Summary
이 논문은 기공 발달을 제어하는 유전자를 특성화하기 위해 표피 껍질을 사용하지 않는 두 가지 표현형 방법을 설명합니다. 첫 번째 방법은 톨루이딘 블루 O-염색 식물 표피를 사용하여 기공 표현형을 분석하는 방법을 보여줍니다. 두 번째 방법은 기공 리간드를 식별하고 생물학적 활성을 모니터링하는 방법을 설명합니다.
Abstract
기공은 가스 교환 및 수증기 방출에 관여하는 육상 식물 표면의 작은 구멍이며 그 기능은 식물의 생산성과 생존에 매우 중요합니다. 따라서 기공이 발달하고 패턴화되는 메커니즘을 이해하는 것은 엄청난 농업적 가치를 가지고 있습니다. 이 논문은 기공 발달 및 패턴화를 제어하는 유전자를 특성화하는 데 사용할 수 있는 애기장 대 자엽을 사용하는 두 가지 표현형 방법을 설명합니다. 먼저 톨루이딘 블루 O-염색 자엽을 사용하여 기공 표현형을 분석하는 절차가 제시됩니다. 이 방법은 빠르고 안정적이며 표현형 분석에 널리 사용되지만 전문 교육이 필요한 표피 필링을 사용할 필요가 없습니다. 여러 시스테인 잔기의 존재로 인해 기공 발달에 역할을 하는 생리활성 EPF 펩타이드의 식별 및 생성이 어려웠습니다. 따라서 두 번째로 제시된 절차는 기공 리간드를 식별하고 생물학적 분석에 의해 생물학적 활성을 모니터링하는 데 사용되는 절차입니다. 이 방법의 주요 장점은 펩타이드 용액의 양과 기공 패턴 및 발달을 제어하는 데 있어 펩타이드의 역할을 특성화하는 데 필요한 시간을 줄이면서 재현 가능한 데이터를 비교적 쉽게 생성한다는 것입니다. 전반적으로, 이러한 잘 설계된 프로토콜은 활성을 위해 매우 복잡한 구조가 필요한 시스테인이 풍부한 분비 펩타이드를 포함한 잠재적인 기공 조절자를 연구하는 효율성을 향상시킵니다.
Introduction
식물 기공의 적절한 패턴화와 분화는 광합성과 증산이라는 두 가지 기본적인 생물학적 과정에서의 기능에 매우 중요하며 EPF 펩타이드 신호 전달 경로에 의해 시행됩니다. 애기장대에서 분비된 세 가지 시스테인이 풍부한 펩타이드인 EPF1, EPF2 및 STOMAGEN/EPFL9는 기공 발달의 다양한 측면을 제어하고 ERECTA 계열 수용체 키나아제(ER, ERL1 및 ERL2), SERK 및 TMM 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . 이러한 인식은 MAPK-의존적 과정(11)에 의한 기공 분화를 촉진하는 전사 인자의 하향 조절로 이어진다. 이러한 핵심 기공 유전자의 발견은 주로 표피 결함을 나타내는 돌연변이체의 표현형 스크리닝에 의해 달성됩니다. 이 논문은 기공 패턴 및 분화를 제어하는 잠재적 유전자를 식별하고 특성화하는 데 필요한 기공 및 기타 표피 세포를 시각화하기 위한 비교적 간단하고 효율적인 표현형 분석 방법을 제시합니다.
식물 표피의 세부 사항에 대한 관찰은 일반적으로 톨루이딘 블루 O(TBO) 또는 사프라닌12,13,14과 같은 염료로 염색하거나 염색하지 않고 표피 껍질을 사용하여 달성되었습니다. 그러나 이러한 방법의 주요 과제는 조직을 찢지 않고 잎 표피를 벗겨내고 잎의 다른 부분에서 촬영한 이미지를 피하면서 패턴 데이터를 주의 깊게 관찰하고 분석하기 위한 전문 교육이 필요하다는 것입니다. 클로랄 수화물 기반 투명화 용액과 같은 시약으로 조직 샘플을 투명화하는 화학적 처리는 또한 다양한 범위의 생물학적 물질에 널리 사용되었습니다 8,15; 이러한 처리는 고품질 이미지를 제공하여 많은 표현형 정보를 생성하지만 위험한 화학 물질(예: 포름알데히드, 염소 수화물)의 사용도 필요합니다. 이 논문은 먼저 정량 분석에 충분한 이미지를 생성하지만 샘플 준비를 위해 위험한 화학 물질과 표피 잎 껍질을 사용할 필요가 없는 비교적 쉽고 편리한 표현형 분석 방법을 제시합니다. TBO 염색 자엽 표피는 또한 trichomes의 부족과 자엽의 더 작은 발달 구배가 표피 표현형의 간단하고 다루기 쉬운 해석을 허용하기 때문에 기공 발달 연구에 이상적입니다.
