Summary
Vi bruger enkle laboratorieværktøjer til at undersøge rodsystemarkitekturen (RSA) af Arabidopsis og Medicago. Planterne dyrkes hydroponisk over mesh og spredes ved hjælp af en kunstbørste for at afsløre RSA. Billeder tages ved hjælp af scanning eller et kamera med høj opløsning og analyseres derefter med ImageJ for at kortlægge træk.
Abstract
Omfattende viden om udvikling af planterodssystemarkitektur (RSA) er afgørende for at forbedre effektiviteten af næringsstofudnyttelsen og øge afgrødesortens tolerance over for miljømæssige udfordringer. En eksperimentel protokol præsenteres til opsætning af hydroponisk system, plantlet vækst, RSA spredning og billeddannelse. Fremgangsmåden anvendte et magenta boxbaseret hydroponisk system indeholdende polypropylennet understøttet af polycarbonatkiler. Eksperimentelle indstillinger eksemplificeres ved at vurdere planternes RSA under varierende næringsstofforsyning (fosfat [Pi]). Systemet blev etableret for at undersøge RSA af Arabidopsis, men det er let at tilpasse til at studere andre planter som Medicago sativa (lucerne). Arabidopsis thaliana (Col-0) plantlets anvendes i denne undersøgelse som et eksempel til at forstå planten RSA. Frøene overfladesteriliseres ved behandling af ethanol og fortyndet kommercielt blegemiddel og opbevares ved 4 °C til stratificering. Frøene spires og dyrkes på et flydende halv-MS-medium på et polypropylennet understøttet af polykarbonatkiler. Planterne dyrkes under standardvækstbetingelser i det ønskede antal dage, forsigtigt plukket ud af masken og nedsænket i vandholdige agarplader. Hvert rodsystem af planterne spredes forsigtigt på den vandfyldte plade ved hjælp af en rund kunstbørste. Disse petriplader fotograferes eller scannes i høj opløsning for at dokumentere RSA-egenskaberne. Rodegenskaberne, såsom primær rod, laterale rødder og forgreningszone, måles ved hjælp af den frit tilgængelige ImageJ-software. Denne undersøgelse giver teknikker til måling af planters rodegenskaber i kontrollerede miljøindstillinger. Vi diskuterer, hvordan man (1) dyrker planterne og indsamler og spreder rodprøver, (2) får billeder af spredte RSA-prøver, (3) fanger billederne og (4) bruger billedanalysesoftware til at kvantificere rodattributter. Fordelen ved den nuværende metode er den alsidige, nemme og effektive måling af RSA-egenskaberne.
Introduction
Rodsystemarkitekturen (RSA), som er under jorden, er et vigtigt organ for plantevækst og produktivitet 1,2,3. Efter fosterstadiet gennemgår planter deres mest betydningsfulde morfologiske ændringer. Den måde, hvorpå rødderne vokser i jorden, påvirker i høj grad væksten af plantedele over jorden. Rødvækst er det første skridt i spiring. Det er et informativt træk, da det unikt reagerer på forskellige tilgængelige næringsstoffer 1,2,3,4. RSA udviser en høj grad af udviklingsmæssig plasticitet, hvilket betyder, at miljøet altid bruges til at træffe beslutninger om udvikling 2,5. Ændringer i miljøet har vanskeliggjort afgrødeproduktionen i det nuværende scenario. RSA indarbejder løbende miljøsignaler i udviklingsvalg5. Som følge heraf er en grundig forståelse af principperne bag rodudvikling afgørende for at lære, hvordan planter reagerer på skiftende miljøer 2,5.
RSA registrerer varierende næringsstofkoncentrationer og gør fænotypiske ændringer 4,6,7,8,9,10,11,12. Undersøgelser tyder på, at rodmorfologi/RSA er meget plastisk sammenlignet med skudmorfologi 1,3. RSA-egenskabskortlægning er yderst effektiv til registrering af effekten af at ændre det omgivende jordmiljø 1,11,12.
Generelt er uoverensstemmelser i effekten af forskellige næringsstofmangler på rodfænotypen blevet rapporteret i mange tidligere undersøgelser 3,11,13,14,15. For eksempel er der flere kontrasterende rapporter om fosfat (Pi) sultinducerede ændringer i antallet, længden og densiteten af laterale rødder (LR'er). Der er rapporteret om en stigning i LR-tætheden under pi-mangelfuld tilstand 6,8. I modsætning hertil er et fald i LR-tætheden under Pi-mangelfulde forhold også blevet rapporteret af andre forfattere 3,13,16. En af de fremtrædende årsager til disse uoverensstemmelser er brugen af det elementære forureningsudsatte geleringsmedium, som agar ofte indeholder10. Forskere dyrker typisk deres eksperimentelle planter på et agarbaseret pladesystem og registrerer rodegenskaberne. Talrige RSA-egenskaber er ofte skjult eller forankret i agarmaterialet og kan ikke dokumenteres. Eksperimenter forbundet med inducerende næringsstofmangel, hvor brugere ofte udelukker en komponent helt fra mediet, kan ikke udføres i geleringsmedium med tendens til elementær forurening11,14,15. Talrige næringsstoffer er ofte til stede i betydelige mængder i agarmedierne, herunder P, Zn, Fe og mange flere11,14,15. Desuden er RSA-væksten langsommere i agarbaserede medier end i ikke-agarbaseret flydende medium. Som følge heraf er der behov for at etablere en alternativ ikke-agarbaseret tilgang til kvantificering og kvalitativ registrering af fænotypen af RSA. Derfor er den nuværende metode blevet udviklet, hvor plantlets opdrættes i et magenta boxbaseret hydroponisk system oven på et polypropylennet understøttet af polycarbonatkiler 1,10,11.
