Summary
APTrack är ett mjukvaruplugin utvecklat för Open Ephus-plattformen som möjliggör datavisualisering i realtid och sluten elektrisk tröskelspårning av neuronala åtgärdspotentialer. Vi har framgångsrikt använt detta i mikroneurografi för humana C-fibernociceptorer och mus-C-fiber- och Aδ-fibernociceptorer.
Abstract
Nociceptorer är en klass av primära afferenta neuroner som signalerar potentiellt skadliga skadliga stimuli. En ökning av nociceptor excitabilitet uppträder vid akuta och kroniska smärttillstånd. Detta ger onormal pågående aktivitet eller minskade aktiveringströsklar till skadliga stimuli. Att identifiera orsaken till denna ökade excitabilitet krävs för utveckling och validering av mekanismbaserade behandlingar. Elektrisk tröskelspårning med en neuron kan kvantifiera nociceptorens excitabilitet. Därför har vi utvecklat en applikation för att tillåta sådana mätningar och demonstrera dess användning hos människor och gnagare. APTrack tillhandahåller datavisualisering i realtid och identifiering av åtgärdspotential med hjälp av ett tidsmässigt rasterdiagram. Algoritmer upptäcker åtgärdspotentialer genom tröskelkorsning och övervakar deras latens efter elektrisk stimulering. Plugin modulerar sedan den elektriska stimuleringsamplituden med hjälp av en upp-ner-metod för att uppskatta nociceptorernas elektriska tröskel. Programvaran byggdes på Open Eprys-systemet (V0.54) och kodades i C ++ med hjälp av JUCE-ramverket. Den körs på Windows, Linux och Mac operativsystem. Den öppna källkoden är tillgänglig (https://github.com/
Introduction
Nociceptorer är primära afferenta neuroner i det perifera nervsystemet som aktiveras av öppet eller potentiellt vävnadsskadande händelser och spelar en kritisk skyddande roll vid akut smärta1. Elektrofysiologiska inspelningar från C-fiber och Aδ-fiber nociceptorer i djurmodeller, friska frivilliga försökspersoner och patienter har avslöjat sensibilisering och onormal spontan aktivitet i ett brett spektrum av smärttillstånd 2,3,4,5,6,7. Att förstå mekanismerna som ligger till grund för dessa förändringar i nociceptor excitabilitet hos patienter kan möjliggöra riktade terapeutiska ingrepp8. Det finns emellertid få verktyg för att bedöma nociceptor excitabilitet direkt, särskilt hos patienter9, men potentialen för användbarheten av sådana verktyg är välkänd10,11.
Helnerv elektrisk tröskelspårning kan användas för att undersöka axonal excitabilitet hos människor12. Men eftersom stora, myeliniserade, perifera neuroner bidrar oproportionerligt till amplituden för den sensoriska sammansatta åtgärdspotentialen, tillåter inte helnervens elektriska tröskelspårning bedömningen av C-fiberfunktion11,13. Faktum är att i en tidigare studie visade helnervens elektriska tröskelspårning i kroniska neuropatiska smärtkohorter med diabetisk neuropati och kemoterapiinducerad polyneuropati inga skillnader i axonal excitabilitet11.
I en tidigare studie användes elektrisk tröskelspårning på singelneuronnivå för att undersöka excitabiliteten hos C-fibernociceptorer under retade fiberinspelningar i ett ex vivo råtthudnervpreparat14. Författarna visade att en ökad kaliumkoncentration, sura förhållanden och bradykinin alla ökade C-fiber nociceptor excitabilitet, vilket återspeglas av en minskad elektrisk tröskel för generering av åtgärdspotential. Dessutom minskade uppvärmningen av det receptiva fältet hos de värmekänsliga nociceptorerna deras elektriska tröskel, medan värmekänsliga nociceptorer uppvisade en ökning av deras elektriska tröskel14. Detta ger viktiga bevis på att elektrisk tröskelspårning med en neuron är möjlig och kan vara till nytta, men det finns för närvarande ingen programvara och / eller hårdvarulösningar tillgängliga för att möjliggöra sådana undersökningar, särskilt för mänskliga studier.
Hos människor är mikroneurografi den enda tillgängliga metoden för att direkt bedöma de elektrofysiologiska egenskaperna hos C-fibrer15. Detta tillvägagångssätt har använts för att visa nociceptordysfunktion hos patienter med kronisk smärta 2,3,4,5,6,7. Mikroneurografi kan detektera enstaka neuron åtgärdspotentialer; På grund av de låga signal-brusförhållandena använder forskare dock märkningstekniken för att karakterisera C-fiberaktivitet16. I märkningstekniken appliceras supratröskel elektrisk stimulering på C-fiberreceptiva fält i huden. Denna elektriska stimulering genererar en åtgärdspotential som uppstår vid en konstant latens, som bestäms av C-fiberns ledningshastighet. C-fibrer uppvisar aktivitetsberoende avmattning, varigenom deras ledningshastighet minskar och därför ökar deras ledningslatens under perioder av verkningspotentialurladdning 17. Under basala förhållanden genererar C-fibrer normalt inte åtgärdspotentialer i frånvaro av skadliga stimuli, och därför är deras ledningslatens som svar på lågfrekvent elektrisk stimulering konstant. Mekaniska, termiska eller farmakologiska stimuli, som framkallar avfyrning, inducerar aktivitetsberoende avmattning, vilket ökar latensen hos de aktionspotentialer som framkallas av samtidig lågfrekvent elektrisk stimulering. Detta möjliggör objektiv identifiering av svar på de applicerade icke-elektriska stimuli i samband med ett lågt signal-brusförhållande. Därför kan aktivitetsberoende bromsning användas för att funktionellt karakterisera C-fibrer16. Faktum är att olika funktionella klasser av C-fibrer uppvisar distinkta mönster av aktivitetsberoende avmattning i elektriska stimuleringsparadigmer som involverar att variera stimuleringsfrekvensen18,19. Denna variation i latensen för C-fiberåtgärdspotentialer utgör en utmaning för algoritmer som är utformade för att övervaka dem.
Pågående aktivitet i en nociceptor leder till ökad variation i dess latens under lågfrekvent elektrisk stimulering, och detta beror återigen på aktivitetsberoende avmattning. Denna ökade variabilitet, eller jitter, är ett kvantifierbart proxymått på excitabilitet2. Ytterligare orsaker till variabilitet i åtgärdspotentiallatens inkluderar flip-flop, där alternativa terminala grenar av en enda neuron stimuleras, vilket gör att den framkallade åtgärdspotentialen har två (eller flera) baslinjelatenser som är ömsesidigt uteslutande20. Slutligen orsakar förändringar i temperaturen hos en perifer neurons terminala grenar också förändringar i åtgärdspotentialen på ett termodynamiskt sätt, med uppvärmning som ökar ledningshastigheten och kylning saktar ledningshastigheten19. Således måste all programvara som försöker utföra sluten elektrisk tröskelspårning av nociceptiva C-fibrer möjliggöra förändringar i latens i elektriskt framkallade åtgärdspotentialer.
För att uppnå vårt mål om artöverskridande elektrisk tröskelspårning av C-fibernociceptorer utvecklade vi APTrack, ett plugin med öppen källkod för Open Eprys-plattformen21, för att möjliggöra realtidsspårning, sluten slinga, elektrisk tröskelspårning och latensspårning. Vi tillhandahåller proof-of-concept-data som visar att C-fiber nociceptor elektrisk tröskelspårning under mänsklig mikroneurografi är möjlig. Vidare visar vi att detta verktyg kan användas i gnagare ex vivo retad fiberelektrofysiologi, vilket möjliggör translationella studier mellan människor och gnagare. Här kommer vi att beskriva i detalj hur forskare kan implementera och använda detta verktyg för att underlätta deras studier av nociceptorfunktion och excitabilitet.
