Summary
Este protocolo describe un método para establecer un modelo de ratón de silicosis a través de la exposición repetida a suspensiones de sílice a través de un goteo nasal. Este modelo puede imitar de manera eficiente, conveniente y flexible el proceso patológico de la silicosis humana con alta repetibilidad y economía.
Abstract
La silicosis puede ser causada por la exposición al polvo de sílice cristalina respiratoria (CSD) en un entorno industrial. La fisiopatología, el cribado y el tratamiento de la silicosis en humanos se han estudiado ampliamente utilizando el modelo de silicosis de ratón. Al hacer que los ratones inhalen repetidamente CSD en sus pulmones, los ratones pueden imitar los síntomas clínicos de la silicosis humana. Esta metodología es práctica y eficiente en términos de tiempo y rendimiento y no causa lesiones mecánicas en el tracto respiratorio superior debido a la cirugía. Además, este modelo puede imitar con éxito el proceso de transformación aguda/crónica de la silicosis. Los principales procedimientos fueron los siguientes. El polvo esterilizado de 1-5 μm de CSD se molió por completo, se suspendió en solución salina y se dispersó en un baño de agua ultrasónico durante 30 minutos. Los ratones bajo anestesia inducida por isoflurano cambiaron de una respiración rápida y superficial a una aspiración profunda y lenta durante aproximadamente 2 s. El ratón se colocó en la palma de una mano y la punta del pulgar tocó suavemente el borde del labio de la mandíbula del ratón para enderezar las vías respiratorias. Después de cada exhalación, los ratones inhalaron la suspensión de sílice gota a gota a través de una fosa nasal, completando el proceso en 4-8 segundos. Después de que la respiración de los ratones se estabilizó, se les acarició el pecho y se les acarició para evitar que el CSD inhalado fuera expulsado al toser. A continuación, los ratones fueron devueltos a la jaula. En conclusión, este modelo puede cuantificar la CSD a lo largo del paso fisiológico típico de partículas diminutas hacia el pulmón, desde el tracto respiratorio superior hasta los bronquiolos terminales y los alvéolos. También puede replicar la exposición recurrente de los empleados debido al trabajo. El modelo puede ser realizado por una sola persona y no necesita equipos costosos. Simula de manera conveniente y efectiva las características de la enfermedad de la silicosis humana con alta repetibilidad.
Introduction
Los trabajadores están inevitablemente expuestos al polvo irregular de sílice cristalina (CSD), que puede inhalarse y es más tóxico en numerosos contextos ocupacionales, como la minería, la cerámica, el vidrio, el procesamiento de cuarzo y el hormigón 1,2. Una afección crónica por inhalación de polvo conocida como silicosis causafibrosis pulmonar progresiva. De acuerdo con los datos epidemiológicos, la incidencia de la silicosis ha ido disminuyendo a nivel mundial en las últimas décadas, pero en los últimos años ha ido en aumento y afectando a personas más jóvenes 4,5,6. El mecanismo subyacente de la silicosis presenta un desafío significativo para la investigación científica debido a su inicio insidioso y su prolongado período de incubación. Todavía se desconoce cómo se desarrolla la silicosis. Además, ningún medicamento actual puede detener la progresión de la silicosis y revertir la fibrosis pulmonar.
Los modelos actuales de ratón para la silicosis implican la ingestión traqueal de una suspensión mixta de CSD. Por ejemplo, la administración de CSD en los pulmones mediante la adopción del traumatismo de la tráquea cervical después de la anestesia no cumple con la exposición humana repetida al polvo de tinte7. El impacto de la exposición al polvo ambiental en las personas puede estudiarse exponiéndolas a la CSD en forma de aerosoles, lo que refleja con mayor precisión las concentraciones ambientales de esta sustancia tóxica8. Sin embargo, la CSD ambiental no puede inhalarse simplemente directamente en los pulmones debido a la estructura fisiológica única de la nariz del ratón9. Además, los equipos asociados a esta tecnología son caros, lo que ha llevado a los investigadores a reevaluar el modelo10 de silicosis de ratón. Al inhalar la suspensión de CSD a través de un goteo nasal cinco veces en 2 semanas, fue posible construir un modelo dinámico de silicosis. Este modelo es consistente y seguro a la vez que fácil de usar. Es importante tener en cuenta que este estudio permite la inhalación repetida de CSD en ratones. Se espera que el modelo de silicosis de ratón creado a través de este procedimiento sea más beneficioso para los requisitos de investigación.
