Åpen kildekode Real-Time Closed-Loop Elektrisk terskelsporing for translasjonell smerteforskning

Summary

APTrack er et programvareplugin utviklet for Open Ephys-plattformen som muliggjør datavisualisering i sanntid og elektrisk terskelsporing med lukket sløyfe av nevrale handlingspotensialer. Vi har med hell brukt dette i mikroneurografi for humane C-fiber nociceptorer og mus C-fiber og Aδ-fiber nociceptorer.

Abstract

Nociceptorer er en klasse av primære afferente nevroner som signaliserer potensielt skadelige skadelige stimuli. En økning i nociceptor excitability oppstår i akutte og kroniske smerteforhold. Dette gir unormal pågående aktivitet eller reduserte aktiveringsterskler for skadelige stimuli. Å identifisere årsaken til denne økte spenningen er nødvendig for utvikling og validering av mekanismebaserte behandlinger. Single-neuron elektrisk terskel sporing kan kvantifisere nociceptor excitability. Derfor har vi utviklet en applikasjon for å tillate slike målinger og demonstrere bruken hos mennesker og gnagere. APTrack gir sanntids datavisualisering og identifisering av handlingspotensial ved hjelp av et tidsmessig rasterplott. Algoritmer oppdager handlingspotensialer ved terskelovergang og overvåker ventetiden etter elektrisk stimulering. Pluggen modulerer deretter den elektriske stimuleringsamplituden ved hjelp av en opp-ned-metode for å estimere den elektriske terskelen til nociceptorene. Programvaren ble bygget på Open Ephys-systemet (V0.54) og kodet i C ++ ved hjelp av JUCE rammeverket. Den kjører på Windows, Linux og Mac-operativsystemer. Åpen kildekode er tilgjengelig (https://github.com/ Microneurography/APTrack). De elektrofysiologiske opptakene ble tatt fra nociceptorer i både et musehud-nervepreparat ved hjelp av den ertet fibermetoden i saphenøs nerve og hos friske frivillige mennesker ved bruk av mikroneurografi i overfladisk peroneal nerve. Nociceptorer ble klassifisert etter deres respons på termiske og mekaniske stimuli, samt ved å overvåke den aktivitetsavhengige bremsingen av ledningshastigheten. Programvaren forenklet eksperimentet ved å forenkle identifikasjonen av handlingspotensialet gjennom det tidsmessige rasterplottet. Vi demonstrerer sanntids lukket sløyfe elektrisk terskelsporing av enkeltnevronaksjonspotensialer under in vivo human mikroneurografi, for første gang, og under ex vivo mus elektrofysiologiske opptak av C-fibre og Aδ-fibre. Vi etablerer prinsippbevis ved å vise at den elektriske terskelen til en menneskelig varmefølsom C-fiber nociceptor reduseres ved oppvarming av det mottakelige feltet. Dette pluginet muliggjør elektrisk terskelsporing av enkeltnevronaksjonspotensialer og tillater kvantifisering av endringer i nociceptor-excitabilitet.

Introduction

Nociseptorer er primære afferente nevroner i det perifere nervesystemet som aktiveres ved åpenbare eller potensielt vevsskadelige hendelser og spiller en kritisk beskyttende rolle ved akutt smerte¹. Elektrofysiologiske registreringer fra C-fiber og Aδ-fiber nociceptorer i dyremodeller, friske frivillige mennesker og pasienter har avslørt sensibilisering og unormal spontan aktivitet i et mangfoldig spekter av smertetilstander 2,3,4,5,6,7. Å forstå mekanismene som ligger til grunn for disse endringene i nociceptoreksitabilitet hos pasienter, kan muliggjøre målrettede terapeutiske inngrep⁸. Det er imidlertid få verktøy for å vurdere nociceptor excitability direkte, spesielt hos pasienter⁹, men potensialet for nytten av slike verktøy er vel anerkjent^10,11.

Helnerve elektrisk terskelsporing kan brukes til å undersøke aksonal eksitabilitet hos mennesker¹². Imidlertid, da store, myeliniserte, perifere nevroner bidrar uforholdsmessig til amplituden til det sensoriske sammensatte handlingspotensialet, tillater ikke sporing av helnerve elektrisk terskel vurdering av C-fiberfunksjon^11,13. Faktisk, i en tidligere studie, helnerve elektrisk terskel sporing i kroniske nevropatiske smertekohorter med diabetisk nevropati og kjemoterapi-indusert polyneuropati viste ingen forskjeller i aksonal eksitabilitet¹¹.

I en tidligere studie ble elektrisk terskelsporing på enkeltnevronnivå brukt til å undersøke eksitabiliteten til C-fibernociceptorer under ertet fiberopptak i et ex vivo hud-nervepreparat¹⁴. Forfatterne viste at en økt kaliumkonsentrasjon, sure forhold og bradykinin alle økte C-fiber nociceptor excitability, noe som reflekteres av en redusert elektrisk terskel for generering av handlingspotensial. Videre reduserte oppvarming av det mottakelige feltet til de varmefølsomme nociceptorene deres elektriske terskel, mens varmefølsomme nociceptorer viste en økning i deres elektriske terskel¹⁴. Dette gir viktig bevis på at sporing av elektrisk terskel er mulig og kan være nyttig, men det finnes for øyeblikket ingen programvare- og/eller maskinvareløsninger tilgjengelig for å muliggjøre slike undersøkelser, spesielt for menneskelige studier.

Hos mennesker er mikroneurografi den eneste tilgjengelige metoden for direkte å vurdere de elektrofysiologiske egenskapene til C-fibre¹⁵. Denne tilnærmingen har blitt brukt til å demonstrere nociceptor dysfunksjon hos pasienter med kronisk smerte 2,3,4,5,6,7. Microneurography kan oppdage single-neuron handlingspotensialer; På grunn av de lave signal-støy-forholdene, bruker forskere imidlertid merkingsteknikken for å karakterisere C-fiberaktivitet¹⁶. I markeringsteknikken brukes supraterskel elektrisk stimulering på C-fiber mottakelige felt i huden. Denne elektriske stimuleringen genererer et handlingspotensial som oppstår ved konstant latens, som bestemmes av C-fiberens ledningshastighet. C-fibre utviser aktivitetsavhengig bremsing, hvorved ledningshastigheten reduseres, og derfor øker ledningsforsinkelsen i perioder med handlingspotensiell utladning¹⁷. Under basale forhold genererer C-fibre normalt ikke handlingspotensialer i fravær av skadelige stimuli, og derfor er ledningsforsinkelsen som respons på lavfrekvent elektrisk stimulering konstant. Mekaniske, termiske eller farmakologiske stimuli, som fremkaller avfyring, induserer aktivitetsavhengig bremsing, noe som øker latensen til aksjonspotensialene fremkalt ved samtidig lavfrekvent elektrisk stimulering. Dette tillater objektiv identifisering av responser på de anvendte ikke-elektriske stimuli i sammenheng med et lavt signal-støy-forhold. Derfor kan aktivitetsavhengig bremsing brukes til å funksjonelt karakterisere C-fibre¹⁶. Faktisk viser forskjellige funksjonelle klasser av C-fibre særegne mønstre av aktivitetsavhengig bremsing i elektriske stimuleringsparadigmer som involverer å variere stimuleringsfrekvensen^18,19. Denne variasjonen i latensen til C-fiber-handlingspotensialer gir en utfordring for algoritmer designet for å overvåke dem.

