Summary
نحن نستخدم أدوات معملية بسيطة لفحص بنية نظام الجذر (RSA) ل Arabidopsis و Medicago. تزرع النباتات في الماء فوق شبكة وتنتشر باستخدام فرشاة فنية للكشف عن RSA. يتم التقاط الصور باستخدام المسح الضوئي أو كاميرا عالية الدقة ، ثم يتم تحليلها باستخدام ImageJ لتعيين السمات.
Abstract
تعد المعرفة الشاملة بتطوير بنية نظام جذر النبات (RSA) أمرا بالغ الأهمية لتحسين كفاءة استخدام المغذيات وزيادة تحمل أصناف المحاصيل للتحديات البيئية. يتم تقديم بروتوكول تجريبي لإعداد نظام الزراعة المائية ، ونمو النباتات ، وانتشار RSA ، والتصوير. استخدم النهج نظاما مائيا قائما على صندوق أرجواني يحتوي على شبكة من مادة البولي بروبيلين مدعومة بأسافين من البولي كربونات. يتم توضيح الإعدادات التجريبية من خلال تقييم RSA للنباتات تحت إمدادات المغذيات المختلفة (الفوسفات [Pi]). تم إنشاء النظام لفحص RSA من Arabidopsis ، لكنه قابل للتكيف بسهولة لدراسة النباتات الأخرى مثل Medicago sativa (البرسيم). تستخدم نباتات Arabidopsis thaliana (Col-0) في هذا التحقيق كمثال لفهم نبات RSA. يتم تعقيم البذور السطحية عن طريق معالجة الإيثانول والتبييض التجاري المخفف ، ويتم الاحتفاظ بها عند 4 درجات مئوية للتقسيم الطبقي. تنبت البذور وتزرع على وسط سائل نصف MS على شبكة من مادة البولي بروبيلين مدعومة بأسافين من البولي كربونات. تزرع النباتات في ظل ظروف النمو القياسية لعدد الأيام المطلوبة ، ويتم انتقاؤها برفق من الشبكة ، وتغمرها في ألواح أجار تحتوي على الماء. ينتشر كل نظام جذر للنباتات برفق على الصفيحة المملوءة بالماء بمساعدة فرشاة فنية مستديرة. يتم تصوير لوحات بتري هذه أو مسحها ضوئيا بدقة عالية لتوثيق سمات RSA. يتم قياس سمات الجذر ، مثل الجذر الأساسي والجذور الجانبية ومنطقة التفرع ، باستخدام برنامج ImageJ المتاح مجانا. توفر هذه الدراسة تقنيات لقياس خصائص جذور النبات في البيئات البيئية الخاضعة للرقابة. نناقش كيفية (1) زراعة النباتات ، وجمع عينات الجذر ونشرها ، (2) الحصول على صور لعينات RSA المنتشرة ، (3) التقاط الصور ، و (4) استخدام برنامج تحليل الصور لتحديد سمات الجذر. ميزة الطريقة الحالية هي القياس متعدد الاستخدامات والسهل والفعال لسمات RSA.
Introduction
تعد بنية نظام الجذر (RSA) ، الموجودة تحت الأرض ، عضوا حيويا لنمو النبات وإنتاجيته1،2،3. بعد المرحلة الجنينية ، تخضع النباتات لأهم التغييرات المورفولوجية. تؤثر الطريقة التي تنمو بها الجذور في التربة بشكل كبير على نمو أجزاء النبات فوق سطح الأرض. نمو الجذر هو الخطوة الأولى في الإنبات. إنها سمة إعلامية لأنها تستجيب بشكل فريد للعناصر الغذائية المختلفة المتاحة1،2،3،4. يظهر RSA درجة عالية من اللدونة التنموية ، مما يعني أن البيئة تستخدم دائما لاتخاذ قرارات بشأن التطوير 2,5. وقد جعلت التغيرات في البيئة إنتاج المحاصيل أكثر صعوبة في السيناريو الحالي. على أساس مستمر ، يدمج RSA الإشارات البيئية في الخيارات التنموية5. نتيجة لذلك ، يعد الفهم الشامل للمبادئ الكامنة وراء تطور الجذور أمرا ضروريا لتعلم كيفية استجابة النباتات للبيئات المتغيرة 2,5.
يستشعر RSA تركيزات المغذيات المختلفة ويجعل التغيرات الظاهرية4،6،7،8،9،10،11،12. تشير الدراسات إلى أن مورفولوجيا الجذر / RSA شديدة اللدائن مقارنة بمورفولوجيا البراعم 1,3. يعد رسم خرائط سمات RSA فعالا للغاية في تسجيل تأثير تغيير بيئة التربة المحيطة1،11،12.
بشكل عام ، تم الإبلاغ عن تناقضات في تأثير نقص المغذيات المختلفة على النمط الظاهري للجذر في العديد من الدراسات السابقة3،11،13،14،15. على سبيل المثال ، هناك العديد من التقارير المتناقضة حول التغيرات الناجمة عن تجويع الفوسفات (Pi) في عدد وطول وكثافة الجذور الجانبية (LRs). تم الإبلاغ عن زيادة في كثافة LR في ظل حالة نقص Pi 6,8. في المقابل ، تم الإبلاغ أيضا عن انخفاض في كثافة LR في ظل ظروف نقص Pi من قبل مؤلفين آخرين3،13،16. أحد الأسباب البارزة لهذه التناقضات هو استخدام وسط التبلور المعرض للتلوث الأولي ، والذي يحتوي الآجار غالبا على10. عادة ما يزرع الباحثون نباتاتهم التجريبية على نظام صفيحة قائم على أجار ويسجلون سمات الجذر. غالبا ما يتم إخفاء العديد من سمات RSA أو ترسيخها داخل مادة الآجار ولا يمكن توثيقها. لا يمكن إجراء التجارب المرتبطة بإحداث نقص المغذيات ، والتي غالبا ما يستبعد فيها المستخدمون مكونا واحدا تماما من الوسط ، في وسط التبلور المعرض للتلوث الأولي11،14،15. توجد العديد من العناصر الغذائية بشكل متكرر بكميات كبيرة في وسائط الآجار ، بما في ذلك P و Zn و Fe وغيرها الكثير11،14،15. علاوة على ذلك ، يكون نمو RSA أبطأ في الوسائط القائمة على الأجار منه في الوسط السائل غير القائم على أجار. ونتيجة لذلك، هناك حاجة إلى وضع نهج بديل غير قائم على الآجار لتحديد النمط الظاهري ل RSA وتسجيله نوعيا. وبالتالي ، تم تطوير الطريقة الحالية ، حيث يتم تربية النباتات في نظام مائي قائم على صندوق أرجواني فوق شبكة من مادة البولي بروبيلين مدعومة بأسافين من البولي كربونات1،10،11.
