Summary
APTrack est un plugin logiciel développé pour la plateforme Open Ephys qui permet la visualisation de données en temps réel et le suivi du seuil électrique en boucle fermée des potentiels d’action neuronale. Nous l’avons utilisé avec succès en microneurographie pour les nocicepteurs de fibres C humaines et les nocicepteurs de fibres C et Aδ de souris.
Abstract
Les nocicepteurs sont une classe de neurones afférents primaires qui signalent des stimuli nocifs potentiellement nocifs. Une augmentation de l’excitabilité des nocicepteurs se produit dans les conditions de douleur aiguë et chronique. Cela produit une activité continue anormale ou des seuils d’activation réduits aux stimuli nocifs. L’identification de la cause de cette excitabilité accrue est nécessaire pour le développement et la validation de traitements basés sur des mécanismes. Le suivi du seuil électrique d’un seul neurone peut quantifier l’excitabilité des nocicepteurs. Par conséquent, nous avons développé une application pour permettre de telles mesures et démontrer son utilisation chez l’homme et les rongeurs. APTrack fournit une visualisation des données en temps réel et une identification du potentiel d’action à l’aide d’un tracé raster temporel. Les algorithmes détectent les potentiels d’action en franchissant le seuil et surveillent leur latence après stimulation électrique. Le plugin module ensuite l’amplitude de stimulation électrique en utilisant une méthode haut-bas pour estimer le seuil électrique des nocicepteurs. Le logiciel a été construit sur le système Open Ephys (V0.54) et codé en C ++ à l’aide du framework JUCE. Il fonctionne sur les systèmes d’exploitation Windows, Linux et Mac. Le code open-source est disponible (https://github.com/ Micronévographie
Introduction
Les nocicepteurs sont des neurones afférents primaires du système nerveux périphérique qui sont activés par des événements ouvertement ou potentiellement dommageables pour les tissus et jouent un rôle protecteur essentiel dans la douleur aiguë1. Les enregistrements électrophysiologiques des nocicepteurs de la fibre C et de la fibre Aδ dans des modèles animaux, des volontaires humains sains et des patients ont révélé une sensibilisation et une activité spontanée anormale dans un large éventail d’états douloureux 2,3,4,5,6,7. Comprendre les mécanismes qui sous-tendent ces changements dans l’excitabilité des nocicepteurs chez les patients pourrait permettre des interventions thérapeutiques ciblées8. Cependant, il existe peu d’outils pour évaluer directement l’excitabilité des nocicepteurs, en particulier chez les patients9, mais le potentiel d’utilité de tels outils est bien reconnu10,11.
Le suivi du seuil électrique du nerf entier peut être utilisé pour examiner l’excitabilité axonale chez l’homme12. Cependant, comme les grands neurones périphériques myélinisés contribuent de manière disproportionnée à l’amplitude du potentiel d’action du composé sensoriel, le suivi du seuil électrique du nerf entier ne permet pas d’évaluer la fonction des fibres C11,13. En effet, dans une étude précédente, le suivi du seuil électrique du nerf entier dans les cohortes de douleur neuropathique chronique atteintes de neuropathie diabétique et de polyneuropathie induite par la chimiothérapie n’a montré aucune différence dans l’excitabilité axonale11.
Dans une étude précédente, le suivi du seuil électrique au niveau d’un seul neurone a été utilisé pour examiner l’excitabilité des nocicepteurs de la fibre C lors d’enregistrements de fibres taquinées dans une préparation ex vivo de nerfs cutanés de rat14. Les auteurs ont démontré qu’une concentration accrue de potassium, des conditions acides et de la bradykinine augmentaient toutes l’excitabilité des nocicepteurs de la fibre C, comme en témoigne un seuil électrique réduit pour la génération de potentiel d’action. De plus, le chauffage du champ récepteur des nocicepteurs thermosensibles a réduit leur seuil électrique, tandis que les nocicepteurs insensibles à la chaleur ont montré une augmentation de leur seuil électrique14. Cela fournit une preuve importante que le suivi du seuil électrique à neurone unique est possible et peut être utile, mais il n’existe actuellement aucune solution logicielle et / ou matérielle disponible pour permettre de telles investigations, en particulier pour les études humaines.
Chez l’homme, la microneurographie est la seule méthode disponible pour évaluer directement les propriétés électrophysiologiques des fibres C15. Cette approche a été utilisée pour mettre en évidence un dysfonctionnement des nocicepteurs chez les patients souffrant de douleur chronique 2,3,4,5,6,7. La microneurographie peut détecter les potentiels d’action d’un seul neurone; cependant, en raison des faibles rapports signal sur bruit, les chercheurs utilisent la technique de marquage pour caractériser l’activité de la fibre C16. Dans la technique de marquage, la stimulation électrique supraseuil est appliquée aux champs récepteurs de la fibre C dans la peau. Cette stimulation électrique génère un potentiel d’action qui se produit à une latence constante, qui est déterminée par la vitesse de conduction de la fibre C. Les fibres C présentent un ralentissement dépendant de l’activité, ce qui réduit leur vitesse de conduction et, par conséquent, leur latence de conduction augmente pendant les périodes de décharge potentielled’action 17. Dans des conditions basales, les fibres C ne génèrent normalement pas de potentiels d’action en l’absence de stimuli nocifs et, par conséquent, leur latence de conduction en réponse à une stimulation électrique à basse fréquence est constante. Les stimuli mécaniques, thermiques ou pharmacologiques, qui évoquent le tir, induisent un ralentissement dépendant de l’activité, ce qui augmente la latence des potentiels d’action évoqués par la stimulation électrique concomitante à basse fréquence. Cela permet d’identifier objectivement les réponses aux stimuli non électriques appliqués dans le contexte d’un faible rapport signal sur bruit. Par conséquent, le ralentissement dépendant de l’activité peut être utilisé pour caractériser fonctionnellement les fibres C16. En effet, différentes classes fonctionnelles de fibres C présentent des modèles distincts de ralentissement dépendant de l’activité dans les paradigmes de stimulation électrique qui impliquent de faire varier la fréquence de stimulation18,19. Cette variabilité de la latence des potentiels d’action des fibres C représente un défi pour les algorithmes conçus pour les surveiller.
L’activité continue chez un nocicepteur entraîne une variabilité accrue de sa latence lors de la stimulation électrique à basse fréquence, ce qui est encore une fois dû au ralentissement dépendant de l’activité. Cette variabilité accrue, ou gigue, est une mesure indirecte quantifiable de l’excitabilité2. D’autres causes de variabilité de la latence du potentiel d’action comprennent la bascule, où des branches terminales alternatives d’un seul neurone sont stimulées, ce qui fait que le potentiel d’action évoqué a deux (ou plus) latences de base qui s’excluent mutuellement20. Enfin, les changements de température des branches terminales d’un neurone périphérique provoquent également des changements de latence du potentiel d’action de manière thermodynamique, le réchauffement augmentant la vitesse de conduction et le refroidissement ralentissant la vitesse de conduction19. Ainsi, tout logiciel cherchant à effectuer un suivi de seuil électrique en boucle fermée des fibres C nociceptives doit tenir compte des changements de latence dans les potentiels d’action évoqués électriquement.
