ensaio para o ensaio de determinação da gama, que é geralmente realizado para determinar as concentrações finais de ensaio de uma substância química para uma experiência. Como os ensaios de viabilidade têm diferentes desfechos de citotoxicidade, recomenda-se o cálculo do CI50 para cada ensaio realizado separadamente para identificar diferenças de sensibilidade causadas por diferentes mecanismos de ação das substâncias químicas ou diferenças de sensibilidade entre linhagens celulares. As diferenças nos valores de CI50 dos produtos químicos testados em diferentes linhagens celulares também podem variar dependendo do tipo de meio de cultura utilizado, uma vez que diferenças na composição relacionada a proteínas e lipídios podem impactar a biodisponibilidade química36. Além disso, a citotoxicidade de muitos produtos químicos pode ser avaliada através destes ensaios. O IC50 de outros produtos químicos avaliados nas linhagens celulares ZFL e ZEM2S é mostrado na Figura 4B-H.

Figure 1
Figura 1: Protocolo esquemático dos ensaios AB, CFDA-AM e NR realizados na mesma placa de 96 poços. Abreviaturas: AB = Alamar Blue; CFDA-AM = éster acetato de diacetato de 5-carboxifluoresceína; NR = Vermelho Neutro; PBS = solução salina tamponada com fosfato. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Protocolo esquemático do ensaio MTT realizado em placa de 96 poços. Abreviatura: MTT = brometo de 3-[4,5-dimetiltiazol-2il]-2,5-difeniltetrazólio. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Resultados representativos dos ensaios AB, CFDA-AM, NR e MTT. As imagens mostram as diferenças de cor nos poços para controles e concentrações de teste nos ensaios (A) AB e CFDA-AM, (B) NR e (C) MTT. Abreviaturas: AB = Alamar Blue; CFDA-AM = éster acetato de diacetato de 5-carboxifluoresceína; NR = Vermelho Neutro; PBS = solução salina tamponada com fosfato; B = poços em branco (poços livres de células); SC = controle de solventes (0,5% de DMSO); NC = controle negativo (células em meio de cultura); PC = controle positivo (1% Triton X-100). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Cálculo da viabilidade celular e dos dados de viabilidade para diferentes produtos químicos de ensaio. O cálculo da viabilidade celular utilizando os dados de leitura pode ser expresso como a percentagem (%) de viabilidade celular relacionada com o NC ou SC (A). A citotoxicidade de um produto químico pode ser avaliada utilizando os dados de viabilidade para interpolar uma curva padrão por regressão não linear para diferentes produtos químicos em estudo (B-H). Os dados são representados como média de viabilidade celular (pontos) e desvio padrão (barras) de três replicações técnicas e três repetições experimentais (ensaio AB). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: Ensaio de MTT realizado em células ZFL e ZEM2S cultivadas na presença (10%) e ausência (0%, completamente privadas de FBS) de FBS por 24 h. (A) As células ZFL a 0% e 10% de FBS não apresentam diferença significativa na viabilidade celular pelo teste de Kruskall-Wallis (p = 0,2286). (B) As células ZEM2S a 0% e 10% de FBS não apresentam diferença significativa na viabilidade celular pelo teste de Mann-Whitney (p = 0,3429). Considerou-se nível de significância de p < 0,05. Os dados são expressos em mediana e intervalo interquartil de três replicações técnicas. Abreviaturas: n.s. = sem diferença significativa; FBS = soro fetal bovino; MTT = brometo de 3-[4,5-dimetiltiazol-2il]-2,5-difeniltetrazólio. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6: Ensaios de MTT e NR realizados em células ZFL e ZEM2S tratadas (24 h) com DMSO em diferentes concentrações (0,1%, 0,5% e 1%) e controle negativo. As células ZFL tratadas com DMSO em qualquer concentração testada não mostraram uma diferença significativa na viabilidade celular relacionada à NC pelo ensaio (A) MTT (p = 0,074) e (B) ensaio NR (p = 0,216). As células ZEM2S tratadas com DMSO não mostraram diferença significativa na viabilidade celular relacionada à NC pelo ensaio (C) MTT (p = 0,422) e (D) NR (p = 0,287). Considerou-se nível de significância de p < 0,05 no teste de Kruskall-Wallis. Os dados são expressos em mediana e intervalo interquartil de três replicações técnicas. Abreviaturas: n.s. = sem diferença significativa; CN = controle negativo; MTT = brometo de 3-[4,5-dimetiltiazol-2il]-2,5-difeniltetrazólio; NR = Vermelho Neutro. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Soluções e mídias utilizadas neste protocolo. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.