Protocol
De mänskliga mikroneurografiexperimenten godkändes av fakulteten för biovetenskaplig forskningsetikkommitté vid University of Bristol (referensnummer: 51882). Alla studiedeltagare gav skriftligt informerat samtycke. Djurförsöken utfördes vid University of Bristol i enlighet med UK Animals (Scientific Procedures) Act 1986 efter godkännande av University of Bristol Animal Welfare och etisk granskningsnämnd och omfattades av en projektlicens.
1. Installera Open Ephys GUI och APTrack
- Kontrollera programvarudokumentationen för att hitta den senaste versionen av Open Ephys grafiska användargränssnitt (GUI) som stöds (https://github.com/Microneurography/APTrack#readme) och ladda sedan ner och installera GUI.
- Installera en kompatibel version av det grafiska användargränssnittet från följande URL: https://github.com/open-ephys/plugin-GUI/releases.
- Ladda ned den senaste versionen från GitHub: https://github.com/Microneurography/APTrack/releases. För en Windows-dator, kopiera den .dll filen till plugins-mappen, som vanligtvis finns på C: \ Program Files \ Open Ephys \ plugins. För en MacOS-dator kopierar du .bundle-filen till mappen Contents/PlugIns i paketet.
2. Montering av registrerings- och stimuleringsapparaten
- Anslut anskaffningskortet till datorn med den kabel som tillverkaren levererade och slå på den.
OBS: För mänsklig mikroneurografi användes en USB 3.0-isolator för att elektriskt isolera deltagaren från datorn, och förvärvskortet drevs av ett bärbart batteri i motsats till nätspänningen som används för gnagarstudier. Alla USB-anslutningar, exklusive stegmotorstyrkortet, leddes genom USB-isolatorn under de mänskliga studierna. - Anslut I/O-kortet till den analoga in-porten på förvärvskortet. Anslut en Intan RHD-inspelningshuvudscen till förvärvskortet med en SPI-kabel (Serial-Peripheral Interface).
OBS: Intan 16-kanals bipolära headstage användes här, men andra monopolära RHD2000-seriens headstages kan användas. - Anslut PulsePal till datorn22. För montering med en analog spänningsstyrd stimulator (t.ex. en DS4) med en PulsePal, som med musens retade fiberinspelningar, följ steg 2.5.1-2.5.3; För montering med en rotationsencoderbaserad stimulator (t.ex. en DS7) med hjälp av en stegmotor, som med inspelningarna av human mikroneurografi, följ steg 2.6.1-2.6.8 (figur 1).
- Bygg signalkedjan i GUI enligt beskrivningen nedan.
- Sätt in Rhythm FPGA-plugin i signalkedjan genom att vänsterklicka och dra den in i signalkedjan; detta ansluter GUI till förvärvskortet. Se till att ADC-knappen har klickats på för att initiera inspelningen av ADC-kanalerna från I / O-kortet. ADC-knappen lyser orange när den är på.
OBS: Om du vill spela upp tidigare inspelade experimentella data kan File Reader-plugin användas i början istället för Rhythm FPGA. Genom att använda detta i kombination med APTrack kan visualisering och latensspårning av åtgärdspotentialerna i tidigare experiment möjliggöras. - Sätt in ett bandpassfilter i signalkedjan; standardinställningarna på 300-6 000 Hz är lämpliga för både mänskliga och musinspelningar. Sätt dessutom in en splitter efter den.
- Sätt in APTrack-plugin i signalkedjan på ena sidan av splittern och LFP Viewer på andra sidan. LFP Viewer ger en traditionell oscilloskopliknande spänningsspårvy, vilket är användbart under experiment.
- Infoga en postnod efter plugin-programmet. I rullgardinsmenyn ändrar du datasparformatet från binärt till Open Ephys. Detta slutför en enkel signalkedja som fungerar bra (figur 2); Ytterligare komponenter kan dock läggas till enligt experimentella krav.
OBS: Om postnoden placeras före plugin i signalkedjan sparas inte spårningsinformationen för åtgärdspotential. - Längst upp till höger i GUI klickar du på uppspelningsknappen för att börja överföra data från förvärvskortet och visualisera det. För att börja spela in, klicka på den cirkulära inspelningsknappen bredvid uppspelningsknappen.
OBS: Det är lätt att glömma att klicka på post; Vi registrerar data från det ögonblick vi börjar förvärva för att förhindra att detta händer.
- Sätt in Rhythm FPGA-plugin i signalkedjan genom att vänsterklicka och dra den in i signalkedjan; detta ansluter GUI till förvärvskortet. Se till att ADC-knappen har klickats på för att initiera inspelningen av ADC-kanalerna från I / O-kortet. ADC-knappen lyser orange när den är på.
- För montering med en analog spänningsstyrd stimulator, följ stegen enligt beskrivningen nedan.
- Slå på en konstant strömstimulator som har sin stimuleringsamplitud styrd av en analog spänningsingång. En DS4 användes i detta fall (figur 1).
- PulsePal-utgångskanal 1 är för det analoga spänningskommandot. Dela denna signal med en BNC T-splitter, och anslut den sedan till konstantströmsstimulatoringången och I / O-kortet så att kommandospänningen registreras.
- PulsePal-utgångskanal 2 är för TTL-händelsemarkören för elektrisk stimulering. Anslut detta till I/O-kortet så att TTL-händelsemarkörerna för stimulering registreras för plugin-programmet som ska användas och för post hoc-analysen.
- För montering med en analog spänningsstyrd stimulator, följ stegen enligt beskrivningen nedan.
- Slå på en konstant strömstimulator som har sin stimuleringsamplitud styrd av en roterande kodningsratt. En DS7 användes i detta fall (figur 1).
- Anslut stegmotorns styrkort till stegmotorn med hjälp av den kabel och magnetfäste som tillverkaren medföljer.
- Anslut styrkortet direkt till datorn med en vanlig USB A till USB micro-B-kabel. Anslut inte styrkortet på deltagarsidan av USB-isolatorn eftersom detta också är anslutet till ett 12 V-nätaggregat.
- Om det är första gången du använder styrkortet laddar du upp stegmotorskriptet från GitHub till styrkortet. Detta behöver bara göras en gång, eller om några programuppdateringar för stegmotorskriptet släpps.
- Ställ in stimuleringsamplitudratten på konstantströmsstimulatorn till 0 mA. Använd ett anpassat monteringsfäste för att ansluta stegmotorn och stimuleringsamplitudratten. Dessa kan 3D-printas, vilket möjliggör billiga, snabba och anpassningsbara monteringslösningar. Konsultera GitHub för att se om ett fäste redan har utformats för den stimulator du väljer.
- Använd en anpassad fatadapter för att ansluta stegmotorröret till kontrollratten för stimuleringsamplitude. Dessa adaptrar bör vara tillverkade av metall av hållfasthets- och hållbarhetsskäl. 3D-utskrivna delar skulle dock också vara lämpliga, även om de kan behöva bytas ut regelbundet. Konsultera GitHub för att se om en fatadapter redan har utformats för den valda stimulatorn.
- Fäst styrkortet/stegmotorapparaten löst på stimulatorns kontrollratt med hjälp av ett anpassat fäste och pipadapter.