Pour atteindre notre objectif de suivi du seuil électrique inter-espèces des nocicepteurs de fibres C, nous avons développé APTrack, un plug-in logiciel open source pour la plate-forme Open Ephys21, afin de permettre un suivi de seuil électrique en temps réel, en boucle fermée, et un suivi de latence. Nous fournissons des données de preuve de concept démontrant que le suivi du seuil électrique des nocicepteurs de fibres C au cours de la microneurographie humaine est possible. De plus, nous montrons que cet outil peut être utilisé dans l’électrophysiologie ex vivo des fibres taquinées de rongeurs, permettant ainsi des études translationnelles entre humains et rongeurs. Ici, nous décrirons en détail comment les chercheurs peuvent mettre en œuvre et utiliser cet outil pour faciliter leur étude de la fonction et de l’excitabilité des nocicepteurs.
Protocol
Les expériences de microneurographie humaine ont été approuvées par le comité d’éthique de la recherche de la Faculté des sciences de la vie de l’Université de Bristol (numéro de référence: 51882). Tous les participants à l’étude ont donné leur consentement éclairé par écrit. Les expériences sur les animaux ont été réalisées à l’Université de Bristol conformément à la loi britannique de 1986 sur les animaux (procédures scientifiques) après approbation par le conseil de bien-être animal et d’éthique de l’Université de Bristol et étaient couvertes par une licence de projet.
1. Installation de l’interface graphique Open Ephys et d’APTrack
- Consultez la documentation du logiciel pour trouver la version la plus récente de l’interface utilisateur graphique (GUI) Open Ephys prise en charge (https://github.com/Microneurography/APTrack#readme), puis téléchargez et installez l’interface graphique.
- Installez une version compatible de l’interface graphique à partir de l’URL suivante : https://github.com/open-ephys/plugin-GUI/releases.
- Téléchargez la dernière version de GitHub: https://github.com/Microneurography/APTrack/releases. Pour un ordinateur Windows, copiez le fichier .dll dans le dossier plugins, qui se trouve généralement dans C:\Program Files\Open Ephys\plugins. Pour un ordinateur MacOS, copiez le fichier .bundle dans le dossier Contents/PlugIns du package.
2. Assemblage de l’appareil d’enregistrement et de stimulation
- Connectez la carte d’acquisition à l’ordinateur à l’aide du câble fourni par le fabricant et mettez-la sous tension.
REMARQUE: Pour la micronévrographie humaine, un isolateur USB 3.0 a été utilisé pour isoler électriquement le participant de l’ordinateur, et la carte d’acquisition a été alimentée par une batterie portable par opposition à l’alimentation secteur utilisée pour les études sur les rongeurs. Toutes les connexions USB, à l’exception de la carte de commande du moteur pas à pas, ont été passées à travers l’isolateur USB pendant les études humaines. - Connectez la carte d’E/S au port d’entrée analogique de la carte d’acquisition. Connectez une tête d’enregistrement RHD Intan à la carte d’acquisition à l’aide d’un câble SPI (Serial Peripheral Interface).
REMARQUE: Le phasme bipolaire Intan à 16 canaux a été utilisé ici, mais d’autres têtes monopolaires de la série RHD2000 peuvent être utilisées. - Connectez le PulsePal à l’ordinateur22. Pour l’assemblage avec un stimulateur analogique contrôlé par tension (par exemple, un DS4) à l’aide d’un PulsePal, comme avec les enregistrements de fibres taquinées de souris, suivez les étapes 2.5.1-2.5.3; pour l’assemblage avec un stimulateur à codeur rotatif (p. ex., un DS7) utilisant un moteur pas à pas, comme pour les enregistrements de microneurographie humaine, suivez les étapes 2.6.1 à 2.6.8 (figure 1).
- Construisez la chaîne de signaux dans l’interface graphique comme décrit ci-dessous.
- Insérez le plug-in FPGA Rhythm dans la chaîne de signaux en cliquant avec le bouton gauche de la souris et en le faisant glisser dans la chaîne de signaux; cela relie l’interface graphique à la carte d’acquisition. Assurez-vous que le bouton ADC a été cliqué pour lancer l’enregistrement des canaux ADC à partir de la carte d’E/S. Le bouton ADC s’allume en orange lorsqu’il est allumé.
REMARQUE: Si vous souhaitez lire des données expérimentales précédemment enregistrées, le plugin File Reader peut être utilisé au début au lieu de Rhythm FPGA. L’utilisation de ceci en combinaison avec APTrack permettra la visualisation et le suivi de la latence des potentiels d’action dans les expériences précédentes. - Insérez un filtre passe-bande dans la chaîne de signal; les paramètres par défaut de 300 à 6 000 Hz conviennent aux enregistrements humains et à la souris. En outre, insérez un séparateur après.
- Insérez le plug-in APTrack dans la chaîne de signaux d’un côté du séparateur et LFP Viewer de l’autre côté. LFP Viewer fournit une vue de tracé de tension traditionnelle de type oscilloscope, ce qui est utile pendant les expériences.
- Insérez un nœud d’enregistrement après le plugin. Dans le menu déroulant, changez le format de sauvegarde des données de binaire à Open Ephys. Cela complète une chaîne de signaux simple qui fonctionne bien (Figure 2); Cependant, des composants supplémentaires peuvent être ajoutés selon les exigences expérimentales.
REMARQUE: Si le nœud d’enregistrement est placé avant le plug-in dans la chaîne de signal, les informations de suivi du potentiel d’action ne seront pas enregistrées. - En haut à droite de l’interface graphique, cliquez sur le bouton de lecture pour commencer à transmettre les données de la carte d’acquisition et à les visualiser. Pour commencer l’enregistrement, cliquez sur le bouton d’enregistrement circulaire à côté du bouton de lecture.
REMARQUE: Il est facile d’oublier de cliquer sur l’enregistrement; Nous enregistrons les données à partir du moment où nous commençons à acquérir pour éviter que cela ne se produise.
- Insérez le plug-in FPGA Rhythm dans la chaîne de signaux en cliquant avec le bouton gauche de la souris et en le faisant glisser dans la chaîne de signaux; cela relie l’interface graphique à la carte d’acquisition. Assurez-vous que le bouton ADC a été cliqué pour lancer l’enregistrement des canaux ADC à partir de la carte d’E/S. Le bouton ADC s’allume en orange lorsqu’il est allumé.
- Pour l’assemblage avec un stimulateur analogique contrôlé par tension, suivez les étapes décrites ci-dessous.
- Allumez un stimulateur à courant constant dont l’amplitude de stimulation est contrôlée par une entrée de tension analogique. Un DS4 a été utilisé dans ce cas (Figure 1).
- Le canal de sortie PulsePal 1 est destiné à la commande de tension analogique. Divisez ce signal à l’aide d’un répartiteur en T BNC, puis connectez-le à l’entrée du stimulateur de courant constant et à la carte d’E/S afin que la tension de commande soit enregistrée.
- Le canal de sortie PulsePal 2 est destiné au marqueur d’événement TTL de stimulation électrique. Connectez-le à la carte d’E/S afin que les marqueurs d’événement TTL de stimulation soient enregistrés pour le plug-in à utiliser et pour l’analyse post-hoc.
- Pour l’assemblage avec un stimulateur analogique contrôlé par tension, suivez les étapes décrites ci-dessous.
- Allumez un stimulateur à courant constant dont l’amplitude de stimulation est contrôlée par un cadran de codage rotatif. Un DS7 a été utilisé dans ce cas (Figure 1).