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Discussion

Os ensaios de citotoxicidade são amplamente utilizados para avaliação de toxicidade in vitro, e este artigo de protocolo apresenta quatro ensaios de citotoxicidade comumente utilizados modificados para serem realizados em linhagens celulares de peixe-zebra (ou seja, densidade celular para placa de 96 poços, tempo de incubação no ensaio MTT, depleção de FBS durante a condição de exposição química e concentração máxima aceitável para o SC). Como esses ensaios quantificam a citotoxicidade por diferentes desfechos de viabilidade celular (função metabólica, integridade da membrana lisossômica e integridade da membrana celular), a combinação dos mesmos fornece uma avaliação precisa da citotoxicidade química em linhagens celulares de peixe-zebra. Este protocolo também recomenda a cultura de linhagens celulares ZFL e ZEM2S em condição livre de CO2, devido à sua composição de meios de cultura que podem tamponar adequadamente o sistema de cultura, mantendo o pH em 7,4 (pH fisiológico). A composição do meio de cultura e o ambiente livre de CO2 propostos neste protocolo para ambas as linhagens celulares são amplamente relatados na literatura. A linhagem celular ZFL é geralmente cultivada em meios L-15 e RPMI com ou sem a adição de bicarbonato de sódio e sem CO2 37,38,39,40,41,42,43. Enquanto isso, a linhagem celular ZEM2S é cultivada de acordo com as instruções do centro de biorrecursos, e seu meio de cultura é formulado para culturas livres de CO2; assim, o CO2 e a mistura de ar podem ser prejudiciais às células quando se utiliza esse tipo de meio de cultura44.

A exposição química em um meio de cultura sem adição de FBS foi realizada com base em estudos publicados, mostrando que a biodisponibilidade das substâncias químicas em ensaios in vitro é significativamente impactada por sua ligação às proteínas séricas. Por exemplo, Chen et al.45 mostraram que a presença de proteínas séricas no ensaio RTgill-W1 poderia reduzir a biodisponibilidade de um surfactante catiônico (C12-benzalcônio) em até três vezes e meia. O produto químico ligado à FBS variou geralmente de 47% a 90% no meio de cultura45. Assim, para evitar esse problema, avaliamos a viabilidade celular das células ZFL e ZEM2S em culturas completamente privadas de FBS por 24 h utilizando o ensaio MTT. Os resultados não mostraram diferença significativa na viabilidade celular das culturas ZFL ou ZEM2S com (10%) e sem (0%) FBS, indicando que essas linhagens celulares de peixe-zebra podem ser submetidas a tratamento químico em meios de cultura privados de FBS (Figura 5). É importante ressaltar que a diminuição da quantidade de FBS pode causar outras consequências na biodisponibilidade química. Por exemplo, os produtos químicos lipofílicos têm maior sorção para materiais de laboratório e placas plásticas, reduzindo a biodisponibilidade química36. No entanto, a presença de FBS no meio de cultura pode diminuir a ligação plástica devido a constituintes séricos competirem com o plástico para ligação aos produtos químicos46. A melhor decisão relacionada com a percentagem de suplementação de FBS ou a sua privação completa pode depender do tipo do produto químico em estudo. Por exemplo, Pomponio et al.46 relataram que, embora a amiodarona química tenha maior ligação ao plástico na ausência de FBS, sua biodisponibilidade é ainda menor quando se utiliza 10% de FBS. Para a mono-N-desetilamiodarona, quase a mesma quantidade está ligada ao meio sérico e às paredes46.

