Summary
We gebruiken eenvoudige laboratoriumtools om de wortelsysteemarchitectuur (RSA) van Arabidopsis en Medicago te onderzoeken. De plantjes worden hydroponisch over gaas gekweekt en verspreid met behulp van een kunstkwast om de RSA te onthullen. Foto's worden gemaakt met behulp van scannen of een camera met hoge resolutie en vervolgens geanalyseerd met ImageJ om eigenschappen in kaart te brengen.
Abstract
Uitgebreide kennis van de ontwikkeling van de plant root system architecture (RSA) is van cruciaal belang voor het verbeteren van de efficiëntie van het gebruik van voedingsstoffen en het verhogen van de tolerantie van gewascultivar voor milieu-uitdagingen. Een experimenteel protocol wordt gepresenteerd voor het opzetten van het hydrocultuursysteem, plantjesgroei, RSA-verspreiding en beeldvorming. De aanpak maakte gebruik van een magenta box-gebaseerd hydroponisch systeem met polypropyleen gaas ondersteund door polycarbonaat wiggen. Experimentele omgevingen worden geïllustreerd door de RSA van de plantjes te beoordelen onder variërende voedingsstof (fosfaat [Pi]) toevoer. Het systeem is opgezet om de RSA van Arabidopsis te onderzoeken, maar het is gemakkelijk aan te passen om andere planten zoals Medicago sativa (Alfalfa) te bestuderen. Arabidopsis thaliana (Col-0) plantjes worden in dit onderzoek gebruikt als voorbeeld om de plant RSA te begrijpen. Zaden worden aan het oppervlak gesteriliseerd door ethanol en verdund commercieel bleekmiddel te behandelen en op 4 °C te houden voor stratificatie. De zaden worden ontkiemd en gekweekt op een vloeibaar half-MS medium op een polypropyleen gaas ondersteund door polycarbonaat wiggen. De plantjes worden gekweekt onder standaard groeiomstandigheden voor het gewenste aantal dagen, voorzichtig uit het gaas geplukt en ondergedompeld in waterhoudende agarplaten. Elk wortelstelsel van de plantjes wordt zachtjes op de met water gevulde plaat verspreid met behulp van een ronde kunstkwast. Deze petriplaten worden gefotografeerd of gescand met hoge resolutie om de RSA-eigenschappen te documenteren. De wortelkenmerken, zoals primaire wortel, laterale wortels en vertakkingszone, worden gemeten met behulp van de vrij beschikbare ImageJ-software. Deze studie biedt technieken voor het meten van plantwortelkenmerken in gecontroleerde omgevingsomgevingen. We bespreken hoe we (1) de plantjes kunnen laten groeien en wortelmonsters kunnen verzamelen en verspreiden, (2) foto's van verspreide RSA-monsters kunnen verkrijgen, (3) de afbeeldingen kunnen vastleggen en (4) beeldanalysesoftware kunnen gebruiken om wortelkenmerken te kwantificeren. Het voordeel van de huidige methode is de veelzijdige, eenvoudige en efficiënte meting van de RSA-eigenschappen.
Introduction
De wortelsysteemarchitectuur (RSA), die ondergronds is, is een vitaal orgaan voor plantengroei en productiviteit 1,2,3. Na het embryonale stadium ondergaan planten hun belangrijkste morfologische veranderingen. De manier waarop de wortels in de grond groeien, heeft grote invloed op de groei van plantendelen boven de grond. Wortelgroei is de eerste stap in ontkieming. Het is een informatieve eigenschap omdat het op unieke wijze reageert op verschillende beschikbare voedingsstoffen 1,2,3,4. De RSA vertoont een hoge mate van ontwikkelingsplasticiteit, wat betekent dat de omgeving altijd wordt gebruikt om beslissingen te nemen over ontwikkeling 2,5. Veranderingen in de omgeving hebben de productie van gewassen in het huidige scenario bemoeilijkt. Op continue basis neemt de RSA omgevingssignalen mee in ontwikkelingskeuzes5. Als gevolg hiervan is een grondig begrip van de principes achter wortelontwikkeling essentieel om te leren hoe planten reageren op veranderende omgevingen 2,5.
De RSA detecteert variërende nutriëntenconcentraties en geeft fenotypische veranderingen 4,6,7,8,9,10,11,12. Studies suggereren dat wortelmorfologie /RSA zeer plastisch is in vergelijking met scheutmorfologie 1,3. RSA trait mapping is zeer effectief in het vastleggen van het effect van het veranderen van de omringende bodemomgeving 1,11,12.
Over het algemeen zijn discrepanties in het effect van verschillende tekorten aan voedingsstoffen op het wortelfenotype gemeld in veel eerdere studies 3,11,13,14,15. Er zijn bijvoorbeeld verschillende contrasterende rapporten over fosfaat (Pi) door uithongering veroorzaakte veranderingen in het aantal, de lengte en de dichtheid van laterale wortels (LRs). Een toename van de LR-dichtheid is gemeld onder de Pi-deficiënte toestand 6,8. Daarentegen is een afname van de LR-dichtheid onder Pi-deficiënte omstandigheden ook gemeld door andere auteurs 3,13,16. Een van de prominente oorzaken van deze inconsistenties is het gebruik van het elementaire contaminatiegevoelige geleermedium, dat agar vaak10 bevat. Onderzoekers kweken hun experimentele planten meestal op een op agar gebaseerd plaatsysteem en registreren de wortelkenmerken. Talrijke RSA-eigenschappen zijn vaak verborgen of verankerd in het agarmateriaal en kunnen niet worden gedocumenteerd. Experimenten die verband houden met het induceren van tekort aan voedingsstoffen, waarbij gebruikers vaak één component volledig uitsluiten van het medium, kunnen niet worden uitgevoerd in elementair contaminatiegevoelig geleermedium11,14,15. Talrijke voedingsstoffen zijn vaak aanwezig in aanzienlijke hoeveelheden in de agar media, waaronder P, Zn, Fe, en nog veel meer11,14,15. Bovendien is de RSA-groei langzamer in op agar gebaseerde media dan in vloeibaar medium dat niet op agar is gebaseerd. Als gevolg hiervan is er behoefte aan een alternatieve, niet-agar-gebaseerde benadering voor het kwantificeren en kwalitatief registreren van het fenotype van RSA. Daarom is de huidige methode ontwikkeld, waarbij plantlets worden grootgebracht in een magenta box-gebaseerd hydroponisch systeem bovenop een polypropyleen gaas ondersteund door polycarbonaat wiggen 1,10,11.
