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Immunology and Infection

Infección de células epiteliales nasales primarias cultivadas en una interfaz aire-líquido para caracterizar las interacciones entre el coronavirus y el huésped humano

Published: September 22, 2023 doi: 10.3791/64868
Automatic Translation
1,2, 1,2, 3,4, 1,2, 3,4
1Department of Microbiology, University of Pennsylvania, 2Penn Center for Research on Coronaviruses and Other Emerging Pathogens, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, 3Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery, University of Pennsylvania, 4Corporal Michael J. Crescenz VA Medical Center

Summary

El epitelio nasal es el principal sitio de barrera que encuentran todos los patógenos respiratorios. Aquí, describimos métodos para utilizar células epiteliales nasales primarias cultivadas como cultivos de interfaz aire-líquido (ALI) para caracterizar las interacciones entre el coronavirus humano y el huésped en un sistema fisiológicamente relevante.

Abstract

En los últimos 20 años han surgido tres coronavirus humanos altamente patógenos —el SARS-CoV (2002), el MERS-CoV (2012) y el SARS-CoV-2 (2019)— que han causado importantes crisis de salud pública. Cuatro HCoV adicionales causan una parte significativa de los casos de resfriado común cada año (HCoV-NL63, -229E, -OC43 y -HKU1), lo que destaca la importancia de estudiar estos virus en sistemas fisiológicamente relevantes. Los HCoV ingresan al tracto respiratorio y establecen la infección en el epitelio nasal, el sitio principal que encuentran todos los patógenos respiratorios. Utilizamos un sistema de cultivo epitelial nasal primario en el que las muestras nasales derivadas del paciente se cultivan en una interfaz aire-líquido (ALI) para estudiar las interacciones huésped-patógeno en este importante sitio centinela. Estos cultivos recapitulan muchas características de la vía aérea in vivo , incluidos los tipos de células presentes, la función ciliar y la producción de moco. Describimos métodos para caracterizar la replicación viral, el tropismo de la célula huésped, la citotoxicidad inducida por virus y la inducción inmune innata en cultivos nasales de ALI después de la infección por HCoV, utilizando como ejemplo trabajos recientes que comparan HCoV letales y estacionales1. Una mayor comprensión de las interacciones huésped-patógeno en la nariz tiene el potencial de proporcionar nuevos objetivos para la terapéutica antiviral contra los HCoV y otros virus respiratorios que probablemente surjan en el futuro.

Introduction

Hasta la fecha se han identificado siete coronavirus humanos (HCoV) que causan una serie de enfermedades respiratorias2. Los HCoV comunes o estacionales (HCoV-NL63, -229E, -OC43 y -HKU1) generalmente se asocian con patología del tracto respiratorio superior y causan aproximadamente entre el 10% y el 30% de los casos de resfriado común anualmente. Aunque este es el fenotipo clínico típico asociado con los HCoV comunes, estos virus pueden causar una enfermedad más significativa del tracto respiratorio inferior en poblaciones de riesgo, incluidos niños, adultos mayores e inmunodeprimidos 3,4. En los últimos 20 años han surgido tres HCoV patógenos que han causado importantes emergencias de salud pública, entre ellos el síndrome respiratorio agudo grave (SARS)-CoV, el síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS)-CoV y el SARS-CoV-2. Los HCoV letales se asocian con una patología más grave de las vías respiratorias, lo que queda claramente ilustrado por la tasa de letalidad del >34% asociada a los casos de MERS-CoV (894 muertes en más de 2.500 casos desde su aparición en 2012)5,6. Es importante tener en cuenta que los HCoV letales también causan una serie de enfermedades de las vías respiratorias, desde infecciones asintomáticas hasta neumonía letal, como se ha visto con la actual pandemia de COVID-197.

Los HCoV, al igual que otros patógenos respiratorios, entran en el tracto respiratorio y establecen una infección productiva en el epitelio nasal8. Se cree que la diseminación a la vía aérea inferior está asociada con la aspiración desde la cavidad oral/nasal hasta el pulmón, donde los HCoV causan una patología más significativa del tracto respiratorio inferior 9,10,11. Por lo tanto, la nariz sirve como el portal inicial para la entrada viral y es la principal barrera para la infección con su robusta maquinaria de eliminación mucociliar y mecanismos inmunológicos innatos únicos destinados a prevenir una mayor propagación viral a las vías respiratorias inferiores12,13. Por ejemplo, se ha reportado que las células epiteliales nasales expresan niveles basales más altos que el promedio de interferones antivirales y genes estimulados por interferón, lo que indica que las células nasales pueden estar preparadas para respuestas tempranas a virus respiratorios14,15,16.

Anteriormente hemos utilizado células epiteliales nasales primarias derivadas de pacientes cultivadas en una interfaz aire-líquido (ALI) para modelar las interacciones entre el HCoV y el huésped en la nariz, donde comienzan las infecciones por HCoV. Los cultivos nasales de ALI son permisivos tanto para los HCoV patógenos (SARS-CoV-2 y MERS-CoV) como para los comunes (HCoV-NL63 y HCoV-229E) y ofrecen varias ventajas sobre las líneas celulares epiteliales tradicionales de las vías respiratorias, como A549 (una línea celular de adenocarcinoma de pulmón)16,17. Después de la diferenciación, los cultivos nasales de ALI contienen una población celular heterogénea y exhiben muchas de las funciones esperadas del epitelio nasal in vivo, como la maquinaria de depuración mucociliar18. Las células nasales también ofrecen ventajas sobre los sistemas de cultivo de la vía aérea inferior (como las células epiteliales bronquiales humanas, HBEC), ya que la adquisición de células epiteliales nasales a través del cepillado citológico es significativamente menos invasiva en comparación con el uso de técnicas como la broncoscopia para la obtención de HBEC 19,20,21.

