Summary
鼻上皮は、すべての呼吸器病原体が遭遇する主要なバリア部位です。ここでは、空気液界面(ALI)培養物として増殖させた初代鼻上皮細胞を用いて、生理学的に関連性の高いシステムにおけるヒトコロナウイルスと宿主の相互作用を特徴付ける方法について概説します。
Abstract
SARS-CoV(2002年)、MERS-CoV(2012年)、SARS-CoV-2(2019年)の3つの高病原性ヒトコロナウイルス(HCoV)が出現し、過去20年間に重大な公衆衛生上の危機を引き起こしました。毎年、風邪の症例のかなりの部分(HCoV-NL63、-229E、-OC43、-HKU1)がさらに4つのHCoVを引き起こしており、生理学的に関連するシステムでこれらのウイルスを研究することの重要性が強調されています。HCoVは気道に侵入し、すべての呼吸器病原体が遭遇する主要な部位である鼻上皮に感染を確立します。私たちは、患者由来の鼻サンプルを気液界面(ALI)で増殖させる一次鼻上皮培養システムを使用して、この重要なセンチネル部位での宿主と病原体の相互作用を研究しています。これらの培養物は、存在する細胞の種類、繊毛機能、粘液産生など、 in vivo 気道の多くの特徴を再現しています。HCoV感染後の経鼻ALI培養におけるウイルス複製、宿主細胞の向性、ウイルス誘発性細胞傷害性、および自然免疫誘導を特徴付ける方法を、致死性と季節性HCoVを比較した最近の研究を例に説明します1。鼻腔内の宿主と病原体の相互作用に関する理解が深まれば、HCoVやその他の呼吸器系ウイルスに対する抗ウイルス治療薬の新たな標的となる可能性があります。
Introduction
これまでに7種類のヒトコロナウイルス(HCoV)が確認されており、さまざまな呼吸器疾患を引き起こします2。一般的または季節性のHCoV(HCoV-NL63、-229E、-OC43、および-HKU1)は、通常、上気道の病理学に関連しており、毎年一般的な風邪症例の推定10%〜30%を引き起こします。これは一般的なHCoVに関連する典型的な臨床表現型ですが、これらのウイルスは、子供、高齢者、免疫不全の個人など、リスクのある集団でより重大な下気道疾患を引き起こす可能性があります3,4。過去20年間に、重症急性呼吸器症候群(SARS)-CoV、中東呼吸器症候群(MERS)-CoV、SARS-CoV-2の3つの病原性HCoVが出現し、重大な公衆衛生上の緊急事態を引き起こしています。致死的なHCoVは、より重篤な気道病変と関連しており、MERS-CoV症例に関連する致死率>34%(2012年の出現以来、2,500例以上で894例)5,6。致死的なHCoVは、現在進行中のCOVID-19パンデミックに見られるように、無症候性感染症から致死性肺炎まで、さまざまな気道疾患も引き起こすことに注意することが重要です7。
HCoVは、他の呼吸器病原体と同様に、気道に入り、鼻上皮に生産的な感染を確立します8。下気道への広がりは、口腔/鼻腔から肺への誤嚥に関連していると考えられており、HCoVはより重大な下気道病状を引き起こします9,10,11。したがって、鼻はウイルス侵入の最初のポータルとして機能し、その強力な粘膜繊毛クリアランス機構と、下気道へのウイルスのさらなる拡散を防ぐことを目的とした独自の自然免疫メカニズムにより、感染に対する主要な障壁となります12,13。例えば、鼻の上皮細胞は、抗ウイルスインターフェロンおよびインターフェロン刺激遺伝子の基底レベルが平均よりも高いことが報告されており、鼻細胞が呼吸器系ウイルスに対する早期応答の準備ができている可能性があることを示しています14,15,16。
私たちはこれまで、患者由来の初代鼻上皮細胞を気液界面(ALI)で増殖させ、HCoV感染が始まる鼻のHCoVと宿主の相互作用をモデル化しました。経鼻ALI培養は、病原性(SARS-CoV-2およびMERS-CoV)と一般的なHCoV(HCoV-NL63およびHCoV-229E)の両方に寛容であり、A549(肺腺癌細胞株)などの従来の気道上皮細胞株に比べてさまざまな利点があります16,17。分化後、鼻腔ALI培養物は不均一な細胞集団を含み、粘膜繊毛クリアランス機構など、in vivo鼻上皮に期待される機能の多くを示す18。鼻細胞は、細胞学的ブラッシングによる鼻上皮細胞の獲得は、HBECを達成するための気管支鏡検査などの技術の使用と比較して侵襲性が大幅に低いため、下気道培養システム(ヒト気管支上皮細胞、HBEC)よりも利点もあります19,20,21。
この論文では、この鼻腔ALI培養システムを利用して、鼻上皮におけるHCoVと宿主の相互作用を特徴付ける方法について説明します。これらの手法を最近発表された研究に適用し、SARS-CoV-2、MERS-CoV、HCoV-NL63、およびHCoV-229E 1,16,17を比較しました。これらの方法と代表的な結果は、この鼻細胞モデルにおけるHCoVの研究を強調していますが、このシステムは他のHCoVや他の呼吸器病原体にも高い適応性を持っています。さらに、これらの方法は、ウイルス複製と細胞向性、ならびに感染後の細胞毒性と自然免疫誘導を調査するために、他のALI培養系により広く適用することができます。
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Protocol
鼻標本の使用は、ペンシルベニア大学治験審査委員会(プロトコル#800614)およびフィラデルフィアVA治験審査委員会(プロトコル#00781)によって承認されました。
1. 鼻腔ALI培養の感染
注:臨床検体の取得、および鼻腔ALI培養の増殖と分化は、この論文の範囲外です。初代鼻上皮細胞を培養するための特定の方法は、これらの培養物を利用した最近発表された研究に見出すことができる18,22,23。以下のプロトコルは、必要に応じて、市販の鼻上皮ALI培養物にさらに適用できます。以下に詳述するプロトコルと容量は、24ウェルプレートトランズウェルインサート(直径6.5 mm、膜表面積0.33 cm2)に適用できます。より大きなトランズウェル(すなわち、12ウェルプレート、直径12 mm、表面積1.12 cm2)で増殖させたALI培養物を使用する場合は、トランジウェルのサイズを反映するように容量を比例的に調整します。