Pågående aktivitet i en nociceptor fører til økt variasjon i latens under lavfrekvent elektrisk stimulering, og dette skyldes igjen aktivitetsavhengig bremsing. Denne økte variabiliteten, eller jitter, er et kvantifiserbart proxy-mål for eksitabilitet². Ytterligere årsaker til variabilitet i handlingspotensiell latens inkluderer flip-flop, hvor alternative terminale grener av et enkelt nevron stimuleres, noe som fører til at det fremkalte handlingspotensialet har to (eller flere) baseline latenser som er gjensidig utelukkende²⁰. Endelig forårsaker endringer i temperaturen til en perifer neurons terminale grener også handlingspotensielle latensendringer på termodynamisk måte, med oppvarming som øker ledningshastigheten og kjøling som reduserer ledningshastigheten¹⁹. Dermed må all programvare som søker å utføre elektrisk terskelsporing med lukket sløyfe av nociceptive C-fibre, tillate endringer i latens i elektrisk fremkalte handlingspotensialer.

For å oppnå vårt mål om sporing av elektrisk terskel på tvers av arter av C-fibernociceptorer, utviklet vi APTrack, en programvareplugin med åpen kildekode for Open Ephys-plattformen²¹, for å muliggjøre sanntids, lukket sløyfe, elektrisk terskelsporing og latenssporing. Vi gir proof-of-concept data som viser at C-fiber nociceptor elektrisk terskel sporing under human microneurography er mulig. Videre viser vi at dette verktøyet kan brukes i elektrofysiologi for nagere ex vivo , og dermed muliggjøre translasjonsstudier mellom mennesker og gnagere. Her vil vi beskrive i detalj hvordan forskere kan implementere og bruke dette verktøyet til å hjelpe deres studie av nociceptorfunksjon og spenning.

Protocol

De menneskelige mikroneurografiforsøkene ble godkjent av fakultetet for biovitenskapelig forskningsetikkkomité ved University of Bristol (referansenummer: 51882). Alle deltakerne i studien ga skriftlig informert samtykke. Dyreforsøkene ble utført ved University of Bristol i samsvar med UK Animals (Scientific Procedures) Act 1986 etter godkjenning fra University of Bristol Animal Welfare and ethical review board og var dekket av en prosjektlisens.

1. Installere Open Ephys GUI og APTrack

1. Se i programvaredokumentasjonen for å finne den nyeste versjonen av det grafiske brukergrensesnittet Open Ephys (GUI) som støttes (https://github.com/Microneurography/APTrack#readme), og last ned og installer deretter GUI-en.
2. Installer en kompatibel versjon av GUI-en fra følgende URL-adresse: https://github.com/open-ephys/plugin-GUI/releases.
3. Last ned den nyeste versjonen fra GitHub: https://github.com/Microneurography/APTrack/releases. For en Windows-maskin kopierer du .dll filen til plugins-mappen, som vanligvis finnes på C: \ Program Files \ Open Ephys \ plugins. For en MacOS-datamaskin, kopier .bundle-filen til mappen Contents/PlugIns i pakken.

