Summary
Detta protokoll presenterar vanliga cytotoxicitetsanalyser (Alamar Blue [AB], CFDA-AM, Neutral Red och MTT-analyser) anpassade för bedömning av cytotoxicitet i zebrafiskembryon (ZEM2S) och lever (ZFL) cellinjer i 96-brunnsplattor.
Abstract
Fiskcellinjer har blivit alltmer använda i ekotoxicitetsstudier, och cytotoxicitetsanalyser har föreslagits som metoder för att förutsäga akut toxicitet hos fisk. Således presenterar detta protokoll cytotoxicitetsanalyser modifierade för att utvärdera cellviabilitet i zebrafisk (Danio rerio) embryo (ZEM2S) och lever (ZFL) cellinjer i 96-brunnsplattor. De utvärderade cytotoxicitetseffektmåtten är mitokondriell integritet (Alamar Blue [AB] och MTT-analyser), membranintegritet via esterasaktivitet (CFDA-AM-analys) och lysosomal membranintegritet (Neutral Red [NR] -analys). Efter exponering av testämnena i en platta med 96 brunnar utförs cytotoxicitetstesterna. här utförs AB och CFDA-AM samtidigt, följt av NR på samma platta, medan MTT-analysen utförs på en separat platta. Avläsningarna för dessa analyser görs genom fluorescens för AB och CFDA-AM och absorbans för MTT och NR. De cytotoxicitetsanalyser som utförs med dessa fiskcellinjer kan användas för att studera den akuta toxiciteten hos kemiska ämnen på fisk.
Introduction
Kemiska ämnen måste testas med avseende på deras säkerhet för människors hälsa och miljön. Molekylära och cellulära biomarkörer har i allt högre grad övervägts i säkerhetsbedömningar för att förutsäga effekter på levande organismer av tillsynsmyndigheter och/eller lagstiftning (t.ex. REACH, OECD, US EPA)1,2, eftersom de kan föregå det negativa resultatet in vivo (t.ex. endokrina störningar, immunologiskt svar, akut toxicitet, fototoxicitet)3,4,5,6,7 . I detta sammanhang har cytotoxicitet använts som ett mått för att förutsäga akut toxicitethos fisk 5,8. Det kan dock ha många andra tillämpningar i ekotoxicitetsstudier, såsom att definiera subcytotoxiska koncentrationer av kemiska ämnen för att studera deras mest olika uppsättning effekter på fisk (t.ex. hormonstörande effekter).
I cellodlingssystem (in vitro-system ) kan kemiska substansers cytotoxicitet bestämmas med metoder som skiljer sig åt i typen av endpoints. Till exempel kan en cytotoxicitetsmetod baseras på en slutpunkt relaterad till specifik morfologi observerad under celldödsprocessen, medan en annan kan bestämma cytotoxicitet genom mätning av celldöd, livskraft och funktionalitet, morfologi, energimetabolism och cellbindning och proliferation. Kemiska substanser kan påverka cellviabiliteten genom olika mekanismer, och därför är cytotoxicitetsbedömning som omfattar olika endpoints för cellviabilitet nödvändig för att förutsäga kemiska effekter9.
MTT och Alamar Blue (AB) är analyser som bestämmer effekter på cellviabilitet baserat på cellmetabolisk aktivitet. MTT-analysen utvärderar aktiviteten hos det mitokondriella enzymet succinatdehydrogenas10. Reduktionen av gulaktig 3-[4,5-dimetyltiazol-2yl]-2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT) till formazanblått sker endast i viabla celler, och dess optiska densitet är direkt proportionell mot antalet viabla celler10. AB-analysen är en känslig oxidationsreduktionsindikator, medierad av mitokondriella enzymer som fluorescerar och ändrar färg när resazurin reduceras till resorufin av levande celler11; cytosoliska och mikrosomala enzymer bidrar emellertid också till minskningen av AB och MTT12. Dessa enzymer kan innefatta flera reduktaser, såsom alkohol- och aldehydoxidoreduktaser, NAD(P)H: kinonoxidoreduktas, flavinreduktas, NADH-dehydrogenas och cytokromer11.
Neutralröd (NR) -analysen är en cellviabilitetsanalys baserad på införlivandet av detta färgämne i lysosomerna i livskraftiga celler13. Upptaget av NR beror på cellernas förmåga att upprätthålla pH-gradienter. Protongradienten inuti lysosomerna upprätthåller ett pH lägre än cytoplasman. Vid normalt fysiologiskt pH presenterar NR en nettoladdning på ungefär noll, vilket gör det möjligt att penetrera cellmembran. Således blir färgämnet laddat och behålls inuti lysosomerna. Följaktligen, ju större mängden kvarhållen NR, desto större är antalet viabla celler14. Kemiska ämnen som skadar cellytan eller lysosomala membran försämrar upptaget av detta färgämne.
CFDA-AM-analysen är en fluorometrisk cellviabilitetsanalys baserad på retention av 5-karboxifluoresceindiacetatacetoximetylester (CFDA-AM)15. 5-CFDA-AM, ett esterassubstrat, omvandlas till karboxifluorescein, en fluorescerande substans som är polär och icke-permeabel genom membran av levande celler15; Således behålls den i insidan av ett intakt cellmembran, vilket indikerar livskraftiga celler.
Nyligen kombinerades tre cytotoxicitetsanalyser (CFDA-AM, NR och AB-analyser) i en validerad ISO-riktlinje (International Organization for Standardization) (ISO 21115:2019)16 och OECD (Organisationen för ekonomiskt samarbete och utveckling) testmetod (OECD TG 249) för att utvärdera akut toxicitet hos fisk med hjälp av RTgill-W1-cellinjen (permanent cellinje från regnbåge [Oncorhynchus mykiss] gill) i 24-brunnsplattor17 . Även om det finns en befintlig cellbaserad metod för att förutsäga akut toxicitet hos fisk har ansträngningar gjorts för att utveckla liknande metoder med andra fiskarter och öka metodens genomströmning. Några exempel är utvecklingen av ZFL-cellinjer transfekterade med rapportgener för specifika toxicitetsvägar18,19, fototoxicitetstester i RTgill-W1-cellinjen 20 och användningen av ZFL- och ZF4-cellinjer (zebrafisk fibroblastisk härledd från 1 dag gamla embryon) för att bedöma toxicitet genom flera cytotoxicitetsanalyser21.
