Summary
تصف هذه الورقة طريقتين للتنميط الظاهري دون استخدام تقشير البشرة لتوصيف الجينات التي تتحكم في نمو الثغور. توضح الطريقة الأولى كيفية تحليل النمط الظاهري للثغور باستخدام بشرة نباتية زرقاء اللون بالتولويدين على شكل حرف O. تصف الطريقة الثانية كيفية التعرف على روابط الثغور ومراقبة أنشطتها البيولوجية.
Abstract
الثغور هي مسام صغيرة على سطح النباتات البرية تشارك في تبادل الغازات وإطلاق بخار الماء، ووظيفتها ضرورية لإنتاجية النبات وبقائه. وعلى هذا النحو، فإن فهم الآليات التي تتطور بها الثغور ونمطها له قيمة زراعية هائلة. يصف هذا البحث طريقتين للنمط الظاهري باستخدام ربتات Arabidopsis التي يمكن استخدامها لتوصيف الجينات التي تتحكم في تطور الثغور ونمطها. يتم تقديم الإجراءات أولا لتحليل الأنماط الظاهرية للثغور باستخدام النبتات الزرقاء الملطخة بالتولويدين O. هذه الطريقة سريعة وموثوقة ولا تتطلب استخدام تقشير البشرة ، والذي يستخدم على نطاق واسع لتحليلات النمط الظاهري ولكنه يتطلب تدريبا متخصصا. نظرا لوجود العديد من بقايا السيستين ، فإن تحديد وتوليد ببتيدات EPF النشطة بيولوجيا التي لها دور في نمو الثغور كان يمثل تحديا. وبالتالي ، فإن العرض الثاني هو إجراء يستخدم لتحديد روابط الثغور ومراقبة نشاطها البيولوجي عن طريق المقايسات الحيوية. الميزة الرئيسية لهذه الطريقة هي أنها تنتج بيانات قابلة للتكرار بسهولة نسبية مع تقليل كمية محلول الببتيد والوقت اللازم لتوصيف دور الببتيدات في التحكم في أنماط الثغور وتطورها. بشكل عام ، تعزز هذه البروتوكولات المصممة جيدا كفاءة دراسة منظمات الثغور المحتملة ، بما في ذلك الببتيدات الإفرازية الغنية بالسيستين ، والتي تتطلب هياكل معقدة للغاية لنشاطها.
Introduction
يعد التنميط والتمايز المناسبين للثغور النباتية أمرا بالغ الأهمية لوظيفتها في عمليتين بيولوجيتين أساسيتين ، التمثيل الضوئي والنتح ، ويتم فرضهما بواسطة مسارات إشارات الببتيد EPF. في أرابيدوبسيس، تتحكم ثلاثة ببتيدات غنية بالسيستين مفرزة، EPF1 و EPF2 و STOMAGEN/EPFL9، في جوانب مختلفة من تطور الثغور ويتم إدراكها بواسطة مكونات مستقبلات سطح الخلية، بما في ذلك كينازات مستقبلات عائلة ERECTA (ER و ERL1 و ERL2) و SERKsو TMM 1،2،3،4،5،6،7،8،9،10 . يؤدي هذا الاعتراف بعد ذلك إلى تقليل تنظيم عوامل النسخ التي تعزز تمايز الثغور من خلال عملية تعتمد على MAPK11. يتم اكتشاف جينات الثغور الأساسية هذه في المقام الأول من خلال الفحص الظاهري للمتحولات التي تظهر عيوب البشرة. تقدم هذه الورقة طرق التنميط الظاهري البسيطة والفعالة نسبيا لتصور الثغور وخلايا البشرة الأخرى ، وهي مطلوبة لتحديد وتوصيف الجينات المحتملة التي تتحكم في أنماط الثغور والتمايز.
عادة ما يتم تحقيق ملاحظة تفاصيل البشرة النباتية باستخدام تقشير البشرة مع أو بدون تلطيخ بصبغة مثل التولويدين الأزرق O (TBO) أو السافرانين12،13،14. ومع ذلك ، فإن التحدي الرئيسي لهذه الطرق هو أنها تتطلب تدريبا متخصصا لتقشير بشرة الأوراق دون تمزيق الأنسجة ومراقبة وتحليل بيانات الزخرفة بعناية مع تجنب الصور الملتقطة من أجزاء مختلفة من الورقة. كما تم استخدام المعالجات الكيميائية لإزالة عينات الأنسجة باستخدام الكواشف مثل محاليل المقاصة القائمة على هيدرات الكلورال على نطاق واسع لمجموعة مختلفة من المواد البيولوجية 8,15 ؛ تولد هذه العلاجات قدرا كبيرا من معلومات النمط الظاهري من خلال توفير صور عالية الجودة ولكنها تتطلب أيضا استخدام مواد كيميائية خطرة (مثل الفورمالديهايد وهيدرات الكلورال). تقدم هذه الورقة أولا طريقة سهلة ومريحة نسبيا للتنميط الظاهري تنتج صورا كافية للتحليل الكمي ولكنها لا تتطلب استخدام مواد كيميائية خطرة وقشور أوراق البشرة لإعداد العينة. تعتبر البشرة الملطخة ب TBO مثالية أيضا لدراسة تطور الثغور لأن نقص trichomes والتدرج التنموي الأصغر في الفلقات يسمح بالتفسير البسيط والقابل للتتبع للأنماط الظاهرية للبشرة.