En este artículo se describen los métodos para utilizar este sistema de cultivo nasal de ALI para caracterizar las interacciones HCoV-huésped en el epitelio nasal. Hemos aplicado estos métodos en trabajos publicados recientemente para comparar SARS-CoV-2, MERS-CoV, HCoV-NL63 y HCoV-229E 1,16,17. Aunque estos métodos y resultados representativos enfatizan el estudio de los HCoV en este modelo de células nasales, el sistema es altamente adaptable a otros HCoV, así como a otros patógenos respiratorios. Además, estos métodos pueden aplicarse de forma más amplia a otros sistemas de cultivo de ALI para investigar la replicación viral y el tropismo celular, así como la citotoxicidad y la inducción inmunitaria innata tras la infección.

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Protocol

El uso de muestras nasales fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional de la Universidad de Pensilvania (protocolo # 800614) y la Junta de Revisión Institucional de VA de Filadelfia (protocolo # 00781).

1. Infección de cultivos nasales de ALI

NOTA: La adquisición de muestras clínicas, así como el crecimiento y la diferenciación de cultivos nasales de ALI, están fuera del alcance de este trabajo. Los métodos específicos para el cultivo de células epiteliales nasales primarias se pueden encontrar en trabajos publicados recientemente que utilizan estos cultivos 18,22,23. Los siguientes protocolos también se pueden aplicar a los cultivos de ALI epitelial nasal disponibles comercialmente si se desea. Los protocolos y volúmenes que se detallan a continuación son aplicables a los insertos transpocillos de placa de 24 pocillos (6,5 mm de diámetro, 0,33 cm2 de superficie de membrana). Si se utilizan cultivos de ALI cultivados en transpocillos más grandes (es decir, placas de 12 pocillos, 12 mm de diámetro, 1,12 cm2 de superficie), ajuste los volúmenes proporcionalmente para reflejar el tamaño del transpocillo.

  1. Día antes de la infección:
    1. Lavar los cultivos de ALI 3 veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS) por vía apical (añadir ~200 μL de PBS calentado, colocar en la incubadora a 37 °C durante 5 min, aspirar PBS y repetir).
    2. Reemplace el medio basal (500 μL).
    3. Permita que los cultivos se equilibren a la temperatura a la que se llevarán a cabo las infecciones durante la noche (es decir, si infecta a 33 °C, coloque los cultivos en una incubadora a 33 °C después de lavar el PBS).
      NOTA: Se ha informado que los HCoV asociados con el resfriado común, como el HCoV-229E y el HCoV-NL63, se replican de manera más eficiente a 33 °C. Además, la temperatura del epitelio nasal in vivo es de 33 °C (esto difiere de la temperatura del pulmón, que es de 37 °C).
  2. Diluya el virus según sea necesario en el medio Eagle modificado (DMEM) de Dulbecco sin suero para lograr la multiplicidad deseada de infección (MOI) en un volumen total de inóculo de 50 μL.
    NOTA: Por lo general, las infecciones se han llevado a cabo en MOI = 5 (MOI alto); sin embargo, las infecciones con MOI = 0,5 (MOI bajo) también se han utilizado para el SARS-CoV-2 y los HCoV asociados al resfriado común, y estos dan lugar a títulos virales máximos comparables, pero con cinética variable (cualquiera de los MOI es aceptable).
  3. Agregue el inóculo por vía apical y vuelva a colocar los cultivos en la incubadora durante 1 h.
  4. Balancee las placas suavemente cada 15 minutos durante la infección (sosteniendo la placa firmemente con ambas manos, muévala hacia adelante y hacia atrás y de lado a lado para asegurar una adsorción uniforme del inóculo viral).
  5. Después de 1 h de incubación, aspire el inóculo viral y lave cada cultivo infectado 3 veces con PBS para asegurar la eliminación del inóculo viral (para cada lavado, agregue 200 μL de PBS, incube durante 5 minutos y aspire o retire con una pipeta).
  6. Si lo desea, recoja el tercer lavado de PBS para confirmar la eliminación adecuada del virus de entrada.
  7. Reemplace el medio basal con medio fresco en las ILA infectadas cada 72 h durante la infección.

2. Recolección de líquido de superficie apical (ASL) y titulación del virus excretado

  1. En puntos de tiempo predeterminados después de la infección, agregue 200 μL de PBS a la cámara apical de cada pocillo trans infectado.
    NOTA: Los puntos de tiempo relevantes varían según el HCoV de interés y oscilan entre 24 h y 192 h después de la infección (consulte la sección de resultados representativos para obtener datos de replicación viral para varios HCoV).
  2. Pipetee PBS hacia arriba y hacia abajo 5 veces para garantizar la máxima recolección del virus excretado apicalmente y recoja todo el volumen en un tubo de microcentrífuga (esta es la muestra de ASL).
    NOTA: El ASL incluye partículas virales excretadas, además de moco y otros productos secretados apicalmente por cultivos de ALI.
  3. Cuantificar el virus infeccioso en ASL mediante un ensayo de placa viral estándar (diluir en serie muestras que contienen virus para cuantificar la concentración de partículas virales).
    NOTA: Los tipos de células y el período de incubación utilizados para el ensayo de placa dependerán del virus utilizado: SARS-CoV-2 (células VeroE6); MERS-CoV (células VeroCCL81); HCoV-NL63 (células LLC-MK2); HCoV-229E (células Huh7). Los detalles sobre cómo realizar ensayos de placa viral están más allá del alcance de este manuscrito, pero se han detallado previamente en una publicación del Journal of Visualized Experiments (JoVE)24.
  4. Si lo desea, recoja el medio basal en varios momentos después de la infección para confirmar la ausencia de virus liberado basalmente. Por lo general, los HCoV se liberan apicalmente de las células epiteliales nasales, pero lo confirman mediante un ensayo de placa de medio basal sin diluir.
  5. Almacene las muestras de ASL a -80 °C si la cuantificación mediante ensayo de placa no se realizará el día de la recolección.

