Summary
Bu protokol, zebra balığı embriyo (ZEM2S) ve karaciğer (ZFL) hücre hatlarında 96 kuyucuklu plakalarda sitotoksisitenin değerlendirilmesi için uyarlanmış yaygın olarak kullanılan sitotoksisite testlerini (Alamar Blue [AB], CFDA-, Nötr Kırmızı ve MTT testleri) sunar.
Abstract
Balık hücre hatları ekotoksisite çalışmalarında giderek daha fazla kullanılmaya başlanmıştır ve sitotoksisite testleri balık akut toksisitesini tahmin etmek için yöntemler olarak önerilmiştir. Bu nedenle, bu protokol, zebra balığı (Danio rerio) embriyo (ZEM2S) ve karaciğer (ZFL) hücre hatlarında 96 kuyucuklu plakalarda hücre canlılığını değerlendirmek için modifiye edilmiş sitotoksisite testleri sunar. Değerlendirilen sitotoksisite sonlanım noktaları mitokondriyal bütünlük (Alamar Blue [AB] ve MTT testleri), esteraz aktivitesi yoluyla membran bütünlüğü (CFDA-testi) ve lizozomal membran bütünlüğüdür (Nötr Kırmızı [NR] testi). Test maddelerinin 96 delikli bir plakaya maruz bırakılmasından sonra, sitotoksisite testleri yapılır; Burada, AB ve CFDA-aynı anda gerçekleştirilir, ardından aynı plakada NR yapılırken, MTT testi ayrı bir plakada gerçekleştirilir. Bu tahliller için okumalar, AB ve CFDA-için floresan ve MTT ve NR için absorbans ile alınır. Bu balık hücre hatları ile yapılan sitotoksisite testleri, kimyasal maddelerin balıklar üzerindeki akut toksisitesini incelemek için kullanılabilir.
Introduction
Kimyasal maddelerin insan sağlığı ve çevre açısından güvenlikleri açısından test edilmeleri gerekmektedir. Moleküler ve hücresel biyobelirteçler, düzenleyici kurumlar ve/veya mevzuatlar (örneğin, REACH, OECD, US EPA)1,2 tarafından canlı organizmalar üzerindeki etkileri tahmin etmek için güvenlik değerlendirmelerinde giderek daha fazla dikkate alınmaktadır, çünkü bunlar in vivo advers sonuçtan (örneğin, endokrin bozulma, immünolojik yanıt, akut toksisite, fototoksisite)3,4,5,6,7 . Bu bağlamda, sitotoksisite, balık akut toksisitesini tahmin etmek için bir ölçüm olarak alınmıştır 5,8; Bununla birlikte, ekotoksisite çalışmalarında, balıklar üzerindeki en çeşitli etkilerini (örneğin, endokrin bozucu etkiler) incelemek için kimyasal maddelerin alt sitotoksik konsantrasyonlarını tanımlamak gibi birçok başka uygulamaya sahip olabilir.
Hücre kültürü sistemlerinde (in vitro sistemler), kimyasal maddelerin sitotoksisitesi, sonlanım noktalarının tiplerinde farklılık gösteren yöntemlerle belirlenebilir. Örneğin, bir sitotoksisite yöntemi, hücre ölümü sürecinde gözlenen spesifik morfoloji ile ilgili bir son noktaya dayanabilirken, bir diğeri hücre ölümü, canlılık ve işlevsellik, morfoloji, enerji metabolizması ve hücre bağlanma ve çoğalmasının ölçülmesiyle sitotoksisiteyi belirleyebilir. Kimyasal maddeler hücre canlılığını farklı mekanizmalarla etkileyebilir, bu nedenle kimyasal etkileri tahmin etmek için farklı hücre canlılık sonlanım noktalarını kapsayan sitotoksisite değerlendirmesi gereklidir9.
MTT ve Alamar Blue (AB), hücre metabolik aktivitesine bağlı olarak hücre canlılığı üzerindeki etkileri belirleyen testlerdir. MTT testi, mitokondriyal enzim süksinat dehidrogenaz10'un aktivitesini değerlendirir. Sarımsı 3-[4,5-dimetiltiazol-2il]-2,5-difeniltetrazolyum bromür (MTT) formazan mavisine indirgenmesi sadece canlı hücrelerde meydana gelir ve optik yoğunluğu canlı hücrelerin sayısı ile doğru orantılıdır10. AB testi, resazurinin canlı hücreler tarafından resorufin'e indirgenmesi üzerine floresan ve renk değiştiren mitokondriyal enzimlerin aracılık ettiği hassas bir oksidasyon-indirgeme göstergesidir11; Bununla birlikte, sitozolik ve mikrozomal enzimler de AB ve MTT12'nin azaltılmasına katkıda bulunur. Bu enzimler, alkol ve aldehit oksidoredüktazları, NAD (P) H gibi çeşitli redüktazları içerebilir: kinon oksidoredüktaz, flavin redüktaz, NADH dehidrogenaz ve sitokromlar11.
Nötr Kırmızı (NR) testi, bu boyanın canlı hücrelerin lizozomlarına dahil edilmesine dayanan bir hücre canlılığı testidir13. NR alımı, hücrelerin pH gradyanlarını koruma kapasitesine bağlıdır. Lizozomların içindeki proton gradyanı, sitoplazmadan daha düşük bir pH tutar. Normal fizyolojik pH'da, NR yaklaşık sıfır net yük sunar ve bu da hücre zarlarına nüfuz etmesini sağlar. Böylece, boya şarj olur ve lizozomların içinde tutulur. Sonuç olarak, tutulan NR miktarı ne kadar büyük olursa, canlı hücrelerin sayısı da o kadar fazlaolur 14. Hücre yüzeyine veya lizozomal membranlara zarar veren kimyasal maddeler bu boyanın alımını bozar.
CFDA-testi, 5-karboksifloresein diasetat asetoksimil esterin (CFDA-) 15'in tutulmasına dayanan bir florometrik hücre canlılığı testidir. Bir esteraz substratı olan 5-CFDA-, polar olan ve canlı hücrelerin zarları tarafından geçirgen olmayan floresan bir madde olan karboksifloreseine dönüştürülür15; Böylece, sağlam bir hücre zarının iç tarafında tutulur ve canlı hücreleri gösterir.
Son zamanlarda, RTgill-W1 hücre hattını (gökkuşağı alabalığından kalıcı hücre hattı [Oncorhynchus mykiss] solungaç) kullanarak balık akut toksisitesini değerlendirmek için doğrulanmış bir ISO (Uluslararası Standardizasyon Örgütü) kılavuzunda (ISO 21115: 2019) 16 ve OECD (Ekonomik İşbirliği ve Kalkınma Örgütü) test yönteminde (OECD TG 249) üç sitotoksisite testi (CFDA-, NR ve AB tahlilleri) birleştirilmiştir17 . Balıkların akut toksisitesini tahmin etmek için mevcut hücre bazlı bir yöntem olmasına rağmen, diğer balık türleriyle benzer yöntemler geliştirmek ve yöntemin verimini artırmak için çabalar harcanmıştır. Bazı örnekler arasında, spesifik toksisite yolları18,19 için muhabir genlerle transfekte edilmiş ZFL hücre hatlarının geliştirilmesi, RTgill-W1 hücre hattı20'de fototoksisite testleri ve ZFL ve ZF4 hücre hatlarının (1 günlük embriyolardan türetilen zebra balığı fibroblastik ) çeşitli sitotoksisite tahlilleri ile toksisiteyi değerlendirmek için kullanılması21.