تنتمي ببتيدات EPF الثغورية إلى مجموعة الببتيدات الغنية بالسيستين الخاصة بالنباتات والتي لها أحجام ناضجة كبيرة نسبيا وروابط ثاني كبريتيد داخل الجزيئات بين بقايا السيستين المحفوظة. يعد الطي المطابق الصحيح أمرا بالغ الأهمية لوظيفتها البيولوجية ، لكن الببتيدات الغنية بالسيستين ، والتي يتم إنتاجها إما عن طريق التخليق الكيميائي أو نظام إعادة التركيب غير المتجانس ، يمكن أن تكون غير نشطة وهي خليط من كل من الببتيدات المطوية وغير المطوية بشكل صحيح3،7،16. وبالتالي ، فإن فحص الببتيدات النشطة بيولوجيا التي لها دور في التحكم في نمو الثغور كان مهمة صعبة للغاية. تصف هذه المخطوطة بالإضافة إلى ذلك مقايسة حيوية لتحديد وتوصيف الببتيدات الثغورية النشطة بيولوجيا بشكل أفضل. في هذه الطريقة ، تزرع شتلات Arabidopsis في صفيحة متعددة الآبار تحتوي على وسائط مع وبدون ببتيدات محتملة لمدة 6-7 أيام. بعد ذلك ، يتم تصور بشرة النبتة باستخدام مجهر متحد البؤر. بشكل عام ، لتصور النشاط البيولوجي للببتيدات المحتملة بوضوح في تطور الثغور ، يتم استخدام الأنماط الجينية التي تنتج المزيد و / أو أقل من خلايا سلالة الثغور ، مثل متحولة epf2 ، التي تنتج المزيد من خلايا البشرة ، وخط STOMAGEN-ami ، الذي يمنح كثافة خلايا البشرة المنخفضة2،4،5 ، بالإضافة إلى مكافحة Arabidopsis من النوع البري (Col-0) للمقايسات الحيوية.
بشكل عام ، يمكن استخدام البروتوكولين المعروضين هنا للتقييم السريع والفعال للأنماط الظاهرية المختلفة للبشرة ولفحص الببتيدات الصغيرة والهرمونات التي لها دور في التحكم في أنماط الثغور وتطورها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. تلطيخ النبتات العربية مع TBO
- تعقيم البذور وظروف النمو
- تعقيم ~ 30 بذور أرابيدوبسيس لكل نمط وراثي في أنبوب طرد مركزي دقيق عن طريق إضافة 1 مل من محلول تعقيم البذور (33٪ مبيض تجاري ، 0.1٪ Triton X-100) ، وصخرة بلطف لمدة 10-12 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT).
ملاحظة: تعقيم ~ 30 بذرة من انضمام أرابيدوبسيس من النوع البري كولومبيا (Col-0) و / أو ~ 60 بذرة من النباتات المعدلة وراثيا التي تحمل جينا محفزا كيميائيا (على سبيل المثال ، Est::EPF27) لاستخدام الشتلات المعدلة وراثيا المزروعة على 1/2 ألواح موراشيج وسكوج (MS) (2.16 جم / لتر تحتوي على 0.8٪ أجار [w / v]) بدون محفز (على سبيل المثال ، β-استراديول) كعناصر تحكم (الشكل 1 والشكل 2). - قم بإزالة محلول التعقيم ، واغسل البذور أربع مرات ب 1 مل من الماء المعقم في غطاء تدفق رقائقي ، وأعد تعليقها في ~ 200 ميكرولتر من أجار معقم 0.1٪.
- زرع ~ 30 بذرة لكل نمط وراثي على ألواح أجار 1/2 مللي ثانية أو ألواح أجار 1/2 مللي ثانية تحتوي على محفز (على سبيل المثال ، 10 ميكرومتر β-استراديول) للتحريض الكيميائي لجين التحوير (على سبيل المثال ، Est::EPF27) باستخدام ماصة ، وختمها بشريط micropore.
ملاحظة: يجب توزيع البذور بالتساوي على الطبق لتجنب وضعها على مقربة ، لأن هذا سيمنع الشتلات من النمو بشكل موحد. - قم بتقسيم البذور إلى طبقات عن طريق وضع الألواح عند 4 درجات مئوية بدون إضاءة لمدة 3-5 أيام لمزامنة الإنبات.
- بعد التقسيم الطبقي ، احتضان الألواح في غرفة النمو عند 22 درجة مئوية تحت 120 μmol · m − 2 · s − 1 ضوء مع فترة ضوئية تبلغ 16 ساعة من الضوء و 8 ساعات من الظلام لمدة 10 أيام.