تقدم هذه الدراسة نسخة مرتجلة مفصلة من الطريقة السابقة التي وصفها Jain et al.10. تم ضبط هذه الاستراتيجية للمتطلبات الحالية في بيولوجيا جذور النبات ويمكن استخدامها أيضا لنباتات مثل البرسيم ، بخلاف النباتات النموذجية. البروتوكول هو الطريقة الأساسية لقياس التغييرات في RSA ، ولا يتطلب سوى معدات بسيطة. يوضح هذا البروتوكول كيفية التنميط الظاهري للعديد من السمات الجذرية ، مثل الجذور الأولية والجانبية في الوسط العادي والمعدل (Pi ناقص). يتم توفير توجيهات خطوة بخطوة وتلميحات مفيدة أخرى مستقاة من تجارب المؤلف لمساعدة الباحثين على متابعة المنهجيات المقدمة في هذه الطريقة. تهدف الدراسة الحالية إلى توفير طريقة بسيطة وفعالة للكشف عن نظام الجذر الكامل للنباتات ، بما في ذلك LRs ذات الترتيب الأعلى. تتضمن هذه الطريقة نشر نظام الجذر يدويا باستخدام فرشاة فنية مستديرة بالألوان المائية ، مما يسمح بالتحكم الدقيق في تعرض الجذور1،10،11،12. لا يتطلب معدات باهظة الثمن أو برامج معقدة. وقد حسنت هذه الطريقة امتصاص المغذيات ومعدل النمو. تحتوي النباتات على محلول غني بالمغذيات تمتصه جذورها بسهولة. الطريقة الحالية مناسبة للباحثين الذين يرغبون في رسم خريطة لسمات نظام جذر النبات بالتفصيل ، خاصة أثناء التطور المبكر (10-15 يوما بعد الإنبات). إنها مناسبة لأنظمة الجذور الصغيرة ، والنباتات النموذجية مثل Arabidopsis والتبغ ، والنباتات غير التقليدية مثل البرسيم حتى يتناسب نظام الجذر الخاص بها مع الصناديق الأرجواني.
تم توضيح خطوات تحليل النمط الظاهري لتطوير RSA في Arabidopsis في هذا البروتوكول على النحو التالي: (1) طريقة تعقيم سطح البذور للنباتات (Arabidopsis) ، (2) خطوات إعداد نظام الزراعة المائية ، متبوعا ببذر البذور على وسط ، (3) إجراء لإخراج البذور الكاملة ونشرها على صفيحة بتري لتحليل RSA ، (4) كيفية تسجيل الصور ل RSA ، و (5) حساب معلمات RSA المهمة باستخدام برنامج ImageJ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم تلخيص البروتوكول بأكمله بشكل تخطيطي في الشكل 1 ، والذي يوضح جميع الخطوات الأساسية التي ينطوي عليها الكشف عن بنية نظام الجذر (RSA) للنباتات. فيما يلي خطوات البروتوكول بالتفصيل:
1. تعقيم سطح بذور أرابيدوبسيس
- انقل مغرفة صغيرة (حوالي 100 بذرة = حوالي 2.5 مجم) من البذور إلى أنبوب الميكروفوج ، وانقعه لمدة 30 دقيقة في الماء المقطر في درجة حرارة الغرفة (RT). يتم تنفيذ هذا الإجراء بأكمله في حالة العقيم.
- قم بطرد مركزي لفترة وجيزة أنبوب الميكروفوج الذي يحتوي على بذور عند 500 × جم لمدة 5 ثوان ، باستخدام أي جهاز طرد مركزي منضدية في RT للسماح للبذور بالاستقرار.
- صب الماء ، أضف 700 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 70٪ (v / v) ، دوامة لبضع ثوان ، وقم بالدوران. كرر الدوامة والغزل إذا لزم الأمر ، ولكن تأكد من بقاء وقت العلاج بنسبة 70٪ من الإيثانول عند 3 دقائق.
- بعد 3 دقائق ، شطف على الفور مرة واحدة بالماء المعقم. حافظ على خطوة غسل الإيثانول في الوقت المناسب قدر الإمكان ، لأن التعرض الطويل للإيثانول يقلل من الإنبات.
- عالج البذور بالمبيض التجاري المخفف (4٪ v / v) مع قطرة من Tween-20 لمدة 7 دقائق. امزج البذور بمحلول التبييض عن طريق قلب الأنابيب بسرعة 8-12 مرة ، متبوعا بجهاز طرد مركزي قصير (500 × جم لمدة 5 ثوان في RT). يظهر الزبد في الأنبوب.
- صب المادة الطافية باستخدام ماصة سعة 1 مل وشطف البذور بخمس غسلات على الأقل بالماء المعقم ، باتباع نفس إجراء الدوامة.
- اترك البذور المعقمة السطحية في الماء واحتضانها لمدة 2-3 أيام عند 4 درجات مئوية للتقسيم الطبقي10.
2. وضع نظام مائي لإنبات البذور
- نصف ملء مربع أرجواني قياسي بالماء المقطر والتعقيم به. الأوتوكلاف ورقة البولي (لون واضح وملمس ناعم) وقطع مستطيلات 4 سم × 8 سم ، مع نقطة منتصف محززة أكثر من منتصف الطريق من خلال المستطيل بحيث يمكن فتح مستطيلين معا لتشكيل شكل X10. استخدم هذا الإعداد لتثبيت شبكة البولي بروبلين (مربعات 6 سم × 6 سم بحجم مسام 250 ميكرومتر ، أو حسب المتطلبات) مقطوعة من صفائح 12 × 24 بوصة10.
ملاحظة: مادة البولي بروبيلين شديدة المقاومة للأحماض والقلويات والمواد الكيميائية الأخرى ؛ لذلك ، تم اختياره. يميل الأوتوكلاف إلى تشويه شبكة البولي بروبلين. وبالتالي ، يوصى بحملها بشكل منفصل ملفوفة بورق الألمنيوم. يوصى بظروف التعقيم النموذجية التي تبلغ 16 دقيقة أو 121 درجة مئوية أو 15 رطلا لكل بوصة مربعة أو 775 ملم زئبق. - أضف وسائط قاعدية معقمة نصف MS مع فيتامينات + 1.5٪ (وزن / حجم) سكروز ، كما وصفه Shukla et al.1 ، إلى كل صندوق للوصول إلى الحافة السفلية لشبكة البولي بروبلين في تدفق رقائقي. يتم تنفيذ جميع الإجراءات في ظل ظروف معقمة.