Deze studie presenteert een gedetailleerde geïmproviseerde versie van de eerdere methode beschreven door Jain et al.10. Deze strategie is afgestemd op de huidige eisen in de biologie van plantenwortels en kan ook worden gebruikt voor planten zoals Alfalfa, anders dan modelplanten. Het protocol is de primaire manier om de veranderingen in RSA te meten en vereist alleen eenvoudige apparatuur. Het huidige protocol illustreert hoe verschillende wortelkenmerken kunnen worden fenotypeerd, zoals primaire en laterale wortels in normaal en gemodificeerd medium (Pi-deficiënt). Stapsgewijze aanwijzingen en andere nuttige tips uit de ervaringen van de auteur worden gegeven om de onderzoekers te helpen de methodologieën te volgen die in deze methode worden aangeboden. De huidige studie heeft tot doel een eenvoudige en effectieve methode te bieden voor het onthullen van het hele wortelstelsel van planten, inclusief LRs van hogere orde. Deze methode omvat het handmatig verspreiden van het wortelstelsel met een ronde aquarel art penseel, waardoor nauwkeurige controle over de blootstelling vande wortels 1,10,11,12. Het vereist geen dure apparatuur of ingewikkelde software. Deze methode heeft de opname en groeisnelheid van voedingsstoffen verbeterd; Planten hebben een voedingsrijke oplossing die gemakkelijk door hun wortels wordt opgenomen. De huidige methode is geschikt voor onderzoekers die de eigenschappen van het wortelstelsel van een plant in detail in kaart willen brengen, met name tijdens de vroege ontwikkeling (10-15 dagen na ontkieming). Het is geschikt voor kleine wortelstelsels, modelplanten zoals Arabidopsis en tabak, en niet-conventionele planten zoals Alfalfa totdat hun wortelstelsel in de magenta-dozen past.
De stappen voor fenotypische analyse van RSA-ontwikkeling in Arabidopsis worden in dit protocol als volgt beschreven: (1) de methode van sterilisatie van het zaadoppervlak voor planten (Arabidopsis), (2) de stappen om het hydroponische systeem op te zetten, gevolgd door zaadzaaien op een medium, (3) procedure voor het verwijderen van de volledige zaailingen en het verspreiden op de petriplaat voor RSA-analyse, (4) hoe de beelden voor RSA op te nemen en (5) belangrijke RSA-parameters te berekenen met behulp van ImageJ-software.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het hele protocol is schematisch samengevat in figuur 1, met alle essentiële stappen die betrokken zijn bij het onthullen van de wortelsysteemarchitectuur (RSA) van plantjes. Protocolstappen worden hieronder in detail gegeven:
1. Arabidopsis zaadoppervlak sterilisatie
- Breng een klein schepje (ongeveer 100 zaden = ongeveer 2,5 mg) zaden over in een microfugebuis en week gedurende 30 minuten in gedestilleerd water op kamertemperatuur (RT). Deze hele procedure wordt uitgevoerd in de aseptische toestand.
- Centrifugeer kort de microfugebuis met zaden op 500 x g gedurende 5 s, met behulp van een tafelcentrifuge bij RT om de zaden te laten bezinken.
- Decanteer het water, voeg 700 μL 70% (v/v) ethanol toe, draai een paar seconden en draai. Herhaal vortexing en spinnen indien nodig, maar zorg ervoor dat de behandelingstijd van 70% ethanol op 3 minuten blijft.
- Na 3 minuten onmiddellijk één keer spoelen met steriel water. Houd de ethanolwasstap zo tijdig mogelijk, omdat langdurige blootstelling aan ethanol de kieming vermindert.
- Behandel de zaden met verdund commercieel bleekmiddel (4% v/v) met een druppel Tween-20 gedurende 7 minuten. Meng de zaden met bleekoplossing door de buizen snel 8-12 keer om te keren, gevolgd door een korte centrifuge (500 x g gedurende 5 s bij RT). Schuim verschijnt in de buis.
- Decanteer het supernatant met een pipet van 1 ml en spoel de zaden met ten minste vijf wasbeurten met steriel water, volgens dezelfde vortexing-procedure.
- Laat de oppervlakte gesteriliseerde zaden in water en incuberen gedurende 2-3 dagen bij 4 °C voor stratificatie10.
2. Een hydroponisch systeem instellen voor zaadkieming
- Vul een standaard magenta doos half met gedestilleerd water en autoclaaf het. Autoclaaf het polycarbonaatvel (heldere kleur en gladde textuur) en snijd rechthoeken van 4 cm x 8 cm, met een middelpunt dat meer dan halverwege de rechthoek is ingekerfd, zodat twee rechthoeken samen kunnen glijden om een X-vorm10 te vormen. Gebruik deze opstelling om het polypropyleen gaas (6 cm x 6 cm vierkanten van 250 μm poriegrootte, of afhankelijk van de vereiste) te houden gesneden uit 12x 24 inch vellen10.
OPMERKING: Polypropyleen is zeer goed bestand tegen zuren, logen en andere chemicaliën; daarom is ervoor gekozen. Autoclaveren heeft de neiging om polypropyleen gaas te vervormen; Daarom wordt het aanbevolen om apart verpakt in aluminiumfolie te worden gedragen. Typische autoclaveromstandigheden van 16 min, 121 °C, 15 psi of 775 mm Hg worden aanbevolen. - Voeg steriele half-MS basale media met vitamines + 1,5% (w / v) sucrose, zoals beschreven door Shukla et al.1, toe aan elke doos om de onderkant van het polypropyleengaas in een laminaire stroom te bereiken. Alle procedures worden uitgevoerd onder aseptische omstandigheden.
- Zaai de oppervlakte gesteriliseerde zaden op het gaas (poriegrootte van 250 μm) hydroponisch en laat ze 3 dagen groeien.