- Connectez la carte de commande du moteur pas à pas au moteur pas à pas à l’aide du câble fourni par le fabricant et du support magnétique.
- Connectez la carte de commande à l’ordinateur directement à l’aide de n’importe quel câble USB A vers USB micro-B standard. Ne connectez pas le tableau de commande du côté participant de l’isolateur USB, car il est également connecté à une alimentation secteur 12 V.
- Si c’est la première fois que vous utilisez la carte de contrôle, téléchargez le script du moteur pas à pas de GitHub vers la carte de contrôle; Cela ne doit être fait qu’une seule fois, ou si des mises à jour logicielles pour le script de moteur pas à pas sont publiées.
- Réglez le cadran d’amplitude de stimulation sur le stimulateur à courant constant sur 0 mA. Utilisez un support de montage personnalisé pour interfacer le moteur pas à pas et le cadran d’amplitude de stimulation. Ceux-ci peuvent être imprimés en 3D, ce qui permet des solutions de montage bon marché, rapides et personnalisables. Consultez GitHub pour voir si une monture a déjà été conçue pour le stimulateur de votre choix.
- Utilisez un adaptateur de barillet personnalisé pour connecter le barillet du moteur pas à pas au cadran de contrôle de l’amplitude de stimulation. Ces adaptateurs devraient être construits en métal pour des raisons de résistance et de durabilité; cependant, les pièces imprimées en 3D conviendraient également, bien qu’elles puissent devoir être remplacées régulièrement. Consultez GitHub pour voir si un adaptateur de barillet a déjà été conçu pour le stimulateur de votre choix.
- Fixez lâchement la carte de commande/l’appareil de moteur pas à pas au cadran de commande du stimulateur à l’aide d’un adaptateur de montage et de barillet personnalisé.
REMARQUE: L’adaptateur de support et de barillet sera serré ultérieurement une fois que le logiciel aura été lancé et que le moteur pas à pas, automatiquement, se mettra en position zéro. - Connectez le PulsePal comme décrit dans les étapes de protocole 2.5.2-2.5.3 (moins la connexion du canal de sortie 1 à un stimulateur), car la génération de marqueurs d’événements TTL est toujours nécessaire pour l’analyse et le fonctionnement du plug-in. De plus, connectez le canal de sortie 2 au stimulateur DS7 pour le déclencher.
- Préparez la préparation peau-nerf de souris comme décrit ci-dessous.
- Fournir de la nourriture et de l’eau ad libitum à des souris C57BL/6J (Charles River Laboratories, Royaume-Uni, dans cette étude) âgées de 2 à 4 mois et des deux sexes.
- Après abattage par surdosage anesthésique par injection intrapéritonéale de pentobarbital sodique (≥200 mg/kg) et confirmation de l’arrêt de la circulation, disséquer la peau de la face dorsale de la patte postérieure de souris et du nerf saphène, qui innerve cette zone, en utilisant les méthodes décrites par Zimmermann et coll.23.
- Maintenir la préparation des nerfs cutanés dans du liquide interstitiel synthétique carbogéné (tableau 1) à 30-32 °C dans la moitié d’un bain acrylique à double chambre sur mesure (débit de perfusion de 15 mL/min, volume de 30 mL). Enfilez le nerf à travers un petit trou dans la chambre remplie d’huile minérale et scellez avec de la vaseline. L’huile fournit un environnement d’enregistrement isolé.
- Enlevez deux filaments fins du tronc du nerf à l’aide d’une pince super fine et suspendez-en un de chaque côté d’une électrode d’enregistrement bipolaire argent/chlorure d’argent.
- Numérisez et amplifiez le signal neuronal à l’aide d’une scène frontale bipolaire RHD2216 à 16 canaux, et traitez-le à l’aide de la carte d’acquisition. Échantillonnez le signal à 30 kHz, avec un filtre passe-bande de 300 à 6 000 Hz, et visualisez-le à l’aide de l’interface graphique.
- À l’aide d’une tige de verre émoussée, caressez la peau de la préparation. Utilisez l’activité de masse de faible amplitude pour confirmer que la préparation est vivante.
- Effectuer la microneurographie humaine de la fibre C comme décrit ci-dessous.
- Effectuer une microneurographie avec les participants qui ont fourni un consentement éclairé écrit, tel que décrit précédemment24.
- Avec le participant assis confortablement allongé sur un lit et soutenu par des oreillers, identifier le nerf péronier superficiel à l’aide d’un échographe et marquer une zone cible d’environ 5 à 10 cm proximale à la malléole latérale, autour du niveau médian du tibia.
- Stériliser la peau autour de la zone cible à l’aide d’une chlorhexidine à 2 % dans une lingette imbibée d’alcool à 70 % et insérer une électrode de référence stérile par voie sous-cutanée près du site d’enregistrement prévu au niveau du tibia moyen.
- Insérez une électrode d’enregistrement stérile dans le nerf péronier superficiel sous guidage échographique dans la zone cible.
- Numérisez et amplifiez le signal neuronal à l’aide d’une scène frontale bipolaire RHD2216 à 16 canaux, et traitez-le à l’aide de la carte d’acquisition. Échantillonnez le signal à 30 kHz, avec un filtre passe-bande de 300 à 6 000 Hz, et visualisez-le à l’aide de l’interface graphique.
REMARQUE : L’équipement d’acquisition a été isolé électriquement de l’ordinateur portable par un isolateur USB 3.0 avec isolation RMS de 5 kV et alimenté par une alimentation par batterie 12 V sur mesure. - Confirmez le succès du positionnement intraneural en caressant doucement la peau pour révéler l’activité de masse évoquée mécaniquement. De plus, les participants signalent généralement une paresthésie de l’aspect dorsolatéral du pied lors d’un positionnement intraneural réussi.
3. Configuration logicielle, identification et phénotypage des neurones périphériques
- Configurez le logiciel comme décrit ci-dessous.
- Ouvrez l’interface graphique (Figure 3). Si la carte de commande du moteur pas à pas est connectée à votre PC, elle sera détectée et réglée sur la position zéro. Serrez le support personnalisé et l’adaptateur de barillet décrits aux étapes 2.6.5 à 2.6.7, car le cadran d’amplitude de stimulation et le moteur pas à pas du stimulateur sont tous deux réglés sur zéro.
REMARQUE: Si le moteur pas à pas et le cadran d’amplitude de stimulation ne sont pas tous deux « mis à zéro », le moteur pas à pas peut essayer de détourner le cadran de commande hors de sa plage, ce qui peut causer des dommages. - Dans le menu des options, sélectionnez le canal de déclenchement. Choisissez le canal ADC contenant le marqueur TTL de stimulation électrique du canal de sortie PulsePal 2.
- Dans le menu des options, sélectionnez le canal de données et choisissez le canal contenant les données électrophysiologiques.
- Dans le panneau de commande de stimulation, définissez les amplitudes de stimulation initiale, minimale et maximale à l’aide du curseur. Assurez-vous que la stimulation actuelle est réglée au-dessus de 0 afin que les marqueurs TTL soient générés.