- زرع البذور المعقمة على السطح على الشبكة (حجم المسام 250 ميكرومتر) في الماء والسماح لها بالنمو لمدة 3 أيام.
- بعد 3 أيام ، قم بنقل الشتلات إلى شبكة (حجم المسام 500 ميكرومتر) واتركها تنمو لمدة 2 أيام.
- بعد يومين (إجمالي 5 أيام) ، انقل الشتلات إلى وسائط التحكم (أي وسائط المغذيات MS المعدلة 1 التي تحتوي على 2.0 mM NH 4 NO 3 ، 1.9 mM KNO3 ، 0.15 mM MgSO 4 · 7H 2O ،0.1 mM MnSO4 · H2O ، 3.0 ميكرومتر ZnSO 4 · 7H 2 O ، 0.1 ميكرومتر CuSO 4 · 5H 2 O ، 0.3 mM CaCl 2 · 2H 2 O ، 5.0 μM KI ، 0.1 ميكرومتر CoCl 2 · 6H 2 O ، 0.1 mM FeSO 4 · 7H 2 O ، 0.1 mMNa2 EDTA · 2H 2 O ، 1.25 mM KH2 PO 4 ، 100 μM H 3 BO3، 1 ميكرومتر Na 2 MoO4 · 2H2O ، 1.5٪ سكروز ، 1.25 مللي مول MES ، درجة الحموضة 5.7 معدلة مع 0.1 M MES [pH 6.1]) وإلى الوسائط التجريبية (على سبيل المثال ، P- [0 mM] المعالجة ؛ يتم استبدالKH 2 PO 4 ب 0.62 mMK 2SO4 من تكوين وسائط التحكم كما هو مذكور أعلاه1. بالنسبة لمعالجات Pi الزائدة ، يزداد تركيز KH 2 PO4 في وسط MS المعدل [2.5، 5.0 ، 10.0 ، 20.0 mM] 1) واترك البذور تنمو لمدة 7 أيام.
ملاحظة: يسهل حجم المسام الشبكية الأكبر (500 ميكرومتر) الانتقاء السلس للشتلات بأكملها دون أي ضرر أو الحاجة إلى القطع في hypocotyl. تنمو النباتات في ظل ظروف النمو القياسية (أي 16 ساعة ضوء / 8 ساعات فترة ضوئية داكنة ، 150 ميكرومول · م -2 · ثانية -1 شدة الضوء ، 60٪ - 70٪ رطوبة) عند 23 درجة مئوية.
3. فحص RSA
- تحضير ألواح أجار (1.1٪) لنشر الجذر (حجم لوحة بتري: 150 مم × 15 مم).
- أضف 10-20 مل من ماء الصنبور المصفى المعقم إلى لوحة بتري ، كما ذكر أعلاه. اسحب الشتلات برفق من الشبكة (500 ميكرومتر) واغمرها في الماء على الألواح.
- انشر جذر كل نبتة برفق في الطبق المملوء بالماء بمساعدة فرشاة فنية مستديرة بالألوان المائية (الأحجام: رقم 14 و 16 و 18 و 20).
ملاحظة: أثناء تنفيذ نشر نظام الجذر ، احصل أولا على الجذر الأساسي وانشره في خط مستقيم ، لأنه يعمل كمحور. بعد ذلك ، انشر LRs بشكل متماثل على كل جانب من الجذر الأساسي ، حيثما أمكن ذلك. بعد ذلك ، انشر LR من الدرجة الثانية المرتبط ب LR من الدرجة الأولى. عملية الانتشار هذه هي نوع من الفن. افعل ذلك بلطف ، ببطء ، مثل فنان يرسم صورة RSA. - قم بإمالة اللوحة قليلا لإزالة الماء.
ملاحظة: في هذه المرحلة ، يمكن إيقاف الإجراء مؤقتا عن طريق وضع ألواح الانتشار هذه عند 4 درجات مئوية. في وقت لاحق ، عندما تكون معالجة الصور مطلوبة ، أخرج اللوحات وضعها في RT لفترة من الوقت. امسح الماء المكثف ، ومن ثم يمكن معالجة الصورة بسهولة.
4. تسجيل الصور ل RSA
- امسح أو صور لوحات بتري هذه بشكل مناسب.
ملاحظة: للحصول على صور فوتوغرافية عالية الجودة، يوصى باستخدام دقة 600 نقطة في البوصة للمسح الضوئي، ويوصى باستخدام كاميرا بدقة 12 ميجابكسل على الأقل للتصوير الفوتوغرافي. - قم بقياس سمات بنية نظام الجذر باستخدام برنامج ImageJ المتاح مجانا (https://imagej.nih.gov/ij/index.html). لاتباع الخطوات بسرعة لقياس طول الجذر باستخدام برنامج ImageJ ، يرجى الرجوع إلى مثال "قياس طول محيط الحمض النووي"17.
ملاحظة: يتم اتباع هذه الخطوات لقياس أطوال الجذر على الصور الملتقطة باستخدام ماسح ضوئي أو كاميرا عالية الدقة.- استخدم مسافة طول معينة لضبط المقياس. المسافة المعروفة لشريط المقياس في الشكل 3 هي 2 سم. حدد أداة الخط المستقيم من شريط أدوات ImageJ (الأداة الخامسة من اليسار). استخدم أداة الخط المستقيم لإنشاء تحديد خط يحدد شريط المقياس. قم بإنهاء المخطط التفصيلي بالنقر بزر الماوس الأيمن أو النقر المزدوج أو النقر في المربع الموجود في البداية.
- قم بقياس طول شريط المقياس المعروف بالبكسل باستخدام شريط أدوات التحليل > القياس . قم بتدوين طول البكسل.
- افتح مربع الحوار تعيين مقياس بالنقر فوق علامة التبويب تعيين مقياس في علامة التبويب تحليل. في حقل المسافة بالبكسل، أدخل طول البكسل (كما هو مذكور أعلاه). بعد ذلك ، في حقل المسافة المعروفة ، أدخل القيمة ، كما هو موضح بشريط المقياس (هنا ، 20 مم). اضبط وحدة الطول على أنها مم. نسبة البكسل إلى الارتفاع هي 1.0. الآن ، يتم تحديد المقياس بعدد x من البكسل لكل ملليمتر. لقفل المقياس لهذه الصورة بالذات ، انقر فوق موافق.