OBS: Fästet och fatadaptern kommer att dras åt senare när programvaran har startats och stegmotorn automatiskt ställs in i läge noll. - Anslut PulsePal enligt beskrivningen i protokollsteg 2.5.2-2.5.3 (minus anslutning av utgångskanal 1 till en stimulator), eftersom generering av TTL-händelsemarkörer fortfarande krävs för analys och för att plugin ska fungera. Anslut dessutom utgångskanal 2 till DS7-stimulatorn för att utlösa den.
- Förbered mushudnervpreparatet enligt beskrivningen nedan.
- Ge C57BL / 6J-möss (Charles River Laboratories, Storbritannien, i denna studie) med 2-4 månaders ålder och av båda könen med mat och vatten ad libitum.
- Efter utgallring genom överdosering av bedövningsmedel genom intraperitoneal injektion av natriumpentobarbital (≥200 mg/kg) och bekräftelse på att cirkulationen upphört, dissekeras huden från ryggdelen av musens baktass och saphenusnerven, som innerverar detta område, med de metoder som beskrivs av Zimmermann et al.23.
- Håll hudnervpreparatet i karbogenerad syntetisk interstitiell vätska (tabell 1) vid 30-32 °C i hälften av ett specialtillverkat akrylbad med två kammare (15 ml/min perfusionshastighet, 30 ml volym). Trä nerven genom ett litet hål i den mineraloljefyllda kammaren och försegla med vaselin. Oljan ger en isolerad inspelningsmiljö.
- Reta bort två fina filament från nervstammen med superfina pincett och häng en på varje sida av en bipolär silver / silverkloridinspelningselektrod.
- Digitalisera och förstärka den neurala signalen med hjälp av en RHD2216 16-kanals bipolär headstage och bearbeta den med hjälp av förvärvskortet. Sampla signalen vid 30 kHz, med ett bandpassfilter på 300-6 000 Hz, och visualisera den med hjälp av GUI.
- Använd en trubbig glasstång och stryk preparatets hud. Använd massaktiviteten med låg amplitud för att bekräfta att preparatet lever.
- Utföra human C-fibermikroneurografi enligt beskrivningen nedan.
- Genomföra mikroneurografi med deltagare som har lämnat skriftligt informerat samtycke, som tidigare beskrivits24.
- Med deltagaren sittande bekvämt lutad på en säng och stödd med kuddar, identifiera den ytliga peroneala nerven med hjälp av en ultraljudsskanner och markera ett målområde ca 5-10 cm proximalt till lateral malleolus, runt mitten av skenbenet.
- Sterilisera huden runt målområdet med en 2% klorhexidin i 70% alkoholservett och sätt in en steril referenselektrod subkutant nära den avsedda inspelningsplatsen vid mitten av skenbenet.
- Sätt in en steril inspelningselektrod i den ytliga peronealnerven under ultraljudsvägledning inom målområdet.
- Digitalisera och förstärka den neurala signalen med hjälp av en RHD2216 16-kanals bipolär headstage och bearbeta den med hjälp av förvärvskortet. Sampla signalen vid 30 kHz, med ett bandpassfilter på 300-6 000 Hz, och visualisera den med hjälp av GUI.
OBS: Anskaffningsutrustningen isolerades elektriskt från den bärbara datorn med en USB 3.0-isolator med 5 kV RMS-isolering och strömförsörjdes via en skräddarsydd 12 V batteriströmförsörjning. - Bekräfta framgångsrik intraneural positionering genom att försiktigt stryka huden för att avslöja mekaniskt framkallad massaktivitet. Dessutom, deltagarna rapporterar vanligtvis parestesi i den dorsolaterala aspekten av foten vid framgångsrik intraneural positionering.
3. Programvaruinstallation och identifiering och fenotypning av perifera neuroner
- Konfigurera programvaran enligt beskrivningen nedan.
- Öppna det grafiska användargränssnittet (bild 3). Om stegmotorstyrkortet är anslutet till din dator kommer det att upptäckas och ställa in sig på position noll. Dra åt det anpassade fästet och fatadaptern som beskrivs i steg 2.6.5-2.6.7, eftersom stimulatorns stimuleringsamplitudratt och stegmotor båda är inställda på noll.
OBS: Om stegmotorn och stimuleringsamplitudratten inte båda är "nollställda" kan detta leda till att stegmotorn försöker vrida kontrollratten utanför sitt område, vilket kan orsaka skador. - I alternativmenyn väljer du utlösarkanalen. Välj ADC-kanalen som innehåller TTL-markören för elektrisk stimulering från PulsePal-utgångskanal 2.
- Välj datakanal på alternativmenyn och välj den kanal som innehåller elektrofysiologiska data.
- I stimuleringskontrollpanelen definierar du initiala, lägsta och maximala stimuleringsamplituder med skjutreglaget. Se till att den aktuella stimuleringen är inställd över 0 så att TTL-markörer genereras.
OBS: Vissa stimulatorer har ett input-to-output-skalningsförhållande som inte är 1: 1; Tänk på detta när du väljer en lämplig stimuleringsamplitud. Till exempel kan ett utgångsförhållande på 1:10 väljas på vissa stimuleringssystem för att uppnå en högre effekt från konstantströmsstimulatorn. - I stimuleringskontrollpanelen klickar du på F för att ladda en fil som innehåller stimuleringsinstruktionerna. Elektriska stimuleringsprotokoll lagras som kommaseparerade värdefiler (CSV) som består av önskade stimuleringsfrekvenser och varaktighet, vilket gör det möjligt för användare att skapa komplexa stimuleringsparadigmer för sina experiment. En exempelmall finns här: https://github.com/Microneurography/APTrack/blob/main/example_playlist.csv
- I stimuleringskontrollpanelen klickar du på > för att starta det laddade stimuleringsparadigmet. Som standard begär APTrack PulsePal att generera 0,5 ms varaktighet positiva fyrkantsvågpulser med varierande amplituder för att styra konstantströmstimulatorns stimuleringsamplitud.
- Det temporala rasterdiagrammet börjar uppdateras med svaret på elektrisk stimulering, där varje nytt stimuleringssvar visas som en ny kolumn till höger.
- Öppna det grafiska användargränssnittet (bild 3). Om stegmotorstyrkortet är anslutet till din dator kommer det att upptäckas och ställa in sig på position noll. Dra åt det anpassade fästet och fatadaptern som beskrivs i steg 2.6.5-2.6.7, eftersom stimulatorns stimuleringsamplitudratt och stegmotor båda är inställda på noll.
- Visualisera och identifiera åtgärdspotentialer för enstaka neuroner.
- För framgångsrik detektion av åtgärdspotentialer med en neuron är det viktigt att ha lämpliga bildtrösklar inställda. I panelen för tidsrasterdiagram justerar du tröskelvärdena för låg, detektering och hög bild.
- Välj ett färgschema på alternativmenyn. I WHOT-läge (White Hot) (standard) kodas spänningar under den låga bildtröskeln i svart. Spänningar mellan de låga bild- och detektionströsklarna kodas i gråskala. Spänningar över detektionströskeln kodas i grönt och spänningar över tröskelvärdet för höga bilder kodas i rött.
- Perifera neuroner uppvisar konstanta latenssvar vid låga stimuleringsfrekvenser (<0,25 Hz), och dessa svar bestäms av deras ledningshastighet och avståndet mellan stimulerings- och inspelningsställena. Med lämpliga bildtrösklar inställda kodas tröskelkorsningshändelserna som detekteras av algoritmerna i grönt (figur 4).