REMARQUE: Certains stimulateurs ont un rapport d’échelle entrées-sorties qui n’est pas de 1: 1; Tenez-en compte lors de la sélection d’une amplitude de stimulation appropriée. Par exemple, un rapport de sortie de 1:10 peut être sélectionné sur certains systèmes de stimulation pour obtenir un rendement plus élevé du stimulateur à courant constant. - Dans le panneau de contrôle de stimulation, cliquez sur F pour charger un fichier contenant les instructions de stimulation. Les protocoles de stimulation électrique sont stockés sous forme de fichiers CSV (valeurs séparées par des virgules) composés des fréquences et de la durée de stimulation souhaitées, ce qui permet aux utilisateurs de créer des paradigmes de stimulation complexes pour leurs expériences. Un exemple de modèle est disponible ici : https://github.com/Microneurography/APTrack/blob/main/example_playlist.csv
- Dans le panneau de configuration de la stimulation, cliquez sur > pour commencer le paradigme de stimulation chargée. Par défaut, APTrack demande au PulsePal de générer des impulsions d’ondes carrées positives d’une durée de 0,5 ms d’amplitudes variables pour contrôler l’amplitude de stimulation du stimulateur à courant constant.
- Le tracé raster temporel commencera à être mis à jour avec la réponse à la stimulation électrique, chaque nouvelle réponse de stimulation étant affichée sous la forme d’une nouvelle colonne à droite.
- Ouvrez l’interface graphique (Figure 3). Si la carte de commande du moteur pas à pas est connectée à votre PC, elle sera détectée et réglée sur la position zéro. Serrez le support personnalisé et l’adaptateur de barillet décrits aux étapes 2.6.5 à 2.6.7, car le cadran d’amplitude de stimulation et le moteur pas à pas du stimulateur sont tous deux réglés sur zéro.
- Visualisez et identifiez les potentiels d’action d’un seul neurone.
- Pour une détection réussie des potentiels d’action d’un seul neurone, il est important de définir des seuils d’image appropriés. Dans le panneau de tracé raster temporel, réglez les valeurs de seuil d’image faible, de détection et d’image haute.
- Sélectionnez un jeu de couleurs dans le menu des options. En mode WHOT (White Hot) (par défaut), les tensions inférieures au seuil d’image bas sont codées en noir. Les tensions entre l’image basse et les seuils de détection sont codées en niveaux de gris. Les tensions au-dessus du seuil de détection sont codées en vert et les tensions au-dessus du seuil d’image élevé sont codées en rouge.
- Les neurones périphériques présentent des réponses de latence constantes à de faibles fréquences de stimulation (<0,25 Hz), et ces réponses sont déterminées par leur vitesse de conduction et la distance entre les sites de stimulation et d’enregistrement. Une fois les seuils d’image appropriés définis, les événements de franchissement de seuil détectés par les algorithmes seront codés en vert (Figure 4).
- Déplacez systématiquement l’électrode stimulante autour de la zone de la peau innervée par le nerf enregistré, en permettant un minimum de trois événements de stimulation à chaque site. Surveillez le tracé raster temporel pour détecter les franchissements de seuil (marqués en vert) qui se produisent au même moment après chaque événement de stimulation électrique.
REMARQUE: Chez la souris, un stimulus de recherche de 5 mA a été utilisé. Chez l’homme, l’amplitude du stimulus de recherche électrique transcutané a été titrée à une cote de douleur verbale telle qu’elle n’a jamais dépassé 7/10. - Vérifiez trois événements de franchissement de seuil (barres vertes) qui apparaissent dans une rangée à la même latence et dans la même position de stimulation; Cela indique l’identification d’un potentiel d’action neuronale périphérique.
- Optimisez la position de l’électrode stimulante en identifiant le point le plus sensible électriquement du champ récepteur du neurone cible, puis fixez l’électrode en position. À ce stade de la micronévrographie humaine, passez à l’utilisation d’aiguilles d’électroacupuncture intradermique (0,2 mm de diamètre) pour la stimulation électrique bipolaire, chez la souris, une sonde stimulante transcutanée personnalisée est utilisée afin que la position de stimulation soit constante.
- Pour une détection réussie des potentiels d’action d’un seul neurone, il est important de définir des seuils d’image appropriés. Dans le panneau de tracé raster temporel, réglez les valeurs de seuil d’image faible, de détection et d’image haute.
- Effectuer la classification et le phénotypage sensoriel des neurones périphériques.
- Estimer le seuil électrique du potentiel d’action cible en ajustant l’amplitude de simulation manuellement ou en utilisant APTrack si désiré (décrit aux étapes 4.1-4.2).
- Stimuler le champ récepteur à 2x le seuil électrique estimé à une fréquence de 0,25 Hz tout au long du protocole de phénotypage sensoriel.
- Calculez la vitesse de conduction du neurone en divisant la distance de conduction par la latence de conduction. Les fibres C peuvent être identifiées par une vitesse de conduction de ≤2 m/s.
- Stimuler mécaniquement le champ récepteur à l’aide de filaments de von Frey pour déterminer le seuil mécanique d’activation. La mécanosensation peut être identifiée par des potentiels d’action évoqués visibles sur la trace de tension et une augmentation de la latence du neurone, s’il s’agit d’une fibre C, à force suffisante.
- Chauffer le champ récepteur du neurone, en surveillant à nouveau les potentiels d’action visibles sur la trace de tension et une augmentation de la latence du neurone, s’il s’agit d’une fibre C, lors d’une application de chaleur suffisante. Les neurones insensibles à la chaleur présenteront une diminution de la latence en raison de l’effet thermodynamique sur la propagation axonale.
REMARQUE: En micronévographie humaine, utilisez un TSC-II pour un contrôle thermique rapide et précis. Dans la préparation de la souris, ajouter du liquide interstitiel synthétique chauffé ou refroidi à une chambre d’isolement en aluminium placée sur le champ récepteur pour permettre l’accès aux bornes neuronales tout en limitant la dissipation rapide de la chaleur dans le fluide environnant. Enregistrez la température à l’aide d’un thermocouple. - Refroidir le champ récepteur, en surveillant à nouveau les potentiels d’action visibles sur la trace de tension et une augmentation marquée de la latence du neurone, s’il s’agit d’une fibre C, lors d’une application à froid suffisante. Tous les neurones présenteront une augmentation de la latence en raison de l’effet thermodynamique sur la propagation axonale, alors faites preuve de prudence en étiquetant les neurones comme sensibles au froid en vous basant uniquement sur une augmentation de la latence.
4. Latence et suivi des seuils électriques
- Effectuez le suivi de la latence comme décrit ci-dessous.
- Après l’identification du ou des potentiels d’action d’un seul neurone sur le tracé raster temporel, déplacez le curseur linéaire gris sur le côté droit du tracé raster temporel pour ajuster la position de la zone de recherche.
- Sous le tracé raster temporel, réglez le curseur rotatif de largeur de la zone de recherche sur une largeur appropriée. Réduisez la largeur de la zone de recherche pour réduire le risque de pics de bruit transitoires, de déclenchements spontanés de potentiels d’action ou d’autres potentiels d’action à latence constante à proximité identifiés à tort comme le potentiel d’action d’intérêt.
- Pour commencer à suivre le potentiel d’action ciblée, cliquez sur le + sous le tableau de suivi multi-unités. Une nouvelle ligne sera ajoutée au tableau contenant des détails sur le potentiel d’action cible, y compris l’emplacement de la latence, le pourcentage de tir sur 2 à 10 stimuli (ajusté dans le menu des options) et l’amplitude maximale détectée.
- Une fois qu’un potentiel d’action est ajouté à la table de suivi multi-unités, l’algorithme de suivi de la latence (Figure 5) sera automatiquement exécuté sur celui-ci à chaque stimulation électrique ultérieure.