- قم بإنشاء تحديد خط يحدد طول الجذر باستخدام أداة الخط المجزأ . قم بإنهاء المخطط التفصيلي بالنقر بزر الماوس الأيمن أو النقر المزدوج أو النقر في المربع الموجود في البداية. انقر واسحب "المقابض" الصغيرة بالأبيض والأسود على طول المخطط التفصيلي لضبط تحديد الخط حسب الحاجة.
- استخدم أمر القياس تحت صفحة التحليل في ImageJ لتحديد طول الجذر. لنقل البيانات المقاسة إلى جدول بيانات ، انقر بزر الماوس الأيمن فوق نافذة النتائج ، وحدد نسخ الكل من القائمة المنبثقة ، وقم بالتبديل إلى جدول البيانات ، ثم الصق البيانات.
ملاحظة: كما هو موضح أعلاه، قم بتعيين المقياس باستخدام المسافة المعروفة لشريط المقياس في خيار مقياس تعيين ImageJ. هذا يعطي عدد وحدات البكسل لكل وحدة طول. مطلوب ضبط المقياس حديثا في كل مرة ، كلما تم تحليل صورة جديدة.
- قياس وحساب سمات RSA
- قم بقياس طول الجذر الأساسي بين تقاطع hypocotyl إلى نهاية طرف الجذر.
- قم بقياس طول LR من الدرجة الأولى والثانية.
- قياس منطقة التفرع (BZ) للجذر الأساسي. تمتد المنطقة المتفرعة للجذر الأساسي (BZPR) من أول نقطة ناشئة LR إلى آخر نقطة ناشئة LR.
- سجل عدد LRs ، وهو عدد LRs الناشئة داخل حدود BZPR.
- قم بقياس متوسط طول LR من الدرجة الأولى والعليا. اشتق متوسط طول LR من الدرجة الأولى (1 ° LR) (سنتيمتر لكل جذر) بقسمة الطول الإجمالي ل 1 ° LR على العدد الإجمالي ل 1 ° LRs.
- قم بقياس متوسط طول LR من الدرجة الثانية. احسب متوسط طول LR من الدرجة الثانية (2 ° LR) بقسمة الطول الإجمالي ل 2 ° LR على إجمالي عدد 2 ° LRs.
- قم بقياس كثافة 1 درجة LR. احسب كثافة 1 ° LR (عدد 1 ° LRs لكل وحدة طول BZPR) بقسمة عدد 1 ° LRs على طول BZPR.
- قم بقياس كثافة 2 درجة LR. احسب كثافة 2 ° LR بقسمة عدد 2 ° LRs على طول BZ من 1 ° LRs (عدد 2 ° LRs لكل وحدة طول BZ من 1 ° الجذور الجانبية).
- قياس إجمالي طول الجذر (TRL). هذا هو إجمالي أطوال الجذر الأساسي ، 1 ° LR ، و 2 ° LR (وأكثر إن وجدت).
5. قياس الشعر الجذري
ملاحظة: على الرغم من أن نظام الزراعة المائية ليس جيدا في تعزيز نمو شعر الجذور وتطوره ، على الرغم من كونه قويا كما هو الحال في وسائط النمو الصلبة ، إلا أنه لا يزال من المهم دراسته في السياق الحالي. اتبع الخطوات أدناه لتحليل نمو شعر الجذر في قسم 5 مم من طرف الجذر الأساسي للشتلات.
- اقطع قسما طوله 2 سم من الجذر الأساسي من طرف الجذر.
- قم بتركيب قسم الجذر على شريحة باستخدام 10٪ من الجلسرين كوسيط تركيب.
- ضع الشريحة تحت مجهر ستيريو.
- استخدم الناقل المحوري لتصور والتقاط صور لشعيرات الجذر.
- قم بتحليل الصور لدراسة بنية وخصائص الشعيرات الجذرية باستخدام برنامج ImageJ كما هو موضح سابقا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يتم قياس السمات المورفومترية المختلفة لبنية نظام الجذر (RSA) باستخدام أدوات معملية بسيطة ، ويتم تصوير الخطوات بشكل تخطيطي في الشكل 1. توضح تفاصيل الإعداد المائي إمكانات البروتوكول في قياس RSA (الشكل 1 والشكل 2).
بالنظر إلى الاختلافات الملحوظة في عوامل التبلور ، استخدمنا نظام زراعة مائي لإجراء جميع الدراسات3،10. كدليل على المفهوم ، يعمل هذا النظام المائي بشكل جيد ، مما يعكس النمط الظاهري المتناقض الواضح في ظل ظروف Pi الناقصة والكافية (الشكل 3). تمت زراعة بذور Arabidopsis في الماء لمدة 5 أيام في وسط نصف MS على شبكة البولي بروبلين ، كما هو موضح في الشكل 2. تم زرع النباتات بعد 5 أيام في ظروف Pi ناقصة وكافية ، وسمح لها بالنمو لمدة 7 أيام (الشكل 3).
عرض توضيحي لسمات RSA تحت إمدادات المغذيات المتنوعة (Pi)
لقد اتبعنا مخططا راسخا لتحليل وتسجيل سمات RSA3. تم تحليل سمات RSA المختلفة في ظل أنظمة Pi المتناقضة في ظروف الزراعة المائية (الشكل 3). استدعت المعالجة الناقصة Pi (0 mM Pi) نمطا ظاهريا للجذر تم الإبلاغ عنه عادة يظهر RSA أقصر وأقل عمقا وأقل تشعبا مقارنة بحالة Pi الكافية (الشكل 3A). تم تخفيف طول الجذر الأساسي بشكل كبير في ظل حالة نقص Pi (الشكل 3A ، B). يظهر طول الجذر الأساسي ، المكتسب بسرعة في وجود Pi (1.25 mM) ، كفاءة النظام المائي الذي يعكس التغيرات الفيزيائية المورفولوجية بشكل كاف (الشكل 3A ، B). انخفض TRL بشكل ملحوظ في ظل حالة نقص Pi (الشكل 3B). تم تخفيف منطقة التفرع (BZPR) ، كما هو موضح في الشكل 3A ، بشكل كبير في ظل حالة نقص Pi (الشكل 3B).