기공 EPF 펩타이드는 상대적으로 큰 성숙 크기와 보존된 시스테인 잔기 사이의 분자내 이황화 결합을 갖는 식물 특이적 시스테인이 풍부한 펩타이드 그룹에 속합니다. 올바른 구조적 폴딩은 생물학적 기능에 매우 중요하지만, 화학 합성 또는 이종 재조합 시스템에 의해 생성되는 시스테인이 풍부한 펩타이드는 비활성일 수 있으며 적절하게 폴딩된 펩타이드와 풀린 펩타이드모두의 혼합물입니다 3,7,16. 따라서 기공 발달을 조절하는 역할을 하는 생리활성 펩타이드의 스크리닝은 매우 어려운 작업이었습니다. 이 원고는 생리활성 기공 펩타이드의 더 나은 식별 및 특성화를 위한 생물학적 분석을 추가로 설명합니다. 이 방법에서, 애기장대 묘목은 6-7일 동안 잠재적인 펩티드가 있거나 없는 배지를 포함하는 다중 웰 플레이트에서 성장합니다. 그런 다음 자엽 표피를 컨포칼 현미경을 사용하여 시각화합니다. 일반적으로, 기공 발달에서 잠재적인 펩타이드의 생물학적 활성을 명확하게 시각화하기 위해, 더 많은 표피 세포를 생성하는 epf2 돌연변이 및 감소된 표피 세포 밀도 2,4,5를 부여하는 STOMAGEN-ami 라인과 같이 더 많거나 적은 기공 계통 세포를 생성하는 유전자형이 생물학적 분석을 위해 야생형 애기장대 대조군(Col-0)에 추가로 사용됩니다.
전반적으로, 여기에 제시된 두 가지 프로토콜은 다양한 표피 표현형의 빠르고 효율적인 평가와 기공 패턴 및 발달을 제어하는 역할을 하는 작은 펩타이드 및 호르몬을 스크리닝하는 데 사용할 수 있습니다.
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Protocol
1. TBO로 애기장 대 자엽 염색
- 종자 살균 및 성장 조건
- 종자 살균 용액 1mL(상업용 표백제 33%, Triton X-100% 33%)를 추가하여 미세원심분리기 튜브에서 유전자형당 ~30개의 애기장대 종자를 소독하고 실온(RT)에서 10-12분 동안 부드럽게 흔들어줍니다.
참고: 야생형 애기장대 수탁 컬럼비아(Col-0)의 ~30개 종자 및/또는 화학적으로 유도성 유전자(예: Est::EPF27)를 운반하는 형질전환 식물의 ~60개 종자를 살균하여 1/2 Murashige 및 Skoog(MS) 플레이트(2.16g/L 함유 0.8% 한천[w/v]) 유도제(예: β-에스트라디올)를 대조군으로 사용하지 않습니다(그림 1 및 그림 2). - 멸균 용액을 제거하고 층류 후드에서 1mL의 멸균수로 종자를 4회 세척한 다음 ~200μL의 멸균 0.1% 한천에 재현탁합니다.
- 이식유전자(예: Est::EPF27)의 화학적 유도를 위한 유도제(예: 10μM β-에스트라디올)가 포함된 1/2 MS 한천 플레이트 또는 1/2 MS 한천 플레이트에 유전자형당 ~30개의 종자를 뿌리고 피펫을 사용하여 미세 기공 테이프로 밀봉합니다.
알림: 씨앗은 묘목이 균일하게 자라는 것을 방지하기 위해 가까운 곳에 두지 않도록 접시에 고르게 분포되어야 합니다. - 발아를 동기화하기 위해 플레이트를 빛없이 4 °C에서 3-5 일 동안 두어 씨앗을 층화합니다.
- 성층화 후, 플레이트를 22 ° C의 성장 챔버에서 120 μmol · m-2 · s-1 빛 하에서 10 일 동안 16 시간의 빛과 8 시간의 어둠으로 배양합니다.
- 종자 살균 용액 1mL(상업용 표백제 33%, Triton X-100% 33%)를 추가하여 미세원심분리기 튜브에서 유전자형당 ~30개의 애기장대 종자를 소독하고 실온(RT)에서 10-12분 동안 부드럽게 흔들어줍니다.
- 애기장대 자엽의 샘플링 및 TBO 염색
- 발아 후 10 일이 지나면 변동성을 제한하기 위해 접시에 다른 묘목과 균일하게 자라는 개별 묘목에서 자엽 중 하나를 신중하게 선택하고 잘라냅니다.
