Summary
Os tumores do sistema nervoso central (SNC) são a principal causa de morte relacionada ao câncer em crianças, e as terapias loco-regionais baseadas em imunidade estão sendo cada vez mais testadas para pacientes em ensaios clínicos. Este protocolo descreve métodos de implante de cânula locorregional em camundongos para avaliação pré-clínica de infusões imunoterápicas direcionadas a tumores do SNC.
Abstract
Os tumores pediátricos do SNC são responsáveis pela maioria das mortes relacionadas ao câncer em crianças e têm prognóstico ruim, apesar dos avanços na quimioterapia e radioterapia. Como muitos tumores carecem de tratamentos eficazes, há uma necessidade crucial de desenvolver opções terapêuticas mais promissoras, como imunoterapias; o uso de terapia com células T do receptor de antígeno quimérico (CAR) direcionada contra tumores do SNC é de particular interesse. Alvos de superfície celular como B7-H3, IL13RA2 e o disialogangliosídeo GD2 são altamente expressos na superfície de vários tumores pediátricos e adultos do SNC, aumentando a oportunidade de usar a terapia com células T CAR contra esses e outros alvos de superfície. Para avaliar a liberação locorregional repetida de células CAR T em modelos murinos pré-clínicos, foi estabelecido um sistema de cateteres de demora que recapitula cateteres de demora atualmente em uso em ensaios clínicos em humanos. Ao contrário da entrega estereotáxica, o sistema de cateter de demora permite a dosagem repetida sem o uso de múltiplas cirurgias. Este protocolo descreve a colocação intratumoral de uma cânula guia fixa que tem sido usada para testar com sucesso infusões seriadas de células T CAR em modelos murinos ortotópicos de tumores cerebrais pediátricos. Após injeção ortotópica e enxerto das células tumorais em camundongos, a colocação intratumoral de uma cânula guia fixa é completada em um aparelho estereotáxico e fixada com parafusos e resina acrílica. As cânulas de tratamento são então inseridas através da cânula guia fixa para entrega repetida de células T CAR. A colocação estereotáxica da cânula guia pode ser ajustada para entregar células CAR T diretamente no ventrículo lateral ou em outros locais do cérebro. Esta plataforma oferece um mecanismo confiável para o teste pré-clínico de infusões intracranianas repetidas de células T CAR e outras novas terapêuticas para esses tumores pediátricos devastadores.
Introduction
Apesar das melhorias na quimioterapia, radioterapia e cirurgia, os tumores do sistema nervoso central (SNC) são a neoplasia maligna mais letal empediatria1, ressaltando a necessidade importante de novas abordagens com resultados mais bem-sucedidos. Com avanços significativos no campo da imunoterapia, abordagens de terapia celular adotiva (TCA) têm mostrado resultados promissores em vários tipos de câncer, especialmente neoplasiashematológicas2. A terapia com células T do receptor de antígeno quimérico (CAR), um tipo específico de ACT, aproveita a capacidade natural do sistema imunológico de reconhecer e matar células nocivas, redirecionando a especificidade das células T para gerar células T direcionadas ao tumor3. A terapia com células CAR T tem demonstrado sucesso substancial no tratamento de leucemias e linfomas4, tornando-se uma abordagem imunoterapêutica promissora e encorajando sua investigação em tumores sólidos. No entanto, até o momento, a terapia com células CAR T em tumores sólidos tem alcançado pouco sucesso clínico e enfrenta muitos desafios, como penetração tumoral ineficiente, antígenos alvo limitados e omicroambiente tumoral supressor5.