من بين هذه السمات ، كان TRL هو الأكثر تضررا ، بسبب الاختلاف الكبير في رقم LR بين شرطي Pi. كان النمو القوي ل RSA في ظل حالة Pi الكافية (1.25 mM) بسبب الزيادة الكبيرة في عدد وطول 1 ° LRs. وبالتالي ، حدث تغيير سريع في RSA ، ويرجع ذلك أساسا إلى التغيير في تطوير LR. قمنا بقياس عدد LRs الناشئة داخل حدود المنطقة المتفرعة للجذر الأساسي ، لأنها تعتبر أكثر أهمية1،3،18. انخفض متوسط طول 1 ° LR (سنتيمتر لكل جذر) بشكل كبير في حالة نقص Pi (الشكل 3C). وبالمثل ، انخفض متوسط طول 2 ° LR ، بسبب حالة P0 ؛ ومع ذلك ، كان أقل في الكمية من متوسط طول 1 درجة LR (الشكل 3C). انخفض عدد 1 ° LRs و 2 ° LRs بشكل كبير في ظل حالة P0 مقارنة بحالة P1.25 (الشكل 3D). لم يتم تغيير كثافة 1 ° LR (عدد 1 ° LRs لكل سنتيمتر من طول BZPR ) تحت شرط P0 بالنسبة لشرط P1.25 (الشكل 3E). كما لم تظهر كثافة 2 ° LR (عدد 2 ° LRs لكل سنتيمتر من BZ من 1 ° LRs) أي تغيير كبير (الشكل 3E). نتيجة لذلك ، يعد تحديد كثافة LRs أمرا ضروريا لاكتساب نظرة ثاقبة مفيدة حول مرونة RSA.
تحليل نمو الشعر الجذري في ظل أنظمة الفوسفات المختلفة (Pi)
تمت دراسة تأثير إمداد Pi على نمو شعر الجذر في الجذر الأساسي للشتلات. وجد أن طول الشعر الجذري زاد مع زيادة تركيزات Pi حتى 2.5 mM ، لكنه انخفض عند 5 mM و 10 mM. ومع ذلك ، عند 20 مللي مول ، عاد طول شعر الجذر إلى مستويات قريبة من الذروة (الشكل التكميلي 1). كان عدد الشعيرات الجذرية أعلى بكثير عند 0 mM مقارنة بجميع إمدادات Pi الأخرى ، مع ملاحظة أعلى عدد عند 20 mM (الشكل التكميلي 1).
تطبيق الطريقة الحالية على نباتات أخرى غير أرابيدوبسيس
لقد درسنا جدوى الطريقة الحالية على نباتات أخرى غير أرابيدوبسيس ، مع أخذ Medicago sativa (البرسيم) كمصنع اختبار. تم تعديل البروتوكول وفقا لمتطلبات جانبين: (1) طريقة تعقيم سطح البذور ، و (2) حجم مسام شبكة البولي بروبلين (الآن أكبر ، 1000 ميكرومتر). يجب دائما تحسين بروتوكول تعقيم البذور السطحية والتقسيم الطبقي اعتمادا على النباتات المختارة للدراسة. بالنسبة للبرسيم ، اتبعت الخطوات كما وصفها ويكس وآخرون 19. بعد تعقيم السطح ، تم تحضين البذور عند 4 درجات مئوية لمدة 7 أيام للتقسيم الطبقي. بعد ذلك ، اتبعنا نفس الإجراء الموضح في هذا البروتوكول مع تعديل حجم المسام الشبكية. كما هو موضح في الشكل 4A ، B ، كانت النباتات جيدة النمو ، مع تغيير RSA تحت إمدادات مختلفة من Pi. يعرض الشكل 4C مرونة نظام الجذر تحت 1.25 و 0 و 20 mM من محلول المغذيات Pi. أدى Pi الزائد (20 mM) ونقص إمداد Pi إلى تقليل تطور نظام الجذر ، مقارنة بحالة Pi الكافية (1.25 mM) (التحكم) (الشكل 4C). يمكن تعيين RSA لسمات مختلفة باستخدام برنامج ImageJ الموضح في البروتوكول. وبالتالي ، فإن البروتوكول بسيط وفعال ويمكن تعديله بسهولة وفقا لأنواع النباتات المختارة. يوفر الفرصة لدراسة RSA لأنواع نباتية متنوعة في ظل ظروف مغذية مختلفة.
الشكل 1: رسم تخطيطي للإجراء. يوضح الرسم التخطيطي الخطوات الرئيسية التي ينطوي عليها بروتوكول الطريقة لرسم خرائط RSA. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: عرض الإعداد المائي في صناديق أرجوانية لزراعة النباتات . (كما وصفه Jain et al.10 ، مع التعديلات). (أ) قطعتان مستطيلتان (4 سم × 8 سم) مع شقوق من أسافين البولي كربونات لتجميع الإعداد. (ب) تجميع أسافين البولي كربونات بعضها ببعض من خلال الشق الذي يتحول إلى شكل X لدعم سطح الشبكة. (ج) لوح شبكي من مادة البولي بروبيلين 250 ميكرومتر (6 سم × 6 سم). (د) منظر علوي لتجميع أسافين البولي كربونات في الصندوق الأرجواني. (ه) تجميع شبكة البولي بروبلين على أسافين البولي كربونات في صندوق أرجواني مملوء بالوسائط. (و) عرض لنباتات أرابيدوبسيس نبتت على الشبكة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: عرض توضيحي لتعديل RSA النموذجي في ظل ظروف مغذية مختلفة (نقص Pi [0 mM] وكاف [1.25 mM]) باستخدام طريقة التنميط الظاهري هذه. تزرع شتلات Arabidopsis (Col-0) في الماء في وسائط 0.5x MS لمدة 5 أيام ، وبعد ذلك تتعرض لنقص Pi وإمدادات كافية (0 و 1.25 mM ، على التوالي) وتزرع لمدة 7 أيام ، كما هو موضح في الشكل 2. (أ) يتم سحب النباتات الفردية من شبكة البولي بروبلين (500 ميكرومتر) وتنتشر على ألواح أجار بتري بمساعدة فرشاة فنية مستديرة وماء. يتم عرض بيانات سمات RSA لطول الجذر الأساسي (B) ، وطول الجذر الكلي (TRL) ، ومنطقة التفرع (BZ) ، (C) متوسط (Av.) طول الجذر الجانبي من الدرجة الأولى (طول 1 درجة LR) ، متوسط (Av.) طول الجذر الجانبي من الدرجة الثانية (2 ° LR طول) ، (D) عدد 1 ° LR و 2 ° LR ، و (E) 1 ° LR و 2 ° LR الكثافة. القيم هي وسائل ± SE. ن = 21. تم تعديل هذا الرقم من شوكلا وآخرين 1. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: عرض توضيحي لنظام جذر Medicago sativa (البرسيم) كمثال لإظهار إمكانية تطبيق هذه الطريقة على نباتات أخرى إلى جانب نبات العربيدوبسيس. (أ) منظر جانبي لصندوق أرجواني يوضح نمو نباتات البرسيم. (B) يوضح المنظر العلوي للصندوق الأرجواني ظهور الساق على شبكة البولي بروبلين (حجم المسام 1000 ميكرومتر). (C) بنية نظام الجذر النموذجية (RSA) لتعديل البرسيم في ظل ظروف مغذية مختلفة (نقص Pi [0 mM] ، Pi الزائد [20 mM] ، وكافية أو تحكم [1.25 mM]) باستخدام طريقة التنميط الظاهري RSA هذه. تزرع شتلات البرسيم في الماء في وسائط 0.5x MS لمدة 5 أيام ، وتتعرض لنقص Pi وإمدادات كافية وزائدة (0 و 1.25 و 20 mM على التوالي) ، وتزرع لمدة 7 أيام. يتم سحب النباتات الفردية من شبكة البولي بروبلين (1000 ميكرومتر) وتنتشر على ألواح أجار بتري ، كما هو موضح في C ، بمساعدة فرشاة فنية وماء. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل التكميلي 1: تركيزات Pi الزائدة المختلفة تعدل نمو شعر الجذر. نمت شتلات WT في الماء ، كما هو موضح في البروتوكول. (أ) تم تقطيع مقطع طوله 1-2 سم من طرف الجذر الأساسي وتركيبه على شريحة تحتوي على 10٪ من الجلسرين ، وتم توثيق منطقة 5 مم من الطرف لعدد شعرة الجذر وطولها. تم تقديم البيانات ل (ب) طول الشعيرات الجذرية و (ج) عدد الشعيرات الجذرية في منطقة 5 مم من قمة الجذر الأولية. القيم هي وسائل ± SE. ن = 10 (ب وج). تختلف الأشرطة ذات أحرف ألفا المختلفة اختلافا كبيرا (p ≤ 0.05) وفقا لاختبار t المقترن للطالب. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
أظهر هذا العمل رسم خرائط RSA باستخدام معدات معملية بسيطة. باستخدام هذه الطريقة ، يتم تسجيل التغيرات المظهرية على المستوى المكرر. تتمثل فائدة هذه الإستراتيجية في أن جزء الساق لا يتلامس أبدا مع الوسائط ، لذا فإن النمط الظاهري للنباتات أصلي. تتضمن هذه الطريقة إنشاء نظام مائي لزراعة النباتات كما هو موضح في البروتوكول. بعد ذلك ، يتم إخراج كل نبتة سليمة ووضعها على طبق بتري مملوء بالآجار. ثم يسمح لنظام الجذر بالانتشار يدويا باستخدام فرشاة فنية ، ويتم التقاط الصور لتحليلها باستخدام برنامج ImageJ1،10،11،12.
يتطلب إنبات البذور تعقيم سطح البذور لإزالة البكتيريا والفطريات والفيروسات. يستخدم الكحول - 70 ٪ من الإيثانول - لتعقيم أسطح البذور. لتطهير البذور دون تدميرها ، يجب اتباع وقت علاج تعقيم الكحول بعناية. ينخفض إنبات البذور عندما يكون تعقيم الكحول مبالغا فيه. تختلف مواعيد العلاج باختلاف أنواع النباتات (على سبيل المثال ، بالنسبة لأرابيدوبسيس ، الحد الزمني هو 3 دقائق1،10،11،12،20 فقط ، بينما بالنسبة ل Medicago sativa ، فهو 5 دقائقو 19. من أجل تسهيل الانتقاء السلس ل RSA للتحليل ، من المهم الحد من عدد البذور لكل شبكة أو صندوق أرجواني ، لمنع تشابك نظام الجذر فيما بينه1،10،11،12. يمكن تحقيق ذلك باستخدام عدد أقل من البذور لكل شبكة. على سبيل المثال ، يمكن أن يساعد استخدام أربع بذور لكل شبكة في تقليل مخاطر التشابك مع السماح بنمو وتطور قوي لأنظمة الجذر. من المهم ملاحظة أن العدد الأمثل للبذور لكل شبكة يعتمد على الأنواع النباتية المحددة وأهداف تحليل RSA. على سبيل المثال ، إذا كانت التجربة تتطلب أنسجة لمزيد من متطلبات المعالجة النهائية مثل عزل الحمض النووي الريبي ، في هذه الحالة ، يوصى بالبذر السائب (100 بذرة لكل شبكة في حالة Arabidopsis) 1،10،11،12. يعد قطف النباتات من الشبكة عملية دقيقة تتطلب أقصى قدر من العناية والاهتمام1،10،11. من المهم التعامل مع هذه المهمة ببطء ورفق وحذر لتجنب إتلاف النباتات الحساسة. لاختيار النباتات من الشبكة ، يوصى باستخدام ملاقط أو ملقط ناعم للإمساك بالنباتات بلطف ولكن بثبات. يجب رفع النباتات بعناية من الشبكة لتجنب إزعاج أنظمة الجذر أو التسبب في أي ضرر للنباتات. من الضروري التحلي بالصبر وأخذ الوقت الكافي لإزالة كل نبتة بعناية من الشبكة لضمان عدم تلفها أثناء العملية. إنها عملية تدريجية يجب تنفيذها ببطء ورفق وبعناية لضمان نجاح التجربة. من أجل قياس RSA للنباتات بدقة ، من الأهمية بمكان وضع علامة على مقياس على لوحة بتري للسماح بالقياس الدقيق1،10،11. يمكن القيام بذلك باستخدام علامة دائمة لرسم خط على لوحة بتري على مسافة معروفة ، مثل 1 سم أو 2 سم. يجب وضع المقياس على طول حافة لوحة بتري في مكان مرئي. باستخدام فرشاة ، من الضروري أيضا توخي أقصى درجات الحذر عند نشر RSA. يجب وضع الجذر الأساسي بعناية في وسط صفيحة بتري ، ويجب أن تنتشر الجذور الجانبية على جانبي الجذر الأساسي. يجب غمر نظام الجذر جزئيا في الماء لتسهيل الانتشار. لقياس كل لوحة بتري جديدة ، يجب على المرء ضبط المقياس في برنامج ImageJ في كل مرة.