Danio rerio (zebra balığı), sucul toksisite çalışmalarında kullanılan başlıca balık türlerinden biridir; Bu nedenle, balık toksisitesi testi için zebra balığı hücre hatları ile hücre bazlı yöntemler son derece yararlı olabilir. ZFL hücre hattı, karaciğer parankimal hücrelerinin temel özelliklerini sunan ve ksenobiyotikleri 7,22,23,24,25 metabolize edebilen bir zebra balığı epitelyal hepatosit hücre hattıdır. Bu arada, ZEM2S hücre hattı, balık26,27 üzerindeki gelişimsel etkileri araştırmak için kullanılabilecek blastula aşamasından türetilen embriyonik bir zebra balığı fibroblastik hücre hattıdır. Bu nedenle, bu protokol, 96 delikli plakalarda ZFL ve ZEM2S hücre hatları ile yapılacak modifikasyonlarla dört sitotoksisite testini (MTT, AB, NR ve CFDA-testleri) tanımlamaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: Bu protokolde kullanılan malzemelerin listesi için Malzeme Tablosu'na ve bu protokolde kullanılan çözümlerin ve ortamların bileşimi için Tablo 1'e bakınız.
1. ZFL ve ZEM2S hücrelerinin hazırlanması
- %80 birleşimli ZFL veya ZEM2S hücrelerinden oluşan bir T75 şişesi ile başlayın, CO 2 olmadan 28 ° C'de ilgili tam ortamda kültürlenmiştir.
- Kültür ortamını şişeden çıkarın ve 10 mL 1x fosfat tamponlu salin (PBS) (0.01 M) ekleyerek hücreleri yıkayın. Kültür şişelerine 3 mL 1x tripsin (%0,05 v/d; 0,5 mM tripsin-EDTA) ekleyin. 3 dakika boyunca 28 ° C'de inkübe edin.
- Hücreleri serbest bırakmak için şişeye hafifçe dokunun ve ardından şişeye 3 mL tam kültür ortamı ekleyerek tripsin sindirimini durdurun.
- Hücre süspansiyonunu 15 mL'lik bir konik santrifüj tüpüne aktarın ve 5 dakika boyunca 100 × g'da santrifüj yapın.
- Santrifüjlemeden sonra, süpernatanı dikkatlice çıkarın, ZFL veya ZEM2S hücreleri için 1 mL tam ortam ekleyin ve bir mikropipet kullanarak peleti yeniden askıya alın.
2. Tripan mavi boya dışlama ile hücre sayımı
- Hücreleri saymak ve canlılıklarını değerlendirmek için bir mikrotüpe 10 μL hücre süspansiyonu ve 10 μL tripan mavisi boya ekleyin. Hücre süspansiyonunu karıştırın ve bir pipet kullanarak boyayın.
- Daha sonra, bu karışımın 10 μL'sini (hücre süspansiyonu + tripan mavisi) bir Neubauer odasına aktarın ve odanın köşelerine yerleştirilen dört büyük karedeki (Quadrants Q) hücreleri, canlı hücrelerin tripan mavisini almayanlar olduğunu düşünerek sayın. Denklem (1)'i kullanarak yaşayabilir hücrelerin sayısını belirleyin:
(1) - Denklem (1) kullanılarak belirlenen hücre sayısını iki ile çarparak hücre süspansiyonundaki son hücre sayısını hesaplayın (tripan mavisinin kullanımından kaynaklanan seyreltme faktörü).
NOT: Alternatif olarak, otomatik bir hücre sayma sistemi (örneğin, hücre sayımı ve canlılık fonksiyonuna sahip bir sitomer) kullanılabilir.
(1)3. 96 delikli plakalarda hücre kaplaması
- Sitotoksisite testlerini gerçekleştirmek için gereken hücre sayısını elde etmek için gereken hücre süspansiyon hacmini hesaplayın. Her hücre satırı için uygun hücrelerin sayısı aşağıda belirtilmiştir:
- Kuyu başına 60.000 canlı ZEM2S hücresi plakası; Bu nedenle, tüm plaka için, 20 mL'lik tam ortamda (200 μL / kuyu, 96 delikli plaka) altı milyon hücre kullanın.
- Kuyu başına 40.000 canlı ZFL hücresi plakası; Bu nedenle, tüm plaka için, 20 mL'lik tam ortamda (200 μL / kuyu, 96 delikli plaka) dört milyon hücre kullanın.
- Bundan sonra, hücre süspansiyonunun ilgili hacmini bir reaktif rezervuarına (steril) aktarın ve ZFL veya ZEM2S için 20 mL'ye kadar tam kültür ortamı ile doldurun. Çok kanallı pipet kullanarak çözeltiyi yavaşça yukarı ve aşağı doğru karıştırın.
NOT: Köpük veya kabarcık oluşturmamaya dikkat edin. - Çok kanallı mikropipeti kullanarak şeffaf polistiren 96 delikli plakanın her bir oluğuna 200 μL hücre süspansiyonu ekleyin. Plakaları 24 saat boyunca 28 ° C'de inkübe edin.
NOT: Plaka, boş kontrol için hücresiz en az üç kuyucuğa sahip olmalı ve bu kuyucuklara yalnızca tam ortam eklenmelidir. Kenar etkisi (kenar kuyularındaki daha yüksek buharlaşmanın neden olduğu) genellikle 96 delikli plaka analizlerinde meydana gelir ve plaka28'in kenar kuyularındaki hücrelerin yaşayabilirliğini etkileyebilir. Bu etki, 96 delikli plaka markasına ve tasarım28'e bağlı olarak daha yüksek veya daha düşük olabilir. Kenar kuyularında ZFL ve ZEM2S için herhangi bir hücre büyümesi / canlılığı bozukluğu fark etmemiş olsak da, bu etkiyi önlemek için plakayı parafilm veya yapışkan sızdırmazlık folyosu ile kapatmanızı veya hücreleri sadece 60 iç kuyuda kültürlemenizi ve kenar kuyucuklarını PBS ile doldurmanızı öneririz.
4. Kimyasal testi için hücrelerin maruz kalması
- Çok kanallı bir mikropipet kullanarak harcanan medyayı kuyucuklardan dikkatlice atın.
- Kimyasalları farklı konsantrasyonlarda test etmek için hücreleri maruz bırakın. Fetal sığır serumu (FBS) (maruz kalma ortamı) olmadan ZFL veya ZEM2S için kültür ortamındaki test kimyasal konsantrasyonlarının çözeltilerini hazırlayın. Daha sonra, bu çözeltilerin kuyucuk başına 100 μL'sini teknik üçlü olarak ekleyin (yani, üç kuyucuk / test kimyasal konsantrasyonu).