- Flytta systematiskt den stimulerande elektroden runt hudområdet som innerveras av nerven som registreras, vilket möjliggör minst tre stimuleringshändelser på varje ställe. Övervaka det tidsmässiga rasterdiagrammet för tröskelkorsningshändelser (markerade med grönt) som inträffar vid samma tidpunkt efter varje elektrisk stimuleringshändelse.
OBS: Hos möss användes en sökstimulans på 5 mA. Hos människor titrerades amplituden för den transkutana elektriska sökstimulansen till en verbal smärtgrad så att den aldrig översteg 7/10. - Sök efter tre tröskelkorsningshändelser (gröna staplar) som visas i rad med samma latens och i samma stimuleringsposition. Detta indikerar identifieringen av en perifer neuronåtgärdspotential.
- Optimera den stimulerande elektrodpositionen genom att identifiera den mest elektriskt känsliga punkten i målneuronens receptiva fält och fixera sedan elektroden på plats. Vid denna punkt i human mikroneurografi, byt till att använda intradermala elektroakupunkturnålar (0,2 mm diameter) för bipolär elektrisk stimulering, hos möss används en anpassad transkutan stimulerande sond så att stimuleringspositionen är konstant.
- För framgångsrik detektion av åtgärdspotentialer med en neuron är det viktigt att ha lämpliga bildtrösklar inställda. I panelen för tidsrasterdiagram justerar du tröskelvärdena för låg, detektering och hög bild.
- Utför klassificering och sensorisk fenotypning av perifera neuroner.
- Uppskatta den elektriska tröskeln för målåtgärdspotentialen genom att justera simuleringsamplituden manuellt eller genom att använda APTrack om så önskas (beskrivs i steg 4.1-4.2).
- Stimulera det receptiva fältet vid 2x den uppskattade elektriska tröskeln vid en frekvens av 0,25 Hz genom hela det sensoriska fenotypningsprotokollet.
- Beräkna neuronens ledningshastighet genom att dividera ledningsavståndet med ledningslatensen. C-fibrer kan identifieras med en ledningshastighet på ≤2 m/s.
- Mekaniskt stimulera det receptiva fältet med hjälp av von Frey-filament för att bestämma den mekaniska tröskeln för aktivering. Mekanosensation kan identifieras genom framkallade åtgärdspotentialer synliga på spänningsspåret och en ökning av neuronens latens, om det är en C-fiber, vid tillräcklig kraft.
- Värm neuronens receptiva fält, titta igen på åtgärdspotentialer synliga på spänningsspåret och en ökning av neuronens latens, om det är en C-fiber, vid tillräcklig värmeapplikation. Värmeokänsliga neuroner kommer att uppvisa en minskning av latens på grund av den termodynamiska effekten på axonal förökning.
OBS: I mänsklig mikroneurografi, använd en TSC-II för snabb och exakt termisk kontroll. I musberedningen, tillsätt uppvärmd eller kyld syntetisk interstitiell vätska till en aluminiumisoleringskammare placerad över det receptiva fältet för att möjliggöra åtkomst till neuronterminalerna samtidigt som snabb värmeavledning begränsas i den omgivande vätskan. Registrera temperaturen med ett termoelement. - Kyl det receptiva fältet, titta igen på åtgärdspotentialer synliga på spänningsspåret och en markant ökning av neuronens latens, om det är en C-fiber, vid tillräcklig kall applikation. Alla neuroner kommer att uppvisa en ökning av latens på grund av den termodynamiska effekten på axonal förökning, så var försiktig med att märka neuroner som kallkänsliga baserat på en latensökning ensam.
4. Latens och elektrisk tröskelspårning
- Utför latensspårning enligt beskrivningen nedan.
- Efter identifieringen av åtgärdspotentialer med en neuron i det temporala rasterdiagrammet flyttar du det grå linjära skjutreglaget till höger om det temporala rasterdiagrammet för att justera sökrutans position.
- Under det tidsmässiga rasterdiagrammet justerar du det roterande reglaget för sökrutans bredd till en lämplig bredd. Gör sökrutans bredd smal för att minska risken för att tillfälliga brustoppar, spontant utlösande åtgärdspotentialer eller andra närliggande åtgärdspotentialer med konstant latens felaktigt identifieras som åtgärdspotentialen av intresse.
- För att börja spåra den riktade åtgärdspotentialen, klicka på + under spårningstabellen för flera enheter. En ny rad läggs till i tabellen som innehåller information om målåtgärdspotentialen, inklusive latensplatsen, procentandelen som avfyrar över 2-10 stimuli (justerad i alternativmenyn) och den upptäckta toppamplituden.
- När en åtgärdspotential läggs till i spårningstabellen för flera enheter körs latensspårningsalgoritmen (figur 5) automatiskt på den vid varje efterföljande elektrisk stimulering.
- Om det finns flera diskreta åtgärdspotentialer synliga i det temporala rasterdiagrammet lägger du till dem i spårningstabellen för flera enheter enligt beskrivningen ovan. Det teoretiska maximala antalet åtgärdspotentialer som kan läggas till i tabellen för samtidig latensspårning är det maximala 32-bitars heltalsvärdet.
- Markera rutan Spåra toppar i tabellen för spårning av flera enheter för att flytta sökrutan till lämplig position för den specifika åtgärdspotentialen, som bestäms av latensspårningsalgoritmen. Detta gör det möjligt att övervaka latensspårningen i realtid och säkerställa att spårningen följer åtgärdspotentialen som förväntat. Latensspårningen av andra toppar fortsätter som vanligt i bakgrunden.
- Ta bort spårade åtgärdspotentialer från spårningstabellen för flera enheter med knappen Ta bort i slutet av varje rad.
- Utför elektrisk tröskelspårning enligt beskrivningen nedan.
- Justera öknings- och minskningshastigheterna i stimuleringskontrollpanelen mellan 0,1 V och 0,5 V. Håll dessa värden lika och justera dem inte under experimentet om inte detta är en del av det experimentella paradigmet.
- Se till att stimuleringsfrekvensen är inställd på en lämplig hastighet, vanligtvis 0,25-0,5 Hz, såvida inte modulering av stimuleringsfrekvensen är en del av det experimentella paradigmet. Ökande nociceptorbränningshastigheter kan förändra den elektriska tröskeln för nociceptor.
- När en åtgärdspotential har spårats markerar du rutan Spårtröskel i spårningstabellen för flera enheter, som initierar den elektriska tröskelspårningsalgoritmen (figur 6).
OBS: Elektrisk tröskelspårning körs endast på den riktade åtgärdspotentialen; Faktum är att avfyrningshastigheterna för andra åtgärdspotentialer i spårningstabellen för flera enheter kommer att uppdateras i enlighet med detta när stimuleringsamplituden ändras. - Justera stimuleringsamplituden manuellt till uppskattningen av den elektriska tröskeln; Detta minskar väntetiden för att bestämma den elektriska tröskeln. Den tid det tar att upprätta en tillförlitlig elektrisk tröskel beror på stimuleringsfrekvensen, öknings- och minskningshastigheterna och skillnaden i stimuleringsampluden från den initiala stimuleringen till neuronens elektriska tröskel.
- Programvaran använder en upp-ner-metod för uppskattning av den elektriska tröskeln för neuronerna. I spårningstabellen för flera enheter bestäms avfyrningshastigheten över 2-10 tidigare stimuleringar (valda i alternativmenyn). Välj antalet stimuleringshändelser som ska beaktas; Ett högre tal ökar tillförlitligheten i tröskelvärdesuppskattningen, men det tar längre tid att uppnå.