يمكن استخدام بعض التعديلات لتحسين كفاءة تحليل RSA وعدم التدخل الجراحي وفعاليته1. أحد هذه التحسينات هو تغيير حجم مسام شبكة البولي بروبلين المستخدمة لعقد النباتات. يمكن تعديل حجم مسام الشبكة لتناسب الاحتياجات المحددة للأنواع النباتية قيد الدراسة ولتحسين نمو وتطور أنظمة الجذر1،10،11،12. على سبيل المثال ، يسهل حجم المسام الشبكية الأكبر (500 ميكرومتر) الانتقاء السلس للشتلات بأكملها دون قطع hypocotyl ، والذي كان يمارس سابقا10،11،12. علاوة على ذلك ، قد يكون حجم المسام الأكبر أكثر ملاءمة للأنواع النباتية الأكبر RSA ، في حين أن حجم المسام الأصغر قد يكون أكثر ملاءمة للأنواع النباتية الأصغر. تعديل آخر يمكن إجراؤه هو لف شبكة البولي بروبلين بورق الألمنيوم لمنعها من الانحناء. يمكن أن يساعد ذلك في الحفاظ على شكل وسلامة الشبكة ، مما يجعلها مناسبة لتكون بمثابة مصفوفة أرضية مسطحة. بالإضافة إلى هذه التعديلات ، يمكن استخدام تقنيات استكشاف الأخطاء وإصلاحها الأخرى لمعالجة أي مشكلات قد تنشأ أثناء تحليل RSA. على سبيل المثال ، إذا كانت النباتات لا تنمو أو تتطور كما هو متوقع ، فقد يكون من الضروري ضبط الظروف البيئية ، مثل درجة الحرارة والرطوبة ومستويات الضوء. إذا كانت أنظمة الجذر متشابكة ، فقد يكون من الضروري تقليل عدد البذور لكل شبكة ، كما ذكر أعلاه.
تتمثل إحدى المزايا الرئيسية لتحليل RSA في أنه يسمح بدراسة أنظمة جذر النبات دون الحاجة إلى أجار. يشيع استخدام أجار كعامل تصلب في زراعة الأنسجة النباتية وتجارب إنبات البذور. ومع ذلك ، فإن استخدام أجار يمكن أن يؤدي إلى تلوث عنصري يمكن أن يولد قطعا أثرية ويؤثر على دقة النتائج10. من خلال استبعاد متطلبات الأجار ، يزيل تحليل RSA خطر تلوث العناصر المشتقة من الأجار وإمكانية القطع الأثرية. هذا يجعل تحليل RSA طريقة أكثر موثوقية ودقة لدراسة أنظمة جذر النبات1،3،10،11،12. على سبيل المثال ، كانت آثار الحرمان من Pi على كثافة الجذر الجانبية موضوع عدد من التقارير المتناقضة. تم الإبلاغ عن أن كثافة LR تزداد عندما يكون Pi منخفضا 6,8. في المقابل ، تم العثور أيضا على انخفاض في كثافة الجذر الجانبي في ظروف نقص Pi3،13،16. قد تعزى هذه التناقضات إلى نظام وسائط النمو القائم على أجار ، حيث يستخدم العمال علامات تجارية مختلفة من أجار لتهجين الوسائط بدرجات متفاوتة من تلوث Pi10. مرة أخرى ، قد لا يتم إجراء التجارب التي تسعى إلى توضيح تأثير نقص الزنك على RSA بشكل كاف باستخدام طريقة صفيحة بتري القائمة على الأجار ، لأن وسط التبلور القائم على الأجار يشمل أيضا تلوث الزنك11. لذلك ، قد لا يكون إجراء تحليل RSA مناسبا للتحقيق في نقص المغذيات باستخدام وسط التبلور القائم على أجار. ثانيا ، لا تتطور النباتات المزروعة على وسائط التبلور القائمة على أجار بالسرعة التي تنمو بها تلك المزروعة في الماء. ثالثا ، نظرا لأن RSA مضمن عادة في وسيط أجار ، لا يتم عرض العديد من ميزات الجذر بشكل صحيح. رابعا ، غالبا ما تتسبب إزالة RSA من الوسط في حدوث أضرار جسيمة ل RSA وتجعلها تقنية مدمرة لأخذ العينات.
استخدمت تقنية الزراعة المائية السابقة ، كما نشرها Jain et al.10 ، شبكة البولي بروبلين بحجم 250 ميكرومتر ، والتي كانت تحتوي على مسام أضيق لا تمكن من سحب RSA السليم. نتيجة لذلك ، في هذه الحالة بالذات ، اضطررنا إلى قطع النباتات من منطقة hypocotyl لفصل RSA ، وتحويلها إلى طريقة أخذ عينات مدمرة10،11،12. الطريقة الحالية مرتجلة لتحويلها إلى غير مدمرة باستخدام شبكة بولي بروبيلين ذات حجم مسام أكبر (500 ميكرومتر) تسمح بسحب نباتات أرابيدوبسيس بأكملها سليمة دون إلحاق أي ضرر ب RSA1. تجدر الإشارة إلى أنه يمكننا دائما ضبط حجم مسام شبكة البولي بروبلين ، اعتمادا على نوع النبات. على سبيل المثال ، يوضح الشكل 4 كيف يمكن استخدام نهج مماثل لرسم خريطة RSA لنباتات مختلفة ، مثل Medicago sativa (البرسيم). لقد اخترنا حجم مسام البولي بروبلين البالغ 1 مم لاستيعاب نظام جذر Medicago.
قد يكون أحد عيوب هذا النظام هو تطور الشعيرات الجذرية ، والتي غالبا لا تزدهر في ظل أنظمة الزراعة المائية مقارنة بأنظمة ألواح الآجار. السبب الرئيسي هو سهولة توافر العناصر الغذائية في الوسائط السائلة بدلا من الوسائط الصلبة. على الرغم من أننا لاحظنا تطور الشعيرات الجذرية (غير القوية) باستخدام نفس النظام وحصلنا على النتائج (الشكل التكميلي 1). يؤثر توفر Pi بشدة على نمو شعر الجذر10,11. هنا ، زاد طول شعر الجذر في البداية حتى 2.5 مللي متر ، ثم انخفض.
إجمالا ، المزايا الرئيسية للنظام هي: (1) إنها طريقة بسيطة ودقيقة لا تتطلب أي معدات متطورة متطورة ؛ (2) تسمح الطريقة بالنمو السريع للنباتات بسبب طبيعتها المائية ؛ (3) إنها طريقة غير مدمرة ؛ (4) يسمح النشر اليدوي ل RSA بالعرض المناسب لكل سمة ، ويكشف عن RSA المخفي ، مما يوفر التحكم الكامل للمستخدم ؛ و (5) تستخدم الطريقة برنامج تصوير متاح مجانا (أي ImageJ) ، وهو أيضا سهل الاستخدام.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.