3. Cuantificación del virus intracelular

  1. Después de recolectar la muestra de ASL, mueva cada pocillo transversal a una placa limpia de 24 pocillos precargada con 500 μL de DMEM que contenga un 2% de suero fetal bovino (FBS) basalmente.
    NOTA: El DMEM con 2% de FBS se utiliza para estabilizar el virus durante los ciclos de congelación y descongelación posteriores.
  2. Lave cada transpocillo 3 veces apicalmente con PBS para asegurar la eliminación completa del virus excretado apicalmente.
  3. Después de aspirar para eliminar el lavado final de PBS, agregue 100 μL de DMEM con 2% de FBS al compartimiento apical.
  4. Mueva la placa que contiene los transpocillos con medios apicales y basales a un congelador de -80 °C y complete tres ciclos consecutivos de congelación y descongelación para lisar las células.
  5. Después del ciclo final de congelación-descongelación, agrupe los medios apicales (100 μL) y basales (500 μL) en un tubo limpio.
  6. Centrifugar a 500 × g durante 10 min a 4 °C para granular cualquier residuo celular.
  7. Recoge el sobrenadante. Esta es la muestra de virus intracelular para la valoración mediante ensayo de placa estándar.
    NOTA: Durante el proceso de recolección se produce una dilución triple en relación con la recolección de ASL; Las muestras de ASL se recogen en 200 μL de PBS, mientras que las muestras de virus intracelulares se recogen en un volumen total de 600 μL.

4. Medición de la resistencia eléctrica transepitelial (TEER)

NOTA: Para la medición de TEER, se debe utilizar PBS suplementado con calcio y magnesio (PBS + Ca 2+/Mg2+). Se utiliza un voltímetro/ohmímetro epitelial configurado para leer en ohmios (consulte la Tabla de materiales).

  1. Limpie, equilibre y deje en blanco el instrumento EVOM de acuerdo con las instrucciones del fabricante; Use un transpocillo "vacío" sin células nasales agregadas para el blanqueo. Registre la medición de TEER en blanco.
    NOTA: Si se utilizan varios virus, el instrumento EVOM debe limpiarse rigurosamente entre condiciones para evitar la contaminación cruzada (los lavados con etanol al 70% seguido de agua desionizada son suficientes).
  2. Mueva cada pocillo infectado a una placa limpia y preetiquetada de 24 pocillos con 500 μl de PBS + Ca 2+/Mg2+ basalmente para lavar el medio basal residual de los pocillos trans.
  3. Añadir 200 μL de PBS + Ca 2+/Mg2+ al compartimento apical de cada pocillo trans.
  4. Agregue 1 mL de PBS + Ca 2+/Mg2+ a la cámara de medición Endohm-6.
  5. Mueva cada transpocillo a la cámara de medición Endohm-6 y vuelva a colocar la tapa de la cámara de modo que el electrodo apical descanse en los 200 μL de PBS en el compartimiento apical; el electrodo basal está integrado en la parte inferior de la cámara Endohm-6.
  6. Permita que la lectura de EVOM se estabilice y registre la medición de TEER sin procesar.
  7. Recoja la muestra de ASL como se ha descrito anteriormente después de realizar la medición de TEER si se desea el ajuste de la titulación (recoja los 200 μL de PBS + Ca 2+/Mg2+ que se añadieron para la medición de TEER).
    NOTA: La recolección de muestras de ASL puede inducir microdesgarros en la barrera epitelial que pueden confundir las lecturas de TEER, por lo que la ASL debe recolectarse después de la medición de TEER. Además, el medio basal no debe cambiarse inmediatamente antes de las lecturas de TEER, ya que esto también puede afectar los valores de TEER.
  8. Para convertir las lecturas brutas de TEER en mediciones finales en ohmios/cm2, reste el valor de TEER en blanco y multiplique este valor por el área de superficie de la membrana transpocillo usando la ecuación (1):
    TEER = [Lectura de TEER - valor TEER en blanco] × (área superficial de transwell) (1)
  9. En el caso de los HCoV, evalúe el TEER cada 24 h o 48 h después de la infección; la cinética de los cambios de TEER a menudo varía entre los virus y requiere la resolución de problemas en varios puntos de tiempo.
  10. Al medir la TEER, incluya siempre cultivos infectados simulados y evalúe en cada punto de tiempo (control negativo).
    NOTA: En el caso de los cultivos simulados, las mediciones de TEER deben permanecer estables o pueden aumentar ligeramente con respecto al valor basal después de completar la diferenciación de los cultivos. El área de superficie de los soportes de membrana variará según el tamaño y el fabricante de los transpozos; Los transpozos de 24 pocillos suelen tener una superficie de 0,33 cm2.

5. Medición de la citotoxicidad durante la infección mediante ensayo de lactato deshidrogenasa (LDH)

NOTA: En este trabajo, el contenido de LDH en muestras de ASL se cuantificó utilizando un kit de detección de citotoxicidad disponible comercialmente. La señal de LDH en el medio basal a menudo estaba por debajo del límite de detección y, a menudo, era menos reproducible que la LDH cuantificada en muestras de ASL de cultivos infectados con HCoV.

  1. Prepare los controles adicionales necesarios para el ensayo de LDH.
    1. Control de fondo: use PBS (use PBS que contenga calcio y magnesio si las muestras de ASL se recolectaron de esta manera).
    2. Control positivo (valor techo): tratar las ALI por vía apical con Triton X-100. Recoja los pozos de control de Tritón (normalmente use tres cultivos ALI para esto en cada punto de tiempo).
      1. Añadir 200 μL de Triton X-100 al 2% en PBS directamente al compartimento apical del transpocillo.
      2. Incubar durante 10-15 minutos para permitir que las células se lisen por completo.
      3. Recoja todo el volumen como una muestra de techo Triton.
    3. Control negativo (baja liberación de LDH de control/inicial): recolectar ASL de cultivos de ALI infectados simuladamente derivados del mismo donante que los cultivos infectados.
      1. Recopile ASL simulado de control negativo siguiendo el procedimiento de recopilación de ASL anterior.
        NOTA: Se pueden utilizar los mismos transpocillos para este control negativo para todos los puntos de tiempo, mientras que para el control Tritón se necesitarán transpocillos nuevos para cada punto de tiempo.
  2. Para permitir la cuantificación del virus excretado además de las lecturas de LDH de cada muestra de ASL, cargue una placa negra de 96 pocillos de fondo plano ópticamente transparente de la siguiente manera:
    1. Diluir todas las muestras en PBS, utilizando 45 μL de muestra y 55 μL de PBS (100 μL de volumen total).
    2. Trate las muestras de control positivo Triton y de control de fondo simulado de la misma manera.
      NOTA: Esta dilución permite la carga por triplicado de cada muestra experimental (45 μL x 3) y suficiente volumen residual de ASL para el ajuste mediante ensayo de placa.
    3. Cargue la placa LDH por triplicado: techo Triton, control de fondo simulado, control PBS y muestras experimentales.
    4. Prepare la mezcla de reacción según lo indicado por el fabricante (solución de colorante + catalizador).
      1. Añadir 100 μL de mezcla de reacción a cada pocillo e incubar la placa a temperatura ambiente durante 20 min protegida de la luz.
    5. Después de 20 minutos, mida la absorbancia a 492 nm.
    6. Calcule el porcentaje de citotoxicidad en relación con el valor máximo de Tritón utilizando la ecuación (2).
      Citotoxicidad (%) Equation 1 (2)