- Under mänsklig mikroneurografi är det viktigt att övervaka smärtsamheten hos elektriska stimuli för att förhindra överdriven deltagares obehag. vissa obehag är oundvikliga under studien av nociceptorer, särskilt av tysta / sovande C-fibrer. Be regelbundet om smärtbetyg medan stimuleringsamplituden ökar under den elektriska tröskelspårningen och förbli i närheten av konstantströmstimulatorn för att koppla ur den på deltagarens begäran.
OBS: Alternativt kan den elektriska stimuleringen kopplas ur via användargränssnittet genom att klicka på knappen [ ] i stimuleringskontrollpanelen. - En avfyrningshastighet på 50% indikerar att den ungefärliga elektriska tröskeln har bestämts.
- Medan elektrisk tröskelspårning, applicera en experimentell manipulation på det receptiva fältet, såsom temperatur eller läkemedelsmanipulationer. Effekterna av dessa manipuleringar på nociceptorns elektriska tröskel kommer att spåras.
OBS: Ge tillräckligt med tid för att identifiera en ny nociceptortröskel efter experimentell manipulation.
Representative Results
Ett representativt exempel på programvaran som arbetar för att styra ett experiment visas i figur 7. Den justerar iterativt stimuleringsamplituden med hjälp av en upp-ner-metod för att effektivt hitta den elektriska tröskeln för enstaka nociceptorer. För första gången demonstrerar vi genomförbarheten av realtids single-neuron elektrisk tröskelspårning hos människor under mikroneurografi (Figur 7A). Dessutom visar vi elektrisk tröskelspårning i en mus Aδ-fiber (figur 7B). Identifieringen av åtgärdspotentialer genom tröskelkorsning, som används här, är tillräcklig för att spåra elektriska trösklar över tiden. Vi rekommenderar att användare vidtar åtgärder för att minimera elektriskt brus under sina inspelningar, till exempel genom att använda en Faraday-bur och bandpassfilter för att förbättra signal-brusförhållandet.
För att visa att elektrisk tröskelspårning kan användas som ett mått på förändringar i nociceptorretbarhet hos människor utfördes spårning av den elektriska tröskeln under ett stegat uppvärmningsparadigm (figur 8). Att öka temperaturen på nociceptorterminalerna minskade den elektriska stimuleringsströmmen som krävs för att framkalla en åtgärdspotential, vilket återspeglar en ökning av nociceptorens excitabilitet (figur 8C). Detta orsakades sannolikt av generering av receptorpotentialer av de värmekänsliga jonkanalerna uttryckta i C-fibernociceptor14. Vid det högsta temperatursteget, 44 °C, framkallades termiskt framkallade åtgärdspotentialer (figur 8A, stimulusnummer 86-96). Detta medför en ökning av den elektriska tröskeln eftersom nociceptorn kan vara i eldfast tillstånd efter högfrekvent urladdning. Som förväntat minskade svarstiden för den spårade åtgärdspotentialen när temperaturen ökade. Detta tros inträffa på grund av en termodynamisk effekt på ledningsmaskineriet, vilket ökar ledningshastigheten hos C-fibern. Denna C-fiber kan också uppvisa flip-flop (figur 8B, stimulansnummer 47-54), vilket kan resultera i att följande elektriska stimulering felaktigt ökas i amplitud om åtgärdspotentialen faller utanför algoritmens sökfönster.
Figur 1: En schematisk bild av utrustningsinställningar och kabelanslutningar som krävs för nociceptors elektriska tröskelspårning med APTrack hos gnagare och människor. Observera de två olika metoderna för stimuleringsamplitudkontroller: en stegmotor för manuellt justerade stimulatorer i vår mänskliga inställning och en PulsePal för ingångsspänningsstyrda stimulatorer i vår gnagarinställning. (1) En PC (Windows, Mac eller Linux) som kör plugin-programmet för Open Ephus-plattformen. (2) En stegmotor som driver stimuleringsamplitudratten på DS7. (3) En konstantströmstimulator godkänd för användning hos människor; här använde vi en DS7. (4) En USB 3.0-optoisolator som isolerar den mänskliga deltagaren från datorn (tillval, krävs endast för mänsklig forskning). (5) En pulsePal V2-pulsgenerator, som genererar TTL-tidsstämplar (utgångskanal 2) och spänningssteg som motsvarar den begärda stimuleringsamplituden (utgångskanal 1). (6) En konstantströmstimulator för användning på djur. här använde vi en DS4. (7) En likströmsförsörjning för systemet (nätaggregat för likström som används för gnagarinstallationen och batteriets likströmsförsörjning som används för den mänskliga installationen). (8) En förvärvsnämnd. (9) Ett I / O-kort för att ansluta BNC-koaxialkablarna som bär signalerna som ska registreras, såsom termoelementutgångar och TTL-markörer. (10) Hudnervpreparatet på möss som genomgår elektrofysiologiska registreringar av nociceptor. (11) En mänsklig deltagare som genomgår mikroneurografiinspelning från C-fibrer i den ytliga peronealnerven. (12) En Intan RHD2216 headstage för förvärv och digitalisering av inspelningarna. (13) Ett Intan-elektrodadapterkort, som inspelningselektroderna är anslutna till och som gör att signalen kan överföras till RHD2216-scenen. (14) Ett termiskt stimuleringssystem som kan mata ut temperaturen via en BNC-koaxialanslutning. (15) En 3,3 V batteridriven knapp-/fotpedal som används för att markera mekaniska stimuleringshändelser och läkemedelstillämpningar. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Mallsignalkedja. Den röda pilen pekar på knappen för att aktivera ADC-indata från I/O-kortet. Den gula pilen anger rullgardinsmenyn för att välja filformatet Open Eprys. Den gröna pilen visar knapparna Spela upp och Spela in. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Bild 3: Grafiskt användargränssnitt. GUI består av fyra huvudkomponenter. (1) Temporal Raster Plot panel (grön) för datavisualisering och inställningarna för att styra diagrammet. Ett konstant svarssvar som visar gradvis aktivitetsberoende avmattning indikeras av den gröna pilen. (2) Stimuleringskontrollpanel (gul) för inställning av stimuleringsamplitudparametrarna och laddning av stimuleringsparadigmskripten. (3) Multi-Unit Tracking Table (blå) för att lägga till åtgärdspotentialerna för spårning och aktivering av latens och elektrisk tröskelspårning. (4) Alternativmeny för att välja färgstilar och ingångskanal för data- och TTL-utlösare. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Underlättande av identifiering av åtgärdspotentialer med konstant latens genom datavisualisering i realtid på ett tidsrasterdiagram med APTrack. Detta är ett exempel med högt signal-brusförhållande. De data som presenteras i det temporala rasterdiagrammet är från en mänsklig C-fiberinspelning från den ytliga peroneala nerven under mikroneurografi. Voltage Trace är det oscilloskopliknande LFP Viewer-pluginet inom Open Ephys. APTrack-användargränssnittet är det grafiska användargränssnittet för plugin. Den spårade åtgärdspotentialen indikeras med gröna pilar och det cirkulära skjutreglaget på gränsen till det temporala rasterdiagrammet är för att styra sökrutans position där algoritmerna söker efter tröskelkorsningshändelser. Artefakten för elektrisk stimulering är markerad med blått på spänningsspåret. Stimuleringsamplituden för det analoga spänningskommandot indikeras i rött; Observera att detta kanske inte är detsamma som stimuleringsströmamplituden beroende på skalningsfaktorn inställd på stimulatorn. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Bild 5: Grafisk representation av latensspårningsalgoritmen. Enkelt uttryckt, om en åtgärdspotential detekteras genom tröskelkorsning, kommer sökrutan att justera sin position för att centrera sig vid tidpunkten för toppspänningen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: Grafisk representation av algoritmen för elektrisk tröskelspårning. Enkelt uttryckt, om en åtgärdspotential detekteras genom tröskelkorsning, kommer stimuleringsamplituden att minskas med minskningshastigheten. Om ingen åtgärdspotential detekteras kommer stimuleringsamplituden att ökas med ökningshastigheten. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 7: Automatiserad elektrisk tröskelspårning av åtgärdspotentialer med en neuron vid en stimuleringsfrekvens på 0,25 Hz . (A) Sekventiella spår av en mänsklig C-fiber av den ytliga peronealnerven under ett mikroneurografiexperiment. (B) Sekventiella spår av en mus Aδ-fiber av saphenous nerven under hud-nervberedning retade fiberelektrofysiologi. Spåren färgades röda när en åtgärdspotential identifierades, vilket resulterade i en minskning av stimulansamplituden. Mjukvarualgoritmen finner effektivt den stimulansamplitud som krävs för en 50% sannolikhet för avfyrning. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 8: Elektrisk tröskelspårning vid en stimuleringsfrekvens på 0,25 Hz under termisk stimulering av en human C-fibernociceptor. Y-axeln kodar stimuleringsnumret från paradigmets början. (A) Spänningsspår för 4 000 ms efter elektrisk stimulering, med tröskelkorsningshändelser markerade med rött. (B) Spänningsspår från A inzoomat runt den spårade åtgärdspotentialen. Spåren färgades röda när den spårade åtgärdspotentialen upptäcktes. Den vertikala blå linjen är baslinjefördröjningen för den spårade enheten. (C) Stimuleringsström som styrs av APTrack. Den vertikala blå linjen är baslinjens elektriska tröskel. (D) Receptivt fält TCS-II termisk stimulerande sondtemperatur. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Förening | Koncentration |
| NaCl | 107,8 mM |
| NaHCO3 Annonser | 26,2 mM |
| KCl | 3,5 mM |
| NaH2PO4 | 1,67 mM |
| CaCl2 | 1,53 mM |
| MgSO4 | 0,69 mM |
| Natriumglukonat | 9,64 mM |
| Sackaros | 7,6 mM |
| Glukos | 5,55 mM |
Tabell 1: Innehåll i den syntetiska interstitiella vätskan för musens hudnervpreparat23.