2. Montering av opptaks- og stimuleringsapparatet

1. Koble oppløsningstavlen til datamaskinen ved hjelp av produsentens kabel, og slå den på.
   MERK: For menneskelig mikroneurografi ble en USB 3.0-isolator brukt til å isolere deltakeren elektrisk fra datamaskinen, og anskaffelseskortet ble drevet av et bærbart batteri i motsetning til strømforsyningen som ble brukt til gnagerstudier. Alle USB-tilkoblingene, unntatt steppermotorens kontrollkort, ble sendt gjennom USB-isolatoren under menneskelige studier.
2. Koble I/O-kortet til den analoge inngangsporten på anskaffelseskortet. Koble et Intan RHD-opptak headstage til anskaffelseskortet ved hjelp av en SPI-kabel (Serial-Peripheral Interface).
   MERK: Intan 16-kanals bipolar headstage ble brukt her, men andre monopolar RHD2000-serien headstages kan brukes.
3. Koble PulsePal til datamaskinen²². For montering med en analog spenningsstyrt stimulator (f.eks. en DS4) ved hjelp av en PulsePal, som med musens teased-fiberopptak, følg trinn 2.5.1-2.5.3; For montering med en roterende koderbasert stimulator (f.eks. en DS7) ved hjelp av en trinnmotor, som med de humane mikroneurografiopptakene, følg trinn 2.6.1-2.6.8 (figur 1).
4. Bygg signalkjeden i det grafiske grensesnittet som beskrevet nedenfor.
   1. Sett inn Rhythm FPGA-pluginet i signalkjeden ved å venstreklikke og dra det inn i signalkjeden; Dette knytter GUI til oppkjøpsstyret. Forsikre deg om at ADC-knappen er klikket på for å starte opptaket av ADC-kanalene fra I / O-kortet. ADC-knappen lyser oransje når den er på.
      MERK: Hvis du ønsker å spille av tidligere innspilte eksperimentelle data, kan File Reader-plugin brukes i starten i stedet for Rhythm FPGA. Ved å bruke dette i kombinasjon med APTrack vil det muliggjøre visualisering og latenssporing av handlingspotensialene i tidligere eksperimenter.
   2. Sett inn et båndpassfilter i signalkjeden; standardinnstillingene på 300-6,000 Hz er egnet for både menneske- og museopptak. I tillegg setter du inn en splitter etter den.
   3. Sett inn APTrack-pluginet i signalkjeden på den ene siden av splitteren og LFP Viewer på den andre siden. LFP Viewer gir en tradisjonell oscilloskoplignende spenningssporvisning, som er nyttig under eksperimenter.
   4. Sett inn en postnode etter plugin-modulen. I rullegardinmenyen endrer du datalagringsformatet fra binært til Open Ephys. Dette fullfører en enkel signalkjede som fungerer bra (figur 2); Imidlertid kan flere komponenter legges til som bestemt av eksperimentelle krav.
      MERK: Hvis postnoden plasseres før plugin-modulen i signalkjeden, lagres ikke sporingsinformasjonen for handlingspotensialet.
   5. Øverst til høyre på GUI-en, klikk på avspillingsknappen for å begynne å overføre data fra anskaffelseskortet og visualisere det. For å begynne innspillingen, klikk på den sirkulære opptaksknappen ved siden av avspillingsknappen.
      MERK: Det er lett å glemme å klikke på posten; Vi registrerer data fra det øyeblikket vi begynner å samle inn for å forhindre at dette skjer.
5. For montering med en analog spenningsstyrt stimulator, følg trinnene som beskrevet nedenfor.
   1. Slå på en konstant strømstimulator som har sin stimuleringsamplitude styrt av en analog spenningsinngang. I dette tilfellet ble det brukt DS4 (figur 1).
   2. PulsePal-utgangskanal 1 er for den analoge spenningskommandoen. Del dette signalet ved hjelp av en BNC T-splitter, og koble det deretter til den konstante strømstimulatorinngangen og I / O-kortet slik at kommandospenningen registreres.
   3. PulsePal-utgangskanal 2 er for TTL-hendelsesmarkøren for elektrisk stimulering. Koble dette til I / O-kortet slik at stimulerings-TTL-hendelsesmarkørene registreres for plugin-modulen som skal brukes og for post hoc-analysen.
6. For montering med en analog spenningsstyrt stimulator, følg trinnene som beskrevet nedenfor.
   1. Slå på en konstant strømstimulator som har sin stimuleringsamplitude kontrollert av et roterende kodingshjul. I dette tilfellet ble det brukt DS7 (figur 1).
   2. Koble steppermotorens kontrollkort til trinnmotoren ved hjelp av produsentens kabel og magnetfeste.
   3. Koble kontrollkortet til datamaskinen direkte ved hjelp av en hvilken som helst standard USB A til USB mikro-B-kabel. Ikke koble kontrolltavlen på deltakersiden av USB-isolatoren, da denne også er koblet til en 12 V strømforsyning.
   4. Hvis det er første gang du bruker kontrolltavlen, laster du opp trinnmotorskriptet fra GitHub til kontrolltavlen; Dette trenger bare å gjøres én gang, eller hvis noen programvareoppdateringer for Stepper Motor skriptet er utgitt.
   5. Sett stimuleringsamplitudehjulet på konstantstrømstimulatoren til 0 mA. Bruk en tilpasset monteringsbrakett til å koble sammen trinnmotoren og stimuleringsamplitudehjulet. Disse kan 3D-printes, noe som muliggjør billige, raske og tilpassbare monteringsløsninger. Rådfør deg med GitHub for å se om et feste allerede er designet for stimulatoren du velger.
   6. Bruk en tilpasset fatadapter til å koble trinnmotorløpet til kontrollhjulet for stimuleringsamplitude. Disse adapterne skal være konstruert av metall for styrke og holdbarhet grunner; 3D-printede deler vil imidlertid også være egnet, selv om de kanskje må byttes ut regelmessig. Ta kontakt med GitHub for å se om en fatadapter allerede er designet for stimulatoren du velger.
   7. Fest kontrollkortet/trinnmotorapparatet løst til stimulatorkontrollhjulet ved hjelp av en tilpasset monterings- og tønneadapter.
      MERK: Monterings- og tønneadapteren strammes senere når programvaren er startet og trinnmotoren automatisk settes til posisjon null.
   8. Koble PulsePal som beskrevet i protokolltrinn 2.5.2-2.5.3 (minus tilkobling av utgangskanal 1 til en stimulator), da generering av TTL-hendelsesmarkører fortsatt er nødvendig for analyse og for at pluginet skal fungere. I tillegg kobler du utgangskanal 2 til DS7-stimulatoren for å utløse den.
7. Forbered musens hud-nervepreparat som beskrevet nedenfor.
   1. Gi C57BL/6J mus (Charles Laboratories, Storbritannia, i denne studien) av 2-4 måneders alder og av begge kjønn med mat og vann ad libitum.
   2. Etter avlivning ved anestetisk overdose gjennom en intraperitoneal injeksjon av natriumpentobarbital (≥200 mg / kg) og bekreftet opphør av sirkulasjon, dissekere huden fra det dorsale aspektet av musens bakpote og saphenøs nerve, som innerverer dette området, ved hjelp av metodene beskrevet av Zimmermann et ^al.23.
   3. Oppretthold hud-nervepreparasjonen i karbogenert syntetisk interstitiell væske (tabell 1) ved 30-32 °C i halvparten av et skreddersydd akrylbad med to kammer (15 ml/min perfusjonshastighet, 30 ml volum). Tre nerven gjennom et lite hull i det mineraloljefylte kammeret, og forsegle med petroleumjell. Oljen gir et isolert opptaksmiljø.
   4. Erte bort to fine filamenter fra stammen av nerven ved hjelp av super fine tang og henge en på hver side av en bipolar sølv / sølvklorid opptak elektrode.
   5. Digitaliser og forsterk det nevrale signalet ved hjelp av en RHD2216 16-kanals bipolar headstage, og behandle det ved hjelp av oppkjøpstavlen. Ta prøve av signalet ved 30 kHz, med et båndpassfilter på 300-6000 Hz, og visualiser det ved hjelp av GUI.
   6. Bruk en stump glassstang, stryk huden på preparatet. Bruk masseaktiviteten med lav amplitude for å bekrefte at preparatet er levende.
8. Utfør human C-fiber mikroneurografi som beskrevet nedenfor.
   1. Utfør mikroneurografi med deltakere som har gitt skriftlig informert samtykke, som tidligere beskrevet²⁴.
   2. Med deltakeren sittende tilbakelent komfortabelt på en seng og støttet med puter, identifiser den overfladiske peroneale nerven ved hjelp av en ultralydskanner, og merk et målområde omtrent 5-10 cm proksimalt for lateral malleolus, rundt midten av skinnnivået.
   3. Steriliser huden rundt målområdet med en 2% klorhexidin i 70% alkoholserviett og sett inn en steril referanseelektrode subkutant nær det tiltenkte opptaksstedet på midten av leggnivået.
   4. Sett inn en steril opptakselektrode i den overfladiske peroneale nerven under ultralydveiledning i målområdet.
   5. Digitaliser og forsterk det nevrale signalet ved hjelp av en RHD2216 16-kanals bipolar headstage, og behandle det ved hjelp av oppkjøpstavlen. Ta prøve av signalet ved 30 kHz, med et båndpassfilter på 300-6000 Hz, og visualiser det ved hjelp av GUI.
      MERK: Anskaffelsesutstyret ble elektrisk isolert fra den bærbare datamaskinen med en USB 3.0-isolator med 5 kV RMS-isolasjon og drevet via en skreddersydd 12 V batteristrømforsyning.
   6. Bekreft vellykket intraneural posisjonering ved å stryke huden forsiktig for å avsløre mekanisk fremkalt masseaktivitet. I tillegg rapporterer deltakerne vanligvis parestesi i det dorsolaterale aspektet av foten ved vellykket intraneural posisjonering.