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Protocol
Todos los procedimientos siguieron las directrices de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud (Publicación de los NIH Nº 8023, revisada en 1978) y fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Facultad de Medicina de la Universidad de Ciencia y Tecnología de Anhui.
1. Manejo y alimentación de ratones
- Asigne 20 ratones machos C57BL/6 sanos a los grupos experimentales o de vehículos en una proporción de 1:1. Aclimatar a los ratones al nuevo entorno durante 1 semana.
- Proporcionar un tiempo de luz constante de 12 h al día. Utilice un interruptor de control de tiempo para una sincronización precisa.
2. Preparación de la suspensión del DCV
- Al menos 1 día antes del goteo nasal, moler la sílice en un mortero de ágata durante 0,5 h.
- Observa el tamaño y la forma de las partículas de cristal. Tome fotografías representativas con microscopía electrónica de barrido (SEM).
- Use cinta conductora para unir las partículas y preparar la muestra para SEM. Use un secador de pelo para soplar suavemente las partículas de silicona que no están firmemente adheridas.
- Evacúe la cámara de muestras, encienda la alta presión y capture la imagen.
NOTA: La distancia de trabajo (WD) entre la lente y la muestra es de 5,9 mm, el voltaje de aceleración es de 2,0 kV y el aumento (Mag) es de 100.000x, utilizando el detector SignalA. Las partículas se dispersan con cristalización irregular y aproximadamente el 80% tienen un diámetro de 1-5 μm (Figura 1A).
- Prepare una suspensión estéril de 20 mg/ml de CSD. Diluir el CSD con solución salina estéril y mezclarlo con un agitador ultrasónico (40 kHz, 80 W) a temperatura ambiente (RT) durante 30 min.
- Revuelva y mezcle bien la suspensión de CSD en un mezclador de vórtice durante 10 s antes de administrar los goteos nasales.
3. Administración de goteos nasales al ratón
- Anestesiar rápidamente a un ratón con isoflurano al 2% a una dosis de 3,6 mL/h en una máquina de anestesia (Figura 1B, panel izquierdo).
NOTA: La anestesia debe realizarse en una campana extractora para evitar la inhalación del anestésico por parte del técnico. Asegúrese de que la profundidad adecuada de la anestesia observe el cambio de una respiración rápida e irregular a un estado lento y estable en los ratones. - Gotee 50 μL de la CSD por vía nasal en 4-8 s (Figura 1B, derecha).
- Para el goteo nasal, coloque la cabeza del ratón en la articulación metacarpofalángica del investigador con la punta del dedo índice.
- Mantenga el ratón en posición prona, con cuatro dedos ligeramente flexionados y la punta del pulgar tocando ligeramente el labio inferior del ratón para enderezar las vías respiratorias. Evite tocar la faringe para provocar el reflejo nauseoso.
- Aspirar 50 μl de líquido con una pipeta de 200 μl. Deje caer el líquido en la cavidad nasal del ratón en tres o cuatro dosis divididas dependiendo de la frecuencia respiratoria del ratón. Cada instilación debe constar de 15 a 20 μl de líquido. Administre los goteos una vez cada 3 días, 5 veces en 12 días. Trate el ratón de control con una cantidad igual de solución salina.
- Masajee suavemente el área del corazón del mouse 5x-10x durante 5 s.
- Sostenga el cuerpo del ratón con la palma de la mano, pellizque la piel de la parte posterior del cuello con el pulgar y el índice y fije las extremidades traseras del ratón con los otros dedos. Luego, presione suavemente el área de latidos del corazón del mouse con el dedo índice de la otra mano de 5 a 10 veces en un período de 5 segundos.
- Cuando la respiración del ratón se haya estabilizado, colóquelo en una jaula de recuperación con una almohadilla térmica y observe hasta que se recupere de la anestesia, luego devuelva el ratón a su jaula de origen. Sacrificar el ratón a los 31 días.