참고: 자엽은 10일 된 묘목에서 채취하는데, 그 이유는 모세포와 미성숙 표피 세포가 없기 때문에 표피 표현형의 해석을 단순화합니다. - 집게를 사용하여 고정 용액 (9 : 1 에탄올에서 아세트산) 1mL가 들어있는 미세 원심 분리 튜브에 각 자엽을 넣고 샘플을 고정 용액에 밤새, 최소 및 실온에 두십시오.
알림: 그런 다음 샘플을 이 조건에서 최대 2년 동안 보관할 수 있습니다. 이미지 그림 2E 는 3년 이상 고정 용액에 보관된 자엽 샘플에서 가져온 것입니다. 절단 직후 자엽을 고정 용액에 보관하고 나중에 균일한 시료 준비를 위해 각 미세 원심분리기 튜브에 자엽을 5개 이하로 배치하는 것이 중요합니다. - 고정 용액을 제거하고, 70% 에탄올 1 mL를 첨가한다. 튜브를 몇 번 뒤집은 후 샘플이 들어 있는 튜브를 ~ 30분 동안 RT에 둡니다.
- 50% 에탄올 1mL를 사용한 다음 20% 에탄올을 사용하여 1.2.3단계를 반복합니다.
- 20% 에탄올 1mL를 증류수 1mL로 교체한 다음 튜브를 몇 번 뒤집은 후 자엽 샘플이 들어 있는 튜브를 ~30분 동안 그대로 둡니다.
참고: 샘플은 증류수에 24시간 이상 머무를 수 있지만 정량 분석을 위해 양질의 이미지(다양한 표피 세포 유형에 대해 잘 염색된 이미지)를 얻는 데는 권장되지 않습니다. - 튜브에서 증류수를 모두 제거합니다. 그런 다음 즉시 ~200μL의 TBO 염색 용액(H2O중 0.5% TBO, 여과됨)을 ~2분 동안 추가합니다.
알림: 각 자엽 샘플이 배양 중에 튜브를 부드럽게 튕겨 TBO 용액에 고르게 노출되었는지 확인하십시오. TBO로 과염색을 방지하려면(염색 시기는 필수적이며 각 유전자형에 따라 다를 수 있음) 한 번에 샘플이 들어 있는 튜브를 6개 이상 처리하지 마십시오. - TBO 염색 용액을 가능한 한 철저하게 제거한 다음 신선한 증류수 1mL를 첨가하여 샘플을 즉시 몇 번 세척하십시오.
- 발아 후 10 일이 지나면 변동성을 제한하기 위해 접시에 다른 묘목과 균일하게 자라는 개별 묘목에서 자엽 중 하나를 신중하게 선택하고 잘라냅니다.
- 이미징 및 데이터 분석
- 현미경 슬라이드를 가지고 15% 글리세롤(~50μL)을 한 방울 떨어뜨립니다. 미세 집게를 사용하여 슬라이드의 축면이 위로 향하게 하여 자엽을 15% 글리세롤에 넣습니다. 그런 다음 형성된 기포가 샘플에서 제거될 수 있도록 커버슬립으로 부드럽게 덮습니다.
- 명시야 현미경(그림 1 및 그림 2)을 사용하여 자엽 표피의 축변을 이미지화한 다음 기공 및 기타 표피 세포 유형의 수를 계산하여 표피 표현형을 검사합니다.
- 각 유전자형에 대해 Jangra et al.17에 의해 설명된 다음 공식을 사용하여 표피 표현형을 계산합니다.
구내지수(%) = (기공의 수/표피세포의 총수) × 100
구내밀도(mm−2) = 기공의 수/면적(mm2)
참고: 각 유전자형에 대해 최소 8개의 자엽(N = 8)을 이미지화하고 유도제 없이 성장한 화학적으로 유도성 이식유전자를 발현하는 야생형 식물 및/또는 형질전환 식물의 표현형과 비교하여 각 유전자형의 표피 표현형을 문서화합니다.
2. 기공 펩타이드에 대한 생물학적 분석
참고: 생물학적 분석 절차는 그림 3에 나와 있습니다.
- 종자 살균 및 성장 조건
- 위와 같이 각 처리에 대해 ~ 25 개의 종자를 살균하고 층류 후드에있는 2 개의 1/2 MS 한천 플레이트 각각에 종자의 약 절반을 뿌립니다.
참고: 야생형 배경(예: Col-0)을 사용하는 대신 상피 세포(예: epf22)가 높은 유전자형을 사용하여 표피 세포 패터닝 및 분화에 대한 펩타이드의 생물학적 활성을 쉽게 검출할 수 있습니다(그림 4). - 종자를 어둠 속에서 4°C에서 3일 동안 성층화한다.