- 感染前日:
- ALI培養物をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で3回洗浄します(~200 μLの加温したPBSを加え、37°Cのインキュベーターに5分間入れ、PBSを吸引し、繰り返します)。
- 基礎培地(500 μL)を交換します。
- 一晩感染する温度で培養物を平衡化させます(つまり、33°Cで感染する場合は、PBS洗浄後に培養物を33°Cのインキュベーターに入れます)。
注:HCoV-229EやHCoV-NL63などの風邪に関連するHCoVは、33°Cでより効率的に複製されることが報告されています。 さらに、 in vivo 鼻上皮の温度は33°Cです(これは肺の温度である37°Cとは異なります)。
- 必要に応じて無血清ダルベッコのModified Eagle Medium(DMEM)でウイルスを希釈し、総接種量50 μLで所望の感染多重度(MOI)を達成します。
注:感染は通常、MOI = 5(高MOI)で行われてきました。しかし、SARS-CoV-2や風邪関連HCoVにはMOI = 0.5(低MOI)の感染が用いられており、これらのウイルス力価のピーク値は同等であるが、動態は変動する(どちらのMOIも許容される)。 - 接種物を先端に添加し、培養物をインキュベーターに1時間戻します。
- 感染中は15分ごとにプレートを静かにロックします(プレートを両手でしっかりと持ち、前後左右に揺らして、ウイルス接種物を均一に吸着させます)。
- 1時間のインキュベーション後、ウイルス接種物を吸引し、ウイルス接種を確実に除去するために、各感染培養物をPBSで3回洗浄します(各洗浄について、200 μLのPBSを加え、5分間インキュベートし、ピペットで吸引または除去します)。
- 必要に応じて、3回目のPBS洗浄を回収し、インプットウイルスの適切な除去を確認します。
- 感染中は、感染したALIの基底培地を72時間ごとに新しい培地と交換します。.
2. 頂端表面液(ASL)の採取と排出ウイルスの滴定
- 感染後の所定の時点で、感染した各トランズウェルの頂端チャンバーに200μLのPBSを添加します。
注:関連する時点は、関心のあるHCoVによって異なり、感染後24時間から192時間の範囲です(さまざまなHCoVのウイルス複製データについては、代表的な結果のセクションを参照してください)。 - PBSを5回上下にピペットで移し、頂端から排出されたウイルスを最大限に回収し、全容量を微量遠心チューブ(ASLサンプル)に収集します。
注:ASLには、ALI培養物から頂端に分泌される粘液やその他の生成物に加えて、排出されたウイルス粒子が含まれます。 - 標準的なウイルスプラークアッセイ(ウイルス粒子の濃度を定量するためにウイルス含有サンプルを段階希釈) により、ASL中の感染性ウイルスを定量します。
注:プラークアッセイに使用される細胞の種類とインキュベーション期間は、使用するウイルスによって異なります:SARS-CoV-2(VeroE6細胞);MERS-CoV(VeroCCL81細胞);HCoV-NL63(LLC-MK2細胞);HCoV-229E(Huh7細胞)。ウイルスプラークアッセイの実施方法の詳細は、この論文の範囲を超えていますが、以前にJournal of Visualized Experiments(JoVE)の出版物24で詳述されています。 - 必要に応じて、感染後のさまざまな時期に基礎培地を採取して、基底に放出されたウイルスがないことを確認します。HCoVは通常、鼻の上皮細胞から頂端に放出されますが、これは希釈されていない基礎培地のプラークアッセイ によって 確認されます。
- ASLサンプルは、採取日にプラークアッセイによる定量が行われない場合は、-80°Cで保管してください。
3. 細胞内ウイルスの定量
- ASLサンプルを採取した後、各トランズウェルを、2%ウシ胎児血清(FBS)を含む500 μLのDMEMをプリロードしたクリーンな24ウェルプレートに移します。
注:2% FBSを含むDMEMは、その後の凍結融解サイクル中にウイルスを安定化させるために使用されます。 - 各トランズウェルをPBSで3回洗浄し、末端から排出されたウイルスを完全に除去します。
- 吸引して最終PBS洗浄液を除去した後、2% FBSを含むDMEM100 μLを頂端コンパートメントに加えます。
- 頂端培地と基底培地の両方を含むトランズウェルを含むプレートを-80°Cの冷凍庫に移し、3回連続して凍結融解サイクルを完了して細胞を溶解します。
- 最後の凍結融解サイクルの後、頂端培地(100 μL)と基底培地(500 μL)を清潔なチューブにプールします。
- 500 × g 、4°Cで10分間遠心分離し、細胞破片をペレット化します。
- 上澄み液を採取します。これは、標準的なプラークアッセイ による滴定用の細胞内ウイルスサンプルです。
注:3倍希釈は、ASL収集と比較して収集プロセス中に発生します。ASLサンプルは200 μLのPBSで収集され、細胞内ウイルスサンプルは総容量600 μLに収集されます。
4. 経上皮電気抵抗(TEER)測定
注:TEER測定には、カルシウムとマグネシウムを添加したPBS(PBS + Ca 2+/Mg2+)を使用する必要があります。オームで読み取るように設定された上皮ボルト/オーム計が使用されます(材料表を参照)。
- 製造元の指示に従って、EVOM機器を洗浄し、平衡化し、ブランクにします。ブランキングのために鼻細胞を追加していない「空の」トランズウェルを使用してください。ブランクTEER測定を記録します。