- Kontroller için, kontrol gruplarını teknik üçlü (üç kuyu/kontrol grubu) içindeki test kimyasalı ile aynı plakaya yerleştirin. Bu nedenle, boş kontrol (B) için, hücresiz kuyucuklara maruz kalma ortamının 100 μL'sini ekleyin, negatif kontrol (NC) için, maruz kalma ortamının 100 μL'sini hücreli kuyucuklara ekleyin ve pozitif kontrol (PC) için, hücreleri maruz kalma ortamında hazırlanan% 1'lik bir Triton X-100 çözeltisine maruz bırakın. Bazı durumlarda, nihai çözücü konsantrasyonu olarak açıkça sitotoksik olmayan bir konsantrasyon göz önüne alındığında, plakaya bir çözücü kontrolü (SC) dahil edilmelidir.
NOT: Çözücü olarak% 0,5 DMSO kullanılması önerilir; DMSO, negatif kontrole bağlı %10'luk sitotoksisite eşiğini aşmadan bu hücre hatlarında çözücü olarak %1'e kadar kullanılabilir. - Plakaları 24 saat boyunca 28 ° C'de inkübe edin. Kültür ortamının buharlaşmasını önlemek için plakaları parafilm veya yapışkan sızdırmazlık folyosu ile kapatın.
NOT: Bazı kimyasallar, gösterge boyalarının absorbansına veya floresansına müdahale edebilecek içsel arka plan emilimine veya floresansına sahip olabilir (örneğin; renkli bileşikler absorbansı, serum albümini29'u ve indirgeme enzimlerine müdahale eden bileşikleri etkileyebilir30,31). Bu durumda, plaka, hücresiz kuyucuklara test kimyasal çözeltileri ekleyerek ek bir kontrol içermelidir. Bu, kimyasal oto-absorbansın / otofloresanın boyalarla olası girişimini doğrulamak içindir. Girişim tespit edilirse, sitotoksisitenin doğru bir tahminini elde etmek için dışlanıp dışlanamayacağı değerlendirilmelidir.
5. Sitotoksisite testleri
NOT: Tüm çözümleri Tablo 1'e göre hazırlayın. Aşağıda açıklanan tüm adımlar (Şekil 1) steril koşullar altında gerçekleştirilir. Maruz kalma ortamını atmak için pipet kullanılması önerilmez, çünkü hücreler kimyasal işlemden sonra kuyucuklardan kolayca ayrılabilir.
- AB ve CFDA-testleri
- 24 saatlik test kimyasal maruziyetinden sonra, içeriği bir toplama tepsisine dökerek pozlama ortamını dikkatlice atın.
- Plakayı 200 μL PBS ile yıkayın. PBS'yi, hücre kaybını önlemek için bir toplama tepsisine dökerek dikkatlice çıkarın.
- AB/CFDA-çözeltisinin kuyucuğu başına 100 μL ekleyin. Plakayı karanlıkta 28 ° C'de 30 dakika boyunca inkübe edin.
- Bir floresan plaka okuyucusundaki floresanı AB için 530 nm (uyarım) ve 595 nm (emisyon) ve CFDA-için 493 nm (uyarma) ve 541 nm (emisyon) olarak ölçün.
- NR testi
NOT: NR testi için adımlar, AB ve CFDA-tahlillerinden hemen sonra gerçekleştirilir (Şekil 1).- NR çalışma solüsyonunu (40 μg/mL) 10 dakika boyunca 600 × g'da santrifüj yapın.
NOT: Tüpteki NR yağışı plakalara aktarılmamalıdır. Bu nedenle, NR çalışma çözeltisinin santrifüjlenmesinden sonra, NR çökeltilerini aspire etmeden bir pipet kullanarak süpernatantı toplayın. Süpernatantı bir reaktif rezervuarına aktarın. - İçeriği bir toplama tepsisine dökerek AB/CFDA-çözümünü dikkatlice çıkarın.
- Çok kanallı bir mikropipet kullanarak NR çalışma çözeltisinin kuyucuğuna 100 μL ekleyin. Plakayı 3 saat boyunca 28 ° C'de inkübe edin.
NOT: 3 saatlik inkübasyondan sonra, mikroskop kullanarak plakalarda NR çökelmesinin meydana gelip gelmediğini gözlemleyin. NR çökeltileri, hücre canlılığının nicelleştirilmesine müdahale edebilir, bu nedenle mevcut olmamalıdırlar. - İçeriği bir toplama tepsisine dökerek NR çözeltisini dikkatlice çıkarın. Kuyu başına 150 μL PBS ekleyerek kuyuları yıkayın.
- NR ekstraksiyon çözeltisinin kuyucuğu başına 150 μL ekleyin ve hafifçe çalkalamak için plakayı bir plaka çalkalayıcı üzerinde 10 dakika boyunca inkübe edin. Bir plaka okuyucuda 540 nm'deki emilimi ölçün.
NOT: Plakadaki herhangi bir arka plan parmak izi emiciliğini dışlamak için 690 nm'de ikinci bir okuma yapılmalıdır.
- NR çalışma solüsyonunu (40 μg/mL) 10 dakika boyunca 600 × g'da santrifüj yapın.
- MTT testi
NOT: MTT testi, yukarıda açıklanan tahlillerden ayrı olarak (yeni bir plakada) yapılmalıdır (Şekil 2).- İçeriği bir toplama tepsisine dökerek pozlama ortamını dikkatlice çıkarın.
- Çok kanallı bir mikropipet kullanarak kuyu başına 100 μL MTT çalışma çözeltisi ekleyin. Plakayı 4 saat boyunca 28 ° C'de inkübe edin.
- İçeriği bir toplama tepsisine dökerek MTT çözümünü atın.
- Formazan kristallerini çıkarmak için DMSO'nun kuyucuğu başına 100 μL ekleyin, plakayı 10 dakika boyunca bir plaka çalkalayıcı üzerinde inkübe edin. Bir plaka okuyucu kullanarak emiciliği 570 nm'de ölçün.
NOT: Plakadaki herhangi bir arka plan parmak izi emiciliğini dışlamak için 690 nm'de ikinci bir okuma yapılmalıdır. Test kimyasallarının, üretilen verilerin kalitesini sağlamak için değerlendirilmesi gereken MTT'ye müdahale edebileceğini belirtmek önemlidir32. Bunun için, test konsantrasyonlarını ve MTT'yi (0.5 mg / mL) içeren hücresiz kuyular açığa çıkarılmalı, ardından kuyucuklarda emilimi artırabilecek ve yanlış canlılık sonuçlarına yol açabilecek herhangi bir renk değişikliğini gözlemlemek için inkübasyon yapılmalıdır. Bu testte MTT ile etkileşime giren kimyasallardan kaçınılmalıdır.
6. Hücre canlılığının/sitotoksisitesinin hesaplanması
NOT: Elde edilen ham absorbans veya floresan, negatif kontrol (doğrudan maruz kalma ortamında hazırlanan test kimyasalları için) veya çözücü kontrolü (DMSO gibi çözücüler kullanılarak hazırlanan test kimyasalları için) ile ilgili bir yüzde olarak hücre canlılığını hesaplamak için kullanılır. Hücre canlılık yüzdesini belirlemeden önce, ham veriler boş kontrol tarafından normalleştirilmelidir.