- Si plusieurs potentiels d’action discrets sont visibles sur le tracé raster temporel, ajoutez-les au tableau de suivi multi-unités comme décrit ci-dessus. Le nombre maximal théorique de potentiels d’action pouvant être ajoutés au tableau pour le suivi simultané de la latence est la valeur entière maximale de 32 bits.
- Cochez la case Track Spike dans la table de suivi multi-unités pour déplacer la zone de recherche à la position appropriée pour ce potentiel d’action particulier, tel que déterminé par l’algorithme de suivi de latence. Cela permettra de surveiller le suivi de la latence en temps réel et de s’assurer que le suivi suit le potentiel d’action comme prévu. Le suivi de la latence des autres pics se poursuivra normalement en arrière-plan.
- Supprimez les potentiels d’action suivis du tableau de suivi à plusieurs unités à l’aide du bouton de suppression à la fin de chaque ligne.
- Effectuez le suivi du seuil électrique comme décrit ci-dessous.
- Ajustez les taux d’incrément et de décrémentation dans le panneau de commande de stimulation entre 0,1 V et 0,5 V. Gardez ces valeurs égales et ne les ajustez pas pendant l’expérience, sauf si cela fait partie du paradigme expérimental.
- Assurez-vous que la fréquence de stimulation est réglée à un taux approprié, généralement de 0,25 à 0,5 Hz, à moins que la modulation de la fréquence de stimulation ne fasse partie du paradigme expérimental. L’augmentation des taux de tir des nocicepteurs peut modifier le seuil électrique du nocicepteur.
- Une fois qu’un potentiel d’action est suivi avec succès, cochez la case Seuil de piste dans le tableau de suivi des unités multiples, qui lancera l’algorithme de suivi du seuil électrique (Figure 6).
REMARQUE: Le suivi du seuil électrique n’est exécuté que sur le potentiel d’action ciblé; En effet, les taux de tir des autres potentiels d’action dans le tableau de suivi multi-unités seront mis à jour en conséquence à mesure que l’amplitude de stimulation change. - Ajuster manuellement l’amplitude de stimulation à l’estimation du seuil électrique; Cela réduira le temps d’attente pour déterminer le seuil électrique. Le temps nécessaire pour établir un seuil électrique fiable dépend de la fréquence de stimulation, des taux d’incrément et de décrémentation et de la différence d’amplitude de stimulation entre la stimulation initiale et le seuil électrique du neurone.
- Le logiciel utilise une méthode haut-bas pour l’estimation du seuil électrique des neurones. Dans le tableau de suivi multi-unités, la cadence de tir est déterminée sur 2 à 10 stimulations précédentes (sélectionnées dans le menu des options). Sélectionner le nombre d’événements de stimulation à considérer; Un nombre plus élevé augmentera la fiabilité de l’estimation du seuil, mais il faudra plus de temps pour l’atteindre.
- Au cours de la micronévographie humaine, il est important de surveiller la douleur des stimuli électriques pour prévenir l’inconfort excessif des participants; un certain inconfort est inévitable lors de l’étude des nocicepteurs, en particulier des fibres C silencieuses / endormies. Demandez régulièrement des indices de douleur pendant que l’amplitude de stimulation augmente pendant le suivi du seuil électrique et restez à proximité du stimulateur à courant constant pour le désengager à la demande du participant.
REMARQUE: Alternativement, la stimulation électrique peut être désengagée via l’interface utilisateur en cliquant sur le bouton [ ] dans le panneau de commande de stimulation. - Une cadence de tir de 50 % indique que le seuil électrique approximatif a été déterminé.
- Lors du suivi du seuil électrique, appliquez une manipulation expérimentale au champ récepteur, telle que la température ou les manipulations de médicaments. Les effets de ces manipulations sur le seuil électrique du nocicepteur seront suivis.
REMARQUE : Prévoyez suffisamment de temps pour identifier un nouveau seuil de nocicepteurs après la manipulation expérimentale.
Representative Results
Un exemple représentatif du logiciel fonctionnant pour contrôler une expérience est présenté à la figure 7. Il ajuste itérativement l’amplitude de stimulation à l’aide d’une méthode haut-bas pour trouver efficacement le seuil électrique des nocicepteurs individuels. Pour la première fois, nous démontrons la faisabilité du suivi en temps réel du seuil électrique d’un seul neurone chez l’homme pendant la microneurographie (Figure 7A). De plus, nous montrons le suivi du seuil électrique dans une fibre Aδ de souris (Figure 7B). L’identification des potentiels d’action par franchissement de seuil, telle qu’elle est utilisée ici, est suffisante pour suivre les seuils électriques dans le temps. Nous recommandons aux utilisateurs de prendre des mesures pour minimiser le bruit électrique pendant leurs enregistrements, par exemple en utilisant une cage de Faraday et des filtres passe-bande pour améliorer le rapport signal sur bruit.
Pour démontrer que le suivi du seuil électrique peut être utilisé comme mesure des changements dans l’excitabilité des nocicepteurs chez les humains, le suivi du seuil électrique au cours d’un paradigme de chauffage par étapes a été effectué (Figure 8). L’augmentation de la température des bornes des nocicepteurs a diminué le courant de stimulation électrique nécessaire pour obtenir un potentiel d’action, reflétant une augmentation de l’excitabilité des nocicepteurs (Figure 8C). Cela a probablement été causé par la génération de potentiels récepteurs par les canaux ioniques sensibles à la chaleur exprimés dans le nocicepteur14 de la fibre C. À l’étape de température la plus élevée, à 44 °C, des potentiels d’action évoqués thermiquement ont été obtenus (Figure 8A, numéro de stimulus 86-96). Cela provoque une augmentation du seuil électrique car le nocicepteur peut être dans un état réfractaire après une décharge à haute fréquence. Comme prévu, la latence du potentiel d’action suivi diminuait à mesure que la température augmentait. On pense que cela se produit en raison d’un effet thermodynamique sur la machinerie de conduction, ce qui augmente la vitesse de conduction de la fibre C. Cette fibre C peut également présenter une bascule (Figure 8B, numéro de stimulus 47-54), ce qui peut entraîner une augmentation erronée de l’amplitude de la stimulation électrique suivante si le potentiel d’action se situe en dehors de la fenêtre de recherche de l’algorithme.