注意:複数のウイルスを使用する場合は、クロスコンタミネーションを避けるために、EVOM装置を条件間で厳密に洗浄する必要があります(70%エタノールで洗浄した後、脱イオン水で十分です)。 - 感染した各トランズウェルを、500 μLのPBS + Ca 2+/Mg 2+を含む標識済みの清潔な24 ウェルプレートに移し、トランズウェルから残留基礎培地を洗浄します。
- 200 μLのPBS + Ca2+/Mg2+ を各トランズウェルの頂端区画に加えます。
- PBS + Ca2+/Mg2+ 1 mLをEndohm-6測定チャンバーに加えます。
- 各トランズウェルをEndohm-6測定チャンバーに移し、チャンバーの蓋を元に戻して、アピカル電極がアピカルコンパートメント内の200 μLのPBSに収まるようにします。基底電極は、Endohm-6チャンバーの底部に組み込まれています。
- EVOMの読み取り値を安定させ、生のTEER測定値を記録します。
- TEER測定後、力価測定が必要な場合は、上記のようにASLサンプルを採取します(TEER測定用に添加したPBS + Ca2+/Mg2+を200 μL採取します)。
注:ASLサンプルの収集は、TEERの読み取り値を混乱させる可能性のある上皮バリアの微小裂傷を誘発する可能性があるため、TEER測定後にASLを収集する必要があります。さらに、基礎培地は、TEER値にも影響を与える可能性があるため、TEER測定値の直前に変更しないでください。 - 生のTEER測定値をオーム/cm2の最終測定値に変換するには、ブランクTEER値を差し引き、式(1)を使用してこの値にトランズウェル膜の表面積を掛けます。
TEER = [TEER読み取り値-空白のTEER値]×(トランジスウェルの表面積)(1) - HCoV の場合、感染後 24 時間または 48 時間ごとに TEER を評価します。TEERの変化の動態はウイルスによって異なることが多く、さまざまな時点でトラブルシューティングが必要です。
- TEERを測定するときは、常に模擬感染培養を含め、各時点で評価します(ネガティブコントロール)。
注:模擬培養の場合、TEER測定値は安定しているか、培養の分化が完了した後、ベースラインからわずかに増加する可能性があります。メンブレンサポートの表面積は、トランズウェルのサイズとメーカーによって異なります。24ウェルトランズウェルの表面積は、通常0.33cm2です。
5. 乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)アッセイ による感染時の細胞毒性の測定
注:この研究では、市販の細胞毒性検出キットを使用して、ASLサンプル中のLDH含有量を定量しました。基礎培地中のLDHシグナルは、HCoV感染培養由来のASLサンプルで定量されたLDHよりも検出限界を下回ることが多く、再現性が低いことが多かった。
- LDHアッセイに必要な追加のコントロールを準備します。
- バックグラウンドコントロール:PBSを使用します(ASLサンプルをこの方法で収集した場合は、カルシウムとマグネシウムを含むPBSを使用します)。
- ポジティブコントロール(上限値):ALIをTriton X-100でアプライに治療する。Triton コントロールウェルを収集します (通常、各時点で 3 つの ALI 培養を使用します)。
- 200 μL の 2% Triton X-100 in PBS をトランズウェルの頂端コンパートメントに直接添加します。
- 10〜15分間インキュベートして、細胞を完全に溶解させます。
- 全ボリュームを Triton 天井サンプルとして収集します。
- ネガティブコントロール(低コントロール/ベースラインLDH放出):感染した培養と同じドナーに由来する模擬感染ALI培養からASLを収集します。
- 上記の ASL 収集手順に従って、ネガティブコントロール模擬 ASL を収集します。
注:このネガティブコントロールにはすべての時点で同じトランズウェルを使用できますが、トリトンコントロールでは各ポイントに新しいトランズウェルが必要になります。
- 上記の ASL 収集手順に従って、ネガティブコントロール模擬 ASL を収集します。
- 各ASLサンプルからのLDH測定値に加えて、排出ウイルスの定量を可能にするには、光学的に透明な平底の黒色の96ウェルプレートを次のようにロードします。
- 45 μL のサンプルと 55 μL の PBS (総容量 100 μL) を使用して、すべてのサンプルを PBS で希釈します。
- Triton ポジティブコントロールサンプルとモックバックグラウンドコントロールサンプルを同じ方法で処理します。
注:この希釈により、各実験サンプル(45 μL x 3)を3回ロードし、プラークアッセイ による力価測定に十分なASL残量を確保できます。 - LDHプレートをTritonシーリング、模擬バックグラウンドコントロール、PBSコントロール、実験サンプルの3回に分けてロードします。
- メーカーの指示に従って反応混合物(染料溶液+触媒)を調製します。
- 各ウェルに100μLの反応混合物を添加し、プレートを室温で20分間インキュベートし、光から保護します。
- 20分後、492nmの吸光度を測定します。
- 式 (2) を使用して、Triton の上限値に対する細胞毒性の割合を計算します。
細胞毒性(%)(2
)
)6. 免疫蛍光(IF)イメージングのための経鼻ALI培養液の調製
- トランズウェルを新しい 24 ウェルプレートに移し、PBS で先端に 3 回洗浄します(力価を上げている場合は、最初の PBS 洗浄液を ASL として収集し、その後、さらに 2 回の PBS 洗浄を行って、IF 品質を妨げる可能性のある過剰な脱落ウイルスを除去します)
- 最後のPBS洗浄後、トランズウェルを頂端および基底部を4% PFAで覆います。
- 30分間インキュベートして4%PFAで固定し、その後、PBSで3回除去して洗浄します。