3. Programvareoppsett og identifisering og fenotyping av perifere nevroner

1. Sett opp programvaren som beskrevet nedenfor.
   1. Åpne GUI-en (figur 3). Hvis steppermotorens kontrollkort er koblet til PC-en din, vil den bli oppdaget og satt til posisjon null. Stram den tilpassede monterings- og tønneadapteren som er beskrevet i trinn 2.6.5-2.6.7, da stimulatorens stimuleringsamplitudehjul og trinnmotor begge er satt til null.
      MERK: Hvis trinnmotoren og stimuleringsamplitudehjulet ikke begge er "nullet", kan dette føre til at steppermotoren prøver å slå kontrollhjulet utenfor sitt område, noe som kan forårsake skade.
   2. I alternativmenyen velger du Trigger Channel. Velg ADC-kanalen som inneholder TTL-markøren for elektrisk stimulering fra PulsePal-utgangskanalen 2.
   3. Velg datakanalen på alternativmenyen, og velg kanalen som inneholder de elektrofysiologiske dataene.
   4. I stimuleringskontrollpanelet definerer du de første, minste og maksimale stimuleringsamplitudene ved hjelp av glidebryteren. Forsikre deg om at gjeldende stimulering er satt over 0 slik at TTL-markører genereres.
      MERK: Noen stimulatorer har et inngang-til-utgangs-skaleringsforhold som ikke er 1: 1; Tenk på dette når du velger en passende stimuleringsamplitude. For eksempel kan et utgangsforhold på 1:10 velges på noen stimuleringssystemer for å oppnå høyere effekt fra den konstante strømstimulatoren.
   5. I stimuleringskontrollpanelet klikker du på F for å laste inn en fil som inneholder stimuleringsinstruksjonene. Elektriske stimuleringsprotokoller lagres som kommaseparerte filer (CSV) sammensatt av ønskede stimuleringsfrekvenser og varighet, noe som gjør det mulig for brukere å lage komplekse stimuleringsparadigmer for sine eksperimenter. En eksempelmal er tilgjengelig her: https://github.com/Microneurography/APTrack/blob/main/example_playlist.csv
   6. I stimuleringskontrollpanelet klikker du på > for å starte det belastede stimuleringsparadigmet. Som standard ber APTrack PulsePal om å generere 0,5 ms varighet positive firkantbølgepulser med varierende amplituder for å kontrollere den konstante strømstimulatorens stimuleringsamplitude.
   7. Det temporale rasterplottet vil begynne å oppdateres med responsen på elektrisk stimulering, med hver ny stimuleringsrespons som vises som en ny kolonne til høyre.
2. Visualiser og identifiser enkeltnevronaksjonspotensialer.
   1. For vellykket påvisning av enkeltnevronaksjonspotensialer er det viktig å ha passende bildeterskler satt. I det temporale rastertegnepanelet justerer du verdiene for lav, gjenkjenning og høy bildeterskel.
      1. Velg et fargevalg på alternativmenyen. I WHOT-modus (White Hot) (standard) kodes spenninger under den lave bildeterskelen i svart. Spenninger mellom terskelen for lavt bilde og deteksjon kodes i gråtoner. Spenninger over deteksjonsterskelen er kodet i grønt, og spenninger over den høye bildeterskelen er kodet i rødt.
   2. Perifere nevroner utviser konstante latensresponser ved lave stimuleringsfrekvenser (<0,25 Hz), og disse responsene bestemmes av ledningshastigheten og avstanden mellom stimulerings- og opptaksstedene. Når egnede bildeterskler er angitt, vil grensekryssingshendelsene som algoritmene registrerer, bli kodet i grønt (figur 4).
   3. Flytt systematisk den stimulerende elektroden rundt hudområdet innervert av nerven som registreres, noe som muliggjør minst tre stimuleringshendelser på hvert sted. Overvåk det temporale rasterplottet for terskelkryssingshendelser (merket med grønt) som forekommer samtidig etter hver elektrisk stimuleringshendelse.
      MERK: Hos mus ble det brukt en søkestimulus på 5 mA. Hos mennesker ble amplituden til den transkutane elektriske søkestimulansen titrert til en verbal smertevurdering slik at den aldri oversteg 7/10.
   4. Se etter tre terskelkryssingshendelser (grønne søyler) som vises på rad med samme ventetid og i samme stimuleringsposisjon; Dette indikerer identifisering av et perifert nevronaksjonspotensial.
   5. Optimaliser den stimulerende elektrodeposisjonen ved å identifisere det mest elektrisk følsomme punktet i målnevronets mottakelige felt, og fest deretter elektroden på plass. På dette punktet i human mikroneurografi, bytt til å bruke intradermale elektroakupunkturnåler (0,2 mm diameter) for bipolar elektrisk stimulering, hos mus brukes en tilpasset transkutan stimulerende sonde slik at stimuleringsposisjonen er konstant.
3. Utføre klassifisering og sensorisk fenotyping av perifere nevroner.
   1. Beregn den elektriske terskelen for målhandlingspotensialet ved å justere simuleringsamplituden manuelt eller ved å bruke APTrack om ønskelig (beskrevet i trinn 4.1-4.2).
   2. Stimulere det mottakelige feltet ved 2x den estimerte elektriske terskelen med en frekvens på 0,25 Hz gjennom sensorisk fenotypingsprotokoll.
   3. Beregn ledningshastigheten til nevronet ved å dele ledningsavstanden med ledningslatens. C-fibre kan identifiseres med en ledningshastighet på ≤2 m/s.
   4. Mekanisk stimulere det mottakelige feltet ved hjelp av von Frey-filamenter for å bestemme den mekaniske terskelen for aktivering. Mekanosensasjon kan identifiseres ved fremkalte handlingspotensialer som er synlige på spenningssporet og en økning i latensen til nevronet, hvis det er en C-fiber, med tilstrekkelig kraft.
   5. Varm opp det mottakelige feltet til nevronet, og se igjen etter handlingspotensialer som er synlige på spenningssporet og en økning i latensen til nevronet, hvis det er en C-fiber, ved tilstrekkelig varmepåføring. Varmefølsomme nevroner vil vise en reduksjon i latens på grunn av den termodynamiske effekten på aksonal forplantning.
      MERK: I human mikroneurografi, bruk en TSC-II for rask og nøyaktig termisk kontroll. I musepreparatet, tilsett oppvarmet eller avkjølt syntetisk interstitiell væske til et aluminiumisolasjonskammer plassert over det mottakelige feltet for å gi tilgang til nevronterminalene samtidig som det begrenser rask varmespredning i omgivende væske. Registrer temperaturen ved hjelp av et termoelement.
   6. Avkjøl det mottakelige feltet, se igjen etter handlingspotensialer som er synlige på spenningssporet og en markert økning i latensen til nevronet, hvis det er en C-fiber, ved tilstrekkelig kald påføring. Alle nevroner vil vise en økning i latens på grunn av den termodynamiske effekten på aksonal forplantning, så vær forsiktig med å merke nevroner som kuldefølsomme basert på en latensøkning alene.