- تعقيم ~ 30 بذور أرابيدوبسيس لكل نمط وراثي في أنبوب طرد مركزي دقيق عن طريق إضافة 1 مل من محلول تعقيم البذور (33٪ مبيض تجاري ، 0.1٪ Triton X-100) ، وصخرة بلطف لمدة 10-12 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT).
- أخذ العينات وتلطيخ TBO من النبتات العربية
- في 10 أيام بعد الإنبات ، حدد بعناية وقطع واحدة من النبتات من الشتلات الفردية التي تنمو بشكل موحد مع الشتلات الأخرى على اللوحة للحد من التباين.
ملاحظة: يتم أخذ عينات من النبتات من شتلات عمرها 10 أيام لأنها لا تحتوي على ترايكهوم وخلايا البشرة غير الناضجة ، مما يبسط تفسير الأنماط الظاهرية للبشرة. - ضع كل فلقة في أنبوب طرد مركزي دقيق يحتوي على 1 مل من محلول التثبيت (9: 1 إيثانول إلى حمض الخليك) باستخدام ملقط ، واترك العينة في محلول التثبيت طوال الليل ، على الأقل ، وفي درجة حرارة الغرفة.
ملاحظة: يمكن بعد ذلك تخزين العينات لمدة تصل إلى عامين في هذه الحالة. تم أخذ الصورة الشكل 2E من عينة فلقة تم تخزينها في محلول التثبيت لأكثر من 3 سنوات. من المهم الاحتفاظ بالنبتة في محلول تثبيت فور القطع وعدم وضع أكثر من خمسة فلقات في كل أنبوب طرد مركزي دقيق لإعداد عينة متجانسة لاحقا. - قم بإزالة محلول التثبيت ، وأضف 1 مل من الإيثانول بنسبة 70٪. بعد قلب الأنبوب عدة مرات ، اترك الأنبوب الذي يحتوي على العينات في RT لمدة ~ 30 دقيقة.
- كرر الخطوة 1.2.3 باستخدام 1 مل من الإيثانول بنسبة 50٪ ثم 20٪ من الإيثانول.
- استبدل 1 مل من الإيثانول بنسبة 20٪ ب 1 مل من الماء المقطر ، ثم اترك الأنبوب الذي يحتوي على عينات النبتة لمدة ~ 30 دقيقة بعد قلب الأنبوب عدة مرات.
ملاحظة: قد تبقى العينات في الماء المقطر لأكثر من 24 ساعة ، ولكن لا ينصح بذلك للحصول على صور عالية الجودة (صور ملطخة جيدا لأنواع مختلفة من خلايا البشرة) للتحليل الكمي. - قم بإزالة كل الماء المقطر من الأنبوب. ثم ، أضف على الفور ~ 200 ميكرولتر من محلول تلطيخ TBO (0.5٪ TBO في H 2 O ، تمت تصفيته) لمدة ~2دقيقة.
ملاحظة: تأكد من تعرض كل عينة من النبتات بالتساوي لمحلول TBO عن طريق تحريك الأنابيب برفق أثناء الحضانة. لمنع الإفراط في تلطيخ TBO (توقيت التلوين ضروري ويمكن أن يكون متغيرا لكل نمط وراثي) ، لا تقم بمعالجة أكثر من ستة أنابيب تحتوي على عينات في وقت واحد. - قم بإزالة محلول تلطيخ TBO جيدا قدر الإمكان ، ثم اغسل العينات على الفور عدة مرات بإضافة 1 مل من الماء المقطر الطازج.
- في 10 أيام بعد الإنبات ، حدد بعناية وقطع واحدة من النبتات من الشتلات الفردية التي تنمو بشكل موحد مع الشتلات الأخرى على اللوحة للحد من التباين.
- التصوير وتحليل البيانات
- خذ شريحة مجهر ، وأضف قطرة من 15٪ جلسرين (~ 50 ميكرولتر). ضع الفلقة مع الجانب المحوري لأعلى في 15٪ جلسرين على الشريحة باستخدام ملقط دقيق. بعد ذلك ، قم بتغطيته برفق بغطاء بحيث يمكن إزالة أي فقاعات هواء متكونة من العينة.
- تخيل الجانب المحوري من بشرة النبتة باستخدام مجهر برايت فيلد (الشكل 1 والشكل 2) ، ثم افحص النمط الظاهري للبشرة عن طريق حساب عدد الثغور وأنواع خلايا البشرة الأخرى.
- لكل نمط جيني ، احسب النمط الظاهري للبشرة باستخدام الصيغ التالية التي وصفها Jangra et al.17:
مؤشر الثغور (٪) = (عدد الثغور / إجمالي عدد خلايا البشرة) × 100
كثافة الثغور (مم −2) = عدد الثغور / المساحة (مم2)
ملاحظة: قم بتصوير ما لا يقل عن ثمانية فلقات (N = 8) لكل نمط وراثي ، وقم بتوثيق النمط الظاهري للبشرة لكل نمط وراثي من خلال مقارنته بالنمط الظاهري للنبات البري و / أو النباتات المحورة وراثيا التي تعبر عن جين محور مستحث كيميائيا يزرع بدون محفز.