Figure 1 : Schéma de la configuration de l’équipement et des connexions de câbles requises pour le suivi du seuil électrique des nocicepteurs avec APTrack chez les rongeurs et les humains. Notez les deux méthodes différentes de contrôle de l’amplitude de stimulation : un moteur pas à pas pour les stimulateurs à réglage manuel dans notre configuration humaine, et un PulsePal pour les stimulateurs contrôlés par tension d’entrée dans notre configuration de rongeurs. (1) Un PC (Windows, Mac ou Linux) exécutant le plugin pour la plateforme Open Ephys. (2) Un moteur pas à pas qui actionne le cadran d’amplitude de stimulation sur la DS7. (3) Un stimulateur à courant constant approuvé pour une utilisation chez l’homme; ici, nous avons utilisé une DS7. (4) Un optoisolateur USB 3.0, qui isole le participant humain du PC (facultatif, requis uniquement pour la recherche humaine). (5) Un générateur d’impulsions PulsePal V2, qui génère des horodatages TTL (canal de sortie 2) et des pas de tension correspondant à l’amplitude de stimulation demandée (canal de sortie 1). (6) Un stimulateur à courant constant pour une utilisation chez les animaux; ici, nous avons utilisé un DS4. (7) Une alimentation CC pour le système (alimentation secteur CC utilisée pour la configuration des rongeurs et alimentation CC de batterie utilisée pour la configuration humaine). (8) Un conseil d’acquisition. (9) Une carte d’E/S pour connecter les câbles coaxiaux BNC transportant les signaux à enregistrer, tels que les sorties thermocouples et les marqueurs TTL. (10) La préparation peau-nerf de souris subissant des enregistrements électrophysiologiques nocicepteurs. (11) Un participant humain subissant un enregistrement microneurographique à partir de fibres C dans le nerf péronier superficiel. (12) Une tête Intan RHD2216 pour l’acquisition et la numérisation des enregistrements. (13) Une carte adaptateur d’électrode Intan, à laquelle les électrodes d’enregistrement sont connectées et qui permet de transmettre le signal à la scène de tête RHD2216. (14) Un système de stimulation thermique qui peut émettre la température via une connexion coaxiale BNC. (15) Une pédale à bouton/pied alimentée par batterie de 3,3 V utilisée pour marquer les événements de stimulation mécanique et les applications médicamenteuses. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Chaîne de signaux du modèle. La flèche rouge pointe vers le bouton permettant d’activer l’entrée ADC à partir de la carte d’E/S. La flèche jaune indique le menu déroulant pour sélectionner le format de fichier Open Ephys. La flèche verte indique les boutons Lecture et Enregistrement. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Interface utilisateur graphique. L’interface graphique se compose de quatre composants principaux. (1) Panneau Temporal Raster Plot (vert) pour la visualisation des données et les paramètres associés au contrôle du tracé. Une réponse de latence constante montrant un ralentissement progressif en fonction de l’activité est indiquée par la flèche verte. (2) Panneau de contrôle de stimulation (jaune) pour définir les paramètres d’amplitude de stimulation et charger les scripts de paradigme de stimulation. (3) Tableau de suivi multi-unités (bleu) pour ajouter les potentiels d’action pour le suivi et l’activation de la latence et du suivi du seuil électrique. (4) Menu d’options pour sélectionner les styles de couleur et le canal d’entrée pour les données et les déclencheurs TTL. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Facilitation de l’identification des potentiels d’action à latence constante grâce à la visualisation de données en temps réel sur un tracé raster temporel à l’aide d’APTrack. Il s’agit d’un exemple de rapport signal/bruit élevé. Les données présentées dans le diagramme raster temporel proviennent d’un enregistrement de fibres C humaines du nerf péronier superficiel pendant la micronévographie. Voltage Trace est le plugin LFP Viewer de type oscilloscope dans Open Ephys. L’interface utilisateur APTrack est l’interface utilisateur graphique du plugin. Le potentiel d’action suivi est indiqué par des flèches vertes, et le curseur circulaire sur la bordure du tracé raster temporel sert à contrôler la position de la boîte de recherche où les algorithmes rechercheront les événements de franchissement de seuil. L’artefact de stimulation électrique est marqué en bleu sur la trace de tension. L’amplitude de stimulation de la commande de tension analogique est indiquée en rouge; Notez que cela peut ne pas être la même que l’amplitude du courant de stimulation en fonction du facteur d’échelle défini sur le stimulateur. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Représentation graphique de l’algorithme de suivi de la latence. En termes simples, si un potentiel d’action est détecté par franchissement de seuil, le champ de recherche ajustera sa position pour se centrer au moment de la tension de crête. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : Représentation graphique de l’algorithme de suivi du seuil électrique. En termes simples, si un potentiel d’action est détecté par franchissement de seuil, l’amplitude de stimulation sera diminuée du taux de décrémentation. Si aucun potentiel d’action n’est détecté, l’amplitude de stimulation sera augmentée du taux d’incrémentation. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 7 : Suivi automatisé du seuil électrique des potentiels d’action d’un seul neurone à une fréquence de stimulation de 0,25 Hz. (A) Traces séquentielles d’une fibre C humaine du nerf péronier superficiel lors d’une expérience de microneurographie. (B) Traces séquentielles d’une fibre Aδ de souris du nerf saphène au cours de la préparation du nerf cutané électrophysiologie des fibres taquinés. Les traces ont été colorées en rouge lorsqu’un potentiel d’action a été identifié, ce qui a entraîné une diminution de l’amplitude du stimulus. L’algorithme logiciel trouve efficacement l’amplitude de stimulus requise pour une probabilité de déclenchement de 50%. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 8 : Suivi du seuil électrique à une fréquence de stimulation de 0,25 Hz pendant la stimulation thermique d’un nocicepteur humain de fibres C. L’axe des y code le nombre de stimulation dès le début du paradigme. (A) Tracé de tension pendant 4 000 ms après la stimulation électrique, avec des événements de franchissement de seuil marqués en rouge. (B) Trace de tension de A zoomée autour du potentiel d’action suivi. Les traces ont été colorées en rouge lorsque le potentiel d’action suivi a été détecté. La ligne bleue verticale est la latence de base de l’unité suivie. (C) Courant de stimulation commandé par APTrack. La ligne bleue verticale est le seuil électrique de base. D) Température de la sonde thermostimulante TCS-II à champ récepteur. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| Composé | Concentration |
| NaCl | 107,8 mM |
| NaHCO3 | 26,2 mM |
| Kcl | 3,5 mM |
| NaH2PO4 | 1,67 mM |
| CaCl2 | 1,53 mM |
| MgSO4 | 0,69 mM |
| Sodium Gluconate | 9,64 mM |
| Saccharose | 7,6 mM |
| Glucose | 5,55 mM |
Tableau 1: Contenu du liquide interstitiel synthétique pour la préparation peau-nerfde souris 23.
Discussion
APTrack est un plugin logiciel à utiliser avec la plateforme Open Ephys. Nous avons choisi cette plate-forme car elle est open-source, flexible et peu coûteuse à mettre en œuvre. Sans compter le coût du stimulateur à courant constant, tout l’équipement nécessaire pour commencer à utiliser le plugin pourrait être acheté pour environ 5 000 USD au moment de la rédaction. Nous espérons que cela permettra aux chercheurs de mettre en œuvre APTrack dans leurs études d’électrophysiologie des nerfs périphériques plus facilement. De plus, les chercheurs peuvent librement modifier le logiciel pour l’adapter à leurs besoins expérimentaux. Il est important de noter que cet outil a permis le suivi du seuil électrique de nocicepteurs à fibre C uniques, pour la première fois, chez l’homme.