Discussion
APTrack är ett mjukvaruplugin för användning med Open Eprys-plattformen. Vi har valt denna plattform eftersom den är öppen källkod, flexibel och billig att implementera. Exklusive kostnaden för konstantströmsstimulatorn kan all utrustning som krävs för att börja använda plugin köpas för cirka $ 5,000 USD i skrivande stund. Vi hoppas att detta kommer att göra det möjligt för forskare att lättare implementera APTrack i sina perifera nervelektrofysiologiska studier. Dessutom kan forskare fritt modifiera programvaran för att passa deras experimentella behov. Det är viktigt att detta verktyg har möjliggjort elektrisk tröskelspårning av enstaka C-fibernociceptorer för första gången hos människor.
Ju högre signal-brusförhållande, desto bättre kan algoritmerna identifiera åtgärdspotentialer. Signal-brusförhållandet under mikroneurografi var tillräckligt i de flesta av våra inspelningar, men användarna måste vara uppmärksamma på risken för signalförsämring över tid. Detta är särskilt viktigt för längre experimentella protokoll, för om den spårade åtgärdspotentialens amplitud sjunker under detektionströskeln kommer stimuleringsamplituden att ökas felaktigt; Detta kan mildras genom att experimenterare övervakar plugin-programmet och sedan justerar inställningarna om det behövs. Signal-brusförhållandet förbättras med bandpassfiltrering, men större transienter kan fortfarande felidentifieras som åtgärdspotentialer om de skulle komma under sökrutans tidsfönster. Risken för felidentifiering av övergående brus som en åtgärdspotential kan minskas genom att begränsa tidsfönstret under vilket plugin söker efter åtgärdspotentialer och genom att optimera tröskelinställningarna. Det finns dock fortfarande situationer som man kan stöta på som hindrar plugin-programmets prestanda. Spontan aktivitet kan orsaka svårigheter om åtgärdspotentialer med större amplitud faller inom algoritmens sökrutefönster, eftersom de kommer att felidentifieras som målåtgärdspotentialen. Dessutom kan spontan aktivitet i neuronen av intresse innebära att den elektriska stimuleringen faller under sin eldfasta period, vilket orsakar misslyckande med att generera en åtgärdspotential. Svårigheter att använda programvaran kan också uppstå när primära afferenta neuroner uppvisar flip-flop, varigenom alternativa terminala grenar av en enda neuron stimuleras, vilket orsakar att den framkallade åtgärdspotentialen har två (eller flera) baslinjelatenser som är ömsesidigt uteslutande20. Under inspelningar från neuroner som uppvisar flip-flop med höga signal-brusförhållanden utförde vi framgångsrikt latens och elektrisk tröskelspårning genom att öka sökrutans bredd för att kapsla in alla potentiella ledningshastigheter som neuronen uppvisade. Den elektriska tröskeln kan emellertid variera beroende på den terminala grenen av neuronen som exciteras, vilket sannolikt delvis beror på skillnader i avståndet från platsen för den elektriska stimuleringen till de alternativa nociceptorterminalerna. Ytterligare arbete med processen för identifiering av åtgärdspotential för att inkludera till exempel mallmatchning är genomförbart och skulle kunna integreras i denna programvara. GUI-plugins för bandstopp eller adaptiv brusfiltrering kan också användas uppströms APTrack i signalkedjan om de skulle utvecklas.
Vi anser att den elektriska tröskeln som bestäms är den ström som krävs för att framkalla en åtgärdspotential 50% av tiden, över ett användardefinierat antal elektriska stimuli, vanligtvis 2-10. Morfologin för elektrisk stimulering är 0,5 ms och positiva fyrkantvågspulser. Detta är inte detsamma som att bestämma reobasen, ett vanligt mått på neuronal excitabilitet. Insticksprogrammet kan anpassas för att bestämma reobasen. Vi eftersträvade dock ett enklare mått, eftersom dynamiska förändringar i retbarhet, såsom de som antas inträffa under uppvärmning, skulle ha varit svårare att kvantifiera med reobasförändringar än vår elektriska tröskeluppskattning.
Denna programvara kan användas i både mänskliga och gnagare experiment. Detta möjliggörs genom flexibelt stöd för de elektriska stimuleringssystemen. Programvaran fungerar med alla stimulatorer som accepterar en analog kommandospänning eller kan anslutas manuellt med en stegmotor. För mikroneurografi använde vi den med en CE-märkt konstantströmstimulator som var utformad för användning i mänsklig forskning och hade stimuleringen styrd av en ratt. Stimulatorer som accepterar analoga spänningskommandon kan vara bullriga eftersom de inte kopplar bort kretsen mellan stimuli, vilket innebär att 50/60 Hz brum eller brus på den analoga ingången kommer att överföras till inspelningen. En stimulator som kräver en ytterligare TLL-utlösningssignal för att ansluta kretsen, vilket tillåter en stimulans vid en ström som är analog med den analoga spänningsingången som ska genereras, är idealisk för användning med plugin. Detta förhindrar att bruset överförs till inspelningen mellan stimuli.