2. المقايسات الحيوية لببتيدات الثغور
ملاحظة: يظهر الإجراء الخاص بالمقايسات الحيوية في الشكل 3.
- تعقيم البذور وظروف النمو
- تعقيم ~ 25 بذرة لكل علاج على النحو الوارد أعلاه ، وزرع ما يقرب من نصف البذور على كل من لوحين أجار 1/2 مللي ثانية في غطاء التدفق الصفحي.
ملاحظة: استخدم النمط الجيني مع خلايا البشرة العالية و / أو المنخفضة (على سبيل المثال ، epf22) بدلا من استخدام خلفية من النوع البري (على سبيل المثال ، Col-0) للكشف بسهولة عن الأنشطة البيولوجية للببتيدات على نمط خلايا البشرة والتمايز (الشكل 4). - طبقي البذور لمدة 3 أيام عند 4 درجات مئوية في الظلام.
- أخرج كل من اللوحين على فترات ~ 10 ساعات ، واحتضن البذور على أطباق عند 22 درجة مئوية تحت 120 ميكرومول · م − 2 · ثانية − 1 ضوء مع فترة ضوئية من 16 ساعة من الضوء و 8 ساعات من الظلام لمدة يوم واحد.
- تعقيم ~ 25 بذرة لكل علاج على النحو الوارد أعلاه ، وزرع ما يقرب من نصف البذور على كل من لوحين أجار 1/2 مللي ثانية في غطاء التدفق الصفحي.
- علاج الببتيد والتصوير
- في غطاء التدفق الصفحي ، قم بزرع 10-12 شتلة أرابيدوبسيس عمرها يوم واحد بعناية من كل من اللوحين المحضرين في صفيحة من 24 بئرا تحتوي على 1.5 مل من 1/2 مللي ثانية وسط سائل في كل بئر (~ 20 شتلة لكل بئر).
ملاحظة: يعد توقيت معالجة الببتيد للشتلات أمرا بالغ الأهمية لنتائج النمط الظاهري لمعالجة الببتيد ، لذا قم بإعداد البذور على لوحين منفصلين للحصول على مرحلتين مختلفتين من نمو الشتلات للعلاج. - أضف إما المخزن المؤقت وحده (50 mM Tris-HCl [pH 8.0]) أو تركيزين مختلفين من الببتيد (عادة ، 1 ميكرومتر و 2.5 ميكرومتر ببتيد في 50 mM Tris-HCl [pH 8.0]) إلى كل بئر يحتوي على ~ 20 شتلة أرابيدوبسيس عمرها يوم واحد تنبت على ألواح أجار 1/2 مللي ثانية.
ملاحظة: قم بإزالة حصص محلول الببتيد من الفريزر ، واحتفظ بها في RT لبضع دقائق قبل العلاج. الببتيدات المخزنة في الفريزر عند -80 درجة مئوية مستقرة لبضع سنوات ، ولكن يجب تجنب دورات التجميد والذوبان عن طريق تخزين محلول الببتيد في قسامات صغيرة. - بعد خلط الشتلات برفق مع مخزن مؤقت بمفرده أو محلول ببتيد باستخدام ماصة ، أغلق اللوحة بشريط micropore. احتضان لوحة الفحص تحت ظروف اليوم الطويل (فترة ضوئية 16 ساعة ، 120 ميكرومول · م − 2 · ثانية − 1 ضوء) لمدة 5-7 أيام عند 22 درجة مئوية.
ملاحظة: امنع الشتلات من النمو بالقرب من بعضها البعض للسماح لكل شتلة بالتعرض لمحلول الببتيد. قم بتدوير اللوحة برفق لمدة 2-3 ساعات قبل احتضان اللوحة في غرفة النمو لزيادة التهوية. - نقل كل شتلة من البئر التي تحتوي إما على العازلة وحدها أو الببتيد على شريحة غطاء ، وتشريح النبتة من الشتلات. ضع الجانب المحوري من النبتة باستخدام ملقط ، وقطعه إلى قطع صغيرة.
- خذ شريحة مجهر نظيفة أخرى ، وضع عليها قطرة من محلول يوديد البروبيديوم (~ 25 ميكرولتر ، 2 مجم / مل في H2O).
- ضع إحدى قطع النبتة الصغيرة في قطرة من محلول يوديد البروبيديوم باستخدام ملقط ، وضع غطاء الغطاء برفق. ضع محلول يوديد البروبيديوم الإضافي على حافة غطاء الغطاء لإزالة أي فقاعات هواء تشكلت.
- قم بتصوير الجانب المحوري من النبتة باستخدام مجهر متحد البؤر ، وقارن الصور بالصور من الشتلات المزروعة في وسط 1/2 مللي ثانية يحتوي على مخزن مؤقت فقط.