Solventes orgânicos (por exemplo, DMSO) são geralmente recomendados para serem usados até 0,5% em ensaios in vitro. No entanto, essa baixa concentração pode prejudicar o teste de concentrações mais altas de produtos químicos solúveis em água pobres. Para evitar esse problema, avaliamos se concentrações mais altas de DMSO eram adequadas para linhagens celulares ZFL e ZEM2S que não excedessem o limiar de citotoxicidade de 10%. Para isso, células não tratadas (NCs) e células tratadas (24 h) com diferentes concentrações de DMSO (0,1%, 0,5% e 1%) foram processadas para os ensaios de MTT e NR. Os resultados não mostraram diferença significativa na viabilidade celular do grupo de tratamento em relação às CNs (Figura 6), indicando que, nessas condições específicas, concentrações de DMSO de até 1% podem ser utilizadas. Outras linhagens celulares de peixes também suportam concentrações de DMSO superiores a 0,5%, o que não é uma particularidade das linhagens celulares ZFL e ZEM2S. Por exemplo, concentrações máximas de solvente de até 2% de DMSO (sem efeito citotóxico observado) foram aplicadas em ensaios de citotoxicidade usando CHSE-214 (linhagem celular derivada do embrião de Oncorhynchus tshawytscha)47, RTG-2 (linhagem celular gonadal de Oncorhynchus mykiss)48,49,50 e PLHC-1 (linhagem celular de carcinoma hepatocelular de Poeciliopsis lucida)48 Células. A concentração máxima de solvente de 1% de DMSO também tem sido utilizada em ensaios de citotoxicidade utilizando células RTL-W1 (linhagem celular gonadal de Oncorhynchus mykiss)51 e CCO (linhagem celular de ovário de Ictalurus punctatus)52. De acordo com Mori e Wakabayashi47, as linhagens celulares de peixes podem ter uma sensibilidade menor ao DMSO do que as linhagens celulares de mamíferos. No entanto, é importante destacar que a concentração máxima aceitável de 1% de DMSO foi definida exclusivamente para citotoxicidade, e isso deve ser cuidadosamente avaliado para outros desfechos (por exemplo, genotoxicidade, epigenética, análise de expressão gênica codificadora de proteínas) em linhagens celulares ZFL e ZEM2S.

Os ensaios de MTT e AB são baseados na atividade metabólica para determinar a viabilidade celular. Embora o ensaio MTT seja o ensaio de viabilidade mais utilizado, em comparação com o ensaio AB pode ser um pouco menos sensível, superestimando a viabilidade celular em alguns casos53. A maior sensibilidade do ensaio AB pode estar relacionada ao método de medição, uma vez que a medida por fluorescência é mais sensível que a medida colorimétrica15. No entanto, tanto os ensaios AB quanto o MTT são ensaios de alta qualidade para identificar substâncias químicas citotóxicas, e seus dados gerados têm sido usados para classificar substâncias químicas perigosas de acordo com seu potencial citotóxico intrínseco53.

A ideia de realizar o ensaio AB, CFDA-AM e NR na mesma placa foi baseada no ensaio OCDE TG 249 (RTgill-W1)17; no entanto, modificações foram feitas para realizar esses ensaios em placas de 96 poços, bem como para ser adequado para linhagens celulares de peixe-zebra. Ensaios em placas de 96 poços, em vez de placas de 24 poços, podem ser vantajosos para testes de citotoxicidade de alto rendimento em linhagens celulares de peixes. Além disso, o ensaio RTgill-W1 usa apenas o meio de cultura L-15, enquanto as linhagens celulares ZFL e ZEM2S são cultivadas em um meio contendo D-glicose. O meio de cultura possibilita a realização do ensaio de MTT nessas linhagens celulares, uma vez que linhagens celulares cultivadas em meio livre de glicose (por exemplo, apenas L-15) podem diminuir imediatamente a redução de MTT nas células e prejudicar o desempenho desse ensaio54. Este protocolo permite que quatro ensaios de viabilidade diferentes sejam facilmente realizados em duas linhagens celulares de peixe-zebra.