- Breng na 3 dagen de zaailingen over op een gaas (poriegrootte van 500 μm) en laat ze 2 dagen groeien.
- Breng na 2 dagen (in totaal 5 dagen) de zaailingen over op de controlemedia (d.w.z. gemodificeerde MS-voedingsmedia 1 met 2,0 mM NH 4 NO 3, 1,9 mM KNO3, 0,15 mM MgSO 4·7H2O,0,1 mM MnSO 4· H 2 O, 3,0 μM ZnSO 4·7H 2 O, 0,1 μM CuSO 4·5H 2 O, 0,3 mM CaCl 2·2H 2 O, 5,0 μM KI, 0,1 μM CoCl 2·6H 2 O, 0,1 mM FeSO 4·7H 2 O, 0,1 mM Na 2 EDTA·2H 2 O, 1,25 mM KH 2PO 4, 100 μM H 3 BO3, 1 μM Na 2 MoO4·2H2O, 1,5% sucrose, 1,25 mM MES, pH 5,7 aangepast met 0,1 M MES [pH 6,1]) en aan de experimentele media (bijv. P- [0 mM] behandeling; KH2 PO 4 wordt vervangen door 0,62 mM K2SO4 van de samenstelling van het besturingsmedium zoals hierboven vermeld1. Voor overtollige Pi-behandelingen wordt de concentratie van KH 2 PO4 verhoogd in gemodificeerd MS-medium [2,5, 5,0, 10,0, 20,0 mM]1) en worden de zaden gedurende 7 dagen laten groeien.
OPMERKING: Een grotere maasporiegrootte (500 μm) vergemakkelijkt het soepel plukken van hele zaailingen zonder enige schade of noodzaak om te snijden bij de hypocotyl. Planten groeien onder standaard groeiomstandigheden (d.w.z. 16 uur licht / 8 uur donkere fotoperiode, 150 μmol·m-2·s-1 lichtintensiteit, 60%- 70% vochtigheid) bij 23 °C.
3. Onderzoek van RSA
- Bereid agar (1,1%) platen voor wortelverspreiding (petriplaatgrootte: 150 mm x 15 mm).
- Voeg 10-20 ml gefilterd kraanwater met autoclaaf toe aan de petriplaat, zoals hierboven vermeld. Trek de zaailingen voorzichtig uit het gaas (500 μm) en dompel ze onder in water op de platen.
- Verdeel de wortel van elke plant voorzichtig in de met water gevulde plaat met behulp van een ronde aquarel art brush (maten: nr. 14, 16, 18 en 20).
OPMERKING: Terwijl u de verspreiding van het wortelstelsel uitvoert, moet u eerst de primaire wortel vastpakken en deze in een rechte lijn verspreiden, omdat deze als een as dient. Verdeel vervolgens de LRs symmetrisch over elke kant van de primaire wortel, waar mogelijk. Verspreid daarna de tweede-orde LR gekoppeld aan de eerste-orde LR. Dit verspreidingsproces is een soort kunst; doe het zachtjes, langzaam, zoals een kunstenaar een afbeelding van de RSA tekent. - Kantel de plaat iets om het water te verwijderen.
OPMERKING: Op dit punt kan de procedure worden gepauzeerd door deze spreidplaten op 4 °C te plaatsen. Later, wanneer beeldverwerking nodig is, haalt u de platen eruit en plaatst u ze een tijdje bij RT. Veeg het gecondenseerde water weg en vervolgens kan het beeld gemakkelijk worden verwerkt.
4. Beelden opnemen voor RSA
- Scan of fotografeer deze petriplaten op de juiste manier.
OPMERKING: Voor het verkrijgen van foto's van hoge kwaliteit wordt de resolutie van 600 dpi aanbevolen voor het scannen en ten minste een 12 megapixelcamera wordt aanbevolen voor fotografie. - Meet de eigenschappen van de rootsysteemarchitectuur met behulp van vrij beschikbare ImageJ-software (https://imagej.nih.gov/ij/index.html). Om snel de stappen te volgen om de wortellengte te meten met behulp van ImageJ-software, raadpleegt u het voorbeeld "DNA-contourlengte meten"17.
OPMERKING: Deze stappen worden gevolgd om de wortellengtes te meten op foto's die zijn gemaakt met een scanner of camera met hoge resolutie.- Gebruik een bepaalde afstand van lengte om de schaal in te stellen. De bekende afstand van de schaalbalk in figuur 3 is 2 cm. Selecteer het gereedschap Rechte lijn op de werkbalk ImageJ (vijfde gereedschap van links). Gebruik het gereedschap Rechtlijnig om een lijnselectie te maken die de schaalbalk omlijnt . Voltooi het overzicht door met de rechtermuisknop te klikken, te dubbelklikken of te klikken in het vak aan het begin.
- Meet de lengte van de bekende schaalbalk in pixels met de werkbalk Analyseren > meten . Noteer de pixellengte.
- Open het dialoogvenster Schaal instellen door op het tabblad Schaal instellen op het tabblad Analyseren te klikken. Voer in het veld Afstand in pixels de pixellengte in (zoals hierboven vermeld). Voer vervolgens in het veld Bekende afstand de waarde in, zoals weergegeven door de schaalbalk (hier is deze 20 mm). Stel de lengte-eenheid in als mm. De pixelverhouding is 1,0. Nu wordt de schaal gespecificeerd door het x aantal pixels per millimeter. Om de schaal voor deze specifieke afbeelding te vergrendelen, klikt u op OK.
- Maak een lijnselectie die de hoofdlengte omlijnt met het gereedschap Gesegmenteerde lijn . Voltooi het overzicht door met de rechtermuisknop te klikken, te dubbelklikken of te klikken in het vak aan het begin. Klik en sleep de kleine zwart-witte "handgrepen" langs de omtrek om de lijnselectie naar wens aan te passen.
- Gebruik de opdracht Meten op het tabblad Analyseren van ImageJ om de lengte van de root te kwantificeren. Als u de gemeten gegevens naar een spreadsheet wilt overbrengen, klikt u met de rechtermuisknop op het venster Resultaten , selecteert u Alles kopiëren in het pop-upmenu, schakelt u over naar de spreadsheet en plakt u de gegevens.