- Her test kimyasal konsantrasyonu ve kontrol grubu (üç kuyucuk / arıtma) için ortalama absorbans veya floresanı hesaplayın.
- Kontrole göre hücre canlılık yüzdesini belirlemek için (negatif veya çözücü), denklem (2) kullanın:
(2)
NOT: Absorbans (abs) veya floresan (fluo) birimleri, konsantrasyon başına üç kuyucukta ölçülen absorbans veya floresan ortalamasını temsil eder; boş, hücresiz kuyuları temsil eder.
(2)Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 3, AB, CFDA-, NR ve MTT tahlillerinin plakalarını göstermektedir. AB tahlili için (Şekil 3A), canlı hücre sayısı az veya hiç olmayan boş kuyular ve kuyular mavi renk ve düşük floresan gösterirken, çok sayıda canlı hücreye sahip kuyular pembemsidir ve resazurinin (AB) canlı hücreler tarafından resorufin'e (pembemsi madde) dönüştürülmesi nedeniyle yüksek floresan değerleri sunar. CFDA-testi için, plakadaki kuyucukların renginde gözle görülür bir fark yoktur; Bununla birlikte, floresan, CFDA-'nin tutulması ve daha sonra karboksifloreseine (floresan madde) dönüştürülmesi nedeniyle canlı hücreler içeren kuyucuklarda daha yüksektir.
NR testi için (Şekil 3B), boş kuyucuklar NR boyasını tutacak hücre olmadığından çok düşük absorbans değerleriyle şeffaf olmalıdır. Bazı durumlarda, boş kuyular şeffaf değildir, bu da plakada NR yağışının meydana geldiğini gösterir; bu durumda, bu geçerli bir deney olarak kabul edilmemelidir. Test kimyasallarının ve PC'nin yüksek sitotoksik konsantrasyonları şeffaftır veya düşük absorbans değerlerine sahip çok açık pembe bir renk sunarken, canlı hücreler içeren kuyucuklar NR boyasını korur ve koyu pembe bir renk ve yüksek emicilik değerleri sunar.
MTT testi için (Şekil 3C), MTT'yi formazan'a dönüştürecek hücre olmadığı için boş kuyucuklar şeffaf ve çok düşük emici olmalıdır. Test kimyasallarının ve PC'nin yüksek sitotoksik konsantrasyonları şeffaftır veya düşük absorbans değerlerine sahip çok açık bir menekşe rengi sunarken, canlı hücreler içeren kuyular MTT'yi (sarı) formazana (menekşe maddesi) dönüştürür ve yüksek emilim değerlerine sahip daha koyu bir menekşe rengi sunar.
Şekil 4A , grup başına floresan veya absorbans değerlerinin ortalamalarını kullanarak, hesaplamadan sonra hücre canlılığının temsili bir grafiğini göstermektedir. Grafik, veri analiz yazılımı kullanılarak protokol bölüm 6'da sunulan uygulanabilirlik hesaplama formülü ile hesaplanan canlılık yüzdesi değerlerinin girdisi ile çizilebilir. SC'ye maruz kalan hücrelerin yaşayabilirliği, NC17'den% 10 daha düşük olmamalıdır. Test kimyasalları için hücre canlılık yüzdesi, çözünürlüklerine bağlı olarak NC veya SC ile ilgili olarak hesaplanır. Bu durumda, bir test maddesi olarak farklı DMSO konsantrasyonları kullanılır ve hücre canlılığı% 100 canlılık olarak tanımlanan NC ile ilişkilidir.
Hücre canlılığı verileri, logaritmik dönüşüm ile test kimyasallarının yarı maksimum inhibitör konsantrasyonunu (IC50) ve uygun replikasyonlar33,34,35'ten sonra doğrusal olmayan regresyon ile interpolasyonlu standart eğriyi hesaplamak için kullanılabilir. Şekil 4B, Şekil 4A'da gösterilen canlılık yüzdesinden hesaplanan IC50'yi göstermektedir. IC50, AB testinde nominal konsantrasyonlar kullanılarak en az üç teknik replikasyon ve üç deneysel replikasyon ile elde edilmiştir. Analizler, test maddelerinin beş farklı konsantrasyonu ile gerçekleştirildi; Bununla birlikte, deneyin türüne bağlı olarak daha fazla sayıda konsantrasyon gerekebilir. Örneğin, genellikle bir deney için bir kimyasal maddenin nihai test konsantrasyonlarını belirlemek için gerçekleştirilen aralık bulma testi için sekiz test konsantrasyonu önerilir. Canlılık testleri farklı sitotoksisite sonlanım noktalarına sahip olduğundan, kimyasal maddelerin farklı etki mekanizmalarının neden olduğu duyarlılık farklılıklarını veya hücre hatları arasındaki duyarlılık farklılıklarını tanımlamak için ayrı ayrı yapılan her tahlil için IC50'nin hesaplanmasını öneririz. Farklı hücre hatlarında test edilen kimyasalların IC50 değerlerindeki farklılıklar, kullanılan kültür ortamının türüne bağlı olarak da değişebilir, çünkü proteinler ve lipitlerle ilgili bileşimdeki farklılıklar kimyasal biyoyararlanımı etkileyebilir36. Ek olarak, birçok kimyasalın sitotoksisitesi bu tahlillerle değerlendirilebilir. ZFL ve ZEM2S hücre hatlarında değerlendirilen diğer kimyasalların IC50'si Şekil 4B-H'de gösterilmiştir.