6. Preparación de cultivos nasales de ALI para imágenes de inmunofluorescencia (IF)

  1. Mueva el transwell a una placa nueva de 24 pocillos y lave 3 veces por vía apical con PBS (recoja el primer lavado de PBS como ASL si se titula; luego, realice dos lavados adicionales de PBS para eliminar el exceso de virus excretados que podrían obstaculizar la calidad del FI)
  2. Después del lavado final de PBS, cubra el transpocillo apical y basalmente con PFA al 4%.
  3. Incubar durante 30 minutos para fijar en PFA al 4%, y luego retirar y lavar 3 veces con PBS.
  4. Extirpe el soporte transwell que contiene las células con una cuchilla de afeitar afilada o unas tijeras.
  5. Para aumentar el número de dianas de FI para cada transpocillo, corte cada membrana por la mitad y tiña cada mitad con diferentes combinaciones de anticuerpos.
  6. Permeabilizar con Triton X-100 al 0,2% en PBS durante 10 min.
  7. Bloquear con 10% de suero de burro normal y 1% de BSA en PBST (PBS + 0,2% Triton X-100) durante 60 min a temperatura ambiente.
    NOTA: Proteja las muestras de la exposición a la luz a partir de este paso.
  8. Incubar en solución primaria de anticuerpos durante la noche a 4 °C. Diluir todos los anticuerpos 1:1.000 en tampón de bloqueo.
    NOTA: A continuación se enumeran los anticuerpos representativos para la tinción de la nucleocápside de HCoV, así como los marcadores de tipo de células epiteliales y las tinciones del citoesqueleto (consulte la Tabla de materiales para obtener información del fabricante y números de catálogo).
    1. Para la tinción del antígeno HCoV, utilice anticuerpos dirigidos a la nucleocápside del SARS-CoV-2, la nucleocápside del MERS-CoV y la nucleocápside HCoV-NL63.
    2. Para identificar los tipos de células epiteliales, utilice anticuerpos dirigidos al marcador de células caliciformes MUC5AC y al marcador de células ciliadas tipo IV β-tubulina.
    3. Para los marcadores citoesqueléticos, use anticuerpos dirigidos contra la faloidina (se une a la F-actina) y el marcador de adhesión de células epiteliales: EpCAM (CD326).
  9. Incubar en solución secundaria de anticuerpos durante 60 min a temperatura ambiente; Utilice colorantes de anticuerpos secundarios diluidos 1:1.000 en tampón de bloqueo.
  10. Una vez completada la tinción, transfiera la membrana a un portaobjetos de vidrio con una espátula, oriente el transpocillo con el lado apical hacia el portaobjetos y agregue la solución de montaje. Deje reposar durante 15-30 minutos antes de aplicar el esmalte de uñas transparente alrededor de los bordes.
  11. Adquisición de imágenes con un microscopio confocal (paso del eje Z: 0,5 μm; barrido secuencial)1,16,17.
    NOTA: Después de la fijación de los cultivos en PFA al 4% y el lavado con PBS, los cultivos fijos pueden almacenarse a 4 °C durante semanas o meses antes de la tinción y la preparación para la obtención de imágenes. Después de la tinción y el montaje de las membranas, las muestras pueden almacenarse a largo plazo (>2 años) a 4 °C en la oscuridad.

7. Recolección de proteína intracelular para inmunotransferencia occidental o ARN para análisis de RT-qPCR

  1. Recolectar ASL como se describe anteriormente si cuantifica títulos virales (sección 2 del protocolo).
  2. Mueva el transpocillo a una placa limpia de 24 pocillos, ya que raspar la membrana puede provocar la rotura del inserto.
  3. Para el análisis de Western blot, recoja el lisado de proteínas totales en 125 μL de tampón RIPA (50 mM de Tris, pH 8, 150 mM de NaCl, 0,5% de desoxicolato, 0,1% de SDS, 1% de NP40) suplementado con inhibidores de la proteasa e inhibidores de la fosfatasa.
  4. Añadir 125 μL de tampón RIPA al compartimento apical e incubar durante 5-10 min.
  5. Raspe la membrana con una punta de pipeta P200 para eliminar las células adheridas restantes y recoja todo el volumen (raspe vigorosamente toda la superficie de la membrana y luego pipetee hacia arriba y hacia abajo varias veces para recolectar toda la muestra).
  6. Incubar muestras de lisado de proteínas en hielo durante 10 minutos y, a continuación, centrifugar a velocidad máxima (20.000 × g) durante 10 minutos a 4 °C.
  7. Mezcle el sobrenadante con 4 tampones de muestra Laemmli con β-mercaptoetanol (agente reductor) de acuerdo con los protocolos del fabricante.
  8. Hervir las muestras de proteínas a 95 °C durante 5 min, y luego ejecutarlas utilizando los protocolos tradicionales de Western blot 1,16,17.
  9. Para la recolección de ARN total, use un kit de extracción de ARN disponible comercialmente.
    NOTA: El compartimento apical de los insertos transpocillos de 24 pocillos tiene un volumen máximo de ~200 μL; Por lo tanto, realizamos dos lavados secuenciales en cada cultivo para alcanzar el volumen total recomendado. Los detalles a continuación corresponden a la recolección recomendada de muestras de ARN en un volumen total de 350 μL.
  10. Añadir 200 μL de tampón de lisis al compartimento apical del transpocillo infectado.
  11. Deje reposar durante 5-10 minutos, raspe las células restantes de la membrana con la punta de una pipeta y recoja todo el volumen en un tubo de microcentrífuga etiquetado.
  12. Agregue 150 μL de tampón de lisis adicional al compartimiento apical del transpocillo y pipetee hacia arriba y hacia abajo antes de recolectar en el mismo tubo de microcentrífuga.
  13. Extraiga el ARN de acuerdo con el protocolo del fabricante.