OPMERKING: Zoals hierboven beschreven, stelt u de schaal in met behulp van de bekende afstand van de schaalbalk in de optie ImageJ-schaal. Dit geeft het aantal pixels per lengte-eenheid. Het is vereist om de schaal elke keer opnieuw in te stellen, wanneer een nieuw beeld wordt geanalyseerd.
- Meting en berekening van RSA-kenmerken
- Meet de primaire wortellengte tussen de hypocotylverbinding en het uiteinde van de wortelpunt.
- Meet de LR-lengte van de eerste en tweede orde.
- Meet de vertakkingszone (BZ) van de primaire wortel. De vertakkingszone van de primaire wortel (BZPR) overspant het eerste LR-opkomend punt tot het laatste LR-opkomend punt.
- Noteer het aantal LRs, dat is het aantal LRs dat afkomstig is binnen de grens van de BZPR.
- Meet de gemiddelde lengte van de eerste- en hogere-orde LRs. Leid de gemiddelde lengte van de eerste-orde LR (1° LR) (centimeter per wortel) af door de totale lengte van de 1° LR te delen door het totale aantal LRs van 1° LRs.
- Meet de gemiddelde lengte van de tweede-orde LR. Bereken de gemiddelde lengte van de tweede-orde LR (2° LR) door de totale lengte van de 2° LR te delen door het totale aantal LRs van 2°.
- Meet de 1° LR-dichtheid. Bereken de 1° LR-dichtheid (aantal 1° LRs per lengte-eenheid BZ PR) door het aantal 1° LRs te delen door de lengte van de BZPR.
- Meet de 2° LR-dichtheid. Bereken de 2° LR-dichtheid door het aantal LRs van 2° te delen door de lengte van de BZ van 1° LRs (aantal 2° LRs per eenheid lengte van de BZ van 1° laterale wortels).
- Meet de totale wortellengte (TRL). Dit is het totaal van de lengte van de primaire wortel, 1° LR en 2° LR (en meer indien aanwezig).
5. Wortelhaar meting
OPMERKING: Hoewel het hydroponische systeem niet goed is in het bevorderen van de groei en ontwikkeling van wortelhaar, ondanks dat het zo robuust is als in vaste groeimedia, is het nog steeds belangrijk om het in de huidige context te bestuderen. Volg de onderstaande stappen om de ontwikkeling van wortelhaar in een gedeelte van 5 mm vanaf de punt van de primaire wortel van de zaailingen te analyseren.
- Hak een deel van 2 cm van de primaire wortel van de wortelpunt af.
- Monteer het wortelgedeelte op een dia met 10% glycerol als montagemedium.
- Plaats de dia onder een stereomicroscoop.
- Gebruik de axiale drager om beelden van de wortelharen te visualiseren en vast te leggen.
- Analyseer de afbeeldingen om de structuur en kenmerken van de wortelharen te bestuderen met behulp van ImageJ-software zoals eerder beschreven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De verschillende morfometrische eigenschappen van wortelsysteemarchitectuur (RSA) worden gemeten met behulp van eenvoudige laboratoriumhulpmiddelen en de stappen zijn schematisch weergegeven in figuur 1. De details van de hydroponische opstelling tonen het potentieel van het protocol bij het meten van de RSA (figuur 1 en figuur 2).
Gezien de waargenomen verschillen in geleermiddelen, gebruikten we een hydroponisch groeisysteem om alle onderzoeken uit te voeren 3,10. Als proof of concept werkt dit hydroponische systeem goed, wat het schijnbare contrasterende fenotype onder Pi-deficiënte en voldoende omstandigheden weerspiegelt (figuur 3). Arabidopsis zaden werden hydroponisch gekweekt gedurende 5 dagen in een half-MS medium op een polypropyleen gaas, zoals geïllustreerd in figuur 2. De plantjes werden na 5 dagen getransplanteerd in Pi-deficiënte en voldoende omstandigheden, en mochten 7 dagen groeien (figuur 3).
Demonstratie van RSA-eigenschappen onder gevarieerde nutriënt (Pi) toevoer
We hebben een vastgesteld schema gevolgd om de eigenschappen van de RSA3 te analyseren en vast te leggen. Verschillende RSA-eigenschappen werden geanalyseerd onder contrasterende Pi-regimes in hydroponische omstandigheden (figuur 3). De P i-deficiënte behandeling (0 mM Pi) riep een typisch gerapporteerd wortelfenotype op dat een kortere, ondiepere en minder vertakte RSA vertoonde in vergelijking met de Pi-voldoende conditie (figuur 3A). De primaire wortellengte was significant verzwakt onder de Pi-deficiënte toestand (figuur 3A,B). Primaire wortellengte, snel verkregen in de aanwezigheid van Pi (1,25 mM), toont de efficiëntie van het hydroponische systeem dat de fysiomorfologische veranderingen adequaat weerspiegelt (figuur 3A, B). De TRL was significant verlaagd onder de Pi-deficiënte toestand (figuur 3B). De vertakkingszone (BZPR), zoals weergegeven in figuur 3A, was significant verzwakt onder de Pi-deficiënte toestand (figuur 3B).
Van deze eigenschappen was de TRL het meest getroffen, vanwege het hoge verschil in LR-aantal tussen de twee Pi-omstandigheden. De krachtige groei van de RSA onder de Pi-conditie (1,25 mM) was te wijten aan een significante toename van het aantal en de lengte van 1° LRs. Er trad dus een snelle RSA-verandering op, voornamelijk als gevolg van de verandering in LR-ontwikkeling. We hebben het aantal LRs gemeten dat afkomstig is van binnen de grens van de vertakkingszone van de primaire wortel, omdat ze als zinvoller worden beschouwd 1,3,18. De gemiddelde lengte van de 1° LR (centimeter per wortel) was significant verminderd in de Pi-deficiënte toestand (figuur 3C). De gemiddelde lengte van 2° LR was eveneens verminderd, als gevolg van de P0-toestand; het was echter lager in hoeveelheid dan de gemiddelde lengte van 1° LR (figuur 3C). Het aantal 1° LRs en 2° LRs daalde sterk onder de P0-conditie ten opzichte van de P1,25-conditie (figuur 3D). De 1° LR-dichtheid (aantal 1° LRs per centimeter BZPR-lengte) werd niet gewijzigd onder de P0-conditie ten opzichte van de P1,25-toestand (figuur 3E). De 2° LR-dichtheid (aantal 2° LRs per centimeter van de BZ van 1° LRs) vertoonde ook geen significante verandering (figuur 3E). Als gevolg hiervan is het bepalen van de dichtheid van LRs essentieel voor het verkrijgen van nuttig inzicht in de RSA-plasticiteit.