Danio rerio (zebrafisk) är en av de viktigaste fiskarterna som används i akvatiska toxicitetsstudier. Således kan cellbaserade metoder med zebrafiskcellinjer för testning av toxicitet på fisk vara extremt användbara. ZFL-cellinjen är en zebrafiskepitelial hepatocytcellinje som presenterar de viktigaste egenskaperna hos leverparenkymala celler och kan metabolisera xenobiotika 7,22,23,24,25. Under tiden är ZEM2S-cellinjen en embryonal zebrafiskfibroblastisk cellinje härledd från blastulastadiet som kan användas för att undersöka utvecklingseffekter på fisk26,27. Således beskriver detta protokoll fyra cytotoxicitetsanalyser (MTT-, AB-, NR- och CFDA-AM-analyser), med modifieringar som ska utföras med ZFL- och ZEM2S-cellinjer i 96-brunnsplattor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Se materialförteckningen för listan över material som används i detta protokoll och tabell 1 för sammansättningen av lösningar och medier som används i detta protokoll.
1. Förbereda ZFL- och ZEM2S-celler
- Börja med en T75-kolv med ZFL- eller ZEM2S-celler med 80 % sammanflöde, odlad i respektive komplett medium vid 28 °C utan CO2.
- Ta bort odlingsmediet från kolven och tvätta cellerna genom att tillsätta 10 ml 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) (0,01 M). Tillsätt 3 ml 1x trypsin (0,05% v / v; 0,5 mM trypsin-EDTA) till odlingskolvarna. Inkubera vid 28 °C i 3 minuter.
- Knacka försiktigt på kolven för att frigöra cellerna och stoppa sedan trypsinuppslutningen genom att tillsätta 3 ml komplett odlingsmedium till kolven.
- Överför cellsuspensionen till ett 15 ml koniskt centrifugrör och centrifugera vid 100 × g i 5 minuter.
- Efter centrifugering, avlägsna försiktigt supernatanten, tillsätt 1 ml komplett medium för ZFL- eller ZEM2S-celler och återsuspendera pelleten med en mikropipett.
2. Cellräkning genom trypanblå färguteslutning
- Tillsätt 10 μL av cellsuspensionen och 10 μL trypanblått färgämne till ett mikrorör för att räkna cellerna och utvärdera deras livskraft. Blanda cellsuspensionen och färgämnet med en pipett.
- Överför sedan 10 μL av denna blandning (cellsuspension + trypanblått) till en Neubauer-kammare och räkna cellerna i de fyra stora rutorna (kvadranter Q) placerade i kammarens hörn, med tanke på att livskraftiga celler är de som inte tar upp trypanblått. Bestäm antalet livskraftiga celler med ekvation (1):
(1) - Beräkna det slutliga cellnumret i cellsuspensionen genom att multiplicera det celltal som bestämts med ekvation (1) med två (utspädningsfaktorn på grund av användning av trypanblått).
OBS: Alternativt kan ett automatiserat cellräkningssystem (t.ex. en cytomer med cellräkning och viabilitetsfunktion) användas.
(1)3. Cellplätering i 96-brunnsplattor
- Beräkna den cellsuspensionsvolym som behövs för att erhålla det antal celler som krävs för att utföra cytotoxicitetsanalyserna. Antalet viabla celler för varje cellinje anges nedan:
- Platta 60 000 livskraftiga ZEM2S-celler per brunn; Således, för hela plattan, använd sex miljoner celler i 20 ml komplett medium (200 μL / brunn, 96-brunnsplatta).
- Platta 40 000 livskraftiga ZFL-celler per brunn; Således, för hela plattan, använd fyra miljoner celler i 20 ml komplett medium (200 μL / brunn, 96-brunnsplatta).
- Därefter överför den respektive volymen av cellsuspensionen till en reagensbehållare (steril) och fyll upp med hela odlingsmediet för ZFL eller ZEM2S till 20 ml. Blanda lösningen försiktigt upp och ner med en flerkanalig pipett.
OBS: Var försiktig så att du inte bildar skum eller bubblor. - Tillsätt 200 μL av cellsuspensionen till varje brunn på en transparent polystyrenplatta med 96 brunnar med hjälp av flerkanalig mikropipett. Inkubera plattorna vid 28 °C i 24 timmar.
OBS: Plattan måste ha minst tre brunnar utan celler för blindkontrollen, och endast hela medier bör läggas till dessa brunnar. Kanteffekten (orsakad av högre avdunstning i kantbrunnarna) förekommer vanligen i plattanalyser med 96 brunnar och kan påverka livskraften hos cellerna i kantbrunnarna på plattan28. Denna effekt kan vara högre eller lägre beroende på 96-brunnsplattans märke och design28. Även om vi inte märkte någon celltillväxt / livskraftstörning för ZFL och ZEM2S i kantbrunnarna, föreslår vi att plattan förseglas med parafilm eller självhäftande tätningsfolie för att förhindra denna effekt, eller odlar cellerna endast i de 60 inre brunnarna och fyller kantbrunnarna med PBS.
4. Exponering av celler för testkemikalie
- Kassera försiktigt det använda mediet från brunnarna med en flerkanalig mikropipett.
- Exponera cellerna för testkemikalier i olika koncentrationer. Bered lösningarna med testkemikaliekoncentrationerna i odlingsmediet för ZFL eller ZEM2S utan fetalt bovint serum (FBS) (exponeringsmedier). Tillsätt sedan 100 μl per brunn av dessa lösningar i tekniskt tre exemplar (dvs. tre brunnar/testkemikaliekoncentration).
- För kontroller, placera kontrollgrupperna på samma platta som testkemikalien i tekniska tripplar (tre brunnar/kontrollgrupp). För blindkontrollen (B) tillsätt sålunda 100 μL av exponeringsmediet i de cellfria brunnarna, för den negativa kontrollen (NC) tillsätt 100 μL av exponeringsmediet till brunnar med celler och för den positiva kontrollen (PC) exponera cellerna för en lösning av 1% Triton X-100 beredd i exponeringsmediet. I vissa fall bör en lösningsmedelskontroll inkluderas i plattan, med en klart icke-cytotoxisk koncentration som en slutlig lösningsmedelskoncentration.