- 細胞を含むトランズウェル支持体を、鋭利なカミソリの刃またははさみを使用して切除します。
- 各トランズウェルのIFターゲットの数を増やすには、各メンブレンを半分に切断し、それぞれ半分を異なる抗体の組み合わせで染色します。
- 0.2% Triton X-100 in PBS で 10 分間透過処理します。
- 10%正常ロバ血清と1%BSA含有PBST(PBS + 0.2% Triton X-100)で室温で60分間ブロックします。
注:このステップ以降、サンプルを光の暴露から保護します。 - 一次抗体溶液中で4°Cで一晩インキュベートします。 すべての抗体をブロッキングバッファーで1:1,000に希釈します。
注:HCoVヌクレオカプシド染色用の代表的な抗体、上皮細胞タイプマーカー、細胞骨格染色剤を以下にリストアップします(メーカー情報およびカタログ番号については、 材料表 を参照してください)。- HCoV抗原染色には、SARS-CoV-2ヌクレオカプシド、MERS-CoVヌクレオカプシド、およびHCoV-NL63ヌクレオカプシドを標的とする抗体を使用します。
- 上皮細胞の種類を同定するには、杯細胞マーカーMUC5ACおよび繊毛細胞マーカーIV型β-チューブリンを標的とする抗体を使用します。
- 細胞骨格マーカーには、ファロイジン(F-アクチンに結合)に対する抗体と上皮細胞接着マーカーであるEpCAM(CD326)を使用します。
- 二次抗体溶液中で室温で60分間インキュベートします。ブロッキングバッファーで1:1,000に希釈した二次抗体色素を使用してください。
- 染色が完了したら、メンブレンをスパチュラでスライドガラスに移し、頂端側をスライドに向けてトランズウェルを向け、封入液を追加します。端の周りに透明なマニキュアを塗る前に、15〜30分間落ち着かせます。
- 共焦点顕微鏡(Z軸ステップ:0.5μm、シーケンシャルスキャン)で画像を取得1,16,17。
注:培養物を 4% PFA で固定し、PBS で洗浄した後、固定培養物を 4 °C で数週間から数か月保存してから、染色およびイメージングの準備を行うことができます。メンブレンを染色してマウントした後、サンプルは暗所で4°Cで長期(>2年)保存できます。
7. ウェスタンイムノブロッティング用の細胞内タンパク質またはRT-qPCR解析用のRNAの採取
- ウイルス力価を定量化する場合は、上記のようにASLを収集します(プロトコルセクション2)。
- メンブレンをこすり落とすとインサートが破損する可能性があるため、トランズウェルを清潔な24ウェルプレートに移動します。
- ウェスタンブロット解析では、プロテアーゼ阻害剤およびホスファターゼ阻害剤を添加した125 μLのRIPAバッファー(50 mM Tris、pH 8、150 mM NaCl、0.5%デオキシコール酸、0.1% SDS、1% NP40)に総タンパク質ライセートを採取します。
- 125 μLのRIPAバッファーを頂端コンパートメントに加え、5〜10分間インキュベートします。
- P200ピペットチップを使用してメンブレンをこすり落とし、付着した細胞を除去し、全容量を回収します(メンブレンの表面全体を激しくこすり、その後、ピペットを複数回上下させてサンプル全体を回収します)。
- タンパク質ライセートサンプルを氷上で10分間インキュベートした後、最高速度(20,000 × g)で4°Cで10分間遠心分離します。
- メーカーのプロトコルに従って、上清を4x Laemmliサンプルバッファーとβ-メルカプトエタノール(還元剤)と混合します。
- タンパク質サンプルを 95 °C で 5 分間煮沸し、従来のウェスタンブロッティングプロトコル 1,16,17 を使用して分析します。
- トータルRNAの採取には、市販のRNA抽出キットをご使用ください。
注:24ウェルトランズウェルインサートの頂端コンパートメントの最大容量は~200 μLです。したがって、各培養物で2回連続して洗浄を行い、総推奨量に達します。以下の詳細は、総容量 350 μL の RNA サンプルの推奨収集に対応しています。 - 200 μLの溶解緩衝液を感染したトランズウェルの頂端コンパートメントに加えます。
- 5〜10分間放置し、ピペットチップを使用してメンブレンから残りの細胞をこすり落とし、全容量をラベル付き微量遠心チューブに集めます。
- トランズウェルの頂端コンパートメントに150 μLの溶解緩衝液を追加し、ピペットで上下させてから、同じ微量遠心チューブに集めます。
- メーカーのプロトコルに従ってRNAを抽出します。
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Representative Results
代表的な数値は、Otter et al.1の原稿に見られるデータから部分的に改作されています。4人または6人のドナー由来の経鼻ALI培養物を、上記のプロトコルに従って4つのHCoV(SARS-CoV-2、MERS-CoV、HCoV-NL63、およびHCoV-229E)のいずれかに感染させ、各ウイルスの平均頂端排出ウイルス力価を 図1Aに示します。これら4つのHCoVはすべて経鼻ALI培養で生産的に複製されますが、SARS-CoV-2とHCoV-229Eは最も効率的に複製します。なお、これらは平均的なウイルス力価であり、個々のドナーにおける各HCoVの力価が最近発表されたものであることに留意されたい1。プロトコルセクション3に記載されているように経鼻ALI培養物を洗浄した後、頂端表面液(ASL)中のMERS-CoV力価を 図1Bの細胞内ウイルス力価と比較します。MERS-CoVの細胞内および頂端から排出されたウイルス力価は、感染後48時間(hpi)でほぼ同じです。