4. Recolección de los tejidos pulmonares y preparación de una sección de parafina
- Inyectar 0,18 mL de hidrato de cloral al 10% por vía intraperitoneal, asegurándose de que los ratones no respondan a la estimulación de los dedos de los pies o de la cola (realizada con las pinzas dentadas). A continuación, continúe con el siguiente paso.
- Fija las extremidades del ratón en una tabla de prueba de espuma y rocía con alcohol al 75% para humedecer el pelaje. Extirpar la mayor parte de las costillas torácicas en la línea media de la clavícula y abrir la cavidad torácica de los ratones para exponer el corazón y los pulmones.
- Abra inmediatamente la aurícula derecha con unas tijeras quirúrgicas oftálmicas e inyecte lentamente 20 ml de tampón fosfato (PBS) desde la punta del corazón en el latido auricular izquierdo con la mayor amplitud para permitir que fluya toda la sangre. A continuación, retire el lóbulo inferior del pulmón derecho y guárdelo a -80 °C para el análisis de Western blot.
- Siga perfundiendo 10 ml de paraformaldehído (PFA) al 4% en el mismo sitio después de la inyección de PBS. Recoger el pulmón restante y conservar la muestra en 30 ml de PFA al 4% para su análisis anatomopatológico.
- Después de 72 h de fijación, incrustar las muestras en parafina.
- Deshidratar los tejidos a través de una serie graduada de diluciones de etanol (EtOH) en agua desionizada (60%, 70%, 80%, 90%, 100%) durante 1 h cada una a RT. Limpiar la muestra en dos lavados de xileno durante 1 h cada uno.
- Infiltrar las muestras con la cera de parafina derretida calentando a 50 °C durante 2 h. Repita este proceso en otro cilindro. Enfríe los moldes de cera con pañuelos de papel durante 1 h para que se endurezcan.
- Después de que la cera se haya endurecido y el tejido se haya incrustado, use una máquina seccionadora de parafina para cortar el tejido a 5 μm. Los pasos precisos de corte y montaje de la corredera se describieron anteriormente11.
NOTA: Se indica una perfusión tisular suficiente mediante el desarrollo de espasmos musculares y torsión de la cola en forma de "S" o flexión después de recibir 10 ml de PFA al 4%.
5. Realización de tinción con hematoxilina y eosina (HE)
- Calentar los tejidos embebidos en parafina en una placa calefactora (60 °C) durante más de 4 h para permitir la adhesión a los portaobjetos y mejorar la desparafina.
- Desparafinar e hidratar las secciones de parafina. Remoje los portaobjetos con muestras en xileno 2 veces durante 30 minutos cada vez. A continuación, sumérjalos en etanol anhidro, luego alcohol al 95%, 85%, 75% y agua desionizada durante 5 minutos, respectivamente.
- Realizar tinción de hematoxilina y eosina. Tiñe los tejidos en un cubo de tinción de hematoxilina durante 10 min. Enjuágalos con agua corriente suave durante 5 min. A continuación, sumerja los portaobjetos en el cubo de tinción de eosina durante 10 s.
- Deshidratar las muestras en etanol anhidro al 75%, 85%, 95% y durante 5 min cada una. Limpie las secciones de tejido sumergiéndolas en xileno durante 5 min. Selle la sección con aproximadamente 60 μL de gotas de resina neutra. Coloque la corredera de la cubierta sobre la sección y bájela con cuidado para evitar burbujas de aire.
6. Realización de la tinción de Masson
- Desparafinar e hidratar las muestras de parafina, como se menciona en el paso 5.2. A continuación, tiñe los núcleos celulares con hematoxilina de Weigert al 50% durante 10 min. Remoje el tejido en licuefacción de etanol ácido durante 10 s y enjuague suavemente los portaobjetos de tejido con agua corriente para azular los núcleos.
NOTA: Prepare la solución de tinción de hematoxilina de Weigert inmediatamente antes de usarla. - Tiñir las muestras con gotas de solución de tinción de rojo de liquun (40 μL por cada portaobjetos de tejido) durante 7 min y lavarlas con una solución de trabajo de ácido débil (ácido clorhídrico al 30%) durante 1 min para eliminar el tinte rojo de lichun suelto.