OBS: Det rekommenderas att använda 0,5% DMSO som lösningsmedel; DMSO kan användas upp till 1% som lösningsmedel i dessa cellinjer utan att överskrida cytotoxicitetströskeln på 10% relaterad till den negativa kontrollen. - Inkubera plattorna vid 28 °C i 24 timmar. Försegla plattorna med parafilm eller självhäftande tätningsfolie för att förhindra avdunstning av odlingsmediet.
OBS: Vissa kemikalier kan ha inneboende bakgrundsabsorbans eller fluorescens som kan störa absorbansen eller fluorescensen hos indikatorfärgämnet (färgämnena) (t.ex. föreningar med färg kan påverka absorbansen, serumalbumin29 och föreningar som stör reduktionsenzymerna30,31). I detta fall måste plattan innehålla en ytterligare kontroll genom tillsats av testkemiska lösningar i brunnarna utan celler. Detta för att verifiera eventuell interferens av den kemiska autoabsorbansen/autofluorescensen med färgämnena. Om interferens upptäcks bör man utvärdera om den kan uteslutas för att få en korrekt förutsägelse av cytotoxicitet.
5. Cytotoxicitetsanalyser
OBS: Förbered alla lösningar enligt tabell 1. Alla steg som beskrivs nedan (figur 1) utförs under sterila förhållanden. Användning av en pipett för att kassera exponeringsmediet rekommenderas inte, eftersom cellerna lätt kan lossna från brunnarna efter kemisk behandling.
- AB och CFDA-AM analyser
- Efter 24 timmars exponering för testkemikalien kasseras exponeringsmediet försiktigt genom att hälla innehållet i en uppsamlingsbricka.
- Tvätta plattan med 200 μL PBS. Ta försiktigt bort PBS genom att hälla den i ett uppsamlingsfack för att undvika att förlora celler.
- Tillsätt 100 μL per brunn AB/CFDA-AM-lösning. Inkubera plattan i 30 minuter i mörker vid 28 °C.
- Mät fluorescensen i en fluorescensplattläsare vid 530 nm (excitation) och 595 nm (emission) för AB, och vid 493 nm (excitation) och 541 nm (emission) för CFDA-AM.
- NR-analys
OBS: Stegen för NR-analysen utförs omedelbart efter AB- och CFDA-AM-analyserna (figur 1).- Centrifugera NR-arbetslösningen (40 μg/ml) vid 600 × g i 10 minuter.
OBS: Utfällning av NR i röret får inte överföras till plattorna. Således, efter centrifugering av NR-arbetslösningen, samla supernatanten med en pipett utan att aspirera NR-utfällningarna. Överför supernatanten till en reagensbehållare. - Ta försiktigt bort AB/CFDA-AM-lösningen genom att hälla innehållet i en uppsamlingsbricka.
- Tillsätt 100 μL per brunn av NR-arbetslösningen med en flerkanalig mikropipett. Inkubera plattan vid 28 °C i 3 timmar.
OBS: Efter 3 h inkubation, observera om NR utfällning inträffade i plattorna med hjälp av ett mikroskop. NR-fällningar kan störa kvantifieringen av cellviabiliteten, så de bör inte vara närvarande. - Ta försiktigt bort NR-lösningen genom att hälla innehållet i en uppsamlingsbricka. Tvätta brunnarna genom att tillsätta 150 μL PBS per brunn.
- Tillsätt 150 μl per brunn av NR-extraktionslösningen och inkubera plattan på en plattskakare i 10 minuter för försiktig skakning. Mät absorbansen vid 540 nm i en plattläsare.
Anmärkning: En andra avläsning vid 690 nm bör utföras för att utesluta eventuell bakgrundsabsorbans för fingeravtryck i plattan.
- Centrifugera NR-arbetslösningen (40 μg/ml) vid 600 × g i 10 minuter.
- MTT-analys
Anmärkning: MTT-testet skall utföras separat från de tester som beskrivs ovan (på en ny platta) (figur 2).- Ta försiktigt bort exponeringsmediet genom att hälla innehållet i ett uppsamlingsfack.
- Tillsätt 100 μL MTT-arbetslösning per brunn med en flerkanalig mikropipett. Inkubera plattan vid 28 °C i 4 timmar.
- Kassera MTT-lösningen genom att hälla innehållet i ett uppsamlingsfack.
- Tillsätt 100 μL per brunn DMSO för att extrahera formazankristallerna, inkubera plattan på en plattskakare i 10 minuter. Mät absorbansen vid 570 nm med en plattläsare.
Anmärkning: En andra avläsning vid 690 nm bör utföras för att utesluta eventuell bakgrundsabsorbans för fingeravtryck i plattan. Det är viktigt att notera att testkemikalier kan störa MTT, vilket måste utvärderas för att säkerställa kvaliteten på de genererade data32. För detta ändamål bör cellfria brunnar som innehåller testkoncentrationerna och MTT (0,5 mg/ml) exponeras, följt av inkubation för att observera eventuella färgförändringar i brunnarna som kan öka absorbansen och leda till felaktiga viabilitetsresultat. Kemikalier som interagerar med MTT måste undvikas i detta test.
6. Beräkning av cellviabilitet/cytotoxicitet
Anmärkning: Den erhållna råabsorbansen eller fluorescensen används för att beräkna cellviabiliteten i procent i samband med den negativa kontrollen (för testkemikalier som beretts direkt i exponeringsmedier) eller lösningsmedelskontrollen (för testkemikalier som beretts med lösningsmedel, t.ex. DMSO). Innan cellviabilitetsprocenten bestäms måste rådata normaliseras av blankkontrollen.
- Beräkna genomsnittlig absorbans eller fluorescens för varje koncentration och kontrollgrupp av testkemikalien (tre brunnar/behandling).
- För att bestämma cellviabilitetsprocenten i förhållande till kontrollen (negativ eller lösningsmedel), använd ekvation (2):
(2)
OBS: Absorbans (abs) eller fluorescens (fluo) enheter representerar medelvärdet av absorbans eller fluorescens mätt i de tre brunnarna per koncentration; blank representerar brunnar utan celler.