Şekil 1: Aynı 96 delikli plakada gerçekleştirilen AB, CFDA-ve NR tahlillerinin şematik protokolü. Kısaltmalar: AB = Alamar Blue; CFDA-= 5-karboksifloresein diasetat asetoksimetil ester; NR = Nötr Kırmızı; PBS = fosfat tamponlu salin. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: 96 delikli bir plakada gerçekleştirilen MTT testinin şematik protokolü. Kısaltma: MTT = 3-[4,5-dimetiltiazol-2il]-2,5-difeniltetrazolium bromür. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: AB, CFDA-, NR ve MTT tahlillerinin temsili sonuçları. Görüntüler, (A) AB ve CFDA-, (B) NR ve (C) MTT tahlillerindeki kontroller ve test konsantrasyonları için kuyulardaki renk farklılıklarını göstermektedir. Kısaltmalar: AB = Alamar Blue; CFDA-= 5-karboksifloresein diasetat asetoksimetil ester; NR = Nötr Kırmızı; PBS = fosfat tamponlu salin; B = boş kuyular (hücresiz kuyular); SC = çözücü kontrolü (% 0.5 DMSO); NC = negatif kontrol (kültür ortamındaki hücreler); PC = pozitif kontrol (%1 Triton X-100). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Farklı test kimyasalları için hücre canlılığı ve canlılık verilerinin hesaplanması. Okuma verilerini kullanarak hücre canlılığının hesaplanması, NC veya SC (A) ile ilgili hücre canlılığının yüzdesi (%) olarak ifade edilebilir. Bir kimyasalın sitotoksisitesi, farklı test kimyasalları (B-H) için doğrusal olmayan regresyon ile standart bir eğriyi interpolasyon yapmak için canlılık verileri kullanılarak değerlendirilebilir. Veriler, üç teknik replikasyonun (AB testi) hücre canlılığı (noktalar) ve standart sapması (çubuklar) ortalaması olarak temsil edilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: 24 saat boyunca FBS varlığında (%10) ve yokluğunda (%0, tamamen FBS'den yoksun) kültürlenmiş ZFL ve ZEM2S hücrelerinde MTT testi yapıldı. (A) %0 ve %10 FBS'deki ZFL hücreleri, Kruskall-Wallis testi ile hücre canlılığında anlamlı bir fark göstermemektedir (p = 0.2286). (B) %0 ve %10 FBS'deki ZEM2S hücreleri, Mann-Whitney testi ile hücre canlılığında anlamlı bir fark göstermemektedir (p = 0.3429). Anlamlılık düzeyi p < 0.05 olarak değerlendirildi. Veriler, üç teknik kopyanın medyan ve çeyrekler arası aralığı olarak ifade edilir. Kısaltmalar: n.s. = anlamlı bir fark yok; FBS = fetal sığır serumu; MTT = 3-[4,5-dimetiltiazol-2il]-2,5-difeniltetrazolyum bromür. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: DMSO ile farklı konsantrasyonlarda (% 0.1,% 0.5 ve% 1) ve negatif kontrolde tedavi edilen ZFL ve ZEM2S hücrelerinde (24 saat) yapılan MTT ve NR testleri. Test edilen herhangi bir konsantrasyonda DMSO ile muamele edilmiş ZFL hücreleri, (A) MTT testi (p = 0.074) ve (B) NR testi (p = 0.216) ile NC ile ilişkili hücre canlılığında anlamlı bir fark göstermemiştir. DMSO ile tedavi edilen ZEM2S hücreleri, (C) MTT testi (p = 0.422) ve (D) NR testi (p = 0.287) ile NC ile ilişkili hücre canlılığında anlamlı bir fark göstermedi. Kruskall-Wallis testinde p < 0.05 anlamlılık düzeyi dikkate alındı. Veriler, üç teknik kopyanın medyan ve çeyrekler arası aralığı olarak ifade edilir. Kısaltmalar: n.s. = anlamlı bir fark yok; NC = negatif kontrol; MTT = 3-[4,5-dimetiltiazol-2il]-2,5-difeniltetrazolyum bromür; NR = Nötr Kırmızı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Tablo 1: Bu protokolde kullanılan çözümler ve medya. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sitotoksisite testleri, in vitro toksisite değerlendirmesi için yaygın olarak kullanılmaktadır ve bu protokol makalesi, zebra balığı hücre hatlarında gerçekleştirilmek üzere modifiye edilmiş dört yaygın olarak kullanılan sitotoksisite tahlilini sunmaktadır (yani, 96 kuyucuklu plaka için hücre yoğunluğu, MTT testinde kuluçka süresi, kimyasal maruz kalma koşulu sırasında FBS tükenmesi ve SC için maksimum kabul edilebilir konsantrasyon). Bu analizler sitotoksisiteyi farklı hücre canlılık bitiş noktaları (metabolik fonksiyon, lizozomal membran bütünlüğü ve hücre zarı bütünlüğü) ile ölçtüğünden, bunların kombinasyonu zebra balığı hücre hatlarındaki kimyasal sitotoksisitenin doğru bir değerlendirmesini sağlar. Bu protokol aynı zamanda ZFL ve ZEM2S hücre hatlarının kültürünü, kültür sistemini yeterince tamponlayabilen ve pH'ı 7.4'te (fizyolojik pH) tutabilen kültür ortamı bileşimleri nedeniyle CO2 içermeyen bir durumda önermektedir. Her iki hücre hattı için bu protokolde önerilen kültür ortamı bileşimi ve CO2'siz ortam literatürde yaygın olarak bildirilmiştir. ZFL hücre hattı genellikle sodyum bikarbonat ilavesi olsun veya olmasın ve CO 2 37,38,39,40,41,42,43 olmadan L-15 ve RPMI ortamlarında kültürlenir. Bu arada, ZEM2S hücre hattı biyokaynak merkezinin talimatlarına göre kültürlenir ve kültür ortamı CO2 içermeyen kültürler için formüle edilir; Bu nedenle, CO2 ve hava karışımı, bu tür kültür ortamlarını kullanırken hücrelere zararlı olabilir44.
FBS eklenmeden bir kültür ortamında kimyasal maruziyet, kimyasal maddelerin in vitro tahlillerinde biyoyararlanımının serum proteinlerine bağlanmalarından önemli ölçüde etkilendiğini gösteren yayınlanmış çalışmalara dayanarak gerçekleştirilmiştir. Örneğin, Chen ve ark.45, RTgill-W1 testinde serum proteinlerinin varlığının, bir katyonik yüzey aktif maddenin (C12-benzalkonyum) biyoyararlanımını üç buçuk kata kadar azaltabileceğini göstermiştir. FBS'ye bağlı kimyasal genellikle kültür ortamı45'te% 47 ila% 90 arasında değişmiştir. Bu nedenle, bu sorunu önlemek için, MTT testini kullanarak FBS'den tamamen yoksun kültürlerde ZFL ve ZEM2S hücrelerinin hücre canlılığını 24 saat boyunca değerlendirdik. Sonuçlar, (% 10) ve (% 0) FBS'siz ZFL veya ZEM2S kültürlerinden hücre canlılığında anlamlı bir fark göstermedi, bu da bu zebra balığı hücre hatlarının FBS'den yoksun kültür ortamlarında kimyasal işleme tabi tutulabileceğini gösterdi (Şekil 5). FBS miktarının azaltılmasının kimyasal biyoyararlanımda başka sonuçlara neden olabileceğini vurgulamak önemlidir. Örneğin, lipofilik kimyasallar plastik laboratuar gereçlerine ve plakalara daha yüksek emilime sahiptir ve kimyasal biyoyararlanımı azaltır36. Bununla birlikte, kültür ortamında FBS'nin varlığı, kimyasallara bağlanmak için plastikle rekabet eden serum bileşenleri nedeniyle plastik bağlanmayı azaltabilir46. FBS takviyesinin yüzdesi veya tamamen yoksunluğu ile ilgili en iyi karar, test kimyasalının türüne bağlı olabilir. Örneğin, Pomponio ve ark.46, kimyasal amiodaron'un FBS yokluğunda plastiğe daha yüksek bir bağlanmaya sahip olmasına rağmen,% 10 FBS kullanıldığında biyoyararlanımının daha da düşük olduğunu bildirmiştir. Mono-N-desethylamiodarone için, neredeyse aynı miktar serum ortamına ve duvarlara bağlanır46.