- Sumérjalos en alcohol al 95% durante 20 s y deshidrételos 2 veces con etanol anhidro durante 1-3 s cada uno. Después de eso, limpie los tejidos con xileno y séllelos con 60 μL de gotas de resina neutra, como se mencionó en el paso 5.4.
7. Realización de la tinción de rojo Sirius
- Desparafinar e hidratar las secciones de parafina como se menciona en el paso 5.2.
- Infiltrar las secciones durante 1 h con la solución de tinción Sirius red.
- Tiñir los núcleos celulares de las muestras durante 8-10 min con solución de tinción de hematoxilina Mayer. Enjuágalos suavemente con agua corriente durante 10 min. Luego, deshidrata y limpia los portaobjetos de tejido. Séllalos como se menciona en el paso 5.4.
8. Realización de inmunohistoquímica
- Desparafinar e hidratar las muestras de parafina como se describe en el paso 5.2.
- Infiltrar las muestras con una solución de recuperación de antígeno EDTA de 3 mg/ml de aproximadamente 30 ml. Hervir durante 20-30 min. Lavar los tejidos con agua desionizada y luego incubarlos en una solución tamponada con fosfato que contenga 0,5% de Tween-20 (PBST) durante 5 min.
- Remojar las muestras durante 15 minutos con una solución de peróxido de hidrógeno al 0,3% para inactivar la peroxidasa endógena en las muestras. Lávelos 3 veces con PBST durante 5 minutos cada vez.
NOTA: La solución de peróxido de hidrógeno al 0,3% debe hacerse fresca en un ambiente a prueba de luz. - Permeabilizar la membrana de las muestras durante 15 min con solución de Triton-100 al 0,3%. A continuación, bloquear con 30-40 μL de albúmina sérica bovina (BSA) al 5% durante 1 h.
- Retire la solución de bloqueo. Añadir anticuerpos primarios diluidos NF-κB (dilución 1:200) y CD68 (dilución 1:1.000) e incubar las muestras durante la noche a 2-8 °C en una caja húmeda IHC de portaobjetos de microscopio para evitar la evaporación y la luz.
- Al día siguiente, transfiéralos a RT durante 1 h. Luego, lávelos con PBST 3x durante 5 minutos cada uno.
- Incubar las muestras durante 1 h en anticuerpos secundarios marcados con peroxidasa antirratón de conejo (relación de dilución 1:500) a RT y lavarlas con PBST 3x durante 5 min cada una.
NOTA: Tanto los anticuerpos primarios como los secundarios se diluyeron con BSA al 5%. - Incubar las muestras con el sustrato 3,3'-diaminobenzidina (DAB) correspondiente al anticuerpo marcado con la enzima durante 5-20 min. Detenga la reacción con agua desionizada cuando se alcance la intensidad óptima de tinción.
NOTA: La solución DAB debe prepararse fresca y protegerse de la luz. La reacción de desarrollo del color debe observarse en tiempo real bajo el microscopio para determinar cuándo detener la tinción. Los especímenes positivos exhiben una tinción intensa, mientras que los especímenes negativos no desarrollan color. - Contratinción de las muestras durante 30 s con hematoxilina Weigert. A continuación, enjuague los pañuelos con agua corriente durante 1 minuto. Luego, deshidrate, limpie y selle los portaobjetos de tejido, como se mencionó en el paso 5.4.
9. Realización del análisis de Western blot
- Lisar los tejidos pulmonares para extraer proteínas. Añadir 200 μL de solución de trabajo RIPA a 20 mg de tejido pulmonar.
- Homogeneizar el tejido en hielo durante 5 min con un molinillo eléctrico de mano e incubar durante 1 h en hielo agitando suavemente. A continuación, centrifugar el homogeneizado a 4 °C durante 15 min a 14.800 x g.
- Recoja el sobrenadante y determine la concentración de proteínas con el kit de ensayo de proteínas BCA. Prepare la solución de almacenamiento de proteínas con RIPA a 6 μg/μL de proteína. Añadir 20 μL de tampón de carga 5x a los 80 μL del lisado de proteína. Alterar la estructura de la proteína secundaria calentando los tubos de microcentrífuga que contienen proteínas en un baño de metal (100 °C) durante 20 min.