(2)Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 3 visar plattorna i AB-, CFDA-AM-, NR- och MTT-analyserna. För AB-analysen (figur 3A) visar de tomma brunnarna och brunnarna med inget eller ett minskat antal viabla celler blå färg och låg fluorescens, medan brunnarna med ett stort antal livskraftiga celler är rosa och uppvisar höga fluorescensvärden på grund av omvandlingen av resazurin (AB) till resorufin (rosa substans) av de viabla cellerna. För CFDA-AM-analysen finns det ingen synlig skillnad i färgen på brunnarna på plattan; fluorescensen är dock högre i brunnar som innehåller livskraftiga celler på grund av retentionen av CFDA-AM och efterföljande omvandling till karboxifluorescein (fluorescerande substans).
För NR-testet (figur 3B) måste blankbrunnarna vara transparenta med mycket låga absorbansvärden eftersom det inte finns några celler som kan behålla NR-färgämnet. I vissa fall är de tomma brunnarna inte transparenta, vilket indikerar förekomsten av NR-nederbörd på plattan; I detta fall bör detta inte betraktas som ett giltigt experiment. Höga cytotoxiska koncentrationer av testkemikalierna och PC-preparatet är transparenta eller har en mycket ljusrosa färg med låga absorbansvärden, medan brunnar som innehåller viabla celler behåller NR-färgämnet och har en mörkrosa färg och höga absorbansvärden.
För MTT-testet (figur 3C) måste blindbrunnarna vara transparenta och med mycket låg absorbans eftersom det inte finns några celler som kan omvandla MTT till formazan. Höga cytotoxiska koncentrationer av testkemikalierna och PC-preparatet är transparenta eller har en mycket ljus violett färg med låga absorbansvärden, medan brunnar som innehåller viabla celler omvandlar MTT (gult) till formazan (violett ämne) och ger en mörkare violett färg med höga absorbansvärden.
Figur 4A visar en representativ bild av cellviabiliteten efter beräkningen, med hjälp av medelvärdena av fluorescens- eller absorbansvärden per grupp. Grafiken kan plottas med inmatningen av viabilitetsprocentvärden, beräknade med formeln för beräkning av livskraften som presenteras i protokollavsnitt 6, med hjälp av dataanalysprogramvara. Viabiliteten hos celler som exponeras för SC bör inte vara 10% lägre än i NC17. Procentuell cellviabilitet för testkemikalierna beräknas i förhållande till NC eller SC, beroende på deras löslighet. I detta fall används olika koncentrationer av DMSO som testämne och cellviabiliteten är relaterad till NC, vilket definieras som 100% livskraft.
Uppgifter om cellviabilitet kan användas för att beräkna testkemikaliernas halva maximala hämmande koncentration (IC50) genom logaritmisk omvandling och interpolerad standardkurva genom icke-linjär regression efter lämpliga replikat33,34,35. Figur 4B visar IC50, beräknat utifrån den viabilitetsprocent som visas i figur 4A. IC50 erhölls med minst tre tekniska replikat och tre experimentella replikat med användning av nominella koncentrationer i AB-testet. Analyserna utfördes med fem olika koncentrationer av testämnena; Ett högre antal koncentrationer kan dock krävas beroende på typ av experiment. Till exempel rekommenderas åtta testkoncentrationer för intervallfinnande test, som vanligtvis utförs för att bestämma slutliga testkoncentrationer av ett kemiskt ämne för ett experiment. Eftersom viabilitetsanalyserna har olika effektmått för cytotoxicitet rekommenderar vi att IC50 beräknas för varje analys som utförs separat för att identifiera skillnader i känslighet som orsakas av olika verkningsmekanismer för de kemiska substanserna eller skillnader i känslighet mellan cellinjer. Skillnaderna i IC50-värden för testade kemikalier i olika cellinjer kan också variera beroende på vilken typ av odlingsmedium som används, eftersom skillnader i sammansättning relaterade till proteiner och lipider kan påverka den kemiska biotillgängligheten36. Dessutom kan cytotoxiciteten hos många kemikalier utvärderas genom dessa analyser. IC50 för andra kemikalier som utvärderats i ZFL- och ZEM2S-cellinjer visas i figur 4B-H.
Figur 1: Schematiskt protokoll för AB-, CFDA-AM- och NR-analyserna utförda på samma 96-brunnsplatta. Förkortningar: AB = Alamar Blue; CFDA-AM = 5-karboxifluoresceindiacetatacetoximetylester; NR = Neutral röd; PBS = fosfatbuffrad saltlösning. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Schematiskt protokoll för MTT-testet utfört på en platta med 96 brunnar. Förkortning: MTT = 3-[4,5-dimetyltiazol-2yl]-2,5-difenyltetrazoliumbromid. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Representativa resultat av AB-, CFDA-AM-, NR- och MTT-testerna. Bilderna visar färgskillnaderna i brunnarna för kontroller och testkoncentrationer i (A) AB och CFDA-AM, (B) NR, och (C) MTT-analyser. Förkortningar: AB = Alamar Blue; CFDA-AM = 5-karboxifluoresceindiacetatacetoximetylester; NR = Neutral röd; PBS = fosfatbuffrad saltlösning; B = tomma brunnar (cellfria brunnar); SC = lösningsmedelskontroll (0,5% DMSO); NC = negativ kontroll (celler i odlingsmedium); PC = positiv kontroll (1% Triton X-100). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Beräkning av data om cellviabilitet och viabilitet för olika testkemikalier. Beräkningen av cellviabiliteten med hjälp av avläsningsdata kan uttryckas som procentandelen (%) av cellviabiliteten relaterad till NC eller SC (A). Cytotoxiciteten hos en kemikalie kan bedömas med hjälp av viabilitetsdata för att interpolera en standardkurva genom icke-linjär regression för olika testkemikalier (B-H). Data representeras som medelvärde av cellviabilitet (punkter) och standardavvikelse (staplar) för tre tekniska replikat och tre experimentella replikat (AB-analys). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: MTT-analys utförd i ZFL- och ZEM2S-celler odlade i närvaro (10 %) och frånvaro (0 %, helt FBS-berövad) av FBS under 24 timmar. (A) ZFL-celler vid 0% och 10% FBS visar ingen signifikant skillnad i cellviabilitet genom Kruskall-Wallis-test (p = 0,2286). (B) ZEM2S-celler vid 0% och 10% FBS visar ingen signifikant skillnad i cellviabilitet genom Mann-Whitney-test (p = 0,3429). En signifikansnivå på p < 0,05 beaktades. Data uttrycks som median- och interkvartilintervall för tre tekniska replikat. Förkortningar: n.s. = ingen signifikant skillnad; FBS = fetalt bovint serum; MTT = 3-[4,5-dimetyltiazol-2yl]-2,5-difenyltetrazoliumbromid. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: MTT- och NR-analyser utförda på ZFL- och ZEM2S-celler behandlade (24 timmar) med DMSO vid olika koncentrationer (0,1 %, 0,5 % och 1 %) och negativ kontroll. DMSO-behandlade ZFL-celler vid någon testad koncentration visade ingen signifikant skillnad i cellviabilitet relaterad till NC med (A) MTT-testet (p = 0,074) och (B) NR-testet (p = 0,216). DMSO-behandlade ZEM2S-celler visade ingen signifikant skillnad i cellviabilitet relaterad till NC med (C) MTT-analysen (p = 0,422) och (D) NR-analys (p = 0,287). En signifikansnivå på p < 0,05 i Kruskall-Wallis-testet beaktades. Data uttrycks som median- och interkvartilintervall för tre tekniska replikat. Förkortningar: n.s. = ingen signifikant skillnad; NC = negativ kontroll; MTT = 3-[4,5-dimetyltiazol-2yl]-2,5-difenyltetrazoliumbromid, NR = Neutral röd. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Tabell 1: Lösningar och medier som används i detta protokoll. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Cytotoxicitetsanalyser används ofta för in vitro-toxicitetsutvärdering, och denna protokollartikel presenterar fyra vanliga cytotoxicitetsanalyser modifierade för att utföras i zebrafiskcellinjer (dvs. celldensitet för 96-brunnsplatta, inkubationstid i MTT-analysen, FBS-utarmning under det kemiska exponeringstillståndet och maximal acceptabel koncentration för SC). Eftersom dessa analyser kvantifierar cytotoxicitet med olika slutpunkter för cellviabilitet (metabolisk funktion, lysosomal membranintegritet och cellmembranintegritet), ger kombinationen av dessa en noggrann utvärdering av kemisk cytotoxicitet i zebrafiskcellinjer. Detta protokoll rekommenderar också odling av ZFL- och ZEM2S-cellinjer i ett CO2-fritt tillstånd, på grund av deras odlingsmediesammansättning som på ett adekvat sätt kan buffra odlingssystemet och bibehålla pH vid 7,4 (fysiologiskt pH). Odlingsmediesammansättningen och den CO2-fria miljön som föreslås i detta protokoll för båda cellinjerna rapporteras allmänt i litteraturen. ZFL-cellinjen odlas vanligtvis i L-15- och RPMI-media med eller utan tillsats av natriumbikarbonat och utan CO2 37,38,39,40,41,42,43. Under tiden odlas ZEM2S-cellinjen enligt instruktioner från bioresurscentret, och dess odlingsmedia är formulerad för CO2-fria kulturer; Således kan CO2 och luftblandning vara skadliga för celler vid användning av denna typ av odlingsmedia44.
Den kemiska exponeringen i ett odlingsmedium utan tillsats av FBS utfördes baserat på publicerade studier, vilket visar att de kemiska substansernas biotillgänglighet i in vitro-analyser påverkas signifikant av deras bindning till serumproteiner. Till exempel visade Chen et al.45 att närvaron av serumproteiner i RTgill-W1-analysen kan minska biotillgängligheten av ett katjoniskt ytaktivt medel (C12-bensalkonium) upp till tre och en halv gånger. Kemikalien bunden till FBS varierade i allmänhet från 47% till 90% i odlingsmediet45. För att undvika detta problem utvärderade vi cellviabiliteten hos ZFL- och ZEM2S-celler i kulturer som helt berövats FBS i 24 timmar med hjälp av MTT-analysen. Resultaten visade ingen signifikant skillnad i cellviabilitet från ZFL- eller ZEM2S-kulturer med (10%) och utan (0%) FBS, vilket indikerar att dessa zebrafiskcellinjer kan bli föremål för kemisk behandling i odlingsmedier som berövas FBS (figur 5). Det är viktigt att betona att minskad mängd FBS kan orsaka andra konsekvenser för kemisk biotillgänglighet. Till exempel har lipofila kemikalier högre sorption till plastlaboratorier och plattor, vilket minskar kemisk biotillgänglighet36. Förekomsten av FBS i odlingsmediet kan dock minska plastbindningen på grund av att serumbeståndsdelar konkurrerar med plasten om bindning till kemikalierna46. Det bästa beslutet i samband med procentandelen FBS-tillskott eller dess fullständiga deprivation kan bero på typen av testkemikalie. Till exempel rapporterade Pomponio et al.46 att även om kemikalien amiodaron har en högre bindning till plast i frånvaro av FBS, är dess biotillgänglighet ännu lägre vid användning av 10% FBS. För mono-N-desetylamiodaron är nästan samma mängd bunden till serummediet och till väggarna46.
Organiska lösningsmedel (t.ex. DMSO) rekommenderas generellt att användas upp till 0,5% i in vitro-analyser. Denna låga koncentration kan dock försämra testning av högre koncentrationer av dåliga vattenlösliga kemikalier. För att förhindra detta problem utvärderade vi om högre koncentrationer av DMSO var lämpliga för ZFL- och ZEM2S-cellinjer som inte överskred cytotoxicitetströskeln på 10%. För detta bearbetades icke-behandlade celler (NC) och celler behandlade (24 timmar) med olika koncentrationer av DMSO (0,1%, 0,5% och 1%) för MTT- och NR-analyserna. Resultaten visade ingen signifikant skillnad i cellviabilitet från behandlingsgruppen jämfört med NCs (figur 6), vilket indikerar att under dessa speciella förhållanden kan koncentrationer av DMSO upp till 1% användas. Andra fiskcellinjer stöder också DMSO-koncentrationer högre än 0,5%, vilket inte är en särdrag hos ZFL- och ZEM2S-cellinjer. Till exempel har maximala lösningsmedelskoncentrationer på upp till 2 % DMSO (utan att någon cytotoxisk effekt observerats) tillämpats i cytotoxicitetsanalyser med användning av CHSE-214 (cellinje härledd från Oncorhynchus tshawytscha embryo)47, RTG-2 (Oncorhynchus mykiss gonadala cellinje)48,49,50 och PLHC-1 (Poeciliopsis lucida hepatocellulärt karcinomcellinje)48 Celler. Den maximala lösningsmedelskoncentrationen på 1% DMSO har också använts i cytotoxicitetsanalyser med RTL-W1 (Oncorhynchus mykiss gonadala cellinje)51 och CCO (Ictalurus punctatus äggstockscellinje)52 celler. Enligt Mori och Wakabayashi47 kan fiskcellinjer ha en lägre känslighet för DMSO än däggdjurscellinjer. Det är dock viktigt att betona att den maximala acceptabla koncentrationen av 1% DMSO uteslutande definierades för cytotoxicitet, och detta bör utvärderas noggrant för andra endpoints (t.ex. genotoxicitet, epigenetik, proteinkodande genuttrycksanalys) i ZFL- och ZEM2S-cellinjer.