Ensaios clínicos recentes começaram a avaliar a terapia com células T CAR para tumores pediátricos do SNC, fornecendo provas de conceito e evidências precoces da atividade de células T em relatos preliminares 6,7,8. Enquanto a maioria dos dados pré-clínicos iniciais se concentrava na liberação intravenosa das células T CAR, evidências pré-clínicas recentes sugeriram a superioridade do parto loco-regional no SNC9,10, que também tem sido utilizado com sucesso em vários ensaios clínicos 6,7,8,11 . Estudos pré-clínicos até o momento que incorporaram a liberação locorregional de células CAR T no SNC se basearam em uma única dose intracraniana de células CAR T liberadas estereotaticamente9,10. Entretanto, ensaios clínicos em humanos têm exigido infusões repetidas de células CAR T no SNC 6,7,8,11, ressaltando a necessidade de avaliar múltiplas infusões repetidas no desenvolvimento pré-clínico. O objetivo deste procedimento é testar com sucesso infusões seriadas de células T CAR usando um cateter em modelos murinos ortotópicos de tumores cerebrais pediátricos. A vantagem dessa técnica é evitar múltiplos procedimentos cirúrgicos para proporcionar tratamentos intra-SNC repetidos. As cânulas têm sido usadas principalmente para amostragem de microdiálise de neurotransmissores e liberação de substâncias neuroativas em neurociência e pesquisa comportamental em roedores12, com relatos limitados de seu uso para a administração de terapêuticas anticâncer. Com base nos relatos anteriores, este protocolo usa um sistema de cânula de habitação estereotaticamente colocado para entregar células CAR T em modelos murinos de xenoenxerto de tumores do SNC. O protocolo pode ser utilizado para testar terapêuticas adicionais em modelos murinos de distúrbios neurológicos ou neuro-oncológicos, e pode ser útil para testar novas terapêuticas em que ultrapassar a barreira hematoencefálica é crítico para a eficácia.
Protocol
Todos os procedimentos do protocolo foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Hospital Infantil da Filadélfia (IAC 19-000907), que é credenciado pela AAALAC. Este estudo utilizou camundongos NOD scid gama (NSG) com 6-12 semanas de idade com tumores de xenoenxerto ortotópicos; no entanto, o protocolo pode ser utilizado em qualquer cepa de camundongo. Camundongos NSG foram alojados em condições de barreira estéril e a cirurgia foi realizada em cabines de biossegurança estéreis. Quando material humano, como células tumorais ou células T, está sendo usado, os procedimentos e o manuseio devem ser concluídos em gabinetes de biossegurança ABSL-2.
1. Preparando o mouse para a cirurgia
- Anestesiar o camundongo em uma câmara de indução com isoflurano (2-4%) a uma taxa de fluxo de oxigênio de 1 L/min até atingir um plano adequado de anestesia (aproximadamente 5 min).
- Pesar o rato utilizando uma balança com uma aproximação de 0,1 g e administrar buprenorfina (1 mg/kg) por via subcutânea de libertação lenta (SR) ou outro analgésico.
OBS: A buprenorfina SR proporciona analgesia por 72 horas. - Faça a barba no topo da cabeça do rato usando cortadores elétricos ou agentes depilatórios.
- Use uma espátula para abrir suavemente a parte inferior do braço estereotáxico e insira a cânula guia usando pinças. Aperte o parafuso no braço para fixar a cânula de modo que aproximadamente 1/2 a 2/3 da porção plástica branca da cânula fique saliente do fundo da abertura, juntamente com todo o comprimento metálico de 5 mm da cânula.
- Insira e prenda os dentes superiores do mouse na barra de mordida do aparelho estereotáxico. Puxe o cone do nariz para frente e aperte-o, garantindo que o rato está a inalar isoflurano.
- Monte o mouse sobre o aparelho estereotáxico aquecido usando manguitos auriculares ou barras auriculares, evitando pressão excessiva.
NOTA: A bandeja aquecida deve ter um termômetro retal inserido, e a bandeja de aquecimento deve se ajustar para manter uma temperatura corporal normal do mouse durante o procedimento. - Aplique pomada oftálmica estéril em ambos os olhos usando um aplicador com ponta de algodão.
- Limpe o local cirúrgico com iodopovidona em uma almofada ou aplicador, seguido de uma compressa de álcool. Execute esta etapa três vezes no total.
- Antes de iniciar o procedimento, realizar uma pinça dos dedos dos pés com pinça para avaliar se há sedação adequada.
2. Procedimento cirúrgico
OBS: Todos os aspectos do procedimento cirúrgico utilizam instrumental esterilizado e técnicas assépticas. Os camundongos continuam sob anestesia com isoflurano (2-4%) durante todo o procedimento, aproximadamente 10-20 min.