Denne undersøgelse præsenterer en detaljeret improviseret version af den tidligere metode beskrevet af Jain et al.10. Denne strategi er tilpasset de aktuelle krav inden for planterodsbiologi og kan også bruges til planter som lucerne, bortset fra modelplanter. Protokollen er den primære måde at måle ændringerne i RSA på, og den kræver kun simpelt udstyr. Denne protokol illustrerer, hvordan man fænotype flere rodfunktioner, såsom primære og laterale rødder i normalt og modificeret medium (Pi-mangel). Trinvise anvisninger og andre nyttige tip hentet fra forfatterens erfaringer leveres for at hjælpe forskerne med at følge med de metoder, der tilbydes i denne metode. Denne undersøgelse har til formål at give en enkel og effektiv metode til at afsløre hele rodsystemet af planter, herunder LR'er af højere orden. Denne metode involverer manuel spredning af rodsystemet med en rund akvarel kunstbørste, hvilket giver mulighed for præcis kontrol over eksponeringen af rødderne 1,10,11,12. Det kræver ikke dyrt udstyr eller kompliceret software. Denne metode har forbedret næringsstofoptagelse og vækstrate; Planter har en næringsrig opløsning, der let absorberes af deres rødder. Den nuværende metode er velegnet til forskere, der ønsker at kortlægge egenskaberne ved en plantes rodsystem i detaljer, især under tidlig udvikling (10-15 dage efter spiring). Det er velegnet til små rodsystemer, modelplanter som Arabidopsis og tobak og ikke-konventionelle planter som lucerne, indtil deres rodsystem passer i magentakasserne.
Trinene til fænotypisk analyse af RSA-udviklingen i Arabidopsis er skitseret i denne protokol som følger: (1) metoden til frøoverfladesterilisering for planter (Arabidopsis), (2) trinene til oprettelse af det hydroponiske system, efterfulgt af frøsåning på et medium, (3) procedure for udtagning af de komplette såninger og spredning på petripladen til RSA-analyse, (4) hvordan man optager billederne til RSA, og (5) beregner vigtige RSA-parametre ved hjælp af ImageJ-software.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hele protokollen er opsummeret skematisk i figur 1, der viser alle de væsentlige trin, der er involveret i at afsløre rodsystemets arkitektur (RSA) af planter. Protokoltrin er beskrevet detaljeret nedenfor:
1. Sterilisering af arabidopsisfrø
- Overfør en lille skefuld (ca. 100 frø = ca. 2,5 mg) frø til et mikrofugerør, og blød i 30 minutter i destilleret vand ved stuetemperatur (RT). Hele denne procedure udføres i aseptisk tilstand.
- Centrifuger kortvarigt mikrofugerøret, der indeholder frø ved 500 x g i 5 s, ved hjælp af en hvilken som helst bordpladecentrifuge ved RT for at lade frøene slå sig ned.
- Dekanter vandet, tilsæt 700 μL 70% (v / v) ethanol, hvirvel i et par sekunder og centrifuger. Gentag hvirvelstrømmen og centrifugeringen, hvis det er nødvendigt, men sørg for, at behandlingstiden for 70% ethanol forbliver på 3 min.
- Efter 3 minutter skylles straks en gang med sterilt vand. Hold ethanolvasketrinnet så rettidigt som muligt, da langvarig ethanoleksponering reducerer spiring.
- Behandl frøene med fortyndet kommercielt blegemiddel (4% v / v) med en dråbe Tween-20 i 7 min. Bland frøene med blegemiddelopløsning ved at vende rørene hurtigt 8-12 gange, efterfulgt af en kort centrifuge (500 x g i 5 s ved RT). Skum ses dukke op i røret.
- Supernatanten dekanteres med en pipette på 1 ml, og frøene skylles med mindst fem vaske med sterilt vand efter samme hvirvelprocedure.
- Lad de overfladesteriliserede frø stå i vand og inkuber i 2-3 dage ved 4 °C til stratificering10.
2. Indstilling af et hydroponisk system til frøspiring
- Fyld en standard magentakasse halvt med destilleret vand og autoklave den. Autoklave polykarbonatarket (klar farve og glat tekstur) og skær 4 cm x 8 cm rektangler med et midtpunkt hakket mere end halvvejs gennem rektanglet, så to rektangler kan stikke sammen for at danne en X-form10. Brug denne opsætning til at holde polypropylennettet (6 cm x 6 cm firkanter med 250 μm porestørrelse eller, afhængigt af kravet) skåret fra 12x 24 tommer ark10.
BEMÆRK: Polypropylen er meget resistent over for syrer, alkalier og andre kemikalier; Derfor er det blevet valgt. Autoklavering har tendens til at forvrænge polypropylennet; Derfor anbefales det at bæres separat indpakket i aluminiumsfolie. Typiske autoklaveringsforhold på 16 min, 121 °C, 15 psi eller 775 mm Hg anbefales. - Tilsæt sterile halv-MS basalmedier med vitamin + 1,5% (w/v) saccharose, som beskrevet af Shukla et al.1, til hver kasse for at nå den nederste kant af polypropylennettet i en laminær strømning. Alle procedurer udføres under aseptiske forhold.
- Så de overfladesteriliserede frø på masken (250 μm porestørrelse) hydroponisk og lad dem vokse i 3 dage.