Organik çözücülerin (örneğin, DMSO) genellikle in vitro tahlillerde% 0,5'e kadar kullanılması önerilir. Bununla birlikte, bu düşük konsantrasyon, suda çözünür kimyasalların daha yüksek konsantrasyonlarının test edilmesini bozabilir. Bu sorunu önlemek için, daha yüksek DMSO konsantrasyonlarının% 10'luk sitotoksisite eşiğini aşmayan ZFL ve ZEM2S hücre hatları için uygun olup olmadığını değerlendirdik. Bunun için, tedavi edilmemiş hücreler (NC'ler) ve farklı DMSO konsantrasyonları (% 0.1,% 0.5 ve% 1) ile tedavi edilmiş hücreler (24 saat) MTT ve NR testleri için işlenmiştir. Sonuçlar, NC'lere kıyasla tedavi grubundan hücre canlılığında anlamlı bir fark göstermemiştir (Şekil 6), bu özel koşullar altında,% 1'e kadar DMSO konsantrasyonlarının kullanılabileceğini göstermektedir. Diğer balık hücresi hatları da,% 0.5'ten daha yüksek DMSO konsantrasyonlarını destekler, bu da ZFL ve ZEM2S hücre hatlarının bir özelliği değildir. Örneğin, CHSE-214 (Oncorhynchus tshawytscha embriyosundan türetilen hücre hattı)47, RTG-2 (Oncorhynchus mykiss gonadal hücre hattı)48,49,50 ve PLHC-1 (Poeciliopsis lucida hepatosellüler karsinom hücre hattı)48 kullanılarak sitotoksisite tahlillerinde %2'ye kadar DMSO'ya kadar maksimum çözücü konsantrasyonları (sitotoksik etki gözlenmeden) uygulanmıştır.48 Hücre. % 1 DMSO'luk maksimum çözücü konsantrasyonu, RTL-W1 (Oncorhynchus mykiss gonadal hücre hattı)51 ve CCO (Ictalurus punctatus over hücre hattı)52 hücreleri kullanılarak sitotoksisite tahlillerinde de kullanılmıştır. Mori ve Wakabayashi47'ye göre, balık hücre hatları DMSO'ya karşı memeli hücre hatlarından daha düşük bir duyarlılığa sahip olabilir. Bununla birlikte, %1 DMSO'nun kabul edilebilir maksimum konsantrasyonunun sadece sitotoksisite için tanımlandığını ve bunun ZFL ve ZEM2S hücre hatlarındaki diğer son noktalar (örneğin, genotoksisite, epigenetik, protein kodlayan gen ekspresyon analizi) için dikkatlice değerlendirilmesi gerektiğini vurgulamak önemlidir.
MTT ve AB testleri, hücre canlılığını belirlemek için metabolik aktiviteye dayanmaktadır. MTT testi en çok kullanılan canlılık testi olmasına rağmen, AB testine kıyasla biraz daha az hassas olabilir, bazı durumlarda hücre canlılığını abartabilir53. AB testinin daha yüksek hassasiyeti, floresan ölçümü kolorimetrik ölçümden daha hassas olduğu için ölçüm yöntemiyle ilişkili olabilir15. Bununla birlikte, hem AB hem de MTT testleri, sitotoksik kimyasal maddeleri tanımlamak için yüksek kaliteli testlerdir ve üretilen veriler, tehlikeli kimyasal maddeleri içsel sitotoksik potansiyellerine göre sınıflandırmak için kullanılmıştır53.
AB, CFDA-ve NR tahlillerinin aynı plakada yapılması fikri OECD TG 249'a (RTgill-W1 tahlili)17; Bununla birlikte, bu tahlillerin 96 kuyucuklu plakalarda yapılması ve zebra balığı hücre hatları için uygun olması için değişiklikler yapılmıştır. 24 delikli plakalar yerine 96 delikli plakalardaki testler, balık hücre hatlarında yüksek verimli sitotoksisite testi için avantajlı olabilir. Ek olarak, RTgill-W1 testi sadece L-15 kültür ortamını kullanırken, ZFL ve ZEM2S hücre hatları D-glikoz içeren bir ortamda kültürlenir. Kültür ortamı, MTT testinin bu hücre hatlarında yapılmasını mümkün kılar, çünkü glikozsuz ortamda kültürlenen hücre hatları (örneğin, sadece L-15) hücrelerdeki MTT azalmasını hemen azaltabilir ve bu tahlilin performansını bozabilir54. Bu protokol, iki zebra balığı hücre hattında dört farklı canlılık testinin kolayca gerçekleştirilmesini sağlar.
Bu protokol, in vitro modeller kullanarak kimyasal maddelerin balıklar üzerindeki etkilerini incelemek için kullanılabilir. Farklı hücre hatları, balık gibi aynı omurgalı grubundan olsalar bile, kimyasal etkileri tahmin etmek için farklı hassasiyetlere sahip olabilir. Örneğin, ZFL ve ZF4 hücre hatlarını balık embriyolarıyla karşılaştıran Langu-Mitea ve ark.21 , ZFL'nin balık embriyosu toksisite testine kıyasla benzer sonuçlar üretebildiğini göstermiştir. Tanneberger ve ark.5 , kalıcı balık hücresi hatları GSF, PLHC, RTG-2, RTgill-W1 ve R1'in kimyasal balık toksisitesini tahmin etmede in vivo (yetişkin balık) ile karşılaştırıldığında farklı hassasiyetlere sahip olduğunu göstermiştir. RTgill-W1 (kalıcı balık solungaç hücre hattı) yakın zamanda balık akut toksisitesini tahmin etmek için alternatif bir yöntem olarak doğrulanmış olsa da, ekotoksisite çalışmalarında diğer hücre hatlarının uygulanabilirliği araştırılmalıdır. Farklı balık türlerinden ve doku kökenlerinden hücre hatlarının yanı sıra gelişim aşamalarının kullanılması (ZEM2S: embriyo; ZFL: yetişkin karaciğeri), balık gelişiminin belirli aşamaları ve hedef organlarla ilgili etkileri ele alabileceğinden, ekotoksisite çalışmalarına önemli ölçüde katkıda bulunabilir. Bu nedenle, kimyasal etkiler, sadece tek bir hücre hattında değil, balıklarda (örneğin, karaciğer, gonadlar, solungaç, beyin) farklı hedef bölgeleri yansıtan farklı hücre kültürleri kullanılarak araştırılmalıdır55.