Analyse van de ontwikkeling van wortelhaar onder verschillende fosfaat (Pi) regimes
Het effect van Pi-toevoer op de ontwikkeling van wortelhaar werd bestudeerd in de primaire wortel van zaailingen. Het bleek dat de wortelhaarlengte toenam met toenemende concentraties Pi tot 2,5 mM, maar afnam bij 5 mM en 10 mM. Bij 20 mM keerde de wortelhaarlengte echter terug naar bijna-piekniveaus (aanvullende figuur 1). Het aantal wortelharen was significant hoger bij 0 mM in vergelijking met alle andere Pi-benodigdheden, met het hoogste aantal waargenomen bij 20 mM (aanvullende figuur 1).
Toepassing van deze methode op andere planten dan Arabidopsis
We hebben de haalbaarheid van de huidige methode onderzocht op andere planten dan Arabidopsis, waarbij Medicago sativa (Alfalfa) als testplant werd gebruikt. Het protocol is aangepast aan de eis van twee aspecten: (1) de sterilisatiemethode van het zaadoppervlak en (2) de poriegrootte van het polypropyleengaas (nu groter, 1.000 μm). Het sterilisatie- en stratificatieprotocol voor oppervlaktezaden moet altijd worden geoptimaliseerd, afhankelijk van de geselecteerde planten die moeten worden bestudeerd. Voor Alfalfa werden stappen gevolgd zoals beschreven door Weeks et al.19. Na oppervlaktesterilisatie werden de zaden gedurende 7 dagen bij 4 °C geïncubeerd voor stratificatie. Daarna hebben we dezelfde procedure gevolgd die in dit protocol wordt beschreven met een wijziging van de poriegrootte van de mazen. Zoals te zien is in figuur 4A,B, waren de plantjes goed gegroeid, met een veranderde RSA onder wisselende voorraden Pi. Figuur 4C toont de plasticiteit van het wortelsysteem onder 1,25, 0 en 20 mM Pi-voedingsoplossing. Een teveel aan Pi (20 mM) en een tekort aan Pi-toevoer leidden tot een vermindering van de ontwikkeling van het wortelstelsel, in vergelijking met de Pi-voldoende (1,25 mM) toestand (controle) (figuur 4C). De RSA kan in kaart worden gebracht voor verschillende eigenschappen met behulp van de ImageJ-software die in het protocol wordt beschreven. Daarom is het protocol eenvoudig, efficiënt en kan het gemakkelijk worden aangepast aan de geselecteerde plantensoort. Het biedt de mogelijkheid om de RSA van diverse plantensoorten onder verschillende voedingscondities te bestuderen.
Figuur 1: Schema van de procedure. Het schematische diagram schetst de belangrijkste stappen die betrokken zijn bij het methodeprotocol voor het in kaart brengen van de RSA. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Weergave van hydroponische opstelling in magenta-dozen om planten te laten groeien . (Zoals beschreven door Jain et al.10, met wijzigingen). (A) Twee rechthoekige stukken (4 cm x 8 cm) met inkepingen van polycarbonaat wiggen voor het monteren van de opstelling. (B) De assemblage van polycarbonaat wiggen in elkaar door middel van een inkeping die in een X-vorm verandert om het maasoppervlak te ondersteunen. C) Een polypropyleen maaswijdte van 250 μm (6 cm x 6 cm). (D) Bovenaanzicht van de assemblage van polycarbonaat wiggen in de magenta doos. E) Montage van het polypropyleennet op de partjes polycarbonaat in een magentadoos gevuld met media. (F) Een weergave van Arabidopsis-plantjes die op het gaas zijn ontkiemd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Demonstratie van typische RSA-modulatie onder verschillende voedingscondities (Pi-deficiënt [0 mM] en voldoende [1,25 mM]) met behulp van deze fenotyperingsmethode. Arabidopsis (Col-0) zaailingen worden hydroponisch gekweekt in 0,5x MS-media gedurende 5 dagen, en daarna onderworpen aan Pi-deficiënte en voldoende voorraden (respectievelijk 0 en 1,25 mM) en gedurende 7 dagen gekweekt, zoals weergegeven in figuur 2. (A) Individuele plantjes worden uit het polypropyleengaas (500 μm) getrokken en met behulp van een ronde kunstkwast en water op de agar-petriplaten verspreid. Gegevens van RSA-kenmerken worden gepresenteerd voor (B) primaire wortellengte (PR), totale wortellengte (TRL), vertakkingszone (BZ), (C) gemiddelde (Av.) eerste orde laterale wortellengte (1 ° LR-lengte), gemiddelde (Av.) tweede orde laterale wortellengte (2 ° LR-lengte), (D) aantal van 1 ° LR en 2 ° LR, en (E) 1 ° LR en 2 ° LR-dichtheid. Waarden zijn middelen ± SE; n = 21. Dit cijfer is aangepast van Shukla et al.1. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Demonstratie van het wortelstelsel van Medicago sativa (Alfalfa) als voorbeeld om de toepasbaarheid van deze methode op andere planten dan Arabidopsis aan te tonen. (A) Zijaanzicht van de magentadoos met de groei van Alfalfa-planten. (B) Het bovenaanzicht van de magentadoos toont de opkomst van de scheut op het polypropyleen gaas (poriegrootte van 1.000 μm). (C) De typische wortelsysteemarchitectuur (RSA) van Alfalfa-modulatie onder verschillende voedingsomstandigheden (Pi-deficiënt [0 mM], overtollige Pi [20 mM], en voldoende of controle [1,25 mM]) met behulp van deze RSA-fenotyperingsmethode. Alfalfa-zaailingen worden hydroponisch gekweekt in 0,5x MS-media gedurende 5 dagen, onderworpen aan Pi-deficiënte, voldoende en overtollige voorraden (respectievelijk 0, 1,25 en 20 mM) en gedurende 7 dagen gekweekt. Individuele plantjes worden uit het polypropyleengaas (1.000 μm) getrokken en verspreid over de agar petriplaten, zoals weergegeven in C, met behulp van een kunstborstel en water. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullende figuur 1: Verschillende overtollige Pi-concentraties moduleren de ontwikkeling van wortelhaar. WT-zaailingen werden hydroponisch gekweekt, zoals beschreven in het protocol. (A) Een sectie van 1-2 cm van de punt van de primaire wortel werd gehakt en gemonteerd op een dia met 10% glycerol, en een gebied van 5 mm vanaf de punt werd gedocumenteerd voor het aantal en de lengte van het wortelhaar. Gegevens worden gepresenteerd voor (B) de wortelhaarlengte en (C) het aantal wortelharen in een gebied van 5 mm van de primaire wortelpunt. Waarden zijn middelen ± SE; n = 10 (B en C). Balken met verschillende alfaletters verschillen aanzienlijk (p ≤ 0,05) volgens de gepaarde t-test van Student. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit werk demonstreerde het in kaart brengen van RSA met behulp van eenvoudige laboratoriumapparatuur. Met behulp van deze methode worden fenotypische veranderingen op het verfijnde niveau geregistreerd. Het voordeel van deze strategie is dat het scheutgedeelte nooit in contact komt met de media, dus het fenotype van de plantjes is origineel. Deze methode omvat het opzetten van een hydroponisch systeem om planten te laten groeien zoals beschreven in het protocol. Vervolgens wordt elk plantje er intact uitgehaald en op een met agar gevulde petriplaat geplaatst. Het wortelsysteem mag zich vervolgens handmatig verspreiden met een kunstpenseel en foto's worden gemaakt om te worden geanalyseerd met ImageJ-software 1,10,11,12.
Zaadkieming vereist sterilisatie van het zaadoppervlak om bacteriën, schimmels en virussen te verwijderen. Alcohol - 70% ethanol - wordt gebruikt om zaadoppervlakken te steriliseren. Om zaden te desinfecteren zonder ze te vernietigen, moet de behandelingstijd van alcoholsterilisatie zorgvuldig worden gevolgd. De kieming van zaden neemt af wanneer alcoholsterilisatie overdreven is. De behandelingstijden variëren met verschillende plantensoorten (bijvoorbeeld voor Arabidopsis is de tijdslimiet 3 min 1,10,11,12,20, terwijl het voor Medicago sativa 5 min 19 is. Om een soepele pluk van de RSA voor analyse te vergemakkelijken, is het belangrijk om het aantal zaden per gaas of magenta-doos te beperken, om verstrengeling van het wortelstelsel onderling te voorkomen 1,10,11,12. Dit kan worden bereikt door een kleiner aantal zaden per gaas te gebruiken. Het gebruik van vier zaden per gaas kan bijvoorbeeld helpen om het risico op verstrengeling te verminderen en tegelijkertijd een robuuste groei en ontwikkeling van de wortelsystemen mogelijk te maken. Het is belangrijk op te merken dat het optimale aantal zaden per gaas afhankelijk is van de specifieke plantensoort en de doelen van de RSA-analyse. Als een experiment bijvoorbeeld weefsel vereist voor verdere downstream-verwerkingsvereisten zoals RNA-isolatie, wordt in dit geval bulkzaaien aanbevolen (100 zaden per gaas in het geval van Arabidopsis)1,10,11,12. Het plukken van plantjes uit het gaas is een delicaat proces dat uiterste zorg en aandacht vereist 1,10,11. Het is belangrijk om deze taak langzaam, voorzichtig en voorzichtig te benaderen om te voorkomen dat de delicate planten worden beschadigd. Om plantjes uit het gaas te plukken, wordt aanbevolen om een fijn pincet of tang te gebruiken om de plantjes voorzichtig maar stevig vast te pakken. De plantjes moeten voorzichtig uit het gaas worden getild om te voorkomen dat de wortelsystemen worden verstoord of schade aan de planten wordt veroorzaakt. Het is essentieel om geduldig te zijn en de tijd te nemen om elke plant zorgvuldig uit het gaas te verwijderen om ervoor te zorgen dat ze tijdens het proces niet worden beschadigd. Het is een geleidelijk proces dat langzaam, voorzichtig en zorgvuldig moet worden uitgevoerd om het succes van het experiment te garanderen. Om de RSA van plantjes nauwkeurig te meten, is het cruciaal om een schaal op de petriplaat te markeren om een nauwkeurige meting 1,10,11 mogelijk te maken. Dit kan door met een permanente marker een lijn op de petriplaat te tekenen op een bekende afstand, zoals 1 cm of 2 cm. De schaal moet langs de rand van de petriplaat op een zichtbare plaats worden geplaatst. Met behulp van een borstel is het ook essentieel om uiterst voorzichtig te zijn bij het verspreiden van de RSA. De primaire wortel moet zorgvuldig in het midden van de petriplaat worden geplaatst en de laterale wortels moeten aan beide zijden van de primaire wortel worden uitgespreid. Het wortelstelsel moet gedeeltelijk worden ondergedompeld in water om verspreiding te vergemakkelijken. Om elke nieuwe petriplaat te meten, moet men de schaal elke keer instellen in de ImageJ-software.