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Representative Results

Las figuras representativas están parcialmente adaptadas de los datos que se pueden encontrar en el manuscrito Otter et al.1. Los cultivos nasales de ALI derivados de cuatro o seis donantes se infectaron con uno de los cuatro HCoV (SARS-CoV-2, MERS-CoV, HCoV-NL63 y HCoV-229E) de acuerdo con los protocolos descritos anteriormente, y los títulos virales promedio de diseminación apical para cada virus se representan en la Figura 1A. Si bien estos cuatro HCoV se replican de manera productiva en cultivos nasales de ALI, el SARS-CoV-2 y el HCoV-229E se replican de manera más eficiente. Obsérvese que se trata de títulos virales medios, y que recientemente se han publicado títulos para cada HCoV en donantes individuales1. Después de lavar los cultivos nasales de ALI, como se describe en la sección 3 del protocolo, los títulos de MERS-CoV en líquido de superficie apical (ASL) se comparan con los títulos virales intracelulares de la figura 1B. Los títulos intracelulares y de excreción viral apical del MERS-CoV son aproximadamente los mismos a las 48 h después de la infección (hpi).

Las imágenes de inmunofluorescencia de cultivos nasales infectados de ALI son una herramienta poderosa que se puede utilizar para sondear el tropismo celular y otros parámetros de infección, como la formación de sincitios, la fusión de célula a célula y el daño a la integridad de la barrera epitelial. La tinción conjunta de cultivos infectados con anticuerpos específicos contra antígenos virales (como la nucleocápside o las proteínas no estructurales HCoV) y marcadores para células ciliadas o caliciformes (tipo IV β-tubulina y MUC5AC, respectivamente) puede determinar el tropismo celular para un HCoV en las ILA nasales25,26. La figura 2A muestra imágenes representativas de cultivos nasales infectados con SARS-CoV-2, MERS-CoV y HCoV-NL63.

El SARS-CoV-2 y el HCoV-NL63 infectan principalmente a las células ciliadas (evidenciado por la colocalización de la tinción de la nucleocápside viral con el marcador de cilios tipo IV β-tubulina y la falta de colocalización del antígeno viral con el marcador de células caliciformes MUC5AC). El MERS-CoV infecta predominantemente las células caliciformes no ciliadas en cultivos nasales de ALI, ya que el MERS-CoV muestra el patrón opuesto, con la colocalización de la tinción del antígeno viral con MUC5AC y la colocalización mínima de la tinción de la nucleocápside viral con la β-tubulina de tipo IV. Marcadores como la faloidina, que se une a los filamentos de actina, o la EpCAM, molécula de adhesión de células epiteliales, pueden utilizarse para visualizar el citoesqueleto epitelial y detectar una pérdida de integridad de la barrera epitelial27. La Figura 2B muestra la tinción de faloidina en cultivos nasales de ALI; El panel 1 muestra la ultraestructura de F-actina del citoesqueleto intacto en un cultivo infectado simulado, y el panel 2 muestra una pérdida de la integridad de la faloidina y sugiere un daño potencial a la función de barrera epitelial en un cultivo infectado con HCoV-NL63. Los marcadores epiteliales como estos se pueden aplicar a las infecciones por HCoV para caracterizar la dinámica de la barrera epitelial durante la infección.

Después de la infección de los cultivos nasales de ALI con cada uno de los cuatro HCoV, se monitorizó la resistencia eléctrica transepitelial (TEER). Se registraron las lecturas basales de TEER antes de la infección, 0 hpi, y se volvió a evaluar la TEER para cada transpocillo a 96 hpi y 192 hpi. La Figura 3 muestra los cambios de TEER para cada uno de los HCoV. La Figura 3A, B muestra los valores de ΔTEER (diferencias en TEER calculadas para cada pocillo transactivo restando TEER de referencia a 0 hpi de TEER medido en un punto dado). En el caso del SARS-CoV-2, el MERS-CoV y el HCoV-NL63, los cambios importantes en el TEER se producen al final de la infección (192 hpi), y la figura 3A ilustra que las infecciones por SARS-CoV-2 y HCoV-NL63 dan lugar a valores negativos de ΔTEER (192 hpi - 0 hpi), mientras que la infección por MERS-CoV no lo hace. A modo de comparación, se incluyen valores simulados de ΔTEER e ilustran que los cambios en los TEER tras la infección por MERS-CoV no son significativamente diferentes de los observados durante la infección simulada. Los valores negativos de ΔTEER indican disminuciones en la integridad de la barrera epitelial y una función de barrera epitelial comprometida. La Figura 3B muestra los valores de ΔTEER para HCoV-229E (calculados a partir de 96 hpi y 192 hpi). El HCoV-229E causa disfunción de la barrera epitelial en el punto de tiempo más temprano (96 hpi), pero la recuperación a niveles simulados ocurre en el punto de tiempo posterior (192 hpi). Estos datos ponen de manifiesto cómo la cinética de los TEER puede diferir entre los virus. La Figura 3C, D muestra los rastros de TEER, que representan los datos brutos de TEER para cada transpocillo infectado a lo largo del tiempo, lo que permite la visualización de las tendencias de TEER en el curso de la infección. Si se desea, el tratamiento con la citocina IL-13 puede incluirse como control positivo durante los experimentos de TEER, ya que esto perjudica las uniones estrechas, compromete la función de barrera epitelial y, por lo tanto, aumenta la permeabilidad de la membrana en los epitelios de las vías respiratorias; por lo tanto, se espera que la citocina IL-13 resulte en disminuciones en TEER28,29,30.