- Pegue suavemente o couro cabeludo entre as orelhas com pinças. Com tesoura estéril, corte o couro cabeludo levantado paralelo ao crânio e remova um retalho oval de pele (0,75-1 cm de comprimento) para expor o crânio.
NOTA: A tesoura é preferida em relação a um bisturi para proporcionar uma abertura limpa e oval e evitar danos desnecessários à pele e aos tecidos circundantes. - Afaste a fáscia usando um bisturi ou cotonetes com ponta de algodão e uma pelota de algodão hemostático para ajudar a retardar o sangramento excessivo, conforme necessário.
NOTA: Usar o lado de madeira de uma ponta de algodão estéril também pode afastar a fáscia e ajudar a evitar sangramento excessivo. - Identificar os pontos de referência bregma e lambda, as respectivas marcas anteriores e posteriores no crânio onde as placas cranianas seencontram13.
NOTA: A identificação pode ser aumentada limpando a parte superior do crânio exposto com peróxido de hidrogênio. - Marque suavemente o crânio usando um bisturi para criar uma superfície para o acrílico fixar. A pontuação deve incluir várias linhas lineares de aproximadamente 0,5-1 cm de comprimento em ângulos de 90° entre si.
- Usando o braço estereotáxico, localize a cânula para o ponto de interesse (bregma ou lambda). Uma vez localizada, eleve a ponta da cânula de 1 a 2 mm acima da superfície do crânio e mova-se para as coordenadas desejadas. Para injeções intratumorais, este utiliza as mesmas coordenadas A/P e M/L que a colocação do tumor.
- No crânio exposto, longe da área onde a cânula entrará, faça dois orifícios de parafuso com uma agulha 18G ou uma broca cirúrgica. Certifique-se de que os orifícios estejam espaçados para incluir espaço suficiente para a cânula. Usando uma broca, torça através dos orifícios do parafuso até que eles peguem no crânio. Insira e prenda dois parafusos nos orifícios usando uma chave de fenda de ponta plana. Em seguida, puxe suavemente os parafusos para cima para garantir que eles estejam presos.
NOTA: Não insira os parafusos até que eles estejam nivelados com o crânio, ou eles podem danificar o cérebro do rato por baixo. Deixe pelo menos um espaço de 1-2 mm entre o parafuso e o crânio. - Usando uma agulha 18 G ou broca cirúrgica, perfure o crânio nas coordenadas identificadas para criar um orifício para a cânula a ser inserida.
- Usando o braço estereotáxico, abaixe a cânula até a coordenada D/V desejada.
OBS: A coordenada D/V do implante da cânula precisa levar em conta o comprimento de projeção do manequim e das cânulas de tratamento, podendo ser mais superficial que a injeção ortotópica de células tumorais (Figura 1). - Em uma placa de porcelana de 12 poços, preencha um poço com pó de resina acrílica (aproximadamente 0,3 g) e 10-15 gotas (aproximadamente 0,5-0,75 mL) de líquido de resina acrílica. Isso produz um material viscoso de cor branca. Retirar a mistura para uma seringa de 1 mL e usá-la para revestir e cobrir o crânio, preenchendo os espaços ao redor da cânula e parafusos.
NOTA: O material viscoso endurece em cimento com o tempo, por isso esta etapa deve ser concluída imediatamente após a mistura. - Enquanto o cimento ainda estiver maleável, solte o parafuso no braço estereotáxico e use uma espátula na abertura na parte inferior para liberar suavemente a cânula do suporte e retrair lentamente o braço estereotáxico para cima para longe do mouse.
- Quando o cimento estiver completamente seco, insira a cânula simulada na cânula guia e fixe-a firmemente girando no sentido horário.
- Uma vez concluído o procedimento, coloque o camundongo de volta em sua gaiola doméstica aquecida para monitorar cuidadosamente, garantindo a recuperação adequada e registrando quaisquer observações pós-procedimento, incluindo que o camundongo recuperou totalmente a consciência, antes de retornar à colônia.
NOTA: Geralmente recomenda-se colocar apenas metade da gaiola em uma almofada de aquecimento para permitir que o animal se mova para o lado mais frio para evitar o superaquecimento. - Administrar analgésicos adicionais conforme necessário se os ratos apresentarem comportamentos indicativos de dor no pós-operatório, como meloxicam 5 mg/kg administrado por via subcutânea uma vez ao dia por até 3 dias.