- Efter 3 dage overføres frøplanterne til et maske (500 μm porestørrelse) og lad dem vokse i 2 dage.
- Efter 2 dage (i alt 5 dage) overføres frøplanterne til kontrolmediet (dvs. modificeret MS-næringsmedie 1 indeholdende 2,0 mMNH4NO3, 1,9 mM KNO3, 0,15 mM MgSO4·7H2O,0,1 mMMnSO4· H 2 O, 3,0 μM ZnSO 4·7H 2 O, 0,1 μM CuSO 4·5H 2 O, 0,3 mM CaCl 2·2H 2 O, 5,0 μM KI, 0,1 μM CoCl 2·6H 2 O, 0,1 mM FeSO 4·7H 2 O, 0,1 mM Na 2 EDTA·2H 2 O, 1,25 mM KH 2PO 4, 100 μM H 3 BO3, 1 μMNa2MoO4·2H2O, 1,5% saccharose, 1,25 mM MES, pH 5,7 justeret med 0,1 M MES [pH 6,1]) og til forsøgsmedierne (f.eks. P- [0 mM] behandling; KH 2 PO4 erstattes med 0,62 mM K2SO4 fra styremediets sammensætning som nævnt ovenfor1. Ved overskydende Pi-behandlinger øges koncentrationen af KH 2 PO4 i modificeret MS-medium [2,5, 5,0, 10,0, 20,0 mM]1) og lad frøene vokse i 7 dage.
BEMÆRK: En større maskeporestørrelse (500 μm) letter jævn plukning af hele frøplanter uden skader eller behov for at skære ved hypocotylen. Planter vokser under standard vækstbetingelser (dvs. 16 timers lys / 8 timers mørk fotoperiode, 150 μmol · m-2 · s-1 lysintensitet, 60% - 70% fugtighed) ved 23 ° C.
3. Undersøgelse af RSA
- Forbered agar (1,1%) plader til rodspredning (petripladestørrelse: 150 mm x 15 mm).
- Tilsæt 10-20 ml autoklaveret filtreret postevand til petripladen, som nævnt ovenfor. Træk forsigtigt frøplanterne ud af masken (500 μm) og nedsænk dem i vand på pladerne.
- Spred forsigtigt hver plantes rod i den vandfyldte plade ved hjælp af en rund akvarelkunstbørste (størrelser: nr. 14, 16, 18 og 20).
BEMÆRK: Mens du udfører spredningen af rodsystemet, skal du først få fat i den primære rod og sprede den i en lige linje, da den fungerer som en akse. Spred derefter LR'erne symmetrisk på hver side af den primære rod, hvor det er muligt. Derefter spredes andenordens LR, der er knyttet til førsteordens LR. Denne spredningsproces er en slags kunst; gør det forsigtigt, langsomt, som en kunstner, der tegner et billede af RSA. - Vip pladen lidt for at fjerne vandet.
BEMÆRK: På dette tidspunkt kan proceduren sættes på pause ved at sætte disse spredeplader ved 4 °C. Senere, når billedbehandling er påkrævet, skal du tage pladerne ud og placere dem på RT et stykke tid. Tør det kondenserede vand ud, og derefter kan billedet behandles bekvemt.
4. Optagelse af billeder til RSA
- Scan eller fotografer disse petriplader korrekt.
BEMÆRK: For at opnå fotografier i høj kvalitet anbefales 600 dpi-opløsningen til scanning, og mindst et 12 megapixel kamera anbefales til fotografering. - Mål rodsystemets arkitekturtræk ved hjælp af frit tilgængelig ImageJ-software (https://imagej.nih.gov/ij/index.html). For hurtigt at følge trinnene til måling af rodlængden ved hjælp af ImageJ-software henvises til eksemplet "måling af DNA-konturlængde"17.
BEMÆRK: Disse trin følges for at måle rodlængderne på billeder, der er taget med en scanner eller et kamera med høj opløsning.- Brug en given længdeafstand til at indstille skalaen. Den kendte afstand til skalabjælken i figur 3 er 2 cm. Vælg værktøjet Lige linje på værktøjslinjen ImageJ (femte værktøj fra venstre). Brug værktøjet Lige linje til at oprette en stregmarkering, der skitserer skalalinjen. Afslut dispositionen ved at højreklikke, dobbeltklikke eller klikke i feltet i begyndelsen.
- Mål længden af den kendte skalalinje i pixel ved hjælp af værktøjslinjen Analysér > måling . Notér pixellængden.
- Åbn dialogboksen Angiv skala ved at klikke på fanen Angiv skala under fanen Analysér. Angiv pixellængden i feltet Afstand i pixel (som nævnt ovenfor). Indtast derefter værdien i feltet Kendt afstand som vist med skalabjælken (her er den 20 mm). Indstil længdeenheden som mm. Pixel-billedformatet er 1,0. Nu er skalaen specificeret af x antal pixels pr. Millimeter. For at låse skalaen for dette særlige billede skal du klikke på OK.
- Opret en linjemarkering, der skitserer rodlængden ved hjælp af værktøjet Segmenteret linje . Afslut dispositionen ved at højreklikke, dobbeltklikke eller klikke i feltet i begyndelsen. Klik og træk de små sort-hvide "håndtag" langs konturen for at justere linjevalget efter behov.
- Brug kommandoen Mål under fanen Analysér i BilledeJ til at kvantificere rodens længde. Hvis du vil overføre de målte data til et regneark, skal du højreklikke på vinduet Resultater , vælge Kopiér alle i pop op-menuen, skifte til regnearket og derefter indsætte dataene.