ملاحظة: تم التقاط الصور المعروضة في الشكل 4 من شتلات Col-0 أو epf2 2,5 من النوع البري التي تمت معالجتها بالمخزن المؤقت فقط (الشكل 4A ، B) أو دفعتين من محلول الببتيد EPF2 (الشكل 4C-F) وتم تخزينها في -80 درجة مئوية على مدار عام واحد.
- في غطاء التدفق الصفحي ، قم بزرع 10-12 شتلة أرابيدوبسيس عمرها يوم واحد بعناية من كل من اللوحين المحضرين في صفيحة من 24 بئرا تحتوي على 1.5 مل من 1/2 مللي ثانية وسط سائل في كل بئر (~ 20 شتلة لكل بئر).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
العديد من النباتات المحورة وراثيا في الثغور والطفرات المعروفة بكثافة الثغور والتجمعات أقل أو أكثر (epf2 2,5 ، epf1 epf2 2,5 ، tmm12 ، خط صامت من STOMAGEN 4 ، وخطوط معدلة وراثيا تحمل est::EPF1 أو Est::EPF2 بناءالتعبير الزائد 7 ) لإثبات فعالية تحليلي النمط الظاهري المقدمين هنا، اللذين يهدفان إلى تحديد وتوصيف الجينات التي لها دور في تطور الثغور ونمطها. من أجل إنتاج صور عالية الجودة للبشرة دون الحاجة إلى تقشير البشرة لتحديد الأنواع المختلفة من خلايا البشرة للتحليل ، من الأهمية بمكان ضبط وقت تلطيخ العينة مسبقا باستخدام TBO لكل نمط وراثي ، حيث قد يكون لكل منها أنماط ظاهرية مختلفة للبشرة مقارنة بتلك الموجودة في النوع البري (Col-0) (الشكل 1A والشكل 2A). بناء على الخبرة ، تتطلب الأنماط الجينية ذات الثغور الأقل أوقات تلطيخ أطول مع TBO (الشكل 1B والشكل 2D ، E) ، بينما تتطلب الأنماط الجينية التي تحتوي على المزيد من الثغور والتجمعات أوقات تلطيخ أقصر (الشكل 1C والشكل 2B ، C). نظرا لأن الكميات المتفاوتة من الببتيدات المطوية بشكل صحيح في محلول الببتيد الكلي يمكن أن تخفي النشاط البيولوجي للببتيدات في تطور الثغور ، فمن الممارسات الجيدة استخدام تركيزات إجمالية إضافية أعلى من محلول الببتيد (على سبيل المثال ، 2.5 ميكرومتر EPF2) ، وكذلك الأنماط الجينية التي تحتوي على أنماط ظاهرية أقل أو أكثر من الثغور (على سبيل المثال ، epf2) ، للمقايسات الحيوية. تم اكتشاف نشاط ببتيدات EPF2 ، التي لها دور في تثبيط بدء الثغور ، بسهولة باستخدام طفرات epf2 مع خلايا البشرة أكثر من Col-0 ، حتى لو كانت دفعات معينة من ببتيدات EPF2 المحضرة تحتوي على كميات أقل من الأشكال النشطة بيولوجيا للببتيد (على سبيل المثال ، دفعة محلول الببتيد EPF2 1 في الشكل 4).
الشكل 1: تأثير وقت الحضانة مع TBO على الأنماط الجينية التي تظهر أنماطا ظاهرية مختلفة للبشرة. صور النبتة المحورية من شتلات عمرها 10 أيام لثلاثة أنماط وراثية من Arabidopsis: (A) النوع البري (Col-0) ، (B) خط STOMAGEN صامت (STOMAGEN-ami) ، و (C) طفرات epf1 epf2. يمثل Col-0 السيطرة على Arabidopsis من النوع البري ، ويمثل الخط الصامت STOMAGEN وطفرات epf1 epf2 الأنماط الجينية ذات الأعداد المنخفضة والعالية من الثغور ، على التوالي. تم التقاط الصور باستخدام مجهر مقلوب بعدسة موضوعية 20x (مجال رؤية 0.35 مم2). كانت جودة الصور متغيرة ، على الرغم من أن جميع عينات النبتة من الأنماط الجينية المختلفة كانت ملطخة ب TBO (0.5٪ TBO في H2O) لنفس الفترة الزمنية (دقيقتان) قبل التصوير. لذلك ، للحصول على صور ملطخة جيدا للتحليل ، من المهم التحديد المسبق لوقت تلطيخ TBO المناسب لكل نمط وراثي. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2: صور البشرة الملطخة ب TBO دون استخدام تقشير البشرة للتحليل الكمي. يمكن استخدام صور تمثيلية للنباتات من شتلات عمرها 10 أيام من (A) من النوع البري (Col-0) و (B) tmm و (C ، D) خطوط معدلة وراثيا تحمل EPF2 مستحثا بالإستراديول (Est::EPF2) أو (E) EPF1 بناء التعبير الزائد (Est::EPF1) للتحليل الكمي للنمط الظاهري للبشرة. تم استخدام فلقة في محلول تثبيت لأكثر من 3 سنوات لالتقاط الصورة المعروضة في (E). تم التقاط الصور باستخدام مجهر مقلوب بعدسة موضوعية 20x (مجال رؤية 0.35 مم2). تم تحديد الخلايا بواسطة تلطيخ TBO ، ويتم تقديم نصف عرض الصور بالحجم الكامل للعرض. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 3: إجراء المقايسات الحيوية . (أ) تزرع البذور على لوحين من الآجار 1/2 مللي ثانية وتخرج كل 10 ساعات. (ب) يتم زرع شتلات Arabidopsis البالغة من العمر يوما واحدا في 24 صفيحة بئر تحتوي على 1/2 MS وسط إما مع تركيزات وهمية أو تركيزين مختلفين من الببتيد. (ج) بعد 5-7 أيام، تكون الشتلات جاهزة للتصوير لتحديد النشاط الحيوي للببتيدات في نمو الثغور ونقشها. (د) توضع شريحة فلقة في قطرة من محلول يوديد البروبيديوم على شريحة مجهرية للتصوير. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: الفحص المجهري البؤري للبشرة المحورية لفلقات أرابيدوبسيس بعد العلاج بالببتيد. صور تمثيلية متحدة البؤر لبشرة (A) من النوع البري و (B) epf2 نمت لمدة 6-7 أيام في محلول عازل وبشرة (C-F) epf2 نمت مع دفعتين مختلفتين من ببتيدات EPF2. تم التقاط الصور باستخدام مجهر متحد البؤر باستخدام عدسة موضوعية 40x (إثارة 561 نانومتر ومرشح انبعاث طويل 561 نانومتر) لالتقاط تلطيخ يوديد البروبيديوم وتصور الخطوط العريضة للخلية. يحتوي كل محلول ببتيد EPF2 محضر على كميات مختلفة من الأشكال المطوية بشكل صحيح (النشطة بيولوجيا) وغير المطوية (غير النشطة) من الببتيدات. لذلك ، من أجل الفحص الأولي للببتيدات ذات الدور المحتمل في نمو الثغور ، يوصى باستخدام تركيزين مختلفين من محاليل الببتيد الكلية كما هو موضح في المقايسات الحيوية. شريط المقياس = 30 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
طريقتا تحليل النمط الظاهري لتحديد وتوصيف الجينات التي تتحكم في أنماط الثغور والتمايز المعروضة هنا هي مقايسات مريحة وموثوقة لأن البروتوكولات لا تتطلب استخدام تقشير البشرة والمعدات المتخصصة (التي تستغرق وقتا طويلا وتتطلب تدريبا خاصا لإعداد العينة) ولكنها تنتج صورا عالية الجودة للتحليل الكمي للأنماط الظاهرية للبشرة.
يتمثل أحد قيود هذه التقنية لتحليل النمط الظاهري باستخدام نباتات Arabidopsis الملطخة ب TBO في أن الحصول على صور عالية الجودة مع تباين بصري لأنواع مختلفة من خلايا البشرة يعتمد على وقت التلوين والخصائص الفريدة للأنسجة ، والتي قد تكون معتمدة على الأنواع وتعتمد على النمط الجيني (الشكل 1)18 . تواجه طرق التنميط الظاهري الأخرى لمراقبة خلايا البشرة باستخدام تقشير البشرة نفس التحديات ، كما أنها تتطلب مزيدا من الوقت وتدريبا خاصا. يمكن تجنب الصعوبات في الحصول على صور البشرة الملطخة بشكل صحيح الكافية لتحليل البيانات عن طريق تلطيخ الفلقات من الأنماط الجينية مع عدد أقل من الثغور لفترات أطول من الوقت وعينات من الأنماط الجينية مع المزيد من الثغور لفترات زمنية أقصر. يمكن أيضا ضبط وقت التلوين لكل نمط جيني عن طريق فحص عدد قليل فقط من العينات أولا لتحسين وقت التلوين للأنماط الجينية ذات الأنماط الظاهرية المماثلة للبشرة.