3. Preparação das células T CAR
- Medir a concentração de células T CAR pré-transfectadas usando um contador de células.
- Centrifugar células T pré-transfectadas a 200 x g por 5 min à temperatura ambiente (TR).
- Aspirar o sobrenadante usando uma pipeta de Pasteur estéril em um sistema de aspiração a vácuo e ressuspender o pellet em solução salina tamponada com fosfatae (PBS) até a concentração desejada. Os volumes de entrega típicos são de 2-5 μL. As doses celulares típicas são de 0,5-5 x 106 células.
4. Infusões de células T CAR
- Prepare a cânula de tratamento alimentando a parte superior através de um pequeno pedaço de tubo de PKG.
- Encha a seringa de tratamento com a suspensão de células T CAR e insira-a através da outra extremidade do tubo de PKG, o suficiente para cobrir a parte superior da cânula de tratamento.
- Anestesiar o camundongo com isoflurano (2-4%) a uma taxa de fluxo de oxigênio de 1 L/min.
- Estabilize a cânula guia usando pinça na base e, em seguida, desaparafuse cuidadosamente e remova a cânula simulada, permitindo o acesso à cânula guia.
NOTA: Uma configuração estereotáxica não é necessária, mas pode ser usada para estabilizar a cabeça para tratamento. - Infundir as células T CAR durante 1 min e manter a cânula de tratamento no lugar durante mais 1 minuto após a cessação da perfusão.
- Remova a cânula de tratamento e rosqueie a cânula manequim firmemente de volta no lugar.
- Administrar meloxicam subcutâneo (5 mg/kg) para controle opcional da dor.
Representative Results
Implante bem-sucedido de cânula no SNC de camundongos
Camundongos com canulação bem-sucedida possuem uma cânula guia segura, que não interfere nas atividades de vida diária (Figura 2A) e que pode facilmente passar por uma cânula de tratamento e fornecer líquido sem resistência (Figura 2B). Em nossa experiência, a maioria das cânulas permanece no local por mais de 4 semanas, embora 0-25% possa ser deslocada ao longo do tempo. A verificação do posicionamento correto pode ser confirmada com o corante azul de Evans injetado na cânula. Por exemplo, uma cânula inserida no ventrículo lateral mostra o corante azul de Evans por todo o sistema ventricular enquanto percorre o líquido cefalorraquidiano, confirmando o correto posicionamento (Figura 2C). Cânulas inseridas no tumor mostram corante azul de Evans no local da implantação do tumor.
Entrega efetiva de células CAR T no SNC para o tratamento de tumores de xenoenxerto.
A eficácia do sistema de cânula intracraniana e a eficácia terapêutica das células CAR T em modelos murinos podem ser medidas através de uma variedade de mecanismos, incluindo imagens bioluminescentes e sobrevida global. Células T CAR direcionadas à GPC2 foram testadas contra meduloblastoma murino e glioma difuso da linha média, modelos 7316-4509 e 7316-3058, respectivamente, usando dosagem repetida de células CAR T através do sistema de cânula intracraniana indicado14. A colocação e enxertia do tumor ortotópico foram confirmadas por imagem bioluminescente, e as cânulas foram colocadas no leito tumoral usando as mesmas coordenadas que o posicionamento do tumor ortotópico. Os tratamentos consistiram de infusões de células T GPC2 CAR uma a duas vezes por semana durante 2-4 semanas, totalizando quatro a seis doses. Após o tratamento, a terapia com células T CAR direcionada por GPC2 induziu regressão tumoral significativa no modelo de meduloblastoma 7316-4509 (p < 0,01) (Figura 3A) e sobrevida significativamente prolongada no glioma talâmico difuso da linha média 7316-3058 (p < 0,05) (Figura 3B)14.