Programvaran använder en enkel upp-ner-metod för att uppskatta den elektriska tröskeln. Detta har använts i psykofysiktester i många decennier25. I linje med upp-ned-metoden tar den elektriska tröskelspårningsalgoritmen för modulering av stimuleringsamplituden endast hänsyn till den tidigare stimuleringens amplitud och respons vid beräkning av nästa stimulerings amplitud. Detta innebär att stimuleringsamplituden kommer att svänga runt den sanna elektriska tröskeln, vilket ger en 50% avfyrningshastighet, förutsatt att tröskeln är stabil. Minsta storleken på ett steg eller minskning är 0,01 V; detta motsvarar 0,01 mA förutsatt att stimulatorn har ett 1 V: 1 mA input-to-output-förhållande och tillräcklig upplösning för att uppnå stegförändringar så små. Insticksprogrammet uppdaterar den levande uppskattningen av målåtgärdspotentialens elektriska tröskel varje gång den når en 50% avfyrningshastighet över ett användardefinierat antal tidigare stimuli (2-10). Post hoc rekommenderar vi att du använder ett rullande medelvärde av stimuleringsamplituden under de senaste 2-10 stimuli för att uppskatta den elektriska tröskeln, och det bör noteras att denna uppskattning endast kommer att vara korrekt när avfyrningshastigheten är relativt stabil vid 50%. I både live- och post hoc-uppskattningarna av den elektriska tröskeln finns det en balans mellan upplösning, tillförlitlighet och tid att överväga. Användning av mindre steg för ökning och minskning ökar noggrannheten i uppskattningen av den elektriska tröskeln, men ökar den tid det tar att hitta den nya elektriska tröskeln initialt och efter störning. Att beräkna den elektriska tröskeln över ett större antal tidigare stimuli ger bättre tillförlitlighet men ökar den tid som krävs för att nå en exakt uppskattning.
APTrack utformades för användning i perifera nervinspelningar, speciellt för att spåra de elektriska trösklarna för C-fibrer under experimentella och patologiska störningar under perioder där åtgärdspotentialens latens kan variera beroende på den underliggande neuronala aktiviteten. Denna metod kommer att möjliggöra undersökning av inte bara axonal excitabilitet utan även av nociceptorgeneratorpotentialer hos friska frivilliga och patienter. Vi förväntar oss att andra områden inom elektrofysiologi kan anta och anpassa detta verktyg för användning i alla experiment som kräver elektrisk tröskelspårning av en stimulanslåst aktivitet. Till exempel kan detta lika gärna anpassas för optogenetisk stimulering med ljuspulser drivna från APTrack. Insticksprogrammet är öppen källkod och tillgängligt för forskare under en GPLv3-licens. Den är byggd på Open Ephys-plattformen, som är ett anpassningsbart, billigt datainsamlingssystem med öppen källkod. Insticksprogrammet ger ytterligare krokar för nedströms plugins för att extrahera åtgärdspotentialinformationen och tillhandahålla ytterligare användargränssnitt eller adaptativa paradigmer. Insticksprogrammet ger ett enkelt användargränssnitt för visualisering och latensspårning av åtgärdspotentialer i realtid. Det kan också spela upp tidigare data och visualisera dem med hjälp av det tidsmässiga rasterdiagrammet. Dessutom kan den också utföra latensspårning under uppspelning av tidigare data. Även om det finns andra programvarupaket tillgängliga för latensspårning i realtid, är de inte öppen källkod och kan inte utföra elektrisk tröskelspårning26,27. APTrack har en fördel jämfört med traditionella metoder för att identifiera åtgärdspotentialer med konstant latens från spänningsspår eftersom den använder ett tidsmässigt rasterdiagram för datavisualiseringen. Dessutom har våra erfarenheter av att använda den i experiment med låga signal-brusförhållanden indikerat att visualiseringsmetoden för temporala rasterdiagram möjliggör identifiering av åtgärdspotentialer med konstant latens som annars kan ha missats.
Tröskelspårning för hela nerven är en allmänt använd metod för att bedöma axonal excitabilitet13. Single-neuron elektrisk tröskelspårning i gnagare C-fibrer har tidigare använts för att kvantifiera nociceptor excitabilitet14, och dess användbarhet hos människor känns igen10,11; Men hittills var detta inte möjligt. Vi tillhandahåller ett nytt verktyg med öppen källkod för att direkt mäta excitabilitet för enstaka nociceptor i elektrofysiologiska studier på både gnagare och humana perifera nerver. APTrack möjliggör realtids, öppen källkod, elektrisk tröskelspårning av enstaka neuronåtgärdspotentialer hos människor, för första gången. Vi förväntar oss att det kommer att underlätta translationella studier av nociceptorer mellan gnagare och människor.
Disclosures
G.W.T.N. är doktorand vid BBSRC Collaborative Training Partnership med University of Bristol och Eli Lilly and Company (BB/T508342/1). A.P.N. är för närvarande anställd hos Eli Lilly and Company och kan äga aktier i detta företag.
Acknowledgments
Vi vill tacka våra finansiärer för deras stöd: Academy of Medical Sciences (J.P.D., A.E.P.), Versus Arthritis (J.P.D., A.E.P.), Jean Golding Institute Seedcorn Grant (J.P.D., A.E.P., G.W., A.C.S., M.M.P.) och Biotechnology and Biological Sciences Research Council samarbetspartnerskap doktorandskap med Eli Lilly (G.W.T.N.). Vi vill tacka alla bidragsgivare till utvecklingen av APTrack. Vi vill också tacka våra volontärer som deltog i mikroneugrafiexperimenten och våra medarbetare i patient- och allmänhetens engagemang och engagemang för deras ovärderliga bidrag.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12V DC Power Supply | NA | NA | To power uStepper S-lite. Required for dial-controlled stimulators. |
| 36 Pin Electrode Adapter Board | Intan Technology | C3410 | APTrack Dependency. For connecting electrode input to headstage. $255 USD as of March 2021. |
| APTrack Plugin | NA | NA | https://github.com/Microneurography/APTrack |
| Bipolar Ag/AgCl Recording Electrode | Custom | NA | Recording electrode for the skin-nerve preparation. Or equivalent. |
| Bipolar Concentric Stimulating Electrode | World Precision Instruments | SNE-100 | For electrical stimulation in the mouse skin-nerve preparation. Or equivalent. |
| Bipolar Transcutaneous Stimulating Electrode | Custom | NA | For transcutaneous electrical stimulation while searching for single-neuron action potentials during microneurography. |
| BNC T Splitter (1+) | NA | NA | APTrack Dependency. Any standard BNC T splitter. |
| BNC to BNC cables (3+) | NA | NA | APTrack Dependency. Any standard BNC cables. |
| C6H11NaO7 | Merck | S2054 | Skin-nerve preparation synthetic interstitial fluid constituent. Or equivalent. |
| CaCl2 | Merck | C5670 | Skin-nerve preparation synthetic interstitial fluid constituent. Or equivalent. |
| Digitimer DS4 Constant Current Stimulator | Digitimer | DS4 | Constant current stiulator for animal research. £1,695 GBP as of September 2022. |
| Digitimer DS7 Constant Current Stimulator | Digitimer | DS7A | Constant current stiulator for human research. £3,400 GBP as of September 2022. |
| Electroaccupuncture Classic Plus Stimulating Electrodes | Harmony Medical | NA | For fixed position intradermal electrical stimulation of the dorsal aspect of the foot during human microneurography. |