Plus le rapport signal sur bruit est élevé, mieux les algorithmes peuvent identifier les potentiels d’action. Le rapport signal sur bruit lors de la microneurographie était suffisant dans la majorité de nos enregistrements, mais les utilisateurs doivent être attentifs au risque de dégradation du signal au fil du temps. Ceci est particulièrement important pour les protocoles expérimentaux plus longs, car si l’amplitude du potentiel d’action suivi tombe en dessous du seuil de détection, l’amplitude de stimulation sera augmentée par erreur; Cela peut être atténué par des expérimentateurs surveillant le plugin, puis ajustant les paramètres si nécessaire. Le rapport signal/bruit est amélioré grâce au filtrage passe-bande, mais les transitoires plus importants peuvent toujours être identifiés à tort comme des potentiels d’action s’ils arrivent pendant la fenêtre temporelle de la zone de recherche. Le risque d’identifier à tort le bruit transitoire comme un potentiel d’action peut être réduit en réduisant la fenêtre de temps pendant laquelle le plugin recherche des potentiels d’action et en optimisant les paramètres de seuil. Cependant, il y a encore des situations que l’on peut rencontrer qui entravent les performances du plugin. L’activité spontanée peut causer des difficultés si des potentiels d’action de plus grande amplitude tombent dans la fenêtre de la boîte de recherche de l’algorithme, car ils seront identifiés à tort comme le potentiel d’action cible. De plus, l’activité spontanée dans le neurone d’intérêt peut signifier que la stimulation électrique tombe pendant sa période réfractaire, ce qui entraîne une incapacité à générer un potentiel d’action. Des difficultés d’utilisation du logiciel peuvent également survenir lorsque les neurones afférents primaires présentent une bascule, par laquelle des branches terminales alternées d’un seul neurone sont stimulées, ce qui fait que le potentiel d’action évoqué a deux (ou plus) latences de base qui s’excluent mutuellement20. Lors d’enregistrements de neurones présentant des bascules avec des rapports signal sur bruit élevés, nous avons effectué avec succès un suivi de latence et de seuil électrique en augmentant la largeur de la boîte de recherche pour encapsuler toutes les vitesses de conduction potentielles présentées par le neurone. Cependant, le seuil électrique peut varier en fonction de la branche terminale du neurone excité, ce qui est probablement dû en partie aux différences de distance entre le site de la stimulation électrique et les bornes nociceptrices alternatives. Des travaux supplémentaires sur le processus d’identification des mesures potentielles pour inclure, par exemple, l’appariement des modèles sont réalisables et pourraient être intégrés à ce logiciel. Les plugins GUI pour la filtrée d’arrêt de bande ou la filtration adaptative du bruit pourraient également être utilisés en amont d’APTrack dans la chaîne de signaux s’ils étaient développés.
Nous considérons que le seuil électrique déterminé est le courant nécessaire pour provoquer un potentiel d’action 50% du temps, sur un nombre défini par l’utilisateur de stimuli électriques, généralement 2-10. La morphologie de la stimulation électrique est de 0,5 ms et des impulsions d’ondes carrées positives. Ce n’est pas la même chose que de déterminer la rhéobase, une mesure couramment utilisée de l’excitabilité neuronale. Le plugin pourrait être adapté pour déterminer la rhéobase. Cependant, nous avons poursuivi une mesure plus simple, car les changements dynamiques de l’excitabilité, tels que ceux supposés se produire pendant le chauffage, auraient été plus difficiles à quantifier avec des changements de rhéobase que notre estimation du seuil électrique.
Ce logiciel peut être utilisé dans les expériences humaines et sur les rongeurs. Ceci est rendu possible par un support flexible pour les systèmes de stimulation électrique. Le logiciel fonctionnera avec n’importe quel stimulateur qui accepte une tension de commande analogique ou peut être interfacé manuellement avec un moteur pas à pas. Pour la micronévographie, nous l’avons utilisé avec un stimulateur à courant constant marqué CE qui a été conçu pour être utilisé dans la recherche humaine et dont la stimulation était contrôlée par un cadran. Les stimulateurs qui acceptent les commandes de tension analogiques peuvent être bruyants car ils ne déconnectent pas le circuit entre les stimuli, ce qui signifie que tout bourdonnement ou bruit 50/60 Hz sur l’entrée analogique sera transmis à l’enregistrement. Un stimulateur qui nécessite un signal de déclenchement TLL supplémentaire pour connecter le circuit, permettant de générer un stimulus à un courant analogue à l’entrée de tension analogique, est idéal pour une utilisation avec le plugin. Cela empêche le bruit d’être transmis à l’enregistrement entre les stimuli.
Le logiciel utilise une méthode simple de haut en bas pour estimer le seuil électrique. Cela a été utilisé dans les tests de psychophysique pendant de nombreuses décennies25. Conformément à la méthode haut-bas, l’algorithme de suivi du seuil électrique pour moduler l’amplitude de stimulation ne prend en compte que l’amplitude et la réponse de la stimulation précédente lors du calcul de l’amplitude de la stimulation suivante. Cela signifie que l’amplitude de stimulation oscillera autour du seuil électrique réel, produisant ainsi une cadence de tir de 50%, en supposant que le seuil soit stable. La taille minimale d’un incrément ou d’une décrémentation est de 0,01 V; cela équivaut à 0,01 mA en supposant que le stimulateur a un rapport entrée/sortie de 1 V: 1 mA et une résolution suffisante pour obtenir des changements d’étape aussi petits. Le plugin mettra à jour l’estimation en direct du seuil électrique du potentiel d’action cible chaque fois qu’il atteint une cadence de tir de 50% sur un nombre défini par l’utilisateur de stimuli précédents (2-10). Post hoc, nous recommandons d’utiliser une moyenne mobile de l’amplitude de stimulation sur les 2-10 derniers stimuli pour estimer le seuil électrique, et il convient de noter que cette estimation ne sera précise que lorsque la cadence de tir est relativement stable à 50%. Dans les estimations en direct et post hoc du seuil électrique, il y a un équilibre entre résolution, fiabilité et temps à considérer. L’utilisation d’étapes d’incrément et de décrémentation plus petites augmentera la précision de l’estimation du seuil électrique, mais augmentera le temps nécessaire pour trouver le nouveau seuil électrique initialement et après la perturbation. Le calcul du seuil électrique sur un plus grand nombre de stimuli précédents fournira une meilleure fiabilité, mais augmentera le temps nécessaire pour atteindre une estimation précise.
APTrack a été conçu pour être utilisé dans les enregistrements de nerfs périphériques, en particulier pour suivre les seuils électriques des fibres C lors de perturbations expérimentales et pathologiques sur des périodes où la latence du potentiel d’action peut varier en fonction de l’activité neuronale sous-jacente. Cette méthode permettra d’examiner non seulement l’excitabilité axonale, mais aussi les potentiels générateurs de nocicepteurs chez les volontaires et les patients sains. Nous prévoyons que d’autres domaines de l’électrophysiologie pourraient adopter et adapter cet outil pour une utilisation dans toute expérience nécessitant le suivi du seuil électrique d’une activité verrouillée par stimulus. Par exemple, cela pourrait tout aussi bien être adapté à la stimulation optogénétique avec des impulsions lumineuses entraînées par APTrack. Le plugin est open-source et disponible pour les chercheurs sous licence GPLv3. Il est construit sur la plate-forme Open Ephys, qui est un système d’acquisition de données adaptable, peu coûteux et open source. Le plugin fournit des crochets supplémentaires pour les plugins en aval afin d’extraire les informations sur le potentiel d’action et de fournir des interfaces utilisateur supplémentaires ou des paradigmes adaptatifs. Le plugin fournit une interface utilisateur simple pour la visualisation et le suivi de la latence des potentiels d’action en temps réel. Il peut également lire les données précédentes et les visualiser à l’aide du tracé raster temporel. En outre, il peut également effectuer un suivi de la latence lors de la lecture des données précédentes. Bien qu’il existe d’autres logiciels disponibles pour le suivi de la latence en temps réel, ils ne sont pas open-source et ne peuvent pas effectuer de suivi de seuil électrique26,27. APTrack a un avantage par rapport aux méthodes traditionnelles d’identification des potentiels d’action à latence constante à partir de traces de tension, car il utilise un tracé raster temporel pour la visualisation des données. De plus, nos expériences d’utilisation dans des expériences avec de faibles rapports signal sur bruit ont indiqué que la méthode de visualisation du tracé raster temporel permet d’identifier des potentiels d’action de latence constante qui auraient pu être manqués autrement.