Para complementar las mediciones de TEER en cultivos nasales, la citotoxicidad se puede cuantificar mediante la cuantificación de la lactato deshidrogenasa (LDH) liberada apicalmente durante la infección. En la Figura 4 se muestran los datos medios de citotoxicidad a 96 hpi y 192 hpi de cultivos derivados de 10 donantes infectados con cada uno de los HCoV analizados. El SARS-CoV-2, el HCoV-NL63 y el HCoV-229E causan citotoxicidad significativa en los cultivos nasales, mientras que el MERS-CoV no lo hace.

La proteína total o el ARN recolectado de cultivos nasales infectados se puede utilizar para examinar varias interacciones entre el HCoV y el huésped. Tratamos cultivos nasales con citoquina tipo 2 IL-13 para inducir hiperplasia de células caliciformes y modelar el paisaje tisular de una vía aérea asmática. La figura 5A muestra los datos de qPCR que cuantifican la abundancia de ARNm de dos receptores principales de HCoV después del tratamiento con IL-13. DPP4 es el receptor celular del MERS-CoV, y ACE2 es el receptor celular tanto del SARS-CoV-2 como del HCoV-NL63. El tratamiento con IL-13 da como resultado un aumento drástico de la expresión de DPP4, pero no hay cambios significativos en la expresión de ACE2. La Figura 5B muestra los datos de Western blot para evaluar la abundancia de proteínas después del tratamiento con IL-13 en cultivos no infectados e infectados por SARS-CoV-2. El tratamiento con IL-13 da como resultado un aumento significativo de MUC5AC (un marcador de células caliciformes) y una disminución de la β-tubulina tipo IV (un marcador de células ciliadas), lo que refleja la hiperplasia de células caliciformes esperada causada por este tratamiento con citocinas. El análisis del nivel de proteínas muestra que el tratamiento con IL-13 aumenta la expresión de DPP4 pero disminuye la expresión de ACE2. La transferencia de Western para la proteína de la nucleocápside del SARS-CoV-2 revela que el tratamiento con IL-13 da como resultado una ligera disminución del antígeno viral en comparación con los cultivos tratados simuladamente. Se pueden realizar análisis similares para cualquier ARNm o proteína de interés tras la manipulación de cultivos nasales de ALI y/o la infección por HCoV.