4. Latens og elektrisk terskelsporing

1. Utfør latenssporing som beskrevet nedenfor.
   1. Etter identifisering av enkeltnevronaksjonspotensial(er) på det temporale rasterplottet, flytter du den grå lineære glidebryteren på høyre side av det temporale rasterplottet for å justere posisjonen til søkeboksen.
   2. Under det temporale rasterplottet justerer du glidebryteren for søkeboksbredde til en passende bredde. Gjør bredden på søkeboksen smal for å redusere sjansen for at forbigående støytopper, spontant avfyrende handlingspotensialer eller andre handlingspotensialer med konstant latens i nærheten blir feilidentifisert som handlingspotensialet av interesse.
   3. For å begynne å spore det målrettede handlingspotensialet, klikk på + under sporingstabellen med flere enheter. En ny rad vil bli lagt til i tabellen som inneholder detaljer om målhandlingspotensialet, inkludert latensplassering, prosentandelen som skyter over 2-10 stimuli (justert i alternativmenyen) og toppamplituden som oppdages.
   4. Når et handlingspotensial er lagt til i sporingstabellen med flere enheter, vil latenssporingsalgoritmen (figur 5) automatisk bli utført på den ved hver påfølgende elektrisk stimulering.
   5. Hvis det er flere diskrete handlingspotensialer synlige på det temporale rasterplottet, legger du dem til i sporingstabellen med flere enheter som beskrevet ovenfor. Det teoretiske maksimale antallet handlingspotensialer som kan legges til tabellen for samtidig latenssporing, er den maksimale 32-biters heltallsverdien.
   6. Merk av for Spor fordypning i tabellen for flerenhetssporing for å flytte søkeboksen til riktig posisjon for det bestemte handlingspotensialet, som bestemt av algoritmen for sporing av ventetid. Dette vil gjøre det mulig å overvåke latenssporing i sanntid og sikre at sporingen følger handlingspotensialet som forventet. Latenssporing av andre pigger vil fortsette som normalt i bakgrunnen.
   7. Fjern sporede handlingspotensialer fra sporingstabellen med flere enheter ved hjelp av sletteknappen på slutten av hver rad.
2. Utfør elektrisk terskelsporing som beskrevet nedenfor.
   1. Juster øknings- og reduksjonshastighetene i stimuleringskontrollpanelet mellom 0,1 V og 0,5 V. Hold disse verdiene like, og ikke juster dem under eksperimentet med mindre dette er en del av det eksperimentelle paradigmet.
   2. Sørg for at stimuleringsfrekvensen er satt til en passende hastighet, typisk 0,25-0,5 Hz, med mindre modulering av stimuleringsfrekvensen er en del av det eksperimentelle paradigmet. Økende nociceptorfyringshastigheter kan endre den elektriske terskelen til nociceptor.
   3. Når et handlingspotensial spores, merker du av for Sporeterskel i sporingstabellen med flere enheter, som vil starte den elektriske terskelsporingsalgoritmen (figur 6).
      MERK: Sporing av elektrisk terskel kjøres bare på det målrettede handlingspotensialet. Faktisk vil avfyringshastighetene for andre handlingspotensialer i multienhetssporingstabellen oppdateres tilsvarende etter hvert som stimuleringsamplituden endres.
   4. Juster stimuleringsamplituden manuelt til estimatet av den elektriske terskelen; Dette vil redusere ventetiden for å bestemme den elektriske terskelen. Tiden det tar å etablere en pålitelig elektrisk terskel er avhengig av stimuleringsfrekvensen, stignings- og reduksjonshastighetene og forskjellen i stimuleringsamplitude fra den første stimuleringen til nevronets elektriske terskel.
   5. Programvaren bruker en opp-ned-metode for estimering av nevronenes elektriske terskel. I multienhetssporingstabellen bestemmes avfyringshastigheten over 2-10 tidligere stimuleringer (valgt i alternativmenyen). Velg antall stimuleringshendelser som skal vurderes; Et høyere tall vil øke påliteligheten til terskelestimatet, men vil ta lengre tid å oppnå.
   6. Under menneskelig mikroneurografi er det viktig å overvåke smertefullheten av elektriske stimuli for å forhindre overdreven ubehag hos deltakerne; noe ubehag er uunngåelig under studiet av nociceptorer, spesielt av stille/sovende C-fibre. Be regelmessig om smertevurderinger mens stimuleringsamplituden øker under sporing av elektrisk terskel, og forbli i nærheten av den konstante strømstimulatoren for å koble den fra på deltakerens forespørsel.
      MERK: Alternativt kan den elektriske stimuleringen kobles ut via brukergrensesnittet ved å klikke på [ ] -knappen i stimuleringskontrollpanelet.
   7. En avfyringshastighet på 50% indikerer at den omtrentlige elektriske terskelen er bestemt.
   8. Mens elektrisk terskelsporing, bruk en eksperimentell manipulasjon til det mottakelige feltet, for eksempel temperatur- eller legemiddelmanipulasjoner. Effektene av disse manipulasjonene på den elektriske terskelen til nociceptoren vil bli sporet.
      MERK: Gi tilstrekkelig tid til å identifisere en ny nociceptorterskel etter eksperimentell manipulasjon.

Representative Results

Et representativt eksempel på programvaren som arbeider for å kontrollere et eksperiment er vist i figur 7. Den justerer iterativt stimuleringsamplituden ved hjelp av en opp-ned-metode for effektivt å finne den elektriske terskelen til enkeltnociceptorer. For første gang demonstrerer vi muligheten for sanntids single-neuron elektrisk terskelsporing hos mennesker under mikroneurografi (figur 7A). I tillegg viser vi elektrisk terskelsporing i en mus Aδ-fiber (figur 7B). Identifisering av tiltakspotensialer ved terskelkryssing, som brukt her, er tilstrekkelig for å spore elektriske terskler over tid. Vi anbefaler at brukerne tar skritt for å minimere elektrisk støy under opptakene sine, for eksempel ved å bruke et Faraday-bur og båndpassfiltre for å forbedre signal-støy-forholdet.

For å demonstrere at sporing av elektrisk terskel kan brukes som et mål på endringer i nociceptorspenning hos mennesker, ble sporing av den elektriske terskelen under et trinnvis oppvarmingsparadigme utført (figur 8). Å øke temperaturen på nociceptorterminalene reduserte den elektriske stimuleringsstrømmen som kreves for å fremkalle et aksjonspotensial, noe som reflekterer en økning i nociceptor-eksitabilitet (figur 8C). Dette var sannsynligvis forårsaket av generering av reseptorpotensialer av de varmefølsomme ionkanalene uttrykt i C-fiber nociceptor¹⁴. Ved høyeste temperaturtrinn, 44 °C, ble termisk fremkalte aksjonspotensialer fremkalt (figur 8A, stimulus nummer 86-96). Dette medfører en økning i den elektriske terskelen, da nociceptoren kan være i en ildfast tilstand etter høyfrekvent utladning. Som forventet ble latensen til det sporede handlingspotensialet redusert etter hvert som temperaturen økte. Dette antas å skje på grunn av en termodynamisk effekt på ledningsmaskineriet, noe som øker ledningshastigheten til C-fiberen. Denne C-fiberen kan også vise flip-flop (figur 8B, stimulus nummer 47-54), noe som kan resultere i at følgende elektriske stimulering feilaktig økes i amplitude hvis handlingspotensialet faller utenfor algoritmens søkevindu.