Er kunnen weinig wijzigingen worden aangebracht om de efficiëntie, niet-invasieve aard en effectiviteit van RSA-analysete verbeteren 1. Een van die verbeteringen is het veranderen van de poriegrootte van het polypropyleengaas dat wordt gebruikt om de plantjes vast te houden. De poriegrootte van het gaas kan worden aangepast aan de specifieke behoeften van de bestudeerde plantensoort en om de groei en ontwikkeling van de wortelsystemen te optimaliseren 1,10,11,12. Een grotere maasporiegrootte (500 μm) vergemakkelijkt bijvoorbeeld het soepel plukken van hele zaailingen zonder de hypocotyl te snijden, wat eerder 10,11,12 werd beoefend. Verder kan een grotere poriegrootte meer geschikt zijn voor grotere plantensoorten RSA, terwijl een kleinere poriegrootte meer geschikt kan zijn voor kleinere plantensoorten. Een andere wijziging die kan worden aangebracht, is om het polypropyleengaas in aluminiumfolie te wikkelen om te voorkomen dat het buigt. Dit kan helpen de vorm en integriteit van het gaas te behouden, waardoor het geschikt is om te dienen als een vlakke vloermatrix. Naast deze wijzigingen kunnen andere technieken voor probleemoplossing worden gebruikt om eventuele problemen aan te pakken die zich tijdens RSA-analyse kunnen voordoen. Als de planten bijvoorbeeld niet groeien of zich ontwikkelen zoals verwacht, kan het nodig zijn om de omgevingsomstandigheden aan te passen, zoals de temperatuur, vochtigheid en lichtniveaus. Als de wortelsystemen verstrengeld zijn, kan het verminderen van het aantal zaden per gaas nodig zijn, zoals hierboven vermeld.
Een van de belangrijkste voordelen van RSA-analyse is dat het mogelijk is om plantenwortelsystemen te bestuderen zonder de noodzaak van agar. Agar wordt vaak gebruikt als stollingsmiddel in plantenweefselkweek en zaadkiemingsexperimenten. Het gebruik van agar kan echter elementaire verontreiniging introduceren die mogelijk artefacten kan genereren en de nauwkeurigheid van de resultaten kan beïnvloeden10. Door de vereiste voor agar uit te sluiten, elimineert RSA-analyse het risico van van agar afgeleide elementaire besmetting en het potentieel voor artefacten. Dit maakt RSA-analyse een betrouwbaardere en nauwkeurigere methode voor het bestuderen van plantenwortelsystemen 1,3,10,11,12. De effecten van Pi-deprivatie op de laterale worteldichtheid zijn bijvoorbeeld het onderwerp geweest van een aantal tegenstrijdige rapporten. Er is gemeld dat de LR-dichtheid toeneemt wanneer Pi laag is 6,8. Daarentegen is een daling van de laterale worteldichtheid ook gevonden in Pi-deficiënte omstandigheden 3,13,16. Deze discrepanties kunnen worden toegeschreven aan het op agar gebaseerde groeimediasysteem, waarbij werknemers verschillende merken agar gebruiken om media met verschillende gradaties van Pi-besmetting te verwoorden10. Nogmaals, experimenten die het effect van Zn-deficiëntie op RSA willen illustreren, worden mogelijk niet adequaat uitgevoerd met behulp van de op agar gebaseerde petriplaatmethode, omdat het op agar gebaseerde geleermedium ook Zn-verontreiniging11 bevat. Daarom is het uitvoeren van RSA-analyse mogelijk niet geschikt om een tekort aan voedingsstoffen te onderzoeken met behulp van het op agar gebaseerde geleermedium. Ten tweede ontwikkelen plantjes die op geleermedia op basis van agar worden gekweekt zich niet zo snel als die welke hydroponisch worden gekweekt. Ten derde, omdat de RSA meestal is ingebed in een agarmedium, worden tal van rootfuncties niet correct weergegeven. Ten vierde veroorzaakt het verwijderen van de RSA uit het medium vaak aanzienlijke schade aan de RSA en maakt het een destructieve bemonsteringstechniek.
De vorige hydroponische techniek, zoals gepubliceerd door Jain et al.10, gebruikte een polypropyleen maaswijdte van 250 μm, die smallere poriën had die het niet mogelijk maakten om de intacte RSA eruit te trekken. Als gevolg hiervan moesten we in dat specifieke geval de plantjes uit het hypocotylgebied snijden om de RSA te scheiden, waardoor het een destructieve bemonsteringsmethode werd10,11,12. De bestaande methode is geïmproviseerd om het niet-destructief te maken door gebruik te maken van een polypropyleen gaas met een grotere poriegrootte (500 μm) waarmee hele Arabidopsis-planten intact kunnen worden uitgetrokken zonder schade toe te brengen aan de RSA1. Het is de moeite waard om op te merken dat we altijd de poriegrootte van het polypropyleengaas kunnen aanpassen, afhankelijk van het type plantje. Figuur 4 illustreert bijvoorbeeld hoe een vergelijkbare aanpak kan worden gebruikt om de RSA van verschillende planten, zoals Medicago sativa (Alfalfa), in kaart te brengen. We hebben gekozen voor de polypropyleen poriegrootte van 1 mm om plaats te bieden aan het Medicago wortelstelsel.
Een nadeel van dit systeem kan de ontwikkeling van wortelharen zijn, die vaak niet gedijen onder hydroponische systemen in vergelijking met agarplaatsystemen. De primaire oorzaak is de gemakkelijke beschikbaarheid van voedingsstoffen in vloeibare media in plaats van in vaste media. Ook al hebben we de ontwikkeling van wortelharen (niet robuust) met hetzelfde systeem waargenomen en de resultaten verkregen (aanvullende figuur 1). De beschikbaarheid van Pi heeft een sterke invloed op de ontwikkeling van wortelhaar10,11. Hierin nam de wortelhaarlengte aanvankelijk toe tot 2,5 mM en nam vervolgens af.
Al met al zijn de belangrijkste voordelen van het systeem: (1) het is een eenvoudige en nauwkeurige methode die geen geavanceerde high-end apparatuur vereist; (2) de methode maakt een snelle groei van de planten mogelijk vanwege de hydroponische aard ervan; (3) het is een niet-destructieve methode; (4) handmatige verspreiding van de RSA maakt de juiste weergave van elke eigenschap mogelijk, waarbij de verborgen RSA wordt onthuld en de gebruiker volledige controle krijgt; en (5) de methode maakt gebruik van een vrij beschikbare beeldvormingssoftware (d.w.z. ImageJ), die ook eenvoudig te gebruiken is.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenverstrengeling.