| Glucose | Fisher Scientific | G/0450/60 | Skin-nerve preparation synthetic interstitial fluid constituent. Or equivalent. |
| HDMI Cable | NA | NA | APTrack Dependency. Any standard passive HMDI cable. To connect OE I/O Board to OE Acquisition Board. |
| KCl | Merck | P9541 | Skin-nerve preparation synthetic interstitial fluid constituent. Or equivalent. |
| MgSO4 | Acros Organics | 213115000 | Skin-nerve preparation synthetic interstitial fluid constituent. Or equivalent. |
| Mineral Oil | Merck | 330779 | Electrical insulation for nerve recordings in th skin-nerve preparation. Or equivalent. |
| NaCl | Merck | S9888 | Skin-nerve preparation synthetic interstitial fluid constituent. Or equivalent. |
| NaHCO3 | Merck | S6014 | Skin-nerve preparation synthetic interstitial fluid constituent. Or equivalent. |
| NaHCO3 | Merck | S0751 | Skin-nerve preparation synthetic interstitial fluid constituent. Or equivalent. |
| Open Ephys Acquisition Board | Open Ephys | NA | APTrack Dependency. Includes USB cable to connect to computer and mains socket power supply. €2,955 EUR as of September 2022. |
| Open Ephys Graphical User Interface | Open Ephys | NA | https://github.com/open-ephys/plugin-GUI |
| Open Ephys I/O Board | Open Ephys | NA | APTrack Dependency. For ADC voltage inputs via BNC cables. €12.5 EUR without connectors, €85 EUR with connectors as of September 2022. |
| PulsePal V2 | Sanworks | 1102 | APTrack Dependency. Open-source DAC and train generator. $725 USD pre-assembled as of September 2022. Approx. $275 USD for self-assembly. |
| RHD 6ft SPI Cable | Intan Technology | C3206 | APTrack Dependency. For connecting headstage to OE Acquisition Board. $295 USD as of March 2021 |
| RHD2216 16ch Bipolar Headstage | Intan Technology | C3313 | APTrack Dependency. For data acquisition and digitization. $725 USD as of March 2021. Or equivalent RHD2000 series headstage. |
| Sucrose | Fisher Scientific | S/8560/60 | Skin-nerve preparation synthetic interstitial fluid constituent. Or equivalent. |
| TCS-II Thermal Stimulator | QST.Lab | NA | For thermal stimualtion of nociceptor receptive fields during human microneurography. |
| Tungsten Microelectrode Pair (Active + Reference) | FHC | 30085 | For microneurography recordings. 35mm. |
| Ultrasound Scanner iQ+ | Butterfly Network | NA | For ultrasound-guided electrode insertion during microneurography. |
| USB 3.0 5kV RMS Isolation | Inota Technology | 7055-D | For isolating human microneuroography participant from computer. €459 EUR as of September 2022. |
| USB-A to micro USB-B cable (2) | NA | NA | APTrack Dependency. To connect computer to PulsePal and to uStepper S-lite if using stepper-stimulator interfacing. |
| uStepper S-lite + NEMA17 motor | uStepper | NA | To interface with stimulators via a control dial. €50 EUR as of September 2022. |
| Von Frey Filaments | Ugo Basile | 37450-275 | For mechanical stimulation of receptive fields during sensory phenotyping of nociceptors. |
References
- Dubin, A. E., Patapoutian, A.
- Serra, J., et al. Microneurographic identification of spontaneous activity in C-nociceptors in neuropathic pain states in humans and rats. Pain. 153 (1), 42-55 (2012).
- Serra, J., et al.
- Namer, B., et al. Specific changes in conduction velocity recovery cycles of single nociceptors in a patient with erythromelalgia with the I848T gain-of-function mutation of Nav1.7. Pain. 156 (9), 1637-1646 (2015).
- Kleggetveit, I. P., et al. High spontaneous activity of C-nociceptors in painful polyneuropathy. Pain. 153 (10), 2040-2047 (2012).
- Orstavik, K., et al. Abnormal function of C-fibers in patients with diabetic neuropathy. Journal of Neuroscience. 26 (44), 11287-11294 (2006).
- Orstavik, K., et al. Pathological C-fibres in patients with a chronic painful condition. Brain. 126, 567-578 (2003).
- Raja, S. N., Ringkamp, M., Guan, Y., Campbell, J. N., John, J. Bonica Award Lecture: Peripheral neuronal hyperexcitability: The "low-hanging" target for safe therapeutic strategies in neuropathic pain. Pain. 161, S14-S26 (2020).
- Middleton, S. J., et al. Studying human nociceptors: From fundamentals to clinic. Brain. 144 (5), 1312-1335 (2021).
- Marshall, A., Alam, U., Themistocleous, A., Calcutt, N., Marshall, A. Novel and emerging electrophysiological biomarkers of diabetic neuropathy and painful diabetic neuropathy. Clinical Therapeutics. 43 (9), 1441-1456 (2021).
- Themistocleous, A. C., et al. Axonal excitability does not differ between painful and painless diabetic or chemotherapy-induced distal symmetrical polyneuropathy in a multicenter observational study. Annals of Neurology. 91 (4), 506-520 (2022).
- Bostock, H., Cikurel, K., Burke, D. Threshold tracking techniques in the study of human peripheral nerve. Muscle Nerve. 21 (2), 137-158 (1998).
- Kiernan, M. C., et al. Measurement of axonal excitability: Consensus guidelines. Clinical Neurophysiology. 131 (1), 308-323 (2020).
- Sauer, S. K., et al. Can receptor potentials be detected with threshold tracking in rat cutaneous nociceptive terminals. Journal of Neurophysiology. 94 (1), 219-225 (2005).
- Vallbo, A. B. Microneurography: How it started and how it works. Journal of Neurophysiology. 120 (3), 1415-1427 (2018).
- Torebjork, H., Hallin, R. A new method for classification of C-unit activity in intact human skin nerves. Advances in Pain Research and Therapy. 1, 29-34 (1976).
- Brown, G. L., Holmes, O. The effects of activity on mammalian nerve fibres of low conduction velocity. Proceedings of the Royal Society of London. Series B: Biological Sciences. 144 (918), 1-14 (1956).
- Obreja, O., et al. Patterns of activity-dependent conduction velocity changes differentiate classes of unmyelinated mechano-insensitive afferents including cold nociceptors, in pig and in human. Pain. 148 (1), 59-69 (2010).
- Serra, J., Campero, M., Ochoa, J., Bostock, H. Activity-dependent slowing of conduction differentiates functional subtypes of C fibres innervating human skin. Journal of Physiology. 515, 799-811 (1999).
- Weidner, C., Schmidt, R., Schmelz, M., Torebjork, H. E., Handwerker, H. O. Action potential conduction in the terminal arborisation of nociceptive C-fibre afferents. Journal of Physiology. 547, 931-940 (2003).
- Siegle, J. H., et al. Open Ephys: An open-source, plugin-based platform for multichannel electrophysiology. Journal of Neural Engineering. 14 (4), 045003 (2017).
- Sanders, J. I., Kepecs, A. A low-cost programmable pulse generator for physiology and behavior. Frontiers in Neuroengineering. 7, 43 (2014).
- Zimmermann, K., et al. Phenotyping sensory nerve endings in vitro in the mouse. Nature Protocols. 4 (2), 174-196 (2009).
- Dunham, J. P., Sales, A. C., Pickering, A. E. Ultrasound-guided, open-source microneurography: Approaches to improve recordings from peripheral nerves in man. Clinical Neurophysiology. 129 (11), 2475-2481 (2018).
- Levitt, H.
- Turnquist, B., RichardWebster, B., Namer, B. Automated detection of latency tracks in microneurography recordings using track correlation. Journal of Neuroscience Methods. 262, 133-141 (2016).
- Kiernan, M. C., Burke, D., Andersen, K. V., Bostock, H. Multiple measures of axonal excitability: A new approach in clinical testing. Muscle Nerve. 23 (3), 399-409 (2000).