Figur 1: Et skjema over utstyrsoppsettet og kabeltilkoblingene som kreves for sporing av nociceptor-elektrisk terskel med APTrack hos gnagere og mennesker. Legg merke til de to forskjellige metodene for stimuleringsamplitudekontroller: en steppermotor for manuelt justerte stimulatorer i vårt menneskelige oppsett, og en PulsePal for inngangsspenningsstyrte stimulatorer i vårt gnageroppsett. (1) En PC (Windows, Mac eller Linux) som kjører plugin-modulen for Open Ephes-plattformen. (2) En stepper motor som driver stimuleringsamplitudehjulet på DS7. (3) En konstant strømstimulator godkjent for bruk hos mennesker; her brukte vi en DS7. (4) En USB 3.0 optoisolator, som isolerer den menneskelige deltakeren fra PCen (valgfritt, bare nødvendig for menneskelig forskning). (5) En PulsePal V2 pulsgenerator, som genererer TTL-tidsstempler (utgangskanal 2) og spenningstrinn som tilsvarer den forespurte stimuleringsamplituden (utgangskanal 1). (6) En konstant strømstimulator for bruk hos dyr; Her brukte vi en DS4. (7) En likestrømforsyning for systemet (nettstrømforsyning som brukes til gnageroppsettet og batteriets likestrømforsyning som brukes til det menneskelige oppsettet). (8) Et ervervsstyre. (9) Et I/O-kort for å koble til BNC-koaksialkablene som bærer signalene som skal registreres, for eksempel termoelementutgangene og TTL-markørene. (10) Musens hud-nervepreparasjon gjennomgår nociceptor elektrofysiologiske opptak. (11) En menneskelig deltaker som gjennomgår mikroneurografiopptak fra C-fibre i den overfladiske peroneale nerven. (12) En Intan RHD2216 headstage for anskaffelse og digitalisering av opptakene. (13) Et Intan Electrode Adapter Board, som opptakselektrodene er koblet til og som gjør det mulig å sende signalet til RHD2216-hovedscenen. (14) Et termisk stimuleringssystem som kan sende ut temperaturen via en BNC-koaksialforbindelse. (15) En 3,3 V batteridrevet knapp / fotpedal som brukes til å markere mekaniske stimuleringshendelser og narkotikaapplikasjoner. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 2: Malsignalkjede. Den røde pilen peker på knappen for å aktivere ADC-inngangen fra I/O-kortet. Den gule pilen indikerer rullegardinmenyen for å velge Open Ephys-filformatet. Den grønne pilen angir knappene Spill av og Ta opp. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 3: Grafisk brukergrensesnitt. GUI-en består av fire hovedkomponenter. (1) Temporal Raster Plot-panel (grønn) for datavisualisering og innstillingene knyttet til kontroll av plottet. En konstant latensrespons som viser gradvis aktivitetsavhengig bremsing, indikeres av den grønne pilen. (2) Stimuleringskontrollpanel (gul) for innstilling av stimuleringsamplitudeparametrene og lasting av stimuleringsparadigmeskriptene. (3) Multi-Unit Tracking Table (blå) for å legge til handlingspotensialene for sporing og aktivering av latens og elektrisk terskelsporing. (4) Alternativer: Meny for valg av fargestiler og inngangskanal for dataene og TTL-utløsere. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 4: Tilrettelegging for identifisering av handlingspotensialer med konstant latens gjennom sanntids datavisualisering på et tidsmessig rasterplott ved hjelp av APTrack. Dette er et eksempel på høyt signal-støy-forhold. Dataene som presenteres i det temporale rasterplottet er fra et humant C-fiberopptak fra den overfladiske peroneale nerven under mikroneurografi. Voltage Trace er oscilloskoplignende LFP Viewer-plugin i Open Ephys. APTrack brukergrensesnitt er det grafiske brukergrensesnittet til pluginet. Det sporede handlingspotensialet indikeres av grønne piler, og den sirkulære glidebryteren på kanten av det temporale rasterplottet er for å kontrollere søkeboksposisjonen der algoritmene vil søke etter terskelkryssingshendelser. Den elektriske stimuleringsartefakten er merket med blått på spenningssporet. Stimuleringsamplituden til den analoge spenningskommandoen er indikert i rødt; Merk at dette kanskje ikke er det samme som stimuleringsstrømamplituden, avhengig av skaleringsfaktoren som er satt på stimulatoren. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 5: Grafisk fremstilling av latenssporingsalgoritmen. Enkelt sagt, hvis et handlingspotensial oppdages ved terskelkryssing, vil søkeboksen justere posisjonen for å sentrere seg selv på tidspunktet for toppspenningen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 6: Grafisk fremstilling av den elektriske terskelsporingsalgoritmen. Enkelt sagt, hvis et aksjonspotensial oppdages ved terskelovergang, vil stimuleringsamplituden reduseres med reduksjonsraten. Hvis det ikke oppdages noe aksjonspotensial, økes stimuleringsamplituden med økningshastigheten. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 7: Automatisert elektrisk terskelsporing av enkeltnevronaksjonspotensialer ved en stimuleringsfrekvens på 0,25 Hz . (A) Sekvensielle spor av en human C-fiber av den overfladiske peroneale nerven under et mikroneurografieksperiment. (B) Sekvensielle spor av en mus Aδ-fiber av saphenøs nerve under hud-nerve forberedelse ertet fiber elektrofysiologi. Sporene ble farget rødt når et aksjonspotensial ble identifisert, noe som resulterte i en reduksjon i stimulusamplituden. Programvarealgoritmen finner effektivt stimulusamplituden som kreves for en 50% sannsynlighet for avfyring. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 8: Sporing av elektrisk terskel ved en stimuleringsfrekvens på 0,25 Hz under termisk stimulering av en human C-fiber nociceptor. Y-aksen koder for stimuleringstallet fra starten av paradigmet. (A) Spenningsspor i 4000 ms etter elektrisk stimulering, med terskelkryssingshendelser merket med rødt. (B) Spenningsspor fra A zoomet inn rundt det sporede handlingspotensialet. Sporene ble farget røde da det sporede aksjonspotensialet ble oppdaget. Den vertikale blå linjen er grunnlinjeventetiden til den sporede enheten. (C) Stimuleringsstrøm kommandert av APTrack. Den vertikale blå linjen er den grunnleggende elektriske terskelen. (D) Mottakelig felt TCS-II termisk stimulerende sondetemperatur. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Sammensatt	Konsentrasjon
NaCl	107,8 mM
NaHCO3	26,2 mM
KCl	3,5 mM
NaH2PO4	1,67 mM
CaCl2	1,53 mM
MgSO4	0,69 mM
Natriumglukonat	9,64 mM
Sukrose	7,6 mM
Glukose	5,55 mM

Tabell 1: Innhold av syntetisk interstitiell væske for musens hud-nervepreparat²³.

Discussion

APTrack er en programvareplugin for bruk med Open Ephys-plattformen. Vi har valgt denne plattformen da den er åpen kildekode, fleksibel og billig å implementere. Ikke inkludert kostnaden for konstant strømstimulator, alt utstyret som kreves for å begynne å bruke pluginet, kan kjøpes for rundt $ 5,000 USD i skrivende stund. Vi håper dette vil gjøre det mulig for forskere å implementere APTrack i sine perifere nerveelektrofysiologistudier lettere. Videre kan forskere fritt endre programvaren for å passe deres eksperimentelle behov. Det er viktig at dette verktøyet har tillatt elektrisk terskelsporing av enkeltfibernociceptorer, for første gang, hos mennesker.