BEMÆRK: Som beskrevet ovenfor skal du indstille skalaen ved hjælp af den kendte afstand til skalabjælken i indstillingen ImageJ-indstillet skala. Dette giver antallet af pixels pr. Længdeenhed. Det er nødvendigt at indstille skalaen hver gang, når et nyt billede analyseres.
- Måling og beregning af RSA-egenskaber
- Mål den primære rodlængde mellem hypocotylkrydset til rodspidsens ende.
- Mål LR-længden af første og anden orden.
- Mål forgreningszonen (BZ) for den primære rod. Forgreningszonen for den primære rod (BZPR) spænder over det første LR-fremspringspunkt til det sidste LR-fremspringspunkt.
- Registrer antallet af LR'er, som er antallet af LR'er med oprindelse inden for BZPR's grænse.
- Mål den gennemsnitlige længde af førsteordens LR'er og LR'er af højere orden. Udled den gennemsnitlige længde af førsteordens LR (1° LR) (centimeter pr. rod) ved at dividere den samlede længde af 1° LR med det samlede antal 1° LR'er.
- Mål den gennemsnitlige længde af andenordens LR. Beregn den gennemsnitlige længde af andenordens LR (2° LR) ved at dividere den samlede længde af 2° LR med det samlede antal 2° LR'er.
- Mål tætheden på 1° LR. Beregn densiteten på 1° LR (antal 1° LR'er pr. længdeenhed af BZ PR) ved at dividere antallet af 1° LR'er med længden af BZPR.
- Mål tætheden på 2° LR. Beregn tætheden på 2° LR ved at dividere antallet af 2° LR'er med længden af BZ på 1° LR'er (antal 2° LR'er pr. længdeenhed af BZ på 1° laterale rødder).
- Mål den samlede rodlængde (TRL). Dette er summen af den primære rod, 1° LR og 2° LR (og mere, hvis den findes) længder.
5. Måling af rodhår
BEMÆRK: Selvom det hydroponiske system ikke er godt til at fremme rodhårvækst og udvikling, på trods af at det er så robust som det er i solide vækstmedier, er det stadig vigtigt at studere det i den nuværende sammenhæng. Følg nedenstående trin for at analysere rodhårudvikling i en 5 mm sektion fra spidsen af plantens primære rod.
- Hak en 2 cm sektion af den primære rod fra rodspidsen.
- Monter rodsektionen på et objektglas med 10% glycerol som monteringsmedium.
- Placer diaset under et stereomikroskop.
- Brug den aksiale bærer til at visualisere og tage billeder af rodhårene.
- Analyser billederne for at studere rodhårenes struktur og egenskaber ved hjælp af ImageJ-software som tidligere beskrevet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De forskellige morfometriske træk ved rodsystemarkitektur (RSA) måles ved hjælp af enkle laboratorieværktøjer, og trinene er afbildet skematisk i figur 1. Detaljerne i den hydroponiske opsætning viser protokollens potentiale til måling af RSA (figur 1 og figur 2).
I betragtning af de observerede forskelle i geleringsmidler brugte vi et hydroponisk dyrkningssystem til at udføre alle undersøgelserne 3,10. Som et bevis på konceptet fungerer dette hydroponiske system godt, hvilket afspejler den tilsyneladende kontrasterende fænotype under Pi-mangelfulde og tilstrækkelige betingelser (figur 3). Arabidopsisfrø blev hydroponisk dyrket i 5 dage i et halvt MS-medium på et polypropylennet, som illustreret i figur 2. Planterne blev transplanteret efter 5 dage i Pi-mangelfulde og tilstrækkelige forhold og fik lov til at vokse i 7 dage (figur 3).
Påvisning af RSA-egenskaber under varieret næringsstofforsyning (Pi)
Vi har fulgt en etableret ordning for at analysere og registrere træk ved RSA3. Forskellige RSA-træk blev analyseret under kontrasterende Pi-regimer under hydroponiske forhold (figur 3). Pi mangelfuld behandling (0 mM Pi) påkaldte en typisk rapporteret rodfænotype, der udviser en kortere, lavere og mindre forgrenet RSA sammenlignet med Pi tilstrækkelig tilstand (figur 3A). Den primære rodlængde blev signifikant svækket under Pi-mangelfuld tilstand (figur 3A, B). Primær rodlængde, hurtigt opnået i nærvær af Pi (1,25 mM), viser effektiviteten af det hydroponiske system, der afspejler de fysio-morfologiske ændringer tilstrækkeligt (figur 3A, B). TRL blev signifikant reduceret under Pi-mangel (figur 3B). Forgreningszonen (BZPR), som vist i figur 3A, blev signifikant svækket under Pi-mangelfuld tilstand (figur 3B).
Af disse træk var TRL den mest berørte på grund af den store forskel i LR-antal mellem de to Pi-betingelser. Den kraftige vækst i RSA under Pi tilstrækkelig betingelse (1,25 mM) skyldtes en betydelig stigning i antallet og længden af 1° LR. Således skete der en hurtig RSA-ændring, hovedsageligt på grund af ændringen i LR-udviklingen. Vi målte antallet af LR'er, der stammer inden for grænsen af den primære rods forgreningszone, da de betragtes som mere meningsfulde 1,3,18. Den gennemsnitlige længde af 1° LR (centimeter pr. rod) blev signifikant reduceret i Pi-mangelfuld tilstand (figur 3C). Den gennemsnitlige længde på 2° LR blev ligeledes reduceret på grund af P0-tilstanden; den var dog lavere i mængde end den gennemsnitlige længde på 1° LR (figur 3C). Antallet af 1° LR'er og 2° LR'er faldt kraftigt underP0-betingelsen sammenlignet med P1,25-betingelsen (figur 3D). Tætheden på 1° LR (antal 1° LR'er pr. centimeter BZPR-længde) blev ikke ændret underP0-betingelsen i forhold til P1,25-betingelsen (figur 3E). Tætheden på 2° LR (antal 2° LR'er pr. centimeter af BZ på 1° LR) viste heller ingen signifikant ændring (figur 3E). Som følge heraf er bestemmelse af tætheden af LR'er afgørende for at få nyttig indsigt i RSA-plasticiteten.