感染した鼻腔ALI培養物の免疫蛍光イメージングは、細胞の向性や、合胞体の形成、細胞間融合、上皮バリアの完全性の損傷などの他の感染パラメータを調べるために使用できる強力なツールです。ウイルス抗原に特異的な抗体(ヌクレオカプシドやHCoV非構造タンパク質など)および繊毛細胞または杯細胞(それぞれIV型β-チューブリンおよびMUC5AC)のマーカーで感染培養物を共染色することにより、鼻腔ALIにおけるHCoVの細胞向性を決定することができます25,26。図2Aは、SARS-CoV-2、MERS-CoV、およびHCoV-NL63に感染した経鼻培養の代表的な画像を示しています。
SARS-CoV-2およびHCoV-NL63は、主に繊毛細胞に感染します(繊毛マーカーIV型βチューブリンによるウイルスヌクレオカプシド染色の共局在と、杯細胞マーカーMUC5ACによるウイルス抗原の共局在の欠如によって証明されています)。MERS-CoVは、MUC5ACによるウイルス抗原染色の共局在と、IV型β-チューブリンによるウイルスヌクレオカプシド染色の共局在が最小限であるという逆のパターンを示すため、主に経鼻ALI培養において非繊毛杯細胞に感染します。アクチンフィラメントに結合するファロイジンや、上皮細胞接着分子であるEpCAMなどのマーカーを使用して、上皮細胞骨格を視覚化し、上皮バリアの完全性の喪失を検出することができます27。 図2B は、鼻腔ALI培養におけるファロイジン染色を示しています。パネル1は、模擬感染培養における無傷の細胞骨格F-アクチン超微細構造を示し、パネル2はファロイジンの完全性の喪失を示し、HCoV-NL63感染培養における上皮バリア機能への潜在的な損傷を示唆しています。このような上皮マーカーは、感染中の上皮バリア動態を特徴付けるためにHCoV感染に適用できます。
鼻腔ALI培養物に4つのHCoVのそれぞれを感染させた後、経上皮電気抵抗(TEER)をモニターしました。ベースラインのTEER測定値は、感染前に0 hpiで記録され、TEERは96 hpiおよび192 hpiで各トランズウェルについて再度評価されました。 図 3 は、各 HCoV の TEER の変化を示しています。 図3A、B は、ΔTEER値(任意の点で測定されたTEERから0hpiでのベースラインTEERを差し引いて計算された各トランスウェルのTEERの差)を示しています。SARS-CoV-2、MERS-CoV、およびHCoV-NL63の場合、TEERの大きな変化は感染の後期(192 hpi)に発生し、 図3A は、SARS-CoV-2およびHCoV-NL63感染が負のΔTEER値(192 hpi - 0 hpi)をもたらすのに対し、MERS-CoV感染は負の値(192 hpi - 0 hpi)をもたらすことを示しています。比較のために模擬ΔTEER値が含まれており、MERS-CoV感染後のTEERの変化は模擬感染中に見られるものと有意差がないことを示しています。負のΔTEER値は、上皮バリアの完全性の低下と上皮バリア機能の低下を示します。 図3B は、HCoV-229EのΔTEER値を示しています(96hpiと192hpiから計算)。HCoV-229Eは、より早い時点(96 hpi)で上皮バリア機能障害を引き起こしますが、後の時点(192 hpi)で模擬レベルへの回復が起こります。これらのデータは、TEERの動態がウイルス間でどのように異なるかを示しています。 図3C、D は、感染した各トランズウェルの生のTEERデータを経時的に描写したTEERトレースを示しており、感染の過程でのTEERの傾向を視覚化することができます。必要に応じて、サイトカインIL-13による治療は、タイトジャンクションを損ない、上皮バリア機能を損ない、気道上皮の膜透過性を高めるため、TEER実験中のポジティブコントロールとして含めることができます。したがって、サイトカインIL-13はTEER28、29、30の減少をもたらすと予想されます。
鼻腔培養におけるTEER測定を補完するために、感染中に頂端に放出される乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)の定量化 により、細胞毒性を定量化することができます。 図 4 は、アッセイした各 HCoV に感染した 10 人のドナーに由来する培養物からの 96 hpi および 192 hpi における平均細胞毒性データを示しています。SARS-CoV-2、HCoV-NL63、およびHCoV-229Eは、経鼻培養で重大な細胞毒性を引き起こしますが、MERS-CoVは引き起こしません。
感染した鼻腔培養物から採取された総タンパク質またはRNAは、さまざまなHCoVと宿主の相互作用を調べるために使用できます。杯細胞過形成を誘発し、喘息気道の組織ランドスケープをモデル化するために、2型サイトカインIL-13で鼻培養を処理しました。 図5A は、IL-13処理後の2つの主要なHCoV受容体のmRNA存在量を定量化したqPCRデータを示しています。DPP4はMERS-CoVの細胞受容体であり、ACE2はSARS-CoV-2とHCoV-NL63の両方の細胞受容体です。IL-13治療により、DPP4の発現は劇的に増加しましたが、ACE2の発現には有意な変化はありませんでした。 図5B は、非感染培養およびSARS-CoV-2感染培養におけるIL-13処理後のタンパク質量を評価するためのウェスタンブロットデータを示しています。IL-13処理により、MUC5AC(杯細胞マーカー)が有意に増加し、IV型β-チューブリン(繊毛細胞マーカー)が減少し、このサイトカイン処理によって引き起こされる杯細胞過形成が予想されることを反映しています。タンパク質レベルの分析では、IL-13処理によりDPP4の発現が増加しますが、ACE2の発現は減少することが示されています。SARS-CoV-2ヌクレオカプシドタンパク質のウェスタンブロッティングにより、IL-13処理では、偽処理培養と比較してウイルス抗原がわずかに減少することが明らかになりました。同様の分析は、鼻腔ALI培養の操作および/またはHCoVの感染後に、目的のmRNAまたはタンパク質に対して実行できます。