MTT- och AB-analyserna är baserade på metabolisk aktivitet för att bestämma cellviabilitet. Även om MTT-analysen är den mest använda viabilitetsanalysen kan den i jämförelse med AB-analysen vara något mindre känslig och i vissa fall överskatta cellviabiliteten53. Den högre känsligheten hos AB-analysen kan relateras till mätmetoden, eftersom fluorescensmätning är känsligare än kolorimetrisk mätning15. Icke desto mindre är både AB- och MTT-analyserna högkvalitativa analyser för att identifiera cytotoxiska kemiska substanser, och deras genererade data har använts för att klassificera farliga kemiska ämnen enligt deras inneboende cytotoxiska potential53.
Idén att utföra AB-, CFDA-AM- och NR-analysen på samma platta baserades på OECD TG 249 (RTgill-W1-analys)17; Modifieringar gjordes dock för att utföra dessa analyser i 96-brunnsplattor, samt för att vara lämpliga för zebrafiskcellinjer. Analyser i 96-brunnsplattor, istället för 24-brunnsplattor, kan vara fördelaktiga för cytotoxicitetstestning med hög genomströmning i fiskcellinjer. Dessutom använder RTgill-W1-analysen endast L-15-odlingsmedium, medan ZFL- och ZEM2S-cellinjerna odlas i ett medium innehållande D-glukos. Odlingsmediet gör det möjligt att utföra MTT-analysen i dessa cellinjer, eftersom cellinjer odlade i glukosfritt medium (t.ex. endast L-15) omedelbart kan minska MTT-reduktionen i celler och försämra prestandan hos denna analys54. Detta protokoll gör att fyra olika viabilitetsanalyser enkelt kan utföras i två zebrafiskcellinjer.
Detta protokoll kan användas för att studera effekterna av kemiska ämnen på fisk genom att använda in vitro-modeller . Olika cellinjer kan ha olika känslighet för att uppskatta kemiska effekter, även om de är från samma grupp ryggradsdjur, såsom fisk. Till exempel visade en jämförelse av ZFL- och ZF4-cellinjer med fiskembryon, Langu-Mitea et al.21 att ZFL kan generera liknande resultat jämfört med toxicitetstestet för fiskembryon. Tanneberger et al.5 visade att de permanenta fiskcellinjerna GSF, PLHC, RTG-2, RTgill-W1 och R1 har olika känslighet för att förutsäga kemisk fisktoxicitet jämfört med in vivo (vuxna fiskar). Även om RTgill-W1 (permanent fiskgälcellinje) nyligen validerades som en alternativ metod för att förutsäga akut toxicitet hos fisk, bör tillämpligheten av andra cellinjer i ekotoxicitetsstudier undersökas. Användning av cellinjer från olika fiskarter och vävnadsursprung samt utvecklingsstadier (ZEM2S: embryo; ZFL: vuxen lever) kan avsevärt bidra till ekotoxicitetsstudier, eftersom det kan behandla effekter relaterade till specifika stadier av fiskutveckling och målorgan. Således bör kemiska effekter undersökas med hjälp av olika cellkulturer som återspeglar olika målställen i fisk (t.ex. lever, gonader, gäl, hjärna), och inte bara i en enda cellinje55.
Dessa protokoll kan ha olika tillämpningar i ekotoxicitetsstudier, och deras användning är inte nödvändigtvis begränsad till att förutsäga akut toxicitet hos fisk. De kan till exempel användas för att definiera subcytotoxiska koncentrationer för att utföra andra in vitro-toxicitetstester på fisk, såsom utvärdering av hormonstörande effekter på fisk. Dessutom kan cytotoxicitetsdata in vitro också bidra till att utveckla och förbättra fysiologiskt baserad toxikokinetisk (PBTK) modellering. Eftersom PBTK fokuserar på fördelningen av en kemikalie i en organism med hänsyn till de olika organen (såsom gäl, lever eller tarm)56, kan användning av cellinjer från olika fiskarter och vävnadsursprung vara en användbar informationskälla för denna modell. Resultaten av bioassays in vitro (t.ex. cytotoxicitetsanalyser) ger indata som representerar biologiska processer i PBTK-modellen och bidrar till extrapolering in vitro till in vivo 21,56.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar ingen intressekonflikt.
Acknowledgments
Till minne av Dr. Márcio Lorencini, medförfattare till detta arbete, en utmärkt forskare inom kosmetikområdet och ägnad åt att främja kosmetisk forskning i Brasilien. Författarna är tacksamma för Multi-user Laboratory i fysiologiska avdelningen (UFPR) för tillgänglighet av utrustning och för ekonomiskt stöd från Coordination for the Improvement of Higher Education Personnel (CAPES, Brasilien) (Finance Code 001) och Grupo Boticario.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-CFDA, AM (5-Carboxyfluorescein Diacetate, Acetoxymethyl Ester) | Invitrogen | C1345 | |
| Cell culture plate, 96 well plate | Sarstedt | 83.3924 | Surface: Standard, flat base |
| DMEM | Gibco | 12800-017 | Powder, high glucose, pyruvate |
| FBS - Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions | Gibco | 12657-029 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mix, powder | Gibco | 21700026 | Powder |
| HEPES (1 M) | Gibco | 15630080 | |
| Leibovitz's L-15 Medium | Gibco | 41300021 | Powder |
| Neutral red | Sigma-Aldrich | N4638 | Powder, BioReagent, suitable for cell culture |
| Orbital shaker | Warmnest | KLD-350-BI | 22 mm rotation diameter |
| Dulbeccos PBS (10X) with calcium and magnesium | Invitrogen | 14080055 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| Resazurin sodium salt | Sigma-Aldrich | R7017 | Powder, BioReagent, suitable for cell culture |
| RPMI 1640 Medium | Gibco | 31800-014 | Powder |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | Powder, bioreagent for molecular biology |
| Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide 98% | Sigma-Aldrich | M2128 | |
| Trypan blue stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red | Gibco | 15400054 | |
| ZEM2S cell line | ATCC | CRL-2147 | This cell line was kindly donated by Professor Dr. Michael J. Carvan (University of Wisconsin, Milwaukee, USA) |
| ZFL cell line | BCRJ | 256 |
References
- ECHA. Non-Animal Approaches-Current Status of Regulatory Applicability Under the REACH, CLP and Biocidal Products Regulations. ECHA. , Available at <87ebb68f-2038-f597-fc33-f4003e9e7d7d (2017).