كان الحصول على كمية كافية من الببتيدات النشطة بيولوجيا المطوية جيدا ، وخاصة الببتيدات الغنية بالسيستين (وهي روابط لها وظائف متنوعة في التحكم في نمو النبات ، بما في ذلك أنماط الثغور) ، تحديا1،2،3،4،5،6،19،20،21،22،23 . علاوة على ذلك ، حتى لو تم إنشاء الببتيدات النشطة بيولوجيا ، فإن فحص الببتيدات التي لها وظائف محتملة في عمليات بيولوجية محددة يعد مهمة صعبة أخرى لأن الببتيدات النشطة بيولوجيا المنتجة غالبا ما تكون مزيجا من الببتيدات المطوية جيدا والنشطة وغير النشطة. تقدم هذه الورقة طريقة فعالة للفحص الحيوي لاكتشاف وتوصيف الببتيدات الثغورية المحتملة. وقد نجحت هذه الطريقة في تحديد مختلف الببتيدات الهامة التي تتحكم في جوانب مختلفة من تطور الثغور في أرابيدوبسيس، وكذلك العشب Brachypodium3،4،7،17. ومع ذلك ، فإن القيد الرئيسي لهذه التقنية هو التباين في استجابات النمط الظاهري ، والذي يحدث على الأرجح بسبب استخدام الشتلات ذات المراحل التنموية المختلفة قليلا ومحاليل الببتيد التي تحتوي على كميات مختلفة من الببتيدات النشطة بيولوجيا. تضمنت المحاولات المبكرة لهذه الطريقة وضع بذور من النوع البري مباشرة في آبار صفيحة تحتوي على محلول ببتيد بعد التقسيم الطبقي. بدون استخدام الأنماط الجينية التي تحتوي على خلايا بشرة أكثر و / أو أقل (على سبيل المثال ، epf22 ، الشكل 4) وشتلات أرابيدوبسيس عمرها يوم واحد تنبت على ألواح أجار 1/2 مللي ثانية ، فإن عددا أقل من الشتلات قادرة على النمو وإظهار استجابات مظهرية واضحة بعد تطبيق الببتيد. في هذا البروتوكول ، تمت معالجة مشكلة التباين باستخدام ~ 20 شتلة أرابيدوبسيس عمرها يوم واحد مع مرحلتين تنمويتين مختلفتين وباستخدام تركيزين مختلفين من محلول الببتيد (1 ميكرومتر و 2.5 ميكرومتر).
يمكن أيضا تحليل الأنماط الظاهرية للبشرة للعينات المعالجة بالببتيد بواسطة طريقة تحليل النمط الظاهري الأولى المقدمة باستخدام عينات ملطخة ب TBO. تسمح هذه الطريقة بتحليل النمط الظاهري الكمي السهل نسبيا لأنه يمكن تحليل مساحة كبيرة نسبيا من كل عينة. بالإضافة إلى ذلك ، توفر هذه الطريقة مرونة في تحضير العينات بعد حصاد العينات المحضرة في نفس ظروف التصوير. ومع ذلك ، فإن الصور التي تم التقاطها بهذه الطريقة ليست بشكل عام من أعلى مستويات الجودة. من ناحية أخرى ، يعطي التصوير البؤري بعد تلطيخ يوديد البروبيديوم صورا عالية الجودة مع تفاصيل البشرة. ومع ذلك ، فإن هذه الطريقة تسمح فقط بالتركيز على مساحة صغيرة من الأنسجة للتحليل. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تحليل عدد معين فقط من الأنسجة الحية المعدة في وقت واحد.
في الختام ، يمكن استخدام تحليل النمط الظاهري المقدم هنا للفحص السريع والفعال للجينات المحتملة التي تتحكم في نمط الثغور والتمايز ، وبالتالي تحسين فهم آليات تطور الثغور ووظيفة الببتيد. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام بروتوكول المقايسة الحيوية هذا لتحديد الجزيئات الصغيرة الأخرى التي لها دور في نمط أنسجة البشرة وكطريقة فحص أولية لتحديد بنية الببتيدات النشطة بيولوجيا المطوية جيدا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ولم يعلن عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
تم تمويل هذا البحث من خلال برنامج اكتشاف مجلس بحوث الموارد الطبيعية والهندسة في كندا (NSERC) وجامعة كونكورديا. يتم دعم KB من قبل المنحة الوطنية في الخارج من الهند.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18 mm x 18 mm cover slip | VWR | 16004-326 | |
| 24-well sterile plates with lid | VWR | CA62406-183 | |
| 3M Micropore surgical tape | Fisher Scientific | 19-027-761 | Microporous surgical paper tape used to seal MS plates |
| 76 x 26 mm Microscope slide | TLG | GEW90-2575-03 | |
| Acetic acid, ≥99.8% | Fisher Scientific | A38-212 | |
| Agar | BioShop | AGR001.1 | |
| Bleech | Household bleach (e.g., Clorox) | ||
| Confocal microscope | Nikon | Nikon C2 operated by NIS-Elements | |
| Ethanol | Greenfield | P210EAAN | |
| FIJI | Open-srouce | (Fiji Is Just) ImageJ v2.1/1.5.3j | Downloaded from https://imagej.net/software/fiji/ |
| Forceps | Sigma-Aldrich | F6521 | |
| Gamborg's vitamin mixture | Cassson Labs | GBL01-100ML | Store at 4 °C |
| Glycerol | Fisher Scientific | G33-4 | |
| Growth chambers | Conviron, model E15 | 16h light cycle, set at 21°C with a light intensity of 120 µmol·m-2·s-1. | |
| Lights | HD Supply | 25272 | Fluorescent lights in growth chambers, Sylvania F72T12/CW/VHO 72"T12 VHO 4200K |
| Microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 14-222-155 | Tubes in which Arabidopsis thaliana seeds are placed to perform sterilization |
| Microscope | Nikon | Nikon Eclipse TiE equipped with a DsRi2 digital camera | |
| Murashige and Skoog basal salts | Cassson Labs | MSP01-1LT | Store at 4 °C |
| Petri Dish 100 mm x 20 mm | Fisher Scientific | 08-757-11Z | Petri dishes in which MS media is poured for the purpose of growing Arabidopsis thaliana |
| Propidium Iodide | VWR | 39139-064 | |
| Scalpel | Fisher Scientific | 08-916-5A | |
| Sucrose | BioShop | SUC700.5 | |
| Toluidine blue O | Sigma-Aldrich | T3260-5G | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-100ML | |
| β-Estradiol | Sigma-Aldrich | E2758 |
References
- Hara, K., Kajita, R., Torii, K. U., Bergmann, D. C., Kakimoto, T. The secretory peptide gene EPF1 enforces the stomatal one-cell-spacing rule. Genes & Development. 21 (14), 1720-1725 (2007).