図1:経鼻ALI培養におけるHCoV複製。6人または4人のドナー由来の鼻腔培養物に、SARS-CoV-2(6)、MERS-CoV(6)、HCoV-NL63(6)、またはHCoV-229E(4)をMOI = 5で3回に分けて感染させた。頂端表面液を0 hpi、48 hpi、96 hpi、144 hpiで採取し、プラークアッセイにより感染性ウイルスを定量した。(A)各HCoVに感染したすべてのドナーの平均ウイルス力価が示されています。(B)単一のドナーに由来する鼻腔培養をMOI = 5で3回感染させ、ASLを48hpiで採取した。ASL回収後、トランズウェルをPBSで3回洗浄し、凍結融解して細胞内ウイルスを定量しました。頂端の小屋のコンパートメントと細胞内コンパートメントの感染性ウイルスをプラークアッセイによって定量しました。データは平均±SDとして表示されます。 略語:ALI = air-liquid interface;MOI = 感染の多重度;ASL =頂端表面液体;HPI = 感染後数時間。PBS = リン酸緩衝生理食塩水。この図は、Otter et al.1に掲載されたデータを用いて作成されました。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図2:細胞の向性と上皮の完全性を特徴付けるための鼻腔ALI培養の免疫蛍光イメージング 。 (A)経鼻ALI培養物をSARS-CoV-2、MERS-CoV、またはHCoV-NL63にMOI = 5で感染させ、96hpiで4%パラホルムアルデヒドに固定しました。培養物は、上記のプロトコルセクション6に記載されているように、各ウイルスヌクレオカプシドタンパク質(赤色で表示)、繊毛細胞マーカーIV型β-チューブリン(緑)、または杯細胞マーカーMUC5AC(緑)に対する一次抗体を使用して、免疫蛍光イメージング用に調製しました。注目すべきは、MUC5AC抗体との種不適合性により、ヌクレオカプシドタンパク質に対する抗体の代わりにMERS-CoV非構造タンパク質8(nsp8)に対する抗体が使用されたことです。ウイルス抗原と各上皮細胞マーカーの共局在は、各ウイルスのマージされた画像でオレンジ/黄色として視覚化されます。(B)鼻腔ALI培養物は、ピンク色で示すように、細胞骨格の完全性を可視化するために、ファロイジン(アクチン細胞骨格フィラメントを染色する)を用いて染色しました。ヘシュト染色は青色で示しています。パネル2B.1は鮮明で無傷のファロイジン染色を示し、無傷の細胞骨格構造を示し、パネル2B.2は上皮の完全性の喪失とファロイジン染色のぼやけを示しています。スケールバー=(A)50μm、(B)10μm。略語:ALI =気液界面。MOI = 感染の多重度;HPI = 感染後数時間。この図は、Otterらに掲載されたデータを使用して作成されました。 この 図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:感染時のALI培養における経上皮電気抵抗の測定 。 (A)10人のドナー由来の経鼻ALI培養物は、模擬感染したか、SARS-CoV-2、MERS-CoV、またはHCoV-NL63にMOI = 5で感染しました。ΔTEERは、192 hpiから0 hpiのTEER(ベースラインTEER)を引いたTEERとして、各トランジウェルについて計算されました。各バーは、各ドナーからの三重培養における各ウイルスの平均ΔTEER値を示しています。(B)8人のドナー由来の鼻腔ALI培養物を模擬感染またはHCoV-229EにMOI = 5で感染させた。ベースラインTEERからのΔTEERは、96 hpiまたは192 hpiのいずれかでTEERを使用して(A)のように計算されました。(C、D)TEERトレースデータは、4人のドナーのそれぞれに由来する模擬感染またはHCoV感染培養について示されています。各線は、経時的な単一のトランズウェルからのTEERデータを表しています(各ドナーからの3つのトランジスウェルをアッセイしました)。寄付者番号は色分けされており、各グラフの右側のキーに表示されます。データは、パネル A とパネル B±SDの平均値として表示されます。略語:ALI =気液界面。MOI = 感染の多重度;HPI = 感染後数時間。TEER = 経上皮電気抵抗。この図は、Otter et al.1に掲載されたデータを用いて作成されました。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図4:経鼻ALI培養のHCoV感染中の細胞毒性の定量化。 MOI = 5 で各 HCoV に 3 回感染した 10 人のドナーに由来する鼻培養を、上記のように ASL サンプルで LDH 定量しました。試験したすべてのドナーの平均細胞毒性は、各HCoVについて96 hpiおよび192 hpiで示されています。データは平均±SDとして表示されます。 略語:ALI = air-liquid interface;MOI = 感染の多重度;HPI = 感染後数時間。TEER = 経上皮電気抵抗;ASL =頂端表面液体;LDH = 乳酸デヒドロゲナーゼ。この図は、Otter et al.1に掲載されたデータを用いて作成されました。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図5:鼻腔培養液の感染後のmRNA/タンパク質分析。 2型サイトカインIL-13で処理した鼻腔培養物または偽処理した経鼻培養物を使用して、HCoV受容体の発現、ならびに繊毛細胞マーカーおよび杯細胞マーカーの変化を評価しました。(A) DPP4 および ACE2 のmRNA発現をRT-qPCR で 定量しました。 IL-13で処理された3人のドナーの培養物のデータは、同じドナー由来の偽処理された培養物に対する倍数変化として示されています。