- Alternative Methods Accepted by US Agencies. National Toxicology Program, and US Department of Health and Human Services. , Available from: https://ntp.niehs.nih.gov/whatwestudy/niceatm/accept-methods/index.html (2022).
- Schirmer, K. Proposal to improve vertebrate cell cultures to establish them as substitutes for the regulatory testing of chemicals and effluents using fish. Toxicology. 224 (3), 163-183 (2006).
- Scholz, S., et al. Alternatives to in vivo tests to detect endocrine disrupting chemicals (EDCs) in fish and amphibians-screening for estrogen, androgen and thyroid hormone disruption. Critical Reviews in Toxicology. 43 (1), 45-72 (2013).
- Tanneberger, K., et al. Predicting fish acute toxicity using a fish gill cell line-based toxicity assay. Environmental Science & Technology. 47 (2), 1110-1119 (2013).
- Roesler, R., Lorencini, M., Pastore, G. Brazilian cerrado antioxidant sources: cytotoxicity and phototoxicity in vitro. Food Science and Technology. 30, 814-821 (2010).
- Ruyra, A., et al. Zebrafish liver (ZFL) cells are able to mount an anti-viral response after stimulation with Poly (I:C). Comparative Biochemistry and Physiology. Part B, Biochemistry & Molecular Biology. 182, 55-63 (2015).
- Natsch, A., Laue, H., Haupt, T., von Niederhäusen, V., Sanders, G. Accurate prediction of acute fish toxicity of fragrance chemicals with the RTgill-W1 cell assay. Environmental Toxicology and Chemistry. 37 (3), 931-941 (2018).
- Freshney, R. I.
- Mosmann, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. Journal of Immunological Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).
- O'Brien, J., Wilson, I., Orton, T., Pognan, F. Investigation of the Alamar Blue (resazurin) fluorescent dye for the assessment of mammalian cell cytotoxicity. European Journal of Biochemistry. 267 (17), 5421-5426 (2000).
- Gonzalez, R. J., Tarloff, J. B. Evaluation of hepatic subcellular fractions for Alamar blue and MTT reductase activity. Toxicology In Vitro. 15 (3), 257-259 (2001).
- Borenfreund, E., Puerner, J. A. Toxicity determined in vitro by morphological alterations and neutral red absorption. Toxicology Letters. 24 (2-3), 119-124 (1985).
- Repetto, G., del Peso, A., Zurita, J. L. Neutral red uptake assay for the estimation of cell viability/cytotoxicity. Nature Protocols. 3 (7), 1125-1131 (2008).
- Kamiloglu, S., Sari, G., Ozdal, T., Capanoglue, E. Guidelines for cell viability assays. Food Frontiers. 1 (3), 332-349 (2020).
- Water Quality-Determination of Acute Toxicity of Water Samples and Chemicals to a Fish Gill Cell Line (RTgill-W1) (ISO 21115:2019). International Organization for Standardization. , Available from: https://www.iso.org/standar/69933.html (2019).
- Organisation for Economic Co-operation and Development. Test Guideline No. 249: Fish Cell Line Acute Toxicity-The RTgill-W1 Cell Line Assay. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 2. Effects on Biotic Systems. , OECD Publishing. Paris. (2021).
- Lungu-Mitea, S., Lundqvist, J. Potentials and pitfalls of transient in vitro reporter bioassays: interference by vector geometry and cytotoxicity in recombinant zebrafish cell lines. Archives of Toxicology. 94 (8), 2769-2784 (2020).
- Lungu-Mitea, S., Han, Y., Lundqvist, J. Development, scrutiny, and modulation of transient reporter gene assays of the xenobiotic metabolism pathway in zebrafish hepatocytes. Cell Biology and Toxicology. , 1-23 (2021).
- Schirmer, K., Chan, A. G., Greenberg, B. M., Dixon, D. G., Bols, N. C. Methodology for demonstrating and measuring the photocytotoxicity of fluoranthene to fish cells in culture. Toxicology In Vitro. 11 (1-2), 107-119 (1997).
- Lungu-Mitea, S., et al. Modeling bioavailable concentrations in zebrafish cell lines and embryos increases the correlation of toxicity potencies across test systems. Environmental Science & Technology. 55 (1), 447-457 (2021).
- Cavalcante, D. G. S. M., et al. Cytotoxic, biochemical and genotoxic effects of biodiesel produced by different routes on ZFL cell line. Toxicology In Vitro. 28 (6), 1117-1125 (2014).
- Meng, Q., Yeung, K., Chan, K. M. Toxic effects of octocrylene on zebrafish larvae and liver cell line (ZFL). Aquatic Toxicology. 236, 105843 (2021).
- Kwok, M. L., Chan, K. M. Oxidative stress and apoptotic effects of copper and cadmium in the zebrafish liver cell line ZFL. Toxicology Reports. 7, 822-835 (2020).
- Yang, J., Chan, K. M. Evaluation of the toxic effects of brominated compounds (BDE-47, 99, 209, TBBPA) and bisphenol A (BPA) using a zebrafish liver cell line, ZFL. Aquatic Toxicology. 159, 138-147 (2015).
- Bradford, C. S., Sun, L., Collodi, P., Barnes, D. W. Cell cultures from zebrafish embryos and adult tissues. Journal of Tissue Culture Methods. 16 (2), 99-107 (1994).