Figure 1
Figura 1: Replicación de HCoV en cultivos nasales de ALI. Los cultivos nasales derivados de seis o cuatro donantes se infectaron por triplicado con SARS-CoV-2 (6), MERS-CoV (6), HCoV-NL63 (6) o HCoV-229E (4) en MOI = 5. El líquido de la superficie apical se recolectó a 0 hpi, 48 hpi, 96 hpi y 144 hpi, y el virus infeccioso se cuantificó mediante ensayo de placa. (A) Se representan los títulos virales promedio de todos los donantes infectados con cada HCoV. (B) Los cultivos nasales derivados de un solo donante se infectaron por triplicado a MOI = 5, y la ASL se recolectó a 48 hpi. Después de la recolección de ASL, los transpocillos se lavaron 3 veces con PBS y luego se lisaron mediante congelación-descongelación para cuantificar el virus intracelular. El virus infeccioso en el compartimiento de excreción apical versus en el compartimiento intracelular se cuantificó mediante ensayo de placa. Los datos se muestran como media ± DE. Abreviaturas: ALI = interfaz aire-líquido; MOI = multiplicidad de infecciones; ASL = líquido de la superficie apical; HPI = horas después de la infección; PBS = solución salina tamponada con fosfato. Esta figura se construyó a partir de los datos publicados en Otter et al.1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Imágenes de inmunofluorescencia de cultivos nasales de ALI para caracterizar el tropismo celular y la integridad epitelial. (A) Los cultivos nasales de ALI se infectaron con SARS-CoV-2, MERS-CoV o HCoV-NL63 en MOI = 5 y se fijaron en paraformaldehído al 4% a 96 hpi. Los cultivos se prepararon para la obtención de imágenes de inmunofluorescencia, como se describe anteriormente en la sección 6 del protocolo, utilizando anticuerpos primarios contra cada proteína de la nucleocápside del virus (que se muestra en rojo), el marcador de células ciliadas tipo IV β-tubulina (verde) o el marcador de células caliciformes MUC5AC (verde). Cabe destacar que se utilizó un anticuerpo contra la proteína no estructural 8 (nsp8) del MERS-CoV en lugar de un anticuerpo contra la proteína de la nucleocápside debido a la incompatibilidad de especies con el anticuerpo MUC5AC. La colocalización entre el antígeno viral y cada uno de los marcadores de células epiteliales se visualiza como color naranja/amarillo en las imágenes combinadas para cada virus. (B) Los cultivos nasales de ALI se tiñeron con faloidina (que tiñe los filamentos del citoesqueleto de actina) para visualizar la integridad del citoesqueleto, como se muestra en rosa. La tinción de Hoescht se muestra en azul. El panel 2B.1 muestra una tinción de faloidina nítida e intacta, lo que indica una arquitectura citoesquelética intacta, mientras que el panel 2B.2 muestra una pérdida de integridad epitelial y difuminación de la tinción de faloidina. Barras de escala = (A) 50 μm, (B) 10 μm. Abreviaturas: ALI = interfaz aire-líquido; MOI = multiplicidad de infecciones; HPI = horas después de la infección. Esta figura se construyó utilizando datos publicados en Otter et al. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Medición de la resistencia eléctrica transepitelial en cultivos de ALI durante la infección. (A) Los cultivos nasales de ALI derivados de 10 donantes se infectaron simuladamente o se infectaron en MOI = 5 con SARS-CoV-2, MERS-CoV o HCoV-NL63. Se calculó el ΔTEER para cada pocillo como TEER a 192 hpi menos TEER a 0 hpi (TEER basal). Cada barra ilustra el valor promedio de ΔTEER para cada virus entre cultivos por triplicado de cada donante. (B) Los cultivos nasales de ALI derivados de 8 donantes fueron infectados simuladamente o infectados con HCoV-229E en MOI = 5. El ΔTEER a partir del TEER basal se calculó como en (A) utilizando TEER a 96 hpi o 192 hpi. (C,D) Se muestran los datos de trazas de TEER para cultivos infectados simuladamente o infectados por HCoV derivados de cada uno de los cuatro donantes. Cada línea representa los datos de TEER de un solo transpocillo a lo largo del tiempo (se analizaron transpocillos por triplicado de cada donante). Los números de donantes están codificados por colores y se muestran en la clave a la derecha de cada gráfico. Los datos se muestran como media ± SD en el panel A y en el panel B. Abreviaturas: ALI = interfaz aire-líquido; MOI = multiplicidad de infecciones; HPI = horas después de la infección; TEER = resistencia eléctrica transepitelial. Esta figura se construyó a partir de los datos publicados en Otter et al.1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Cuantificación de la citotoxicidad durante la infección por HCoV en cultivos nasales de ALI. Los cultivos nasales derivados de 10 donantes infectados con cada HCoV por triplicado en MOI = 5 se sometieron a la cuantificación de LDH en muestras de ASL, como se describió anteriormente. La citotoxicidad promedio entre todos los donantes analizados se muestra para cada HCoV a 96 hpi y 192 hpi. Los datos se muestran como media ± DE. Abreviaturas: ALI = interfaz aire-líquido; MOI = multiplicidad de infecciones; HPI = horas después de la infección; TEER = resistencia eléctrica transepitelial; ASL = líquido de la superficie apical; LDH = lactato deshidrogenasa. Esta figura se construyó a partir de los datos publicados en Otter et al.1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Análisis de ARNm/proteínas tras infección de cultivos nasales. Se utilizaron cultivos nasales tratados con citocina tipo 2 IL-13 o tratados simulados para evaluar los cambios en la expresión de los receptores de HCoV, así como en los marcadores de células ciliadas y caliciformes. (A) La expresión de ARNm de DPP4 y ACE2 se cuantificó mediante RT-qPCR. Los datos de los cultivos de tres donantes tratados con IL-13 se muestran como cambios en el pliegue con respecto a los cultivos tratados de forma simulada derivados de los mismos donantes. Los datos se muestran como media ± DE, y cada punto representa la inducción media del cambio de pliegue para un solo donante. (B) La proteína total se recolectó de cultivos nasales que fueron tratados con IL-13 simulada e infectados con SARS-CoV-2. Las proteínas se separaron mediante SDS-PAGE e inmunotransferencia con anticuerpos contra marcadores de células epiteliales (β-tubulina tipo IV, MUC5AC), receptores HCoV (ACE2, DPP4), proteína de la nucleocápside del SARS-CoV-2 y GAPDH. Abreviaturas: RT-qPCR = reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa con transcripción inversa; SDS-PAGE = electroforesis en gel de poliacrilamida dodecilsulfato de sodio. Esta figura se construyó a partir de los datos publicados en Otter et al.1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Los métodos que se detallan aquí describen un sistema de cultivo epitelial primario en el que las células epiteliales nasales derivadas del paciente se cultivan en una interfaz aire-líquido y se aplican al estudio de las interacciones HCoV-huésped. Una vez diferenciados, estos cultivos nasales de ALI recapitulan muchas características del epitelio nasal in vivo , incluida una población celular heterogénea con células ciliadas, caliciformes y basales representadas, así como una función mucociliar intacta con una secreción de cilios y moco que late de forma robusta. Esta población celular heterogénea es un beneficio clave de este sistema de cultivo sobre las líneas celulares epiteliales respiratorias tradicionales, ya que permite la caracterización del tropismo de la célula huésped durante la infección viral (como se muestra en la Figura 2). Las líneas celulares epiteliales tradicionales de las vías respiratorias también carecen de mecanismos funcionales de eliminación mucociliar, que desempeñan un papel clave en la defensa primaria contra los virus respiratorios junto con las vías inmunitarias innatas, como la producción de interferón.

Los pasos críticos dentro del protocolo incluyen el procedimiento de infección inicial; Por ejemplo, los cultivos deben equilibrarse a la temperatura deseada antes de la infección, y se debe utilizar una metodología coherente para iniciar cada infección. Estos pasos son fundamentales para estandarizar el método y garantizar la reproducibilidad de los hallazgos posteriores.

Quizás la parte más importante de estos métodos es la cuantificación del virus liberado apicalmente, ya que comprender el ciclo de replicación único de cada HCoV ayuda a determinar los puntos de tiempo que podrían ser mejores para un análisis posterior. Las técnicas de inmunofluorescencia descritas anteriormente también son críticas, ya que la capacidad de visualizar infecciones virales en un epitelio nasal in vitro con una población celular heterogénea representativa permite una evaluación precisa del tropismo viral y proporciona la capacidad de consultar aún más las interacciones virus-huésped en un entorno fisiológico.

El epitelio nasal es el sitio de barrera primario que encuentran todos los virus respiratorios y, por lo tanto, es probable que las infecciones por HCoV comiencen con una infección primaria del epitelio nasal, con el potencial de propagarse a las vías respiratorias inferiores a través de un eje de aspiración oral-pulmonar. Es probable que esto desempeñe un papel en el desarrollo de neumonía grave y enfermedades respiratorias durante la infección patógena por HCoV (MERS-CoV, SARS-CoV-2), mientras que los HCoV estacionales tienden a causar enfermedad solo en las vías respiratorias superiores. Es fundamental comprender las interacciones entre el HCoV y el huésped en este importante sitio centinela inmunitario, y este sistema nasal de ALI permite la caracterización de la replicación viral, el tropismo de la célula huésped, así como la citotoxicidad y la inducción inmunitaria innata durante la infección por HCoV.