データは平均± SD として表示され、各点は 1 人のドナーの平均倍変化誘導を表します。(B)総タンパク質は、偽またはIL-13で処理され、模擬またはSARS-CoV-2に感染した経鼻培養物から採取されました。タンパク質を SDS-PAGE で分離し、上皮細胞マーカー(IV型βチューブリン、MUC5AC)、HCoV受容体(ACE2、DPP4)、SARS-CoV-2ヌクレオカプシドタンパク質、およびGAPDHに対する抗体で免疫ブロットしました。略語:RT-qPCR = 逆転写定量的ポリメラーゼ連鎖反応;SDS-PAGE = ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動。この図は、Otter et al.1に掲載されたデータを用いて作成されました。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
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Discussion
ここで詳述する方法は、患者由来の鼻上皮細胞を空気と液体の界面で増殖させ、HCoVと宿主の相互作用の研究に適用する一次上皮培養システムについて説明しています。分化されると、これらの鼻腔ALI培養物は、繊毛細胞、杯細胞、基底細胞が表される不均一な細胞集団や、繊毛と粘液分泌を頑強に鼓動する無傷の粘膜繊毛機能など、 in vivo 鼻上皮の多くの特徴を再現します。この不均一な細胞集団は、ウイルス感染時の宿主細胞の向性特性評価を可能にするため、従来の呼吸器上皮細胞株に対するこの培養システムの重要な利点です( 図2を参照)。また、従来の気道上皮細胞株は、インターフェロン産生などの自然免疫経路とともに呼吸器系ウイルスに対する一次防御に重要な役割を果たす機能的な粘膜繊毛クリアランス機構を欠いています。
プロトコル内の重要なステップには、最初の感染手順が含まれます。例えば、培養物は感染前に所望の温度で平衡化する必要があり、各感染を開始するために一貫した方法論を使用する必要があります。これらのステップは、分析法を標準化し、ダウンストリームの所見の再現性を確保するために極めて重要です。
おそらく、これらの手法の最も重要な部分は、各HCoVの固有の複製サイクルを理解することで、さらなる分析に最適な時点を決定するのに役立つため、先端から放出されたウイルスの定量化です。また、代表的な不均一な細胞集団を有する in vitro 鼻上皮におけるウイルス感染を可視化する能力は、ウイルスの向性を正確に評価し、生理学的設定におけるウイルスと宿主の相互作用をさらに照会する能力を提供するため、上記の免疫蛍光法も重要です。
鼻上皮は、すべての呼吸器系ウイルスが遭遇する主要なバリア部位であるため、HCoV感染は鼻上皮の一次感染から始まり、口腔-肺吸引軸 を介して 下気道に広がる可能性があります。これは、病原性HCoV感染(MERS-CoV、SARS-CoV-2)中の重度の肺炎および呼吸器疾患の発症に関与している可能性がありますが、季節性HCoVは上気道にのみ疾患を引き起こす傾向があります。この重要な免疫センチネル部位におけるHCoVと宿主の相互作用を理解することは極めて重要であり、この鼻腔ALIシステムは、HCoV感染中のウイルス複製、宿主細胞の向性、細胞毒性、自然免疫誘導の特性評価を可能にします。
また、この鼻腔ALI培養システムは適応性が高く、多くの臨床病態を反映するために使用できます。嚢胞性線維症(塩化物チャネルの欠損によって引き起こされる)や原発性毛様体ジスキネジア(毛様体拍動メカニズムが機能不全)などの遺伝性肺疾患の患者から採取した鼻の標本を使用して、これらの病状を代表する鼻のALI培養を増殖させ、これらの患者がHCoV感染によってどのように異なる影響を受けるかを理解することができます31,32.さらに、鼻腔ALI培養の分化中にさまざまなサイトカイン処理を使用して、他の病態の特徴を再現することができます。例えば、分化中のIL-13処理は杯細胞過形成を誘発し、喘息またはアレルギー性気道を研究するための代理として使用できる33,34。したがって、この鼻腔ALIシステムは、健康な鼻気道と病気の鼻気道の両方で、HCoV宿主やその他のウイルスと宿主の相互作用を調べるための強力なツールです。
このシステムには多くの利点がありますが、経鼻ALI培養の使用にはいくつかの制限も生じます。鼻細胞は、気管支細胞や肺細胞よりもはるかに侵襲的で取得できない技術を必要としますが、ALI培養の増殖と分化には、従来の不死化細胞株の使用よりもはるかに多くの時間とリソースが必要です。さらに、感染に対する寛容性やHCoV感染に対する宿主の反応に関するドナー間のばらつきにより、データの再現と解釈がより困難になる可能性があります(これが、これらの問題を軽減するために、5〜10人のドナーに由来する培養物で実験が行われることが多い理由です)。
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Disclosures
Susan Weissは、Ocugenの科学諮問委員会のメンバーです。ノーム・A・コーエンは、GSK、アストラゼネカ、ノバルティス、サノフィ/レジェロン、オイスター・ポイント・ファーマシューティカルズのコンサルティングを担当し、米国特許「Therapy and Diagnostics for Respiratory Infection」(10,881,698 B2, WO20913112865)を取得し、GeneOne Life Sciencesとライセンス契約を結んでいます。
Acknowledgments