Figura 1: Cânula guia com manequim de projeção e cânulas de tratamento. (A) Cânula guia com cânula de projeção de 0,5 mm e manequim de projeção de 2 mm no lugar. (B) Cânula guia com cânula de projeção de 0,5 mm e cânula de tratamento de projeção de 2 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Sistema de liberação da cânula de tratamento para doses repetidas de células CAR T . (A) Cânula implantada em crânio de camundongo com tampa no lugar quando não estiver em uso. (B) Infusão de células CAR T em um tumor pontino através da cânula de tratamento enquanto o camundongo está sob anestesia. (C) Verificação da colocação da cânula no ventrículo lateral com corante azul de Evans. O corante foi inserido através da cânula, seguido de eutanásia e excisão cerebral, com corante presente em todos os ventrículos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: As células T CAR direcionadas por GPC2 medeiam respostas antitumorais e prolongam a sobrevida em tumores cerebrais pediátricos in vivo. (A) Quantificação da bioluminescência do xenoenxerto de meduloblastoma ortotópico do grupo 4 7316-4509 tratado com células T de RNAm direcionadas para GPC2 ou CD19. As doses são indicadas pelas setas no gráfico. Dados apresentados como média com DP, n = 9-11 camundongos por braço. (B) Sobrevida global de camundongos implantados com xenoenxerto talâmico DMG 7316-3058 tratados com seis doses repetidas de 2 x 106 células T CAR. As doses são indicadas pelas setas no gráfico. n = 7 camundongos por braço. **p < 0,01; *p < 0,05; ns = não significante. Esse valor foi reproduzido com permissão de Foster et al.14. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Discussion
A terapia com células T CAR revolucionou o tratamento de cânceres hematológicos e apresenta valor promissor no tratamento de tumores sólidos cerebrais6,7,8. Este protocolo foi desenhado para permitir a avaliação pré-clínica da liberação loco-regional de células T CAR para o tratamento de tumores pediátricos do SNC. O sistema de cânula replica um reservatório de Ommaya ou Rickham, um sistema de cateter intraventricular atualmente em uso em ensaios clínicos em andamento de terapia com células CAR T em tumores pediátricos do SNC6,7,8, ressaltando a relevância e o potencial translacional desses métodos. Este sistema permite a entrega repetida de células CAR T que ultrapassam a barreira hematoencefálica, novamente semelhante aos métodos que estão sendo empregados em ensaios clínicos em andamento. O parto loco-regional pode proporcionar máxima eficácia no SNC9 e também pode reduzir o risco de toxicidades sistêmicas associadas ao tráfico de circulação15. Enquanto a administração estereotáxica pode fornecer uma única dose no SNC, a vantagem desse sistema é a oportunidade de fornecer várias doses repetidas em um local especificado no SNC sem a necessidade de múltiplas cirurgias. As limitações deste procedimento incluem um local de entrega fixo sem a capacidade de mudar de local ou fazer ajustes uma vez que a cânula está no lugar, e o potencial de deslocamento da cânula.
Uma etapa crítica desse protocolo é o implante da cânula guia fixa em uma coordenada D/V que leva em consideração a projeção das cânulas de tratamento. A cânula de tratamento irá se projetar além da ponta da cânula guia e, portanto, deve-se tomar cuidado para garantir que a colocação resulte na entrega de células CAR T para a região de interesse. Os comprimentos de projeção da cânula de tratamento podem ser personalizados e, na experiência do autor, 0,5 mm é um comprimento de projeção útil. Esse comprimento garante que o terapêutico não permaneça na cânula guia no momento da dispensação, mas também não requer ajuste significativo das coordenadas D/V da cânula guia para a região de interesse. Um passo adicional importante neste protocolo é o tempo em que a cânula de tratamento é deixada no local após a infusão de células T CAR. A cânula de tratamento deve ser mantida no local por pelo menos 1 min após o término da infusão, para evitar vazamentos e a perda da liberação loco-regional da terapia com células CAR T.
A solução de problemas desse método é simples, com a maioria das complicações envolvendo dificuldade em remover a cânula simulada ou inserir a cânula de tratamento na cânula guia fixa, provavelmente devido ao sangue seco no interior da cânula guia. Isso pode ser facilmente resolvido passando suavemente a cânula simulada através da cânula guia até que haja menos resistência e os detritos tenham sido removidos. A resina acrílica pode ocasionalmente se deslocar do crânio, resultando na perda do sistema de cânula. Em nossa experiência, isso geralmente é limitado pela pontuação do crânio com um bisturi e a colocação de dois parafusos. Além disso, todos os itens da gaiola que possam acidentalmente aplicar força à cânula enquanto o mouse está se movendo são removidos, como cabanas de enriquecimento de mouse específicas com pequenas aberturas.