- He, S., et al. Genetic and transcriptome characterization of model zebrafish cell lines. Zebrafish. 3 (4), 441-453 (2006).
- Mansoury, M., Hamed, M., Karmustaji, R., Al Hannan, F., Safrany, S. T. The edge effect: A global problem. The trouble with culturing cells in 96-well plates. Biochemistry and Biophysics Reports. 26, 100987 (2021).
- Funk, D., Schrenk, H. -H., Frei, E. Serum albumin leads to false-positive results in the XTT and the MTT assay. BioTechniques. 43 (2), 178 (2007).
- Dayeh, V. R., Bols, N. C., Tanneberger, K., Schirmer, K., Lee, L. E. J. The use of fish-derived cell lines for investigation of environmental contaminants: An update following OECD's fish toxicity testing framework no. 171. Current Protocols in Toxicology. 1, (2013).
- Stepanenko, A. A., Dmitrenko, V. V. Pitfalls of the MTT assay: Direct and off-target effects of inhibitors can result in over/underestimation of cell viability. Gene. 574 (2), 193-203 (2015).
- Ulukaya, E., Colakogullari, M., Wood, E. J. Interference by anti-cancer chemotherapeutic agents in the MTT-tumor chemosensitivity assay. Chemotherapy. 50 (1), 43-50 (2004).
- Sebaugh, J. L. Guidelines for accurate EC50/IC50 estimation. Pharmaceutical Statistics. 10 (2), 128-134 (2011).
- Weimer, M., et al. The impact of data transformations on concentration-response modeling. Toxicology Letters. 213 (2), 292-298 (2012).
- Green, J. W., Holbech, T. A., Henrik, Chapter 4: Analysis of Continuous Data (Regression). Statistical Analysis of Ecotoxicity Studies. , John Wiley & Sons, Inc. (2018).
- Proença, S., et al. Effective exposure of chemicals in in vitro cell systems: A review of chemical distribution models. Toxicology In Vitro. 73, 105133 (2021).
- Guidony, N. S., et al. ABC proteins activity and cytotoxicity in zebrafish hepatocytes exposed to triclosan. Environmental Pollution. 271, 116368 (2021).
- da Silva, N. D. G., et al. Interference of goethite in the effects of glyphosate and Roundup® on ZFL cell line. Toxicology In Vitro. 65, 104755 (2020).
- Yang, Y., et al. Temperature is a key factor influencing the invasion and proliferation of Toxoplasma gondii in fish cells. Experimental Parasitology. 217, 107966 (2020).
- Lopes, F. M., Sandrini, J. Z., Souza, M. M. Toxicity induced by glyphosate and glyphosate-based herbicides in the zebrafish hepatocyte cell line (ZF-L). Ecotoxicology and Environmental Safety. 162, 201-207 (2018).
- Lachner, D., Oliveira, L. F., Martinez, C. B. R. Effects of the water soluble fraction of gasoline on ZFL cell line: Cytotoxicity, genotoxicity and oxidative stress. Toxicology In Vitro. 30, 225-230 (2015).
- Morozesk, M., et al. Effects of multiwalled carbon nanotubes co-exposure with cadmium on zebrafish cell line: Metal uptake and accumulation, oxidative stress, genotoxicity and cell cycle. Ecotoxicology and Environmental Safety. 202, 110892 (2020).
- Dognani, G., et al. Nanofibrous membranes for low-concentration Cr VI adsorption: kinetic, thermodynamic and the influence on ZFL cells viability. Materials Research. , 24 (2021).
- ZEM2S (ATCC®CRL-2147™). American Type Culture Collection. , Available from: https://www.atcc.org/products/crl-2147 (2023).
- Chen, Y., et al. Acute toxicity of the cationic surfactant C12-benzalkonium in different bioassays: how test design affects bioavailability and effect concentrations. Environmental Toxicology and Chemistry. 33 (3), 606-615 (2014).
- Pomponio, G., et al. In vitro kinetics of amiodarone and its major metabolite in two human liver cell models after acute and repeated treatments. Toxicology In Vitro. 30, 36-51 (2015).
- Mori, M., Wakabayashi, M. Cytotoxicity evaluation of chemicals using cultured fish cells. Water Science and Technology. 42 (7-8), 277-282 (2000).
- Caminada, D., Escher, C., Fent, K. Cytotoxicity of pharmaceuticals found in aquatic systems: comparison of PLHC-1 and RTG-2 fish cell lines. Aquatic Toxicology. 79 (2), 114-123 (2006).
- Giltrap, M., et al. In vitro screening of organotin compounds and sediment extracts for cytotoxicity to fish cells. Environmental Toxicology and Chemistry. 30 (1), 154-161 (2011).
- Hollert, H., Duerr, M., Erdinger, L., Braunbeck, T. Cytotoxicity of settling particulate matter and sediments of the Neckar River (Germany) during a winter flood. Environmental Toxicology and Chemistry. 19 (3), 528-534 (2000).
- Pannetier, P., et al. Toxicity assessment of pollutants sorbed on environmental sample microplastics collected on beaches: Part I-adverse effects on fish cell line. Environmental Pollution. 248, 1088-1097 (2019).
- Ternjej, I., Srček, V. G., Mihaljević, Z., Kopjar, N. Cytotoxic and genotoxic effects of water and sediment samples from gypsum mining area in channel catfish ovary (CCO) cells. Ecotoxicology and Environmental Safety. 98, 119-127 (2013).
- Hamid, R., Rotshteyn, Y., Rabadi, L., Parikh, R., Bullock, P. Comparison of alamar blue and MTT assays for high throughput screening. Toxicology In Vitro. 18 (5), 703-710 (2004).
- Vistica, D. T., et al. Tetrazolium-based assays for cellular viability: a critical examination of selected parameters affecting formazan production. Cancer Research. 51 (10), 2515-2520 (1991).
- Knauer, K., Lampert, C., Gonzalez-Valero, J. Comparison of in vitro and in vivo acute fish toxicity in relation to toxicant mode of action. Chemosphere. 68 (8), 1435-1441 (2007).
- Stadnicka-Michalak, J., Tanneberger, K., Schirmer, K., Ashauer, R. Measured and modeled toxicokinetics in cultured fish cells and application to in vitro-in vivo toxicity extrapolation. PLoS One. 9 (3), 92303 (2014).