Acknowledgments
نحن نقدر وزارة الزراعة الأمريكية (المنحة 58-6406-1-017) لدعم هذا البحث. كما نعرب عن تقديرنا لمركز التكنولوجيا الحيوية WKU ، جامعة ويسترن كنتاكي ، بولينغ غرين ، كنتاكي ، الولايات المتحدة الأمريكية ، ومدير المعهد المركزي للنباتات الطبية والعطرية CSIR ، لكناو ، الهند ، لتوفير مرافق الأدوات والدعم (اتصال مخطوطة CSIR CIMAP رقم CIMAP / PUB / 2022/103). تقر SS بالدعم المالي من جامعة سانت جوزيف ، فيلادلفيا ، الولايات المتحدة الأمريكية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Arabidospsis thaliana (Col 0) | Lehle Seeds | WT-02 | Columbia (Col-0**, no markers)* |
| Art brushes | Amazon or any other vendor | Water color round brush size no. 14 (8 mm), 16 (9.5 mm), 18 (12 mm), and 20 (14.2 mm) | |
| Automated Microscope with digital camera | Leica Microsystems | LAS version 4.12.0, Leica Microsystems | |
| Imaging Software | ImageJ | ImageJ V 1.8.0 |
|
| Magenta box GA-7 | Fisher Scientific | 50-255-176 | |
| Medicago sativa | Johnny's Seeds | ||
| Petri-plate (150 mm x 15 mm) | USA Scientific | 8609-0215 | 150 mm x 15 mm PS Petri Dish (https://www.usascientific.com) |
| Photo camera | Cannon or Nikon | Any high mega pixel (atleast 12 mega pixel per inch) camera on macro mode | |
| Plant-Agar | Sigma-Aldrich | A3301 | Agargel Suitable for plant tissue culture |
| Polycarbonate Sheets | Amazon | 1 mm thick | |
| Polypropylene Mesh | Amazon | Pore size 250 µm, 500 µm and 1000 µm | |
| Scanner | Epson | Epson Perfection V700 Photo (Scan at 600 dpi) |
References
- Shukla, D., Rinehart, C. A., Sahi, S. V. Comprehensive study of excess phosphate response reveals ethylene mediated signaling that negatively regulates plant growth and development. Scientific Reports. 7 (1), 3074 (2017).
- Rellán-Álvarez, R., Lobet, G., Dinneny, J. R. Environmental control of root system biology. Annual Review of Plant Biology. 67, 619-642 (2016).
- Gruber, B. D., Giehl, R. F. H., Friedel, S., von Wirén, N. Plasticity of the Arabidopsis root system under nutrient deficiencies. Plant Physiology. 163 (1), 161-179 (2013).
- Shukla, D., et al. Genome-wide expression analysis reveals contrasting regulation of phosphate starvation response (PSR) in root and shoot of Arabidopsis and its association with biotic stress. Environmental and Experimental Botany. , 188 (2021).
- Robbins 2nd,, E, N., Dinneny, J. R. Growth is required for perception of water availability to pattern root branches in plants. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (4), E822-E831 (2018).
- Linkohr, B. I., Williamson, L. C., Fitter, A. H., Leyser, H. M. O. Nitrate and phosphate availability and distribution have different effects on root system architecture of Arabidopsis. The Plant Journal. 29 (6), 751-760 (2002).
- Lynch, J. P., Brown, K. M. Topsoil foraging: an architectural adaptation of plants to low phosphorus availability. Plant and Soil. 237 (2), 225-237 (2001).
- López-Bucio, J., et al. Phosphate availability alters architecture and causes changes in hormone sensitivity in the Arabidopsis root system. Plant Physiology. 129 (1), 244-256 (2002).
- Jain, A., et al. Differential effects of sucrose and auxin on localized phosphate deficiency-induced modulation of different traits of root system architecture in Arabidopsis. Plant Physiology. 144 (1), 232-247 (2007).
- Jain, A., et al. Variations in the composition of gelling agents affect morphophysiological and molecular responses to deficiencies of phosphate and other nutrients. Plant Physiology. 150 (2), 1033-1049 (2009).
- Jain, A., Sinilal, B., Dhandapani, G., Meagher, R. B., Sahi, S. V. Effects of deficiency and excess of zinc on morphophysiological traits and spatiotemporal regulation of zinc-responsive genes reveal incidence of cross talk between micro- and macronutrients. Environmental Science and Technology. 47 (10), 5327-5335 (2013).
- Jain, A., et al. Role of Fe-responsive genes in bioreduction and transport of ionic gold to roots of Arabidopsis thaliana during synthesis of gold nanoparticles. Plant Physiology and Biochemistry. 84, 189-196 (2014).
- Williamson, L. C., Ribrioux, S. P., Fitter, A. H., Leyser, H. M. Phosphate availability regulates root system architecture in Arabidopsis. Plant Physiology. 126 (2), 875-882 (2001).
- Yang, T. J. W., Lin, W. D., Schmidt, W. Transcriptional profiling of the Arabidopsis iron deficiency response reveals conserved transition metal homeostasis networks. Plant Physiology. 152 (4), 2130 (2010).
- Kobae, Y., et al. Zinc transporter of Arabidopsis thaliana AtMTP1 is localized to vacuolar membranes and implicated in zinc homeostasis. Plant Cell and Physiology. 45 (12), (2004).
- Al-Ghazi, Y., et al. Temporal responses of Arabidopsis root architecture to phosphate starvation: evidence for the involvement of auxin signalling. Plant, Cell and Environment. 26 (7), 1053-1066 (2003).
- S, U. National Institutes of Health. , Bethesda, Maryland, USA. 1997-2007 (1997).
- Dubrovsky, J. G., Forde, B. G. Quantitative analysis of lateral root development: pitfalls and how to avoid them. The Plant Cell. 24 (1), 4-14 (2012).
- Weeks, J. T., Ye, J., Rommens, C. M. Development of an in planta method for transformation of Alfalfa (Medicago sativa). Transgenic Research. 17 (4), 587-597 (2008).
- Shukla, D., Krishnamurthy, S., Sahi, S. V. Microarray analysis of Arabidopsis under gold exposure to identify putative genes involved in the synthesis of gold nanoparticles (AuNPs).Genomics Data. 3, 100-102 (2015).