Este sistema de cultivo nasal de ALI también es altamente adaptable y se puede utilizar para reflejar muchos estados clínicos de la enfermedad. Las muestras nasales adquiridas de pacientes con enfermedades pulmonares genéticas, como la fibrosis quística (causada por un defecto en el canal de cloruro) o las discinesias ciliares primarias (en las que los mecanismos de latido ciliar son disfuncionales) se pueden utilizar para cultivar cultivos nasales de ALI representativos de estas patologías para comprender cómo estos pacientes pueden verse afectados de manera diferencial por la infección por HCoV31,32. Además, se pueden utilizar varios tratamientos con citoquinas durante la diferenciación de cultivos nasales de ALI para recrear características de otros estados de enfermedad. Por ejemplo, el tratamiento con IL-13 durante la diferenciación induce hiperplasia de células caliciformes y puede utilizarse como sustituto para el estudio de las vías respiratorias asmáticas o alérgicas33,34. Por lo tanto, este sistema ALI nasal es una herramienta poderosa para sondear las interacciones entre el huésped y el virus y el huésped, así como para otras interacciones virus-huésped, tanto en las vías respiratorias nasales sanas como en las enfermas.

Aunque este sistema ofrece muchas ventajas, también surgen algunas limitaciones con el uso de cultivos nasales de ALI. Aunque las células nasales requieren técnicas mucho menos invasivas para su adquisición que las células bronquiales o pulmonares, el cultivo y la diferenciación de cultivos de ALI requieren mucho más tiempo y recursos que el uso de líneas celulares inmortalizadas tradicionales. Además, la variabilidad de un donante a otro en términos de permisividad a la infección, así como las respuestas del huésped a la infección por HCoV, pueden dificultar la reproducción e interpretación de los datos (por eso a menudo se realizan experimentos con cultivos derivados de 5 a 10 donantes, con el fin de mitigar estos problemas).

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Disclosures

Susan Weiss forma parte de los Consejos Asesores Científicos de Ocugen. Noam A. Cohen es consultor de GSK, AstraZeneca, Novartis, Sanofi/Regeron y Oyster Point Pharmaceuticals y tiene una patente estadounidense, "Terapia y diagnóstico para infecciones respiratorias" (10.881.698 B2, WO20913112865), y un acuerdo de licencia con GeneOne Life Sciences.

Acknowledgments

Este estudio cuenta con las siguientes fuentes de financiamiento: Institutos Nacionales de Salud (NIH, por sus siglas en inglés) R01AI 169537 (S.R.W. y N.A.C.), NIH R01AI 140442 (S.R.W.), VA Merit Review CX001717 (N.A.C.), VA Merit Review BX005432 (S.R.W. y N.A.C.), Penn Center for Research on Coronaviruses and other Emerging Pathogens (S.R.W.), Laffey-McHugh Foundation (S.R.W. y N.A.C.), T32 AI055400 (CJO), T32 AI007324 (AF).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alexa Fluor secondary antibodies (488, 594, 647) Invitrogen Various
BSA (bovine serum albumin) Sigma-Aldrich A7906
cOmplete mini EDTA-free protease inhibitor Roche 11836170001
Cytotoxicity detection kit Roche 11644793001
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Media) Gibco 11965-084
DPBS (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline) Gibco 14190136
DPBS + calcium + magnesium Gibco 14040-117
Endohm-6G measurement chamber World Precision Instruments ENDOHM-6G
Epithelial cell adhesion marker (EpCAM; CD326) eBiosciences 14-9326-82
Epithelial Volt/Ohm (TEER) Meter (EVOM) World Precision Instruments 300523
FBS (Fetal Bovine Serum) HyClone SH30071.03
FV10-ASW software for imaging Olympus Version 4.02
HCoV-NL63 (Human coronavirus, NL63) BEI Resources NR-470
HCoV-NL63 nucleocapsid antibody Sino Biological 40641-V07E
Hoescht stain Thermo Fisher H3570
Laemmli sample buffer (4x) BIO-RAD 1610747
LLC-MK2 cells ATCC CCL-7 To titrate HCoV-NL63
MERS-CoV (Human coronavirus, Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus (MERS-CoV), EMC/2012) BEI Resources  NR-44260
MERS-CoV nucleocapsid antibody Sino Biological 40068-MM10
MUC5AC antibody Sigma-Aldrich AMAB91539
Olympus Fluoview confocal microscope Olympus FV1000
Phalloidin-iFluor 647 stain Abcam ab176759
PhosStop easy pack (phosphatase inhibitors)  Roche PHOSS-RO
Plate reader  Perkin Elmer HH34000000 Any plate reader or ELISA reader is sufficient; must be able to read absorbance at 492 nm
RIPA buffer (50 mM Tris pH 8; 150 mM NaCl; 0.5% deoxycholate; 0.1% SDS; 1% NP40) Thermo Fisher 89990 Can prep in-house or purchase
RNeasy Plus Kit Qiagen 74134
SARS-CoV-2 (SARS-Related Coronavirus 2, Isolate USA-WA1/2020) BEI Resources NR-52281
SARS-CoV-2 nucleocapsid antibody Genetex GTX135357
Triton-X 100 Fisher Scientific BP151100
Type IV β- tubulin antibody Abcam ab11315
VeroCCL81 cells ATCC CCL-81 To titrate MERS-CoV
VeroE6 cells ATCC CRL-1586 To titrate SARS-CoV-2

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References

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Infección Células Epiteliales Nasales Primarias Interfaz Aire-Líquido Coronavirus Humano Interacciones Huésped SARS-CoV MERS-CoV SARS-CoV-2 HCoV-NL63 HCoV-229E HCoV-OC43 HCoV-HKU1 Tracto Respiratorio Epitelio Nasal Muestras Nasales Derivadas del Paciente Interacciones Huésped-Patógeno Vía Aérea Función Ciliar Producción de Moco Replicación Viral Tropismo de la Célula Huésped Citotoxicidad Inducida por Virus Inducción Inmunitaria Innata Terapéutica Antiviral
Infección de células epiteliales nasales primarias cultivadas en una interfaz aire-líquido para caracterizar las interacciones entre el coronavirus y el huésped humano
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Otter, C. J., Fausto, A., Tan, L. H., Weiss, S. R., Cohen, N. A. Infection of Primary Nasal Epithelial Cells Grown at an Air-Liquid Interface to Characterize Human Coronavirus-Host Interactions. J. Vis. Exp. (199), e64868, doi:10.3791/64868 (2023).

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