Em conclusão, descreve-se aqui um protocolo para a inserção de um sistema de cânula em modelos murinos de tumores do SNC para a entrega repetida de células CAR T. A colocação da cânula pode ser ajustada para vários locais de parto loco-regionais, testando a eficácia de diferentes locais de parto. Além disso, esse sistema pode ser usado para terapêuticas adicionais além das células CAR T para avaliar a eficácia ao ultrapassar a barreira hematoencefálica, e também pode ser útil para a avaliação da terapêutica em modelos murinos de distúrbios não oncológicos.
Disclosures
A JBF detém uma patente relacionada a imunoterapias dirigidas ao glipican 2 (GPC2). Todos os outros autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
O financiamento para este trabalho foi fornecido pela Matthew Larson Foundation, Grayson Saves Foundation, Hyundai Hope on Wheels Young Investigator Award, Kortney Rose Foundation, National Institutes of Health NCI K12 CA076931-19 e 1K08CA263179-01, e pelo Departamento de Defesa W81XWH-21-1-0221.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18 G needles | BD | 511097 | 1 1/2 inch metal hub |
| Acrylic resin liquid | Lang Dental | B1323 | |
| Acrylic resin powder | Lang Dental | B1323 | |
| Alcohol wipes | BD | 326895 | |
| Centrifuge 5240 | Eppendorf | 5420000040 | Centrifuge |
| Cotton tipped swabs | Puritan | 826-WC | Handle Width = 2.11 mm (0.083), Head Width = 1.27 mm (0.050), Handle Length = 147.62 mm (5.812), Overall Length = 152.4 mm (6), Head Length = 12.7 mm (0.500) |
| Drill bit holder | P1 Technologies | DH-1 | Drill bit holder for D56-D70 |
| Drill bit | P1 Technologies | D58 | 1.07 mm |
| Dummy cannula | P1 Technologies | C315DCS-5/SPC | Configuration: Small cap; Length: Cut 5.00 mm below pedestal; Projection: 0.50 mm |
| Flat tip screwdriver | P1 Technologies | SD-80 | Screwdriver |
| Graefe forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | Forceps |
| Guide cannula | P1 Technologies | C315GS-5/SPC | Configuration: 5.00 mm pedestal height; Length: Cut 5.00 mm below pedestal |
| Hemostatic cotton pellets with racemic epinephrine | Pascal | 1151602 | |
| MOXI Z Mini automated cell counter Kit | Moxi | MXZ001 | Cell counter |
| NOD scid gamma (NSG) mice | Jackson Laboratory | 5557 | 6 to 12-week-old males and females |
| Pasteur pipet | VWR | 14673-043 | |
| PKG tubing | P1 Technologies | C313CT | Diameter: 0.58 mm x 1.27 mm |
| Porcelain 12 well plate | Flinn Scientific | AP6064 | |
| Povidone iodine | Medline | MDS093943 | |
| Scalpel | World Precision Instrument | 50-822-457 | Disposable Scalpel, no.10, sterile, 10/box, Plastic Handle with 6" Ruler |
| Screws | P1 Technologies | 0-80 X 3/32 | 2.4 mm |
| Stereotaxic Frame | David Kopf Instruments | 940 | Model 940 Small Animal Stereotaxic Instrument with Digital Display Console |
| Student fine scissors | Fine Science Tools | 91460-12 | Scissors |
| Treatment cannula | P1 Technologies | C315IS-5/SPC | 33GA; Configuration: Standard internal; Length: Cut 5.00 mm below pedestal; Projection: 0.50 mm |
| Treatment syringes | Hamilton | 87908 | 5 µL, Model 75 Cemented Needle Special (SN) Syringe, 75SN/22/0.5"/PT3 |
| Vactrap XL | Foxx Life Sciences | 305-4401-FLS | Vacuum System |
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