Bu protokollerin ekotoksisite çalışmalarında farklı uygulamaları olabilir ve kullanımları mutlaka balık akut toksisitesini tahmin etmekle sınırlı değildir. Örneğin, balıklar üzerindeki endokrin bozucu etkilerin değerlendirilmesi gibi diğer in vitro balık toksisitesi testlerini gerçekleştirmek için sub-sitotoksik konsantrasyonları tanımlamak için uygulanabilirler. Ek olarak, in vitro sitotoksisite verileri fizyolojik temelli toksikokinetik (PBTK) modellemenin geliştirilmesine ve iyileştirilmesine de yardımcı olabilir. PBTK, bir kimyasalın organizmadaki farklı organları (solungaç, karaciğer veya bağırsak gibi) göz önünde bulundurarak dağılımına odaklandığından56, farklı balık türlerinden ve doku kökenlerinden hücre hatları kullanmak bu model için yararlı bir bilgi kaynağı olabilir. İn vitro biyotahlillerin sonuçları (örneğin, sitotoksisite testleri), PBTK modelinde biyolojik süreçleri temsil eden girdi verileri sağlar ve in vitro in vivo ekstrapolasyon 21,56'ya katkıda bulunur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Bu çalışmanın ortak yazarı, kozmetik alanında mükemmel bir araştırmacı olan ve Brezilya'da kozmetik araştırmalarını teşvik etmeye adanmış Dr. Márcio Lorencini'nin anısına. Yazarlar, ekipman kullanılabilirliği ve Yüksek Öğretim Personelinin İyileştirilmesi için Koordinasyon (CAPES, Brezilya) (Finans Kodu 001) ve Grupo Boticario'nun mali desteği için Fizyoloji Bölümündeki (UFPR) Çok Kullanıcılı Laboratuvara minnettardır.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-CFDA, AM (5-Carboxyfluorescein Diacetate, Acetoxymethyl Ester) | Invitrogen | C1345 | |
| Cell culture plate, 96 well plate | Sarstedt | 83.3924 | Surface: Standard, flat base |
| DMEM | Gibco | 12800-017 | Powder, high glucose, pyruvate |
| FBS - Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions | Gibco | 12657-029 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mix, powder | Gibco | 21700026 | Powder |
| HEPES (1 M) | Gibco | 15630080 | |
| Leibovitz's L-15 Medium | Gibco | 41300021 | Powder |
| Neutral red | Sigma-Aldrich | N4638 | Powder, BioReagent, suitable for cell culture |
| Orbital shaker | Warmnest | KLD-350-BI | 22 mm rotation diameter |
| Dulbeccos PBS (10X) with calcium and magnesium | Invitrogen | 14080055 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| Resazurin sodium salt | Sigma-Aldrich | R7017 | Powder, BioReagent, suitable for cell culture |
| RPMI 1640 Medium | Gibco | 31800-014 | Powder |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | Powder, bioreagent for molecular biology |
| Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide 98% | Sigma-Aldrich | M2128 | |
| Trypan blue stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red | Gibco | 15400054 | |
| ZEM2S cell line | ATCC | CRL-2147 | This cell line was kindly donated by Professor Dr. Michael J. Carvan (University of Wisconsin, Milwaukee, USA) |
| ZFL cell line | BCRJ | 256 |
References
- ECHA. Non-Animal Approaches-Current Status of Regulatory Applicability Under the REACH, CLP and Biocidal Products Regulations. ECHA. , Available at <87ebb68f-2038-f597-fc33-f4003e9e7d7d (2017).
- Alternative Methods Accepted by US Agencies. National Toxicology Program, and US Department of Health and Human Services. , Available from: https://ntp.niehs.nih.gov/whatwestudy/niceatm/accept-methods/index.html (2022).
- Schirmer, K. Proposal to improve vertebrate cell cultures to establish them as substitutes for the regulatory testing of chemicals and effluents using fish. Toxicology. 224 (3), 163-183 (2006).
- Scholz, S., et al. Alternatives to in vivo tests to detect endocrine disrupting chemicals (EDCs) in fish and amphibians-screening for estrogen, androgen and thyroid hormone disruption. Critical Reviews in Toxicology. 43 (1), 45-72 (2013).
- Tanneberger, K., et al. Predicting fish acute toxicity using a fish gill cell line-based toxicity assay. Environmental Science & Technology. 47 (2), 1110-1119 (2013).
- Roesler, R., Lorencini, M., Pastore, G. Brazilian cerrado antioxidant sources: cytotoxicity and phototoxicity in vitro. Food Science and Technology. 30, 814-821 (2010).
- Ruyra, A., et al. Zebrafish liver (ZFL) cells are able to mount an anti-viral response after stimulation with Poly (I:C). Comparative Biochemistry and Physiology. Part B, Biochemistry & Molecular Biology. 182, 55-63 (2015).
- Natsch, A., Laue, H., Haupt, T., von Niederhäusen, V., Sanders, G. Accurate prediction of acute fish toxicity of fragrance chemicals with the RTgill-W1 cell assay. Environmental Toxicology and Chemistry. 37 (3), 931-941 (2018).
- Freshney, R. I.
- Mosmann, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. Journal of Immunological Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).
- O'Brien, J., Wilson, I., Orton, T., Pognan, F. Investigation of the Alamar Blue (resazurin) fluorescent dye for the assessment of mammalian cell cytotoxicity. European Journal of Biochemistry. 267 (17), 5421-5426 (2000).
- Gonzalez, R. J., Tarloff, J. B. Evaluation of hepatic subcellular fractions for Alamar blue and MTT reductase activity. Toxicology In Vitro. 15 (3), 257-259 (2001).
- Borenfreund, E., Puerner, J. A. Toxicity determined in vitro by morphological alterations and neutral red absorption. Toxicology Letters. 24 (2-3), 119-124 (1985).
- Repetto, G., del Peso, A., Zurita, J. L. Neutral red uptake assay for the estimation of cell viability/cytotoxicity. Nature Protocols. 3 (7), 1125-1131 (2008).
- Kamiloglu, S., Sari, G., Ozdal, T., Capanoglue, E. Guidelines for cell viability assays. Food Frontiers. 1 (3), 332-349 (2020).
- Water Quality-Determination of Acute Toxicity of Water Samples and Chemicals to a Fish Gill Cell Line (RTgill-W1) (ISO 21115:2019). International Organization for Standardization. , Available from: https://www.iso.org/standar/69933.html (2019).
- Organisation for Economic Co-operation and Development. Test Guideline No. 249: Fish Cell Line Acute Toxicity-The RTgill-W1 Cell Line Assay. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 2. Effects on Biotic Systems. , OECD Publishing. Paris. (2021).
- Lungu-Mitea, S., Lundqvist, J. Potentials and pitfalls of transient in vitro reporter bioassays: interference by vector geometry and cytotoxicity in recombinant zebrafish cell lines. Archives of Toxicology. 94 (8), 2769-2784 (2020).
- Lungu-Mitea, S., Han, Y., Lundqvist, J. Development, scrutiny, and modulation of transient reporter gene assays of the xenobiotic metabolism pathway in zebrafish hepatocytes. Cell Biology and Toxicology. , 1-23 (2021).
- Schirmer, K., Chan, A. G., Greenberg, B. M., Dixon, D. G., Bols, N. C. Methodology for demonstrating and measuring the photocytotoxicity of fluoranthene to fish cells in culture. Toxicology In Vitro. 11 (1-2), 107-119 (1997).
- Lungu-Mitea, S., et al. Modeling bioavailable concentrations in zebrafish cell lines and embryos increases the correlation of toxicity potencies across test systems. Environmental Science & Technology. 55 (1), 447-457 (2021).
- Cavalcante, D. G. S. M., et al. Cytotoxic, biochemical and genotoxic effects of biodiesel produced by different routes on ZFL cell line. Toxicology In Vitro. 28 (6), 1117-1125 (2014).