- Después del enfriamiento, alícuota 100 μL de la solución de almacenamiento de proteínas en cada tubo y almacenar las muestras en un refrigerador a -80 °C. Diluir la concentración de proteína a 2-3 μg/μL con tampón de carga 1x antes de la electroforesis.
NOTA: El proceso de extracción de proteínas debe realizarse en hielo. Para la solución de trabajo RIPA, añadir 1 μL de 100 mM de fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) a 99 μL de RIPA para inhibir la degradación de proteínas fosforiladas. Prepare 1x tampón de carga diluyendo 5x tampón de carga con RIPA en una proporción de 1:4. - Agregue 20 μg de muestras a cada pocillo y ejecute el gel. Para geles concentrados al 5%, use 80 V durante 20 minutos para electroforezar las proteínas desde el mismo punto de partida. Para geles aislados al 10%, correr a 100 V durante 1 h para permitir que las proteínas de diferentes pesos moleculares se separen tanto como sea posible.
- Activar previamente la membrana de PVDF con metanol durante 20 s. Transfiera las proteínas a la membrana de PVDF utilizando el método de transferencia húmeda con una corriente de 400 mA durante 1-2 h.
NOTA: Asegúrese de que el tanque de electroforesis y el tanque de electrotransferencia estén horizontales. Enfríe todo el tanque con hielo, ya que el proceso de transferencia por membrana genera mucho calor. - Lave la membrana con una solución TBST durante 5 minutos cada vez, 5 veces. A continuación, bloquee con un 5% de BSA o un 5% de leche desnatada durante 1 h. Diluir los anticuerpos primarios NF-κB (1:1.000) y β-actina (1:1.000) con BSA al 5%. Sumerja las tiras en la solución de anticuerpos y agite las tiras suavemente durante la noche a 2-8 °C.
- Lave las tiras con PBST. A continuación, diluir el anticuerpo secundario anti-conejo conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) (1:10.000) e incubarlos en el anticuerpo secundario diluido durante 1 h a RT con una suave agitación.
- Prepare un revelador de quimioluminiscencia mejorada (ECL), colóquelo en la tira e incube durante 3 minutos.
- Exponga la tira a un generador de imágenes en gel durante 20 s. Mida el valor de gris de la tira para evaluar el nivel de proteína mediante el software del sistema. Utilice la β-actina como control interno.
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Representative Results
La patogénesis potencial de la silicosis en ratones se investigó utilizando el método propuesto. Encontramos que el peso corporal de los ratones en el grupo experimental disminuyó significativamente en relación con el grupo de control y que el peso corporal se recuperó lentamente después del cese de la exposición. Debido a la dosis optimizada utilizada aquí, no se observó mortalidad en ratones expuestos a sílice en este experimento. La hoja de ruta técnica del goteo nasal repetido a la DCV se muestra en la (Figura 1). Los procedimientos previamente descritos incluyeron la preparación de la suspensión de CSD, la anestesia inducida por isoflurano, el goteo nasal y el masaje torácico12. Demostramos depósito de colágeno y diferenciación de miofibroblastos después de 4 semanas de alimentación estática12. Hemos utilizado este método de exposición al polvo para estudiar el mecanismo subyacente de la fibrosis pulmonar causada por el polvo de carbón. Los nuevos subconjuntos de macrófagos y el efecto de intervención de la vitamina D se encontraron a través de la tecnología del transcriptoma unicelular13. En este estudio, la progresión de la fibrosis pulmonar en ratones se aceleró significativamente por la exposición a la CSD, que causó daño a las fibras elásticas periféricas bronquiales (Figura 2 y Figura 3). Los nódulos de silicosis están compuestos por macrófagos que contienen CSD. La fibrosis nodular está enriquecida con muchas CSD, y los macrófagos CD68 positivos engullen activamente estas partículas. Estos CSD depositados promueven la formación de focos fibrosos. Como se mencionó anteriormente, después de estar expuestos a CSD durante 4 semanas, los ratones adquirieron lesiones obvias, como la deposición de colágeno en nódulos pulmonares de silicio y daño a la estructura del tejido pulmonar. También hubo una lesión moderada del tejido que rodea losbronquios 12. El proceso biológico del estrés del RE causado por la CSD está relacionado con el NF-κB, que está implicado en la respuesta inflamatoria (véase la figura 4). En general, estos hallazgos muestran que el enfoque propuesto puede simular eficazmente el desarrollo de la silicosis en ratones.