Este protocolo pode ser usado para estudar os efeitos de substâncias químicas em peixes usando modelos in vitro . Diferentes linhagens celulares podem ter diferentes sensibilidades para estimar os efeitos químicos, mesmo que sejam do mesmo grupo de vertebrados, como os peixes. Por exemplo, comparando linhagens celulares ZFL e ZF4 com embriões de peixes, Langu-Mitea et al.21 demonstraram que a ZFL é capaz de gerar resultados semelhantes em comparação com o teste de toxicidade embrionária de peixes. Tanneberger et al.5 mostraram que as linhagens celulares permanentes de peixes GSF, PLHC, RTG-2, RTgill-W1 e R1 têm sensibilidades diferentes na predição da toxicidade química de peixes em comparação com in vivo (peixes adultos). Embora o RTgill-W1 (linhagem celular permanente das brânquias de peixe) tenha sido recentemente validado como um método alternativo para predizer a toxicidade aguda dos peixes, a aplicabilidade de outras linhagens celulares em estudos de ecotoxicidade deve ser investigada. Usando linhagens celulares de diferentes espécies de peixes e origens de tecidos, bem como estágios de desenvolvimento (ZEM2S: embrião; ZFL: fígado adulto) pode contribuir significativamente para estudos de ecotoxicidade, uma vez que pode abordar os efeitos relacionados com fases específicas do desenvolvimento dos peixes e órgãos-alvo. Assim, os efeitos químicos devem ser investigados usando diferentes culturas celulares que refletem diferentes locais-alvo em peixes (por exemplo, fígado, gônadas, guelra, cérebro), e não apenas em uma única linhagem celular55.

Esses protocolos podem ter diferentes aplicações em estudos de ecotoxicidade, e seu uso não se limita necessariamente à previsão da toxicidade aguda dos peixes. Por exemplo, eles podem ser aplicados para definir concentrações subcitotóxicas para realizar outros testes de toxicidade em peixes in vitro, como avaliar os efeitos de desregulação endócrina em peixes. Além disso, os dados de citotoxicidade in vitro também podem ajudar a desenvolver e melhorar a modelagem toxicocinética de base fisiológica (PBTK). Como o PBTK se concentra na distribuição de um produto químico em um organismo considerando os diferentes órgãos (como a guelra, o fígado ou o intestino)56, o uso de linhagens celulares de diferentes espécies de peixes e origens de tecidos pode ser uma fonte útil de informações para esse modelo. Os resultados de bioensaios in vitro (por exemplo, ensaios de citotoxicidade) fornecem dados de entrada que representam processos biológicos no modelo PBTK e contribuem para a extrapolação in vitro para in vivo 21,56.

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Disclosures

Os autores declaram não haver conflito de interesses.

Acknowledgments

Em memória do Dr. Márcio Lorencini, coautor deste trabalho, excelente pesquisador na área de cosméticos e dedicado à promoção da pesquisa cosmética no Brasil. Os autores agradecem ao Laboratório Multiusuário do Departamento de Fisiologia (UFPR) pela disponibilidade de equipamentos e pelo apoio financeiro da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES, Brasil) (Código Financeiro 001) e do Grupo Boticário.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5-CFDA, AM (5-Carboxyfluorescein Diacetate, Acetoxymethyl Ester) Invitrogen C1345
Cell culture plate, 96 well plate Sarstedt 83.3924 Surface: Standard, flat base
DMEM Gibco 12800-017 Powder, high glucose, pyruvate
FBS - Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions Gibco 12657-029
Ham's F-12 Nutrient Mix, powder Gibco 21700026 Powder
HEPES (1 M) Gibco 15630080
Leibovitz's L-15 Medium Gibco 41300021 Powder
Neutral red  Sigma-Aldrich N4638 Powder, BioReagent, suitable for cell culture
Orbital shaker  Warmnest KLD-350-BI 22 mm rotation diameter
Dulbeccos PBS (10X) with calcium and magnesium Invitrogen 14080055
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Gibco 15140122
Resazurin sodium salt  Sigma-Aldrich R7017 Powder, BioReagent, suitable for cell culture
RPMI 1640 Medium Gibco 31800-014 Powder
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S5761 Powder,  bioreagent for molecular biology
Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide  98% Sigma-Aldrich M2128
Trypan blue stain (0.4%) Gibco 15250-061
Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red Gibco 15400054
ZEM2S cell line ATCC CRL-2147 This cell line was kindly donated by Professor Dr. Michael J.
Carvan (University of Wisconsin, Milwaukee, USA)
ZFL cell line BCRJ 256

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