Analyse af rodhårets udvikling under varierende fosfat (Pi) regimer
Effekten af Pi-forsyning på rodhårudvikling blev undersøgt i plantens primære rod. Det blev konstateret, at rodhårlængden steg med stigende koncentrationer af Pi op til 2,5 mM, men faldt ved 5 mM og 10 mM. Ved 20 mM vendte rodhårlængden imidlertid tilbage til næsten topniveauer (supplerende figur 1). Antallet af rodhår var signifikant højere ved 0 mM sammenlignet med alle andre Pi-forsyninger, med det højeste antal observeret ved 20 mM (supplerende figur 1).
Anvendelse af denne metode på andre planter end Arabidopsis
Vi har undersøgt gennemførligheden af den nuværende metode på andre planter end Arabidopsis, idet vi anvender Medicago sativa (lucerne) som forsøgsplante. Protokollen er blevet ændret i henhold til kravet om to aspekter: (1) frøoverfladesteriliseringsmetoden og (2) porestørrelsen af polypropylennettet (nu større, 1.000 μm). Steriliserings- og stratificeringsprotokollen for overfladefrø skal altid optimeres afhængigt af de valgte planter, der skal studeres. For lucerne blev trin fulgt som beskrevet af Weeks et al.19. Efter overfladesterilisering blev frøene inkuberet ved 4 °C i 7 dage til stratificering. Derefter fulgte vi den samme procedure beskrevet i denne protokol med en ændring af maskeporestørrelsen. Som vist i figur 4A,B var planterne velvoksne med en ændret RSA under varierende forsyninger af Pi. Figur 4C viser rodsystemets plasticitet under 1,25, 0 og 20 mM Pi-næringsopløsning. Overskydende Pi (20 mM) og mangelfuld Pi-forsyning førte til faldende udvikling af rodsystemet sammenlignet med Pi-tilstrækkelig (1,25 mM) tilstand (kontrol) (figur 4C). RSA kan kortlægges for forskellige egenskaber ved hjælp af ImageJ-softwaren, der er beskrevet i protokollen. Derfor er protokollen enkel, effektiv og kan let ændres i henhold til de valgte plantearter. Det giver mulighed for at studere RSA af forskellige plantearter under forskellige næringsstofforhold.
Figur 1: Skematisk oversigt over proceduren. Det skematiske diagram skitserer de vigtigste trin i metodeprotokollen til kortlægning af RSA. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Visning af hydroponisk opsætning i magenta kasser til dyrkning af planter . (Som beskrevet af Jain et al.10, med ændringer). (A) To rektangulære stykker (4 cm x 8 cm) med hak af polycarbonatkiler til montering af opsætningen. (B) Samlingen af polycarbonatkiler ind i hinanden gennem hak, der bliver til en X-form for at understøtte maskeoverfladen. C) Et 250 μm polypropylennetark (6 cm x 6 cm). (D) Set ovenfra af samlingen af polykarbonatkiler i magentakassen. E) Samling af polypropylenmasken på polykarbonatkilerne i en magentakasse fyldt med medier. (F) En visning af Arabidopsis plantlets spiret på masken. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Påvisning af typisk RSA-modulation under varierende næringsstofforhold (Pi-mangel [0 mM] og tilstrækkelig [1,25 mM]) ved hjælp af denne fænotypemetode. Arabidopsis (Col-0) frøplanter dyrkes hydroponisk i 0,5x MS-medier i 5 dage og udsættes derefter for Pi-mangelfulde og tilstrækkelige forsyninger (henholdsvis 0 og 1,25 mM) og dyrkes i 7 dage, som vist i figur 2. (A) Individuelle planter trækkes ud af polypropylennettet (500 μm) og spredes på agar petripladerne ved hjælp af en rund kunstbørste og vand. Data om RSA-egenskaber præsenteres for (B) primær rodlængde (PR), total rodlængde (TRL), forgreningszone (BZ), (C) gennemsnitlig (Av.) første ordens lateral rodlængde (1 ° LR længde), gennemsnitlig (Av.) anden ordens lateral rodlængde (2 ° LR længde), (D) antal 1 ° LR og 2 ° LR og (E) 1 ° LR og 2 ° LR tæthed. Værdier er midler ± SE; n = 21. Denne figur er blevet ændret fra Shukla et al.1. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Demonstration af Medicago sativa (lucerne) rodsystem som et eksempel for at vise anvendeligheden af denne metode til andre planter udover Arabidopsis . (A) Set fra siden af den magenta kasse, der viser væksten af lucerne plantlets. (B) Det øverste billede af magentakassen viser skuddets fremkomst på polypropylennettet (porestørrelse på 1.000 μm). (C) Den typiske rodsystemarkitektur (RSA) for lucernemodulation under varierende næringsstofforhold (Pi-mangel [0 mM], overskydende Pi [20 mM] og tilstrækkelig eller kontrol [1,25 mM]) ved hjælp af denne RSA-fænotypemetode. Alfalfaplanter dyrkes hydroponisk i 0,5x MS-medier i 5 dage, udsættes for Pi-mangel, tilstrækkelige og overskydende forsyninger (henholdsvis 0, 1,25 og 20 mM) og dyrkes i 7 dage. Individuelle planter trækkes ud af polypropylennettet (1.000 μm) og spredes på agar petripladerne, som vist i C, ved hjælp af en kunstbørste og vand. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende figur 1: Forskellige overskydende Pi-koncentrationer modulerer rodhårets udvikling. WT-frøplanter blev dyrket hydroponisk, som beskrevet i protokollen. (A) En 1-2 cm sektion fra spidsen af primærroden blev hakket og monteret på et objektglas med 10% glycerol, og et område på 5 mm fra spidsen blev dokumenteret for rodhårets antal og længde. Data præsenteres for (B) rodhårets længde og (C) antallet af rodhår i et 5 mm område af den primære rodspids. Værdier er midler ± SE; n = 10 (B og C). Søjler med forskellige alfabogstaver adskiller sig markant (p ≤ 0,05) i henhold til elevens parrede t-test. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dette arbejde demonstrerede kortlægning af RSA ved hjælp af simpelt laboratorieudstyr. Ved hjælp af denne metode registreres fænotypiske ændringer på det raffinerede niveau. Fordelen ved denne strategi er, at skuddelen aldrig kommer i kontakt med medierne, så fænotypen af plantene er original. Denne metode indebærer oprettelse af et hydroponisk system til dyrkning af planter som beskrevet i protokollen. Derefter tages hver plante intakt ud og placeres på en agarfyldt petriplade. Rotsystemet får derefter lov til at sprede sig manuelt ved hjælp af en kunstbørste, og fotografier tages for at blive analyseret med ImageJ-software 1,10,11,12.
Frøspiring kræver frøoverfladesterilisering for at fjerne bakterier, svampe og vira. Alkohol - 70% ethanol - bruges til at sterilisere frøoverflader. For at desinficere frø uden at ødelægge dem, skal behandlingstiden for alkoholsterilisering følges nøje. Frøspiring falder, når alkoholsterilisering er overdrevet. Behandlingstidspunkterne varierer med forskellige plantearter (f.eks. for Arabidopsis er tidsgrænsen kun 3 min 1,10,11,12,20, mens den for Medicago sativa er 5 min 19. For at lette en jævn plukning af RSA til analyse er det vigtigt at begrænse antallet af frø pr. maske eller magentakasse for at forhindre sammenfiltring af rodsystemetindbyrdes 1,10,11,12. Dette kan opnås ved at bruge et mindre antal frø pr. Maske. For eksempel kan brug af fire frø pr. maske bidrage til at reducere risikoen for sammenfiltring, samtidig med at det giver mulighed for robust vækst og udvikling af rodsystemerne. Det er vigtigt at bemærke, at det optimale antal frø pr. Maske afhænger af den specifikke planteart og målene for RSA-analysen. For eksempel, hvis et eksperiment kræver væv til yderligere nedstrøms behandlingskrav som RNA-isolering, anbefales bulksåning i dette tilfælde (100 frø pr. maske i tilfælde af Arabidopsis)1,10,11,12. Plukning af planter fra masken er en delikat proces, der kræver yderste omhu og opmærksomhed 1,10,11. Det er vigtigt at nærme sig denne opgave langsomt, forsigtigt og omhyggeligt for at undgå at beskadige de sarte planter. For at plukke planter fra masken anbefales det at bruge fin pincet eller tang til at gribe planterne forsigtigt, men fast. Planterne skal forsigtigt løftes ud af masken for at undgå at forstyrre rodsystemet eller forårsage skade på planterne. Det er vigtigt at være tålmodig og tage sig tid til omhyggeligt at fjerne hver plante fra masken for at sikre, at de ikke beskadiges under processen. Det er en gradvis proces, der skal udføres langsomt, forsigtigt og omhyggeligt for at sikre eksperimentets succes. For nøjagtigt at måle RSA for plantlets er det afgørende at markere en skala på petripladen for at muliggøre præcis måling 1,10,11. Dette kan gøres ved at bruge en permanent markør til at tegne en linje på petripladen i en kendt afstand, såsom 1 cm eller 2 cm. Skalaen skal placeres langs kanten af petripladen på et synligt sted. Ved hjælp af en børste er det også vigtigt at være yderst forsigtig, når du spreder RSA. Den primære rod skal placeres omhyggeligt i midten af petripladen, og laterale rødder skal spredes ud på begge sider af den primære rod. Rotsystemet skal delvist nedsænkes i vand for at lette spredningen. For at måle hver ny petriplade skal man indstille skalaen i ImageJ-softwaren hver gang.