Figura 1: Se utilizaron partículas de polvo de sílice cristalina (CSD) de menos de cinco micras para el goteo nasal. (A) La microscopía electrónica de barrido (SEM) de CSD mostró que las partículas tenían una forma irregular. (B) Se utilizó la suspensión de CSD para preparar el modelo de silicosis de ratón por goteo nasal. La máquina de la izquierda se utiliza para la anestesia con isoflurano, y el panel de la derecha describe los puntos clave que conducen al funcionamiento del goteo nasal. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: La tinción con rojo de Sirius mostró fibrosis en los pulmones de los ratones mediante CSD por goteo nasal durante 1 mes. (A) Se realizó la tinción de rojo de Sirius para medir la deposición de colágeno en el tejido pulmonar después de un tratamiento con CSD o solución salina (superior izquierdo e inferior izquierdo en los cristales). La microscopía polarizante reveló tres tipos diferentes de fibras de colágeno (rojo, amarillo y verde), de las cuales las fibras de colágeno tipo 1 que se muestran en rojo son un factor de riesgo para la silicosis. Sin embargo, no se encontró fibrosis significativa en el grupo de vehículos (paneles superior e inferior). (B) La puntuación de fibrosis (FS) es un índice de evaluación semicuantitativo basado en la tinción de rojo de Sirius12 que difiere significativamente del control (***P < 0,0001). Barra de escala = 200 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Tinción inmunohistoquímica de CD68 en pulmón de ratón tratado con CSD para monitorizar el papel de los macrófagos en la formación de un nódulo silicótico. Un nódulo de sílice típico se caracteriza por necrosis licuada después de la fagocitosis de la CSD en el centro, rodeado de macrófagos en la periferia (tinción HE). Además, la DSC se enriqueció en los nódulos, acompañada de fibrosis (tinción de Masson). La tinción inmunohistoquímica de CD68 reveló que los macrófagos estaban ampliamente presentes en el tejido pulmonar. Además, estos macrófagos habían ingerido CSD (visto bajo la microscopía de luz polarizada, panel derecho), lo que causó una lesión pulmonar grave. Barra de escala = 50 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Expresión de NF-κB en el pulmón de ratón tratado con CSD . (A) Se realizó tinción inmunohistoquímica en el tejido pulmonar. El pulmón de los ratones tratados con CSD en el panel derecho mostró una alta tinción de NF-κB en comparación con el grupo Vehicle de la izquierda. Barra de escala = 50 μm. (B) El Western blot representativo mostró que los ratones tratados con CSD tienen una mayor expresión de NF-κB en el pulmón. La lisis del tejido pulmonar fresco se sometió a Western blot. (C) La diferencia de NF-κB entre los grupos Sil y Veh fue significativa (** P < 0,01). La intensidad de la banda se midió usando la Imagen J. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Los modelos de ratón de silicosis son cruciales para estudiar la patogénesis y el tratamiento de la silicosis. Este protocolo describe un método para preparar un modelo de silicosis en ratones a través de la exposición nasal repetida. Este método permite el estudio de las características patológicas de la silicosis inducida por diferentes tiempos de exposición. Los ratones fueron anestesiados con un respirador y se monitorizó su frecuencia respiratoria. La frecuencia respiratoria inicial corta y rápida disminuyó gradualmente y se profundizó con el tiempo. La anestesia hizo que los músculos de los ratones se relajaran, lo que llevó a una respiración profunda y les permitió inhalar CSD durante una ventana de tiempo de respiración lenta y profunda. Durante este proceso, el operador sujeta la mandíbula del ratón con el pulgar y endereza su cuello para evitar que el líquido entre en el tracto digestivo, un método de exposición al polvo respirable que no causa dolor y no es invasivo. Este método puede satisfacer las necesidades individuales de implementación repetida para estudiar la exposición al polvo. Kato et al. en 2017 utilizaron una sola dosis grande (125 mg/mL, 40 μL) a través de un goteo orofaríngeo para modelar la fibrosis pulmonar, y nos referimos a esta concentración para tratar de explorar los cambios pulmonares inducidos por múltiples dosis pequeñas a través de la cavidad nasal14.