- Meng, Q., Yeung, K., Chan, K. M. Toxic effects of octocrylene on zebrafish larvae and liver cell line (ZFL). Aquatic Toxicology. 236, 105843 (2021).
- Kwok, M. L., Chan, K. M. Oxidative stress and apoptotic effects of copper and cadmium in the zebrafish liver cell line ZFL. Toxicology Reports. 7, 822-835 (2020).
- Yang, J., Chan, K. M. Evaluation of the toxic effects of brominated compounds (BDE-47, 99, 209, TBBPA) and bisphenol A (BPA) using a zebrafish liver cell line, ZFL. Aquatic Toxicology. 159, 138-147 (2015).
- Bradford, C. S., Sun, L., Collodi, P., Barnes, D. W. Cell cultures from zebrafish embryos and adult tissues. Journal of Tissue Culture Methods. 16 (2), 99-107 (1994).
- He, S., et al. Genetic and transcriptome characterization of model zebrafish cell lines. Zebrafish. 3 (4), 441-453 (2006).
- Mansoury, M., Hamed, M., Karmustaji, R., Al Hannan, F., Safrany, S. T. The edge effect: A global problem. The trouble with culturing cells in 96-well plates. Biochemistry and Biophysics Reports. 26, 100987 (2021).
- Funk, D., Schrenk, H. -H., Frei, E. Serum albumin leads to false-positive results in the XTT and the MTT assay. BioTechniques. 43 (2), 178 (2007).
- Dayeh, V. R., Bols, N. C., Tanneberger, K., Schirmer, K., Lee, L. E. J. The use of fish-derived cell lines for investigation of environmental contaminants: An update following OECD's fish toxicity testing framework no. 171. Current Protocols in Toxicology. 1, (2013).
- Stepanenko, A. A., Dmitrenko, V. V. Pitfalls of the MTT assay: Direct and off-target effects of inhibitors can result in over/underestimation of cell viability. Gene. 574 (2), 193-203 (2015).
- Ulukaya, E., Colakogullari, M., Wood, E. J. Interference by anti-cancer chemotherapeutic agents in the MTT-tumor chemosensitivity assay. Chemotherapy. 50 (1), 43-50 (2004).
- Sebaugh, J. L. Guidelines for accurate EC50/IC50 estimation. Pharmaceutical Statistics. 10 (2), 128-134 (2011).
- Weimer, M., et al. The impact of data transformations on concentration-response modeling. Toxicology Letters. 213 (2), 292-298 (2012).
- Green, J. W., Holbech, T. A., Henrik, Chapter 4: Analysis of Continuous Data (Regression). Statistical Analysis of Ecotoxicity Studies. , John Wiley & Sons, Inc. (2018).
- Proença, S., et al. Effective exposure of chemicals in in vitro cell systems: A review of chemical distribution models. Toxicology In Vitro. 73, 105133 (2021).
- Guidony, N. S., et al. ABC proteins activity and cytotoxicity in zebrafish hepatocytes exposed to triclosan. Environmental Pollution. 271, 116368 (2021).
- da Silva, N. D. G., et al. Interference of goethite in the effects of glyphosate and Roundup® on ZFL cell line. Toxicology In Vitro. 65, 104755 (2020).
- Yang, Y., et al. Temperature is a key factor influencing the invasion and proliferation of Toxoplasma gondii in fish cells. Experimental Parasitology. 217, 107966 (2020).
- Lopes, F. M., Sandrini, J. Z., Souza, M. M. Toxicity induced by glyphosate and glyphosate-based herbicides in the zebrafish hepatocyte cell line (ZF-L). Ecotoxicology and Environmental Safety. 162, 201-207 (2018).
- Lachner, D., Oliveira, L. F., Martinez, C. B. R. Effects of the water soluble fraction of gasoline on ZFL cell line: Cytotoxicity, genotoxicity and oxidative stress. Toxicology In Vitro. 30, 225-230 (2015).
- Morozesk, M., et al. Effects of multiwalled carbon nanotubes co-exposure with cadmium on zebrafish cell line: Metal uptake and accumulation, oxidative stress, genotoxicity and cell cycle. Ecotoxicology and Environmental Safety. 202, 110892 (2020).
- Dognani, G., et al. Nanofibrous membranes for low-concentration Cr VI adsorption: kinetic, thermodynamic and the influence on ZFL cells viability. Materials Research. , 24 (2021).
- ZEM2S (ATCC®CRL-2147™). American Type Culture Collection. , Available from: https://www.atcc.org/products/crl-2147 (2023).
- Chen, Y., et al. Acute toxicity of the cationic surfactant C12-benzalkonium in different bioassays: how test design affects bioavailability and effect concentrations. Environmental Toxicology and Chemistry. 33 (3), 606-615 (2014).
- Pomponio, G., et al. In vitro kinetics of amiodarone and its major metabolite in two human liver cell models after acute and repeated treatments. Toxicology In Vitro. 30, 36-51 (2015).
- Mori, M., Wakabayashi, M. Cytotoxicity evaluation of chemicals using cultured fish cells. Water Science and Technology. 42 (7-8), 277-282 (2000).
- Caminada, D., Escher, C., Fent, K. Cytotoxicity of pharmaceuticals found in aquatic systems: comparison of PLHC-1 and RTG-2 fish cell lines. Aquatic Toxicology. 79 (2), 114-123 (2006).
- Giltrap, M., et al. In vitro screening of organotin compounds and sediment extracts for cytotoxicity to fish cells. Environmental Toxicology and Chemistry. 30 (1), 154-161 (2011).
- Hollert, H., Duerr, M., Erdinger, L., Braunbeck, T. Cytotoxicity of settling particulate matter and sediments of the Neckar River (Germany) during a winter flood. Environmental Toxicology and Chemistry. 19 (3), 528-534 (2000).
- Pannetier, P., et al. Toxicity assessment of pollutants sorbed on environmental sample microplastics collected on beaches: Part I-adverse effects on fish cell line. Environmental Pollution. 248, 1088-1097 (2019).
- Ternjej, I., Srček, V. G., Mihaljević, Z., Kopjar, N. Cytotoxic and genotoxic effects of water and sediment samples from gypsum mining area in channel catfish ovary (CCO) cells. Ecotoxicology and Environmental Safety. 98, 119-127 (2013).
- Hamid, R., Rotshteyn, Y., Rabadi, L., Parikh, R., Bullock, P. Comparison of alamar blue and MTT assays for high throughput screening. Toxicology In Vitro. 18 (5), 703-710 (2004).
- Vistica, D. T., et al. Tetrazolium-based assays for cellular viability: a critical examination of selected parameters affecting formazan production. Cancer Research. 51 (10), 2515-2520 (1991).
- Knauer, K., Lampert, C., Gonzalez-Valero, J. Comparison of in vitro and in vivo acute fish toxicity in relation to toxicant mode of action. Chemosphere. 68 (8), 1435-1441 (2007).
- Stadnicka-Michalak, J., Tanneberger, K., Schirmer, K., Ashauer, R. Measured and modeled toxicokinetics in cultured fish cells and application to in vitro-in vivo toxicity extrapolation. PLoS One. 9 (3), 92303 (2014).