- Hara, K., et al. Epidermal cell density is autoregulated via a secretory peptide, EPIDERMAL PATTERNING FACTOR 2 in Arabidopsis leaves. Plant & Cell Physiology. 50 (6), 1019-1031 (2009).
- Kondo, T., et al. Stomatal density is controlled by a mesophyll-derived signaling molecule. Plant & Cell Physiology. 51 (1), 1-8 (2010).
- Sugano, S. S., et al. Stomagen positively regulates stomatal density in Arabidopsis. Nature. 463 (7278), 241-244 (2010).
- Hunt, L., Gray, J. E. The signaling peptide EPF2 controls asymmetric cell divisions during stomatal development. Current Biology. 19 (10), 864-869 (2009).
- Hunt, L., Bailey, K. J., Gray, J. E. The signalling peptide EPFL9 is a positive regulator of stomatal development. New Phytologist. 186 (3), 609-614 (2010).
- Lee, J. S., et al. Direct interaction of ligand-receptor pairs specifying stomatal patterning. Genes & Development. 26 (2), 126-136 (2012).
- Shpak, E. D., McAbee, J. M., Pillitteri, L. J., Torii, K. U. Stomatal patterning and differentiation by synergistic interactions of receptor kinases. Science. 309 (5732), 290-293 (2005).
- Nadeau, J. A., Sack, F. D. Control of stomatal distribution on the Arabidopsis leaf surface. Science. 296 (5573), 1697-1700 (2002).
- Meng, X., et al. Differential function of Arabidopsis SERK family receptor-like kinases in stomatal patterning. Current Biology. 25 (18), 2361-2372 (2015).
- Lampard, G. R., Macalister, C. A., Bergmann, D. C. Arabidopsis stomatal initiation is controlled by MAPK-mediated regulation of the bHLH SPEECHLESS. Science. 322 (5904), 1113-1116 (2008).
- Yang, M., Sack, F. D. The too many mouths and four lips mutations affect stomatal production in Arabidopsis. The Plant Cell. 7 (12), 2227-2239 (1995).
- Theunissen, J. D. An improved method for studying grass leaf epidermis. Stain Technology. 64 (5), 239-242 (1989).
- Venkata, B. P., et al. crw1--A novel maize mutant highly susceptible to foliar damage by the western corn rootworm beetle. PLoS One. 8 (8), 71296 (2013).
- Tucker, M. R., et al. Somatic small RNA pathways promote the mitotic events of megagametogenesis during female reproductive development in Arabidopsis. Development. 139 (8), 1399-1404 (2012).
- Ohki, S., Takeuchi, M., Mori, M. The NMR structure of stomagen reveals the basis of stomatal density regulation by plant peptide hormones. Nature Communications. 2, 512 (2011).
- Jangra, R., et al. Duplicated antagonistic EPF peptides optimize grass stomatal initiation. Development. 148 (16), (2021).
- Zhao, C., Craig, J. C., Petzold, H. E., Dickerman, A. W., Beers, E. P. The xylem and phloem transcriptomes from secondary tissues of the Arabidopsis root-hypocotyl. Plant Physiology. 138 (2), 803-818 (2005).
- Uchida, N., et al. Regulation of inflorescence architecture by intertissue layer ligand-receptor communication between endodermis and phloem. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (16), 6337-6342 (2012).
- Tameshige, T., et al. A secreted peptide and its receptors shape the auxin response pattern and leaf margin morphogenesis. Current Biology. 26 (18), 2478-2485 (2016).
- Abrash, E. B., Davies, K. A., Bergmann, D. C. Generation of signaling specificity in Arabidopsis by spatially restricted buffering of ligand-receptor interactions. The Plant Cell. 23 (8), 2864-2879 (2011).
- Uchida, N., Tasaka, M. Regulation of plant vascular stem cells by endodermis-derived EPFL-family peptide hormones and phloem-expressed ERECTA-family receptor kinases. Journal of Experimental Botany. 64 (17), 5335-5343 (2013).
- Kosentka, P. Z., Overholt, A., Maradiaga, R., Mitoubsi, O., Shpak, E. D. EPFL Signals in the boundary region of the SAM restrict its size and promote leaf initiation. Plant Physiology. 179 (1), 265-279 (2019).