Hay varios desafíos asociados con los goteos nasales posteriores a la anestesia desde un punto de vista técnico. Durante este proceso, el operador sujeta la mandíbula del ratón con el pulgar para enderezar su cuello y evitar que el líquido entre en el tracto digestivo. Si los ratones no logran la anestesia profunda o el operador no es hábil y pierde la ventana de tiempo para respirar lentamente y profundamente, el efecto del goteo nasal y las características patológicas del modelo no serán las esperadas. Por lo tanto, para evitar la muerte por anestesia excesiva y el fracaso del modelado por anestesia insuficiente, aquellos que trabajan con ratones anestesiados con isoflurano deben estar adecuadamente entrenados y dominar las características críticas de los ratones anestesiados con isoflurano antes de realizar el goteo nasal. Además, presionar el pecho de los ratones después del goteo nasal, comúnmente llamado masaje, promueve el viaje de la CSD para llegar a los bronquios terminales e incluso a las paredes alveolares de los pulmones. Los ratones anestesiados a un nivel profundo eran propensos a la asfixia cuando recibían una dosis alta de goteos nasales. Sin embargo, si su pecho se comprimía rápidamente, la tasa de supervivencia aumentaba. Por último, pero no menos importante, la creación de modelos de silicosis requiere ratones con una base física sólida, y algunos estudios han ilustrado que los ratones mayores de 10-12 semanas de edad tienen poca tolerancia y una mayor tasa de mortalidad después de la exposición repetida a la CSD. A pesar de sus ventajas, este modelo tiene varias desventajas. Una desventaja es que el ratón no inhala directamente las partículas de polvo a través del flujo de aire. Para abordar este problema, hemos limitado la cantidad de suspensión de CSD inhalada en una sola respiración y la frecuencia de la administración repetida de CSD. Además, hemos creado grupos de vehículos. Los datos revelan que la inhalación de una pequeña cantidad de líquido solo interrumpe temporalmente la ventilación, lo que no dañará los pulmones de los ratones. Los ratones de control del vehículo absorberán rápidamente el líquido salino inhalado sin afectar la función pulmonar, el peso corporal o la actividad basal de los ratones. Por el contrario, la exposición repetida a la CSD a través de la inhalación nasal puede crear el modelo dinámico deseado de silicosis en ratones12. Debido a que las diferentes frecuencias de exposición afectan el proceso de fibrosis en modelos con exposiciones repetidas, no tenemos un punto de tiempo claro. Por lo general, para una exposición única al polvo de sílice, el día 7 todavía se encuentra en las primeras etapas de la silicosis. Los días 7-14 corresponden a la etapa de actividad inflamatoria, los días 14-28 corresponden a la etapa de transformación de la fibrosis y el tiempo después del día 28 corresponde a la etapa de formación de la fibrosis12,15. Sin embargo, la patología en estos momentos puede variar en función de la dosis.
El método de goteo nasal tiene varias ventajas sobre los goteos endotraqueales tradicionales o los abordajes de traqueostomía expuestos quirúrgicamente16,17, como la reducción de las infecciones relacionadas con la traqueotomía y los cuidados postoperatorios. Este enfoque también puede satisfacer el requisito de exposición repetida a CSD durante un experimento y no requiere equipos costosos. Además, el método de goteo nasal es una representación más realista de la exposición al polvo, ya que pequeñas partículas ingresan a los pulmones desde el tracto respiratorio superior y viajan a los bronquiolos terminales y alvéolos. Dado que utilizamos múltiples dosis pequeñas de goteos de sílice, la dosis de polvo de sílice puede entrar en el pulmón al máximo y estimular continuamente el organismo. Por lo tanto, este enfoque de modelado se desarrolla para simular la exposición recurrente de los empleados a la CS en su entorno de trabajo y para explorar el proceso patológico de la silicosis.