Jo høyere signal-støy-forhold, desto bedre kan algoritmene identifisere handlingspotensialer. Signal-støy-forholdet under mikronevrografi var tilstrekkelig i de fleste av våre registreringer, men brukerne må være oppmerksomme på risikoen for signalforringelse over tid. Dette er spesielt viktig for lengre eksperimentelle protokoller, fordi hvis det sporede aksjonspotensialets amplitude faller under deteksjonsterskelen, vil stimuleringsamplituden økes feilaktig; Dette kan reduseres ved at eksperimenter overvåker pluginet og deretter justerer innstillingene om nødvendig. Signal-støy-forholdet forbedres med båndpassfiltrering, men større transienter kan fortsatt feilidentifiseres som handlingspotensialer hvis de ankommer i løpet av søkeboksens tidsvindu. Risikoen for feilidentifisering av forbigående støy som et handlingspotensial kan reduseres ved å begrense tidsvinduet der programtillegget søker etter handlingspotensialer og ved å optimalisere terskelinnstillingene. Imidlertid er det fortsatt situasjoner man kan støte på som hindrer pluginets ytelse. Spontan aktivitet kan forårsake vanskeligheter hvis aksjonspotensialer med større amplitude faller innenfor algoritmens søkeboksvindu, da de vil bli feilidentifisert som målhandlingspotensialet. I tillegg kan spontan aktivitet i nevronet av interesse bety at den elektriske stimuleringen faller i løpet av sin ildfaste periode, noe som forårsaker manglende generering av et handlingspotensial. Vanskeligheter med å bruke programvaren kan også oppstå når primære afferente nevroner utviser flip-flop, hvorved alternative terminale grener av et enkelt nevron stimuleres, og dermed forårsaker at det fremkalte handlingspotensialet har to (eller flere) baseline latenser som er gjensidig utelukkende²⁰. Under opptak fra nevroner som viser flip-flop med høye signal-til-støy-forhold, utførte vi vellykket latens og elektrisk terskelsporing ved å øke bredden på søkeboksen for å innkapsle alle potensielle ledningshastigheter som nevronet viste. Den elektriske terskelen kan imidlertid variere avhengig av den terminale grenen av nevronet som blir begeistret, noe som sannsynligvis delvis skyldes forskjeller i avstanden fra stedet for den elektriske stimuleringen til de alternative nociceptorterminalene. Ytterligere arbeid på handlingspotensialidentifikasjonsprosessen for å inkludere for eksempel malmatching er mulig og kan integreres i denne programvaren. GUI-pluginene for båndstopp eller adaptiv støyfiltrering kan også brukes oppstrøms for APTrack i signalkjeden hvis de utvikles.

Vi anser den elektriske terskelen bestemt til å være strømmen som kreves for å fremkalle et handlingspotensial 50% av tiden, over et brukerdefinert antall elektriske stimuli, typisk 2-10. Morfologien til elektrisk stimulering er 0,5 ms og positive, firkantbølgepulser. Dette er ikke det samme som å bestemme reobasen, et vanlig mål for neuronal excitability. Plugin kan tilpasses for å bestemme reobasen. Imidlertid forfulgte vi et enklere tiltak, da dynamiske endringer i eksitabilitet, som de som antas å forekomme under oppvarming, ville ha vært vanskeligere å kvantifisere med rheobaseendringer enn vårt elektriske terskelestimat.

Denne programvaren kan brukes i både eksperimenter med mennesker og gnagere. Dette er mulig takket være fleksibel støtte til de elektriske stimuleringssystemene. Programvaren vil fungere med enhver stimulator som aksepterer en analog kommandospenning eller kan kobles manuelt med en stepper motor. For mikroneurografi brukte vi den med en CE-merket konstant strømstimulator som var designet for bruk i menneskelig forskning og fikk stimuleringen styrt av en skive. Stimulatorer som godtar analoge spenningskommandoer kan være støyende da de ikke kobler fra kretsen mellom stimuli, noe som betyr at enhver 50/60 Hz hum eller støy på den analoge inngangen vil bli overført til opptaket. En stimulator som krever et ekstra TLL-utløsersignal for å koble til kretsen, slik at en stimulus ved en strøm som er analog med den analoge spenningsinngangen som skal genereres, er ideell for bruk med pluginet. Dette forhindrer at støyen overføres til opptaket mellom stimuli.

Programvaren bruker en enkel opp-ned-metode for å estimere den elektriske terskelen. Dette har blitt brukt i psykofysikktester i mange tiår²⁵. I tråd med opp-ned-metoden tar den elektriske terskelsporingsalgoritmen for modulering av stimuleringsamplituden bare hensyn til den forrige stimuleringens amplitude og respons ved beregning av neste stimuleringsamplitude. Dette betyr at stimuleringsamplituden vil svinge rundt den sanne elektriske terskelen, og dermed produsere en 50% avfyringshastighet, forutsatt at terskelen er stabil. Minste størrelse på en økning eller reduksjon er 0, 01 V; Dette tilsvarer 0,01 mA forutsatt at stimulatoren har et inngangsforhold på 1 V: 1 mA inngang til utgang og tilstrekkelig oppløsning for å oppnå trinnendringer så små. Plugin vil oppdatere live-estimatet av målhandlingspotensialets elektriske terskel hver gang den når en 50% avfyringshastighet over et brukerdefinert antall tidligere stimuli (2-10). Post hoc anbefaler vi å bruke et rullerende gjennomsnitt av stimuleringsamplituden over de siste 2-10 stimuli for å estimere den elektriske terskelen, og det skal bemerkes at dette estimatet bare vil være nøyaktig når avfyringshastigheten er relativt stabil på 50%. I både live og post hoc estimater av den elektriske terskelen, er det en balanse mellom oppløsning, pålitelighet og tid til å vurdere. Bruk av mindre øknings- og reduksjonstrinn vil øke nøyaktigheten til det elektriske terskelestimatet, men vil øke tiden det tar å finne den nye elektriske terskelen først og etter forstyrrelse. Beregning av den elektriske terskelen over et større antall tidligere stimuli vil gi bedre pålitelighet, men vil øke tiden som kreves for å nå et nøyaktig estimat.