この研究には、次の資金源があります:国立衛生研究所(NIH)R01AI 169537(SRWおよびN.A.C.)、NIH R01AI 140442(S.R.W.)、VA Merit Review CX001717(N.A.C.)、VA Merit Review BX005432(S.R.W.およびN.A.C.)、Penn Center for Research on Coronaviruses and other Emerging Pathogens(S.R.W.)、Laffey-McHugh Foundation(S.R.W.およびN.A.C.)、 T32 AI055400 (CJO)、T32 AI007324 (AF)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor secondary antibodies (488, 594, 647) | Invitrogen | Various | |
| BSA (bovine serum albumin) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| cOmplete mini EDTA-free protease inhibitor | Roche | 11836170001 | |
| Cytotoxicity detection kit | Roche | 11644793001 | |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Media) | Gibco | 11965-084 | |
| DPBS (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline) | Gibco | 14190136 | |
| DPBS + calcium + magnesium | Gibco | 14040-117 | |
| Endohm-6G measurement chamber | World Precision Instruments | ENDOHM-6G | |
| Epithelial cell adhesion marker (EpCAM; CD326) | eBiosciences | 14-9326-82 | |
| Epithelial Volt/Ohm (TEER) Meter (EVOM) | World Precision Instruments | 300523 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | HyClone | SH30071.03 | |
| FV10-ASW software for imaging | Olympus | Version 4.02 | |
| HCoV-NL63 (Human coronavirus, NL63) | BEI Resources | NR-470 | |
| HCoV-NL63 nucleocapsid antibody | Sino Biological | 40641-V07E | |
| Hoescht stain | Thermo Fisher | H3570 | |
| Laemmli sample buffer (4x) | BIO-RAD | 1610747 | |
| LLC-MK2 cells | ATCC | CCL-7 | To titrate HCoV-NL63 |
| MERS-CoV (Human coronavirus, Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus (MERS-CoV), EMC/2012) | BEI Resources | NR-44260 | |
| MERS-CoV nucleocapsid antibody | Sino Biological | 40068-MM10 | |
| MUC5AC antibody | Sigma-Aldrich | AMAB91539 | |
| Olympus Fluoview confocal microscope | Olympus | FV1000 | |
| Phalloidin-iFluor 647 stain | Abcam | ab176759 | |
| PhosStop easy pack (phosphatase inhibitors) | Roche | PHOSS-RO | |
| Plate reader | Perkin Elmer | HH34000000 | Any plate reader or ELISA reader is sufficient; must be able to read absorbance at 492 nm |
| RIPA buffer (50 mM Tris pH 8; 150 mM NaCl; 0.5% deoxycholate; 0.1% SDS; 1% NP40) | Thermo Fisher | 89990 | Can prep in-house or purchase |
| RNeasy Plus Kit | Qiagen | 74134 | |
| SARS-CoV-2 (SARS-Related Coronavirus 2, Isolate USA-WA1/2020) | BEI Resources | NR-52281 | |
| SARS-CoV-2 nucleocapsid antibody | Genetex | GTX135357 | |
| Triton-X 100 | Fisher Scientific | BP151100 | |
| Type IV β- tubulin antibody | Abcam | ab11315 | |
| VeroCCL81 cells | ATCC | CCL-81 | To titrate MERS-CoV |
| VeroE6 cells | ATCC | CRL-1586 | To titrate SARS-CoV-2 |
References
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