La creación de modelos de ratón de silicosis a través de la exposición nasal a CSD se puede aplicar a exposiciones repetidas. Por lo tanto, este modelo animal se puede utilizar para estudiar los efectos de la frecuencia de exposición y la dosificación en la progresión de la silicosis y las características patológicas dinámicas y los mecanismos de la silicosis. Además, la exposición combinada con otras sustancias o medicamentos también es muy factible.
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Disclosures
Los autores declaran no tener conflictos de intereses.
Acknowledgments
Este estudio contó con el apoyo del Programa de Innovación de Sinergia Universitaria de la Provincia de Anhui (GXXT-2021-077) y el Fondo de Innovación de Posgrado de la Universidad de Ciencia y Tecnología de Anhui (2021CX2120).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 mL tube | Biosharp | BS-05-M | |
| 10% formalin neutral fixative | Nanchang Yulu Experimental Equipment Co. | NA | |
| Adobe Illustrator | Adobe | NA | |
| Alcohol disinfectant | Xintai Kanyuan Disinfection Products Co. | NA | |
| CD68 | Abcam | ab125212 | |
| Citrate antigen retrieval solution | biosharp life science | BL619A | |
| DAB chromogenic kit | NJJCBio | W026-1-1 | |
| Dimethyl benzene | West Asia Chemical Technology (Shandong) Co | NA | |
| Enhanced BCA protein assay kit | Beyotime Biotechnology | P0009 | |
| Hematoxylin and Eosin (H&E) | Beyotime Biotechnology | C0105S | |
| HRP substrate | Millipore Corporation | P90720 | |
| HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG(H+L) | Proteintech | Sa00001-2 | |
| Iceacetic acid | West Asia Chemical Technology (Shandong) Co | NA | |
| ImageJ | NIH | NA | |
| Isoflurane | RWD Life Science | R510-22 | |
| Masson's Trichrome stain kit | Solarbio | G1340 | |
| Methanol | Macklin | NA | |
| Microtubes | Millipore | AXYMCT150CS | |
| NF-κB p65 | Cell Signaling Technology | 8242S | |
| Oscillatory thermostatic metal bath | Abson | NA | |
| Paraffin embedding machine | Precision (Changzhou) Medical Equipment Co. | PBM-A | |
| Paraffin Slicer | Jinhua Kratai Instruments Co. | NA | |
| Phosphate buffer (PBS) | Biosharp | BL601A | |
| Physiological saline | The First People's Hospital of Huainan City | NA | |
| Pipettes | Eppendorf | NA | |
| PMSF | Beyotime Biotechnological | ST505 | |
| Polarized light microscope | Olympus | BX51 | |
| Precision balance | Acculab | ALC-110.4 | |
| Prism7.0 | GraphPad | Version 7.0 | |
| PVDF membranes | Millipore | 3010040001 | |
| RIPA lysis buffer | Beyotime Biotechnology | P0013B | |
| RODI IOT intelligent multifunctional water purification system | RSJ | RODI-220BN | |
| Scilogex SK-D1807-E 3D Shaker | Scilogex | NA | |
| SDS-PAGE gel preparation kit | Beyotime Biotechnology | P0012A | |
| Silicon dioxid | Sigma | #BCBV6865 | |
| Sirius red staining | Nanjing SenBeiJia Biological Technology Co., Ltd. | 181012 | |
| Small animal anesthesia machine | Anhui Yaokun Biotech Co., Ltd. | ZL-04A | |
| Universal Pipette Tips (0.1–10 µL) | KIRGEN | KG1011 | |
| Universal Pipette Tips (100–1000 µL) | KIRGEN | KG1313 | |
| Universal Pipette Tips (1–200 µL) | KIRGEN | KG1212 | |
| Vortex mixer | VWR | NA | |
| ZEISS GeminiSEM 500 | Zeiss Germany | SEM 500 | |
| β-actin | Bioss | bs-0061R |
References
- Olsson, A., Kromhout, H. Occupational cancer burden: the contribution of exposure to process-generated substances at the workplace. Molecular Oncology. 15 (3), 753-763 (2021).
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- Lancet, C. C., Yu, I. T., Chen, W.
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