Få ændringer kan anvendes til at forbedre effektiviteten, ikke-invasiviteten og effektiviteten af RSA-analyse1. En sådan forbedring er at ændre porestørrelsen af polypropylennettet, der bruges til at holde plantagerne. Porestørrelsen af masken kan justeres, så den passer til de specifikke behov hos de plantearter, der undersøges, og for at optimere væksten og udviklingen af rodsystemerne 1,10,11,12. For eksempel letter en større maskeporestørrelse (500 μm) den glatte plukning af hele frøplanter uden at skære hypocotylen, som tidligere blev praktiseret10,11,12. Desuden kan en større porestørrelse være mere egnet til større plantearter RSA, mens en mindre porestørrelse kan være mere passende for mindre plantearter. En anden ændring, der kan foretages, er at pakke polypropylennettet ind i aluminiumsfolie for at forhindre, at det bøjes. Dette kan hjælpe med at bevare maskens form og integritet, hvilket gør den velegnet til at fungere som en flad gulvmatrix. Ud over disse ændringer kan andre fejlfindingsteknikker anvendes til at løse eventuelle problemer, der måtte opstå under RSA-analyse. For eksempel, hvis planterne ikke vokser eller udvikler sig som forventet, kan det være nødvendigt at justere miljøforholdene, såsom temperatur, fugtighed og lysniveauer. Hvis rodsystemerne er sammenfiltrede, kan det være nødvendigt at reducere antallet af frø pr. Maske som nævnt ovenfor.
En af de største fordele ved RSA-analyse er, at det giver mulighed for at studere planterodsystemer uden behov for agar. Agar anvendes almindeligvis som et størkningsmiddel i plantevævskultur og frøspiringsforsøg. Brug af agar kan dog introducere elementær forurening, der potentielt kan generere artefakter og påvirke nøjagtigheden af resultaterne10. Ved at udelukke kravet om agar eliminerer RSA-analyse risikoen for agarafledt elementær kontaminering og potentialet for artefakter. Dette gør RSA-analyse til en mere pålidelig og præcis metode til at studere planterodsystemer 1,3,10,11,12. F.eks. har virkningerne af Pi-berøvelse på lateral rodtæthed været genstand for en række modstridende rapporter. Det er blevet rapporteret, at LR-densiteten stiger, når Pi er lav 6,8. I modsætning hertil er der også fundet et fald i lateral rodtæthed under Pi-mangelfulde forhold 3,13,16. Disse uoverensstemmelser kan tilskrives det agarbaserede vækstmediesystem, hvor arbejdere bruger forskellige agarmærker til at jellificere medier med varierende grader af Pi-forurening10. Igen kan eksperimenter, der søger at illustrere effekten af Zn-mangel på RSA, muligvis ikke udføres tilstrækkeligt ved hjælp af den agarbaserede petriplademetode, fordi det agarbaserede geleringsmedium også inkluderer Zn-forurening11. Derfor er udførelse af RSA-analyse muligvis ikke egnet til at undersøge næringsstofmangel ved hjælp af det agarbaserede geleringsmedium. For det andet udvikler planter, der dyrkes på agarbaserede geleringsmedier, ikke så hurtigt som dem, der dyrkes hydroponisk. For det tredje, fordi RSA typisk er indlejret i et agarmedium, vises mange rodfunktioner ikke korrekt. For det fjerde forårsager fjernelse af RSA fra mediet ofte betydelig skade på RSA og gør det til en destruktiv prøveudtagningsteknik.
Den tidligere hydroponiske teknik, som offentliggjort af Jain et al.10, anvendte en polypropylenmaskestørrelse på 250 μm, som havde smallere porer, der ikke gjorde det muligt at trække den intakte RSA ud. Som følge heraf måtte vi i det pågældende tilfælde skære planterne fra hypocotylområdet for at adskille RSA og gøre det til en destruktiv prøveudtagningsmetode10,11,12. Den eksisterende metode improviseres for at gøre den ikke-destruktiv ved hjælp af et polypropylennet med en større porestørrelse (500 μm), der gør det muligt at trække hele Arabidopsis-plantlets intakte ud uden at forårsage skade på RSA1. Det er værd at bemærke, at vi altid kan justere porestørrelsen på polypropylennettet afhængigt af plantens type. For eksempel illustrerer figur 4, hvordan en lignende tilgang kan bruges til at kortlægge RSA for forskellige planter, såsom Medicago sativa (lucerne). Vi har valgt polypropylenporestørrelsen på 1 mm for at imødekomme Medicago rodsystemet.
En ulempe ved dette system kan være udviklingen af rodhår, som ofte ikke blomstrer under hydroponiske systemer sammenlignet med agarpladesystemer. Den primære årsag er den lette tilgængelighed af næringsstoffer i flydende medier snarere end i faste medier. Selvom vi observerede udviklingen af rodhår (ikke robuste) ved hjælp af det samme system og opnåede resultaterne (supplerende figur 1). Tilgængeligheden af Pi påvirker stærkt rodhårets udvikling10,11. Heri steg rodhårlængden oprindeligt til 2,5 mM og faldt derefter.
Alt i alt er de vigtigste fordele ved systemet: (1) det er en enkel og præcis metode, der ikke kræver noget sofistikeret avanceret avanceret udstyr; (2) metoden tillader hurtig vækst af planterne på grund af dens hydroponiske natur; 3) det er en ikke-destruktiv metode (4) manuel spredning af RSA muliggør korrekt visning af hvert træk, afslører den skjulte RSA og giver brugeren fuld kontrol; og (5) metoden anvender en frit tilgængelig billedbehandlingssoftware (dvs. ImageJ), som også er enkel at bruge.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt.