APTrack ble designet for bruk i perifere nerveopptak, spesielt for å spore de elektriske tersklene til C-fibre under eksperimentelle og patologiske forstyrrelser over perioder hvor handlingspotensialets latens kan variere avhengig av den underliggende nevronaktiviteten. Denne metoden vil muliggjøre undersøkelse av ikke bare aksonal eksitabilitet, men også av nociceptorgeneratorpotensialer hos friske frivillige og pasienter. Vi forventer at andre felt av elektrofysiologi kan vedta og tilpasse dette verktøyet til bruk i ethvert eksperiment som krever elektrisk terskelsporing av en stimuluslåst aktivitet. For eksempel kan dette like gjerne tilpasses for optogenetisk stimulering med lyspulser drevet fra APTrack. Plugin er åpen kildekode og tilgjengelig for forskere under en GPLv3-lisens. Den er bygget på Open Ephys-plattformen, som er et tilpasningsdyktig, rimelig datainnsamlingssystem med åpen kildekode. Plugin gir ekstra kroker for nedstrøms plugins for å trekke ut handlingspotensialinformasjonen og gi flere brukergrensesnitt eller adaptative paradigmer. Plugin gir et enkelt brukergrensesnitt for visualisering og latenssporing av handlingspotensialer i sanntid. Den kan også spille av tidligere data og visualisere dem ved hjelp av det temporale rasterplottet. Videre kan den også utføre latenssporing under avspilling av tidligere data. Selv om det finnes andre programvarepakker tilgjengelig for latenssporing i sanntid, er de ikke åpen kildekode og kan ikke utføre elektrisk terskelsporing^26,27. APTrack har en fordel i forhold til tradisjonelle metoder for å identifisere konstante latenshandlingspotensialer fra spenningsspor, da den bruker et tidsmessig rasterplott for datavisualiseringen. Videre har våre erfaringer med å bruke den i eksperimenter med lave signal-støy-forhold indikert at den temporale rasterplottvisualiseringsmetoden tillater identifisering av konstante latenshandlingspotensialer som ellers kan ha blitt savnet.

Helnerveterskelsporing er en mye brukt metode for å vurdere aksonal eksitabilitet¹³. Single-neuron elektrisk terskelsporing i gnagere C-fibre har tidligere blitt brukt til å kvantifisere nociceptor excitability¹⁴, og dens nytte hos mennesker er anerkjent^10,11; Men til nå har dette ikke vært mulig. Vi tilbyr et nytt verktøy med åpen kildekode for direkte måling av eksitabilitet for enkeltnociceptorer i både elektrofysiologiske studier av gnagere og mennesker. APTrack muliggjør sanntids, åpen kildekode, elektrisk terskelsporing av enkeltnevronaksjonspotensialer hos mennesker, for første gang. Vi forventer at det vil lette translasjonsstudier av nociceptorer mellom gnagere og mennesker.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
12V DC Power Supply	NA	NA	To power uStepper S-lite. Required for dial-controlled stimulators.
36 Pin Electrode Adapter Board	Intan Technology	C3410	APTrack Dependency. For connecting electrode input to headstage. $255 USD as of March 2021.
APTrack Plugin	NA	NA	https://github.com/Microneurography/APTrack
Bipolar Ag/AgCl Recording Electrode	Custom	NA	Recording electrode for the skin-nerve preparation. Or equivalent.
Bipolar Concentric Stimulating Electrode	World Precision Instruments	SNE-100	For electrical stimulation in the mouse skin-nerve preparation. Or equivalent.
Bipolar Transcutaneous Stimulating Electrode	Custom	NA	For transcutaneous electrical stimulation while searching for single-neuron action potentials during microneurography.
BNC T Splitter (1+)	NA	NA	APTrack Dependency. Any standard BNC T splitter.
BNC to BNC cables (3+)	NA	NA	APTrack Dependency. Any standard BNC cables.
C6H11NaO7	Merck	S2054	Skin-nerve preparation synthetic interstitial fluid constituent. Or equivalent.
CaCl2	Merck	C5670	Skin-nerve preparation synthetic interstitial fluid constituent. Or equivalent.
Digitimer DS4 Constant Current Stimulator	Digitimer	DS4	Constant current stiulator for animal research. £1,695 GBP as of September 2022.
Digitimer DS7 Constant Current Stimulator	Digitimer	DS7A	Constant current stiulator for human research. £3,400 GBP as of September 2022.
Electroaccupuncture Classic Plus Stimulating Electrodes	Harmony Medical	NA	For fixed position intradermal electrical stimulation of the dorsal aspect of the foot during human microneurography.
Glucose	Fisher Scientific	G/0450/60	Skin-nerve preparation synthetic interstitial fluid constituent. Or equivalent.
HDMI Cable	NA	NA	APTrack Dependency. Any standard passive HMDI cable. To connect OE I/O Board to OE Acquisition Board.
KCl	Merck	P9541	Skin-nerve preparation synthetic interstitial fluid constituent. Or equivalent.
MgSO4	Acros Organics	213115000	Skin-nerve preparation synthetic interstitial fluid constituent. Or equivalent.
Mineral Oil	Merck	330779	Electrical insulation for nerve recordings in th skin-nerve preparation. Or equivalent.
NaCl	Merck	S9888	Skin-nerve preparation synthetic interstitial fluid constituent. Or equivalent.
NaHCO3	Merck	S6014	Skin-nerve preparation synthetic interstitial fluid constituent. Or equivalent.
NaHCO3	Merck	S0751	Skin-nerve preparation synthetic interstitial fluid constituent. Or equivalent.
Open Ephys Acquisition Board	Open Ephys	NA	APTrack Dependency. Includes USB cable to connect to computer and mains socket power supply. €2,955 EUR as of September 2022.
Open Ephys Graphical User Interface	Open Ephys	NA	https://github.com/open-ephys/plugin-GUI
Open Ephys I/O Board	Open Ephys	NA	APTrack Dependency. For ADC voltage inputs via BNC cables. €12.5 EUR without connectors, €85 EUR with connectors as of September 2022.
PulsePal V2	Sanworks	1102	APTrack Dependency. Open-source DAC and train generator. $725 USD pre-assembled as of September 2022. Approx. $275 USD for self-assembly.
RHD 6ft SPI Cable	Intan Technology	C3206	APTrack Dependency. For connecting headstage to OE Acquisition Board. $295 USD as of March 2021
RHD2216 16ch Bipolar Headstage	Intan Technology	C3313	APTrack Dependency. For data acquisition and digitization. $725 USD as of March 2021. Or equivalent RHD2000 series headstage.
Sucrose	Fisher Scientific	S/8560/60	Skin-nerve preparation synthetic interstitial fluid constituent. Or equivalent.
TCS-II Thermal Stimulator	QST.Lab	NA	For thermal stimualtion of nociceptor receptive fields during human microneurography.
Tungsten Microelectrode Pair (Active + Reference)	FHC	30085	For microneurography recordings. 35mm.
Ultrasound Scanner iQ+	Butterfly Network	NA	For ultrasound-guided electrode insertion during microneurography.
USB 3.0 5kV RMS Isolation	Inota Technology	7055-D	For isolating human microneuroography participant from computer. €459 EUR as of September 2022.
USB-A to micro USB-B cable (2)	NA	NA	APTrack Dependency. To connect computer to PulsePal and to uStepper S-lite if using stepper-stimulator interfacing.
uStepper S-lite + NEMA17 motor	uStepper	NA	To interface with stimulators via a control dial. €50 EUR as of September 2022.
Von Frey Filaments	Ugo Basile	37450-275	For mechanical stimulation of receptive fields during sensory phenotyping of nociceptors.