Acknowledgments
We erkennen het Amerikaanse ministerie van Landbouw (Grant 58-6406-1-017) voor het ondersteunen van dit onderzoek. We erkennen ook het WKU Biotechnology Centre, Western Kentucky University, Bowling Green, KY, VS, en de directeur, CSIR Central Institute of Medicinal and Aromatic Plants, Lucknow, India, voor het leveren van de instrumentfaciliteiten en ondersteuning (CSIR CIMAP manuscript communicatie nr. CIMAP / PUB / 2022/103). SS erkent de financiële steun van Saint Joseph's University, Philadelphia, VS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Arabidospsis thaliana (Col 0) | Lehle Seeds | WT-02 | Columbia (Col-0**, no markers)* |
| Art brushes | Amazon or any other vendor | Water color round brush size no. 14 (8 mm), 16 (9.5 mm), 18 (12 mm), and 20 (14.2 mm) | |
| Automated Microscope with digital camera | Leica Microsystems | LAS version 4.12.0, Leica Microsystems | |
| Imaging Software | ImageJ | ImageJ V 1.8.0 |
|
| Magenta box GA-7 | Fisher Scientific | 50-255-176 | |
| Medicago sativa | Johnny's Seeds | ||
| Petri-plate (150 mm x 15 mm) | USA Scientific | 8609-0215 | 150 mm x 15 mm PS Petri Dish (https://www.usascientific.com) |
| Photo camera | Cannon or Nikon | Any high mega pixel (atleast 12 mega pixel per inch) camera on macro mode | |
| Plant-Agar | Sigma-Aldrich | A3301 | Agargel Suitable for plant tissue culture |
| Polycarbonate Sheets | Amazon | 1 mm thick | |
| Polypropylene Mesh | Amazon | Pore size 250 µm, 500 µm and 1000 µm | |
| Scanner | Epson | Epson Perfection V700 Photo (Scan at 600 dpi) |
References
- Shukla, D., Rinehart, C. A., Sahi, S. V. Comprehensive study of excess phosphate response reveals ethylene mediated signaling that negatively regulates plant growth and development. Scientific Reports. 7 (1), 3074 (2017).
- Rellán-Álvarez, R., Lobet, G., Dinneny, J. R. Environmental control of root system biology. Annual Review of Plant Biology. 67, 619-642 (2016).
- Gruber, B. D., Giehl, R. F. H., Friedel, S., von Wirén, N. Plasticity of the Arabidopsis root system under nutrient deficiencies. Plant Physiology. 163 (1), 161-179 (2013).
- Shukla, D., et al. Genome-wide expression analysis reveals contrasting regulation of phosphate starvation response (PSR) in root and shoot of Arabidopsis and its association with biotic stress. Environmental and Experimental Botany. , 188 (2021).
- Robbins 2nd,, E, N., Dinneny, J. R. Growth is required for perception of water availability to pattern root branches in plants. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (4), E822-E831 (2018).
- Linkohr, B. I., Williamson, L. C., Fitter, A. H., Leyser, H. M. O. Nitrate and phosphate availability and distribution have different effects on root system architecture of Arabidopsis. The Plant Journal. 29 (6), 751-760 (2002).
- Lynch, J. P., Brown, K. M. Topsoil foraging: an architectural adaptation of plants to low phosphorus availability. Plant and Soil. 237 (2), 225-237 (2001).
- López-Bucio, J., et al. Phosphate availability alters architecture and causes changes in hormone sensitivity in the Arabidopsis root system. Plant Physiology. 129 (1), 244-256 (2002).
- Jain, A., et al. Differential effects of sucrose and auxin on localized phosphate deficiency-induced modulation of different traits of root system architecture in Arabidopsis. Plant Physiology. 144 (1), 232-247 (2007).
- Jain, A., et al. Variations in the composition of gelling agents affect morphophysiological and molecular responses to deficiencies of phosphate and other nutrients. Plant Physiology. 150 (2), 1033-1049 (2009).
- Jain, A., Sinilal, B., Dhandapani, G., Meagher, R. B., Sahi, S. V. Effects of deficiency and excess of zinc on morphophysiological traits and spatiotemporal regulation of zinc-responsive genes reveal incidence of cross talk between micro- and macronutrients. Environmental Science and Technology. 47 (10), 5327-5335 (2013).
- Jain, A., et al. Role of Fe-responsive genes in bioreduction and transport of ionic gold to roots of Arabidopsis thaliana during synthesis of gold nanoparticles. Plant Physiology and Biochemistry. 84, 189-196 (2014).
- Williamson, L. C., Ribrioux, S. P., Fitter, A. H., Leyser, H. M. Phosphate availability regulates root system architecture in Arabidopsis. Plant Physiology. 126 (2), 875-882 (2001).
- Yang, T. J. W., Lin, W. D., Schmidt, W. Transcriptional profiling of the Arabidopsis iron deficiency response reveals conserved transition metal homeostasis networks. Plant Physiology. 152 (4), 2130 (2010).
- Kobae, Y., et al. Zinc transporter of Arabidopsis thaliana AtMTP1 is localized to vacuolar membranes and implicated in zinc homeostasis. Plant Cell and Physiology. 45 (12), (2004).
- Al-Ghazi, Y., et al. Temporal responses of Arabidopsis root architecture to phosphate starvation: evidence for the involvement of auxin signalling. Plant, Cell and Environment. 26 (7), 1053-1066 (2003).
- S, U. National Institutes of Health. , Bethesda, Maryland, USA. 1997-2007 (1997).
- Dubrovsky, J. G., Forde, B. G. Quantitative analysis of lateral root development: pitfalls and how to avoid them. The Plant Cell. 24 (1), 4-14 (2012).
- Weeks, J. T., Ye, J., Rommens, C. M. Development of an in planta method for transformation of Alfalfa (Medicago sativa). Transgenic Research. 17 (4), 587-597 (2008).
- Shukla, D., Krishnamurthy, S., Sahi, S. V. Microarray analysis of Arabidopsis under gold exposure to identify putative genes involved in the synthesis of gold nanoparticles (AuNPs).Genomics Data. 3, 100-102 (2015).