Acknowledgments
Vi anerkender U.S. Department of Agriculture (Grant 58-6406-1-017) for at støtte denne forskning. Vi anerkender også WKU Biotechnology Centre, Western Kentucky University, Bowling Green, KY, USA, og direktøren, CSIR Central Institute of Medicinal and Aromatic Plants, Lucknow, Indien, for at levere instrumentfaciliteterne og support (CSIR CIMAP manuskriptmeddelelse nr. CIMAP / PUB / 2022/103). SS anerkender den økonomiske støtte fra Saint Joseph's University, Philadelphia, USA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Arabidospsis thaliana (Col 0) | Lehle Seeds | WT-02 | Columbia (Col-0**, no markers)* |
| Art brushes | Amazon or any other vendor | Water color round brush size no. 14 (8 mm), 16 (9.5 mm), 18 (12 mm), and 20 (14.2 mm) | |
| Automated Microscope with digital camera | Leica Microsystems | LAS version 4.12.0, Leica Microsystems | |
| Imaging Software | ImageJ | ImageJ V 1.8.0 |
|
| Magenta box GA-7 | Fisher Scientific | 50-255-176 | |
| Medicago sativa | Johnny's Seeds | ||
| Petri-plate (150 mm x 15 mm) | USA Scientific | 8609-0215 | 150 mm x 15 mm PS Petri Dish (https://www.usascientific.com) |
| Photo camera | Cannon or Nikon | Any high mega pixel (atleast 12 mega pixel per inch) camera on macro mode | |
| Plant-Agar | Sigma-Aldrich | A3301 | Agargel Suitable for plant tissue culture |
| Polycarbonate Sheets | Amazon | 1 mm thick | |
| Polypropylene Mesh | Amazon | Pore size 250 µm, 500 µm and 1000 µm | |
| Scanner | Epson | Epson Perfection V700 Photo (Scan at 600 dpi) |
References
- Shukla, D., Rinehart, C. A., Sahi, S. V. Comprehensive study of excess phosphate response reveals ethylene mediated signaling that negatively regulates plant growth and development. Scientific Reports. 7 (1), 3074 (2017).
- Rellán-Álvarez, R., Lobet, G., Dinneny, J. R. Environmental control of root system biology. Annual Review of Plant Biology. 67, 619-642 (2016).
- Gruber, B. D., Giehl, R. F. H., Friedel, S., von Wirén, N. Plasticity of the Arabidopsis root system under nutrient deficiencies. Plant Physiology. 163 (1), 161-179 (2013).
- Shukla, D., et al. Genome-wide expression analysis reveals contrasting regulation of phosphate starvation response (PSR) in root and shoot of Arabidopsis and its association with biotic stress. Environmental and Experimental Botany. , 188 (2021).
- Robbins 2nd,, E, N., Dinneny, J. R. Growth is required for perception of water availability to pattern root branches in plants. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (4), E822-E831 (2018).
- Linkohr, B. I., Williamson, L. C., Fitter, A. H., Leyser, H. M. O. Nitrate and phosphate availability and distribution have different effects on root system architecture of Arabidopsis. The Plant Journal. 29 (6), 751-760 (2002).
- Lynch, J. P., Brown, K. M. Topsoil foraging: an architectural adaptation of plants to low phosphorus availability. Plant and Soil. 237 (2), 225-237 (2001).
- López-Bucio, J., et al. Phosphate availability alters architecture and causes changes in hormone sensitivity in the Arabidopsis root system. Plant Physiology. 129 (1), 244-256 (2002).
- Jain, A., et al. Differential effects of sucrose and auxin on localized phosphate deficiency-induced modulation of different traits of root system architecture in Arabidopsis. Plant Physiology. 144 (1), 232-247 (2007).
- Jain, A., et al. Variations in the composition of gelling agents affect morphophysiological and molecular responses to deficiencies of phosphate and other nutrients. Plant Physiology. 150 (2), 1033-1049 (2009).
- Jain, A., Sinilal, B., Dhandapani, G., Meagher, R. B., Sahi, S. V. Effects of deficiency and excess of zinc on morphophysiological traits and spatiotemporal regulation of zinc-responsive genes reveal incidence of cross talk between micro- and macronutrients. Environmental Science and Technology. 47 (10), 5327-5335 (2013).
- Jain, A., et al. Role of Fe-responsive genes in bioreduction and transport of ionic gold to roots of Arabidopsis thaliana during synthesis of gold nanoparticles. Plant Physiology and Biochemistry. 84, 189-196 (2014).
- Williamson, L. C., Ribrioux, S. P., Fitter, A. H., Leyser, H. M. Phosphate availability regulates root system architecture in Arabidopsis. Plant Physiology. 126 (2), 875-882 (2001).
- Yang, T. J. W., Lin, W. D., Schmidt, W. Transcriptional profiling of the Arabidopsis iron deficiency response reveals conserved transition metal homeostasis networks. Plant Physiology. 152 (4), 2130 (2010).
- Kobae, Y., et al. Zinc transporter of Arabidopsis thaliana AtMTP1 is localized to vacuolar membranes and implicated in zinc homeostasis. Plant Cell and Physiology. 45 (12), (2004).
- Al-Ghazi, Y., et al. Temporal responses of Arabidopsis root architecture to phosphate starvation: evidence for the involvement of auxin signalling. Plant, Cell and Environment. 26 (7), 1053-1066 (2003).
- S, U. National Institutes of Health. , Bethesda, Maryland, USA. 1997-2007 (1997).
- Dubrovsky, J. G., Forde, B. G. Quantitative analysis of lateral root development: pitfalls and how to avoid them. The Plant Cell. 24 (1), 4-14 (2012).
- Weeks, J. T., Ye, J., Rommens, C. M. Development of an in planta method for transformation of Alfalfa (Medicago sativa). Transgenic Research. 17 (4), 587-597 (2008).
- Shukla, D., Krishnamurthy, S., Sahi, S. V. Microarray analysis of Arabidopsis under gold exposure to identify putative genes involved in the synthesis of gold nanoparticles (AuNPs).Genomics Data. 3, 100-102 (2015).