Le suivi du seuil du nerf entier est une méthode largement utilisée pour évaluer l’excitabilité axonale13. Le suivi du seuil électrique mononeuronal dans les fibres C de rongeurs a déjà été utilisé pour quantifier l’excitabilité des nocicepteurs14, et son utilité chez l’homme est reconnue10,11; Cependant, jusqu’à présent, cela n’était pas possible. Nous fournissons un nouvel outil open source pour mesurer directement l’excitabilité d’un seul nocicepteur dans les études électrophysiologiques des rongeurs et des nerfs périphériques humains. APTrack permet pour la première fois le suivi en temps réel, open-source, du seuil électrique des potentiels d’action d’un seul neurone chez l’homme. Nous prévoyons qu’il facilitera les études translationnelles des nocicepteurs entre rongeurs et humains.
Disclosures
G.W.T.N. est une bourse de doctorat du BBSRC Collaborative Training Partnership avec l’Université de Bristol et Eli Lilly and Company (BB/T508342/1). A.P.N. est un employé actuel d’Eli Lilly and Company et peut posséder des actions de cette société.
Acknowledgments
Nous tenons à remercier nos bailleurs de fonds pour leur soutien : Academy of Medical Sciences (J.P.D., A.E.P.), Versus Arthritis (J.P.D., A.E.P.), Jean Golding Institute Seedcorn Grant (J.P.D., A.E.P., G.W., A.C.S., M.M.P.) et Biotechnology and Biological Sciences Research Council collaboration training partnership doctoral studentship with Eli Lilly (G.W.T.N.). Nous tenons à remercier tous les contributeurs au développement d’APTrack. Nous tenons également à remercier nos bénévoles qui ont participé aux expériences de microneurographie et nos collaborateurs de la participation et de l’engagement des patients et du public pour leurs contributions inestimables.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12V DC Power Supply | NA | NA | To power uStepper S-lite. Required for dial-controlled stimulators. |
| 36 Pin Electrode Adapter Board | Intan Technology | C3410 | APTrack Dependency. For connecting electrode input to headstage. $255 USD as of March 2021. |
| APTrack Plugin | NA | NA | https://github.com/Microneurography/APTrack |
| Bipolar Ag/AgCl Recording Electrode | Custom | NA | Recording electrode for the skin-nerve preparation. Or equivalent. |
| Bipolar Concentric Stimulating Electrode | World Precision Instruments | SNE-100 | For electrical stimulation in the mouse skin-nerve preparation. Or equivalent. |
| Bipolar Transcutaneous Stimulating Electrode | Custom | NA | For transcutaneous electrical stimulation while searching for single-neuron action potentials during microneurography. |
| BNC T Splitter (1+) | NA | NA | APTrack Dependency. Any standard BNC T splitter. |
| BNC to BNC cables (3+) | NA | NA | APTrack Dependency. Any standard BNC cables. |
| C6H11NaO7 | Merck | S2054 | Skin-nerve preparation synthetic interstitial fluid constituent. Or equivalent. |
| CaCl2 | Merck | C5670 | Skin-nerve preparation synthetic interstitial fluid constituent. Or equivalent. |
| Digitimer DS4 Constant Current Stimulator | Digitimer | DS4 | Constant current stiulator for animal research. £1,695 GBP as of September 2022. |
| Digitimer DS7 Constant Current Stimulator | Digitimer | DS7A | Constant current stiulator for human research. £3,400 GBP as of September 2022. |
| Electroaccupuncture Classic Plus Stimulating Electrodes | Harmony Medical | NA | For fixed position intradermal electrical stimulation of the dorsal aspect of the foot during human microneurography. |
| Glucose | Fisher Scientific | G/0450/60 | Skin-nerve preparation synthetic interstitial fluid constituent. Or equivalent. |
| HDMI Cable | NA | NA | APTrack Dependency. Any standard passive HMDI cable. To connect OE I/O Board to OE Acquisition Board. |
| KCl | Merck | P9541 | Skin-nerve preparation synthetic interstitial fluid constituent. Or equivalent. |
| MgSO4 | Acros Organics | 213115000 | Skin-nerve preparation synthetic interstitial fluid constituent. Or equivalent. |
| Mineral Oil | Merck | 330779 | Electrical insulation for nerve recordings in th skin-nerve preparation. Or equivalent. |
| NaCl | Merck | S9888 | Skin-nerve preparation synthetic interstitial fluid constituent. Or equivalent. |
| NaHCO3 | Merck | S6014 | Skin-nerve preparation synthetic interstitial fluid constituent. Or equivalent. |
| NaHCO3 | Merck | S0751 | Skin-nerve preparation synthetic interstitial fluid constituent. Or equivalent. |
| Open Ephys Acquisition Board | Open Ephys | NA | APTrack Dependency. Includes USB cable to connect to computer and mains socket power supply. €2,955 EUR as of September 2022. |
| Open Ephys Graphical User Interface | Open Ephys | NA | https://github.com/open-ephys/plugin-GUI |
| Open Ephys I/O Board | Open Ephys | NA | APTrack Dependency. For ADC voltage inputs via BNC cables. €12.5 EUR without connectors, €85 EUR with connectors as of September 2022. |
| PulsePal V2 | Sanworks | 1102 | APTrack Dependency. Open-source DAC and train generator. $725 USD pre-assembled as of September 2022. Approx. $275 USD for self-assembly. |
| RHD 6ft SPI Cable | Intan Technology | C3206 | APTrack Dependency. For connecting headstage to OE Acquisition Board. $295 USD as of March 2021 |
| RHD2216 16ch Bipolar Headstage | Intan Technology | C3313 | APTrack Dependency. For data acquisition and digitization. $725 USD as of March 2021. Or equivalent RHD2000 series headstage. |
| Sucrose | Fisher Scientific | S/8560/60 | Skin-nerve preparation synthetic interstitial fluid constituent. Or equivalent. |
| TCS-II Thermal Stimulator | QST.Lab | NA | For thermal stimualtion of nociceptor receptive fields during human microneurography. |
| Tungsten Microelectrode Pair (Active + Reference) | FHC | 30085 | For microneurography recordings. 35mm. |
| Ultrasound Scanner iQ+ | Butterfly Network | NA | For ultrasound-guided electrode insertion during microneurography. |
| USB 3.0 5kV RMS Isolation | Inota Technology | 7055-D | For isolating human microneuroography participant from computer. €459 EUR as of September 2022. |
| USB-A to micro USB-B cable (2) | NA | NA | APTrack Dependency. To connect computer to PulsePal and to uStepper S-lite if using stepper-stimulator interfacing. |
| uStepper S-lite + NEMA17 motor | uStepper | NA | To interface with stimulators via a control dial. €50 EUR as of September 2022. |
| Von Frey Filaments | Ugo Basile | 37450-275 | For mechanical stimulation of receptive fields during sensory phenotyping of nociceptors. |
References
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