- ~10시간 간격으로 두 개의 플레이트를 각각 꺼내고 120μmol·m-2·s-1 빛 아래에서 16시간의 빛과 8시간의 어둠으로 1 일 동안 22°C의 플레이트에 씨앗을 배양합니다.
- 위와 같이 각 처리에 대해 ~ 25 개의 종자를 살균하고 층류 후드에있는 2 개의 1/2 MS 한천 플레이트 각각에 종자의 약 절반을 뿌립니다.
- 펩타이드 처리 및 이미징
- 층류 후드에서 준비된 두 개의 플레이트 각각에서 10-12 일 된 애기장대 묘목을 각 웰 (웰 당 ~ 20 개의 묘목)에 1.5mL의 1/2 MS 액체 배지가 들어있는 24 웰 플레이트에 조심스럽게 이식합니다.
참고: 묘목에 대한 펩타이드 처리의 시기는 펩타이드 처리의 표현형 결과에 매우 중요하므로 두 개의 별도 플레이트에 씨앗을 준비하여 처리를 위한 두 가지 다른 묘목 발달 단계를 얻습니다. - 완충액 단독(50mM Tris-HCl[pH 8.0]) 또는 두 가지 다른 농도의 펩타이드(일반적으로 50mM Tris-HCl[pH 8.0]에서 1μM 및 2.5μM 펩타이드)를 ~20개의 1/2MS 한천 플레이트에서 발아된 ~20개의 1일 된 애기장대 묘목을 포함하는 각 웰에 추가합니다.
참고: 냉동실에서 펩타이드 용액 분취량을 제거하고 치료 전에 몇 분 동안 RT에 보관하십시오. -80°C의 냉동고에 보관된 펩타이드는 몇 년 동안 안정적이지만 펩타이드 용액을 작은 분취량으로 보관하여 동결-해동 주기를 피해야 합니다. - 묘목을 완충액 단독 또는 피펫을 사용하여 펩타이드 용액과 부드럽게 혼합한 후 미세 기공 테이프로 플레이트를 밀봉합니다. 22°C에서 5-7일 동안 장일 조건(16시간 광주기, 120μmol·m-2·s-1 광)에서 분석 플레이트를 배양합니다.
알림: 묘목이 너무 가깝게 자라서 각 묘목이 펩타이드 용액에 고르게 노출되는 것을 방지하십시오. 통기를 증가시키기 위해 성장 챔버에서 플레이트를 배양하기 전에 플레이트를 2-3시간 동안 부드럽게 회전시킵니다. - 완충액 단독 또는 펩타이드가 들어 있는 우물에서 각 묘목을 덮개 슬라이드에 옮기고 묘목의 자엽을 해부합니다. 집게를 사용하여 자엽의 아축 쪽을 위로 올리고 작은 조각으로 자릅니다.
- 또 다른 깨끗한 현미경 슬라이드를 가져다가 요오드화 프로피듐 용액(~25μL, H 2O에서2mg/mL)을 한 방울 떨어뜨립니다.
- 집게를 사용하여 자엽의 작은 조각 중 하나를 프로피듐 요오드화물 용액 한 방울에 넣고 커버슬립을 부드럽게 놓습니다. 커버슬립 가장자리에 요오드화 프로피듐 용액을 추가로 도포하여 형성된 기포를 제거합니다.
- 컨포칼 현미경을 사용하여 자엽의 축방향 면을 이미지화하고 버퍼만 포함된 1/2 MS 배지에서 자란 묘목의 이미지와 이미지를 비교합니다.
참고: 그림 4에 제시된 이미지는 완충액만(그림 0A, B) 또는 EPF2 펩타이드 용액의 두 배치(그림 4C-F)로 처리된 야생형 Col-2 또는 epf2 2,5 묘목에서 촬영되었으며 1년 동안 -80°C에서 보관되었습니다.
- 층류 후드에서 준비된 두 개의 플레이트 각각에서 10-12 일 된 애기장대 묘목을 각 웰 (웰 당 ~ 20 개의 묘목)에 1.5mL의 1/2 MS 액체 배지가 들어있는 24 웰 플레이트에 조심스럽게 이식합니다.
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Representative Results
더 낮거나 더 많은 기공 밀도 및 클러스터링을 갖는 것으로 알려진 다양한 기공 형질전환 식물 및 돌연변이체(epf2 2,5, epf1 epf2 2,5, tmm12, STOMAGEN-침묵 라인4 및 에스트라디올 유도성 Est::EPF1 또는 Est::EPF2 과발현 구조체 7을 운반하는 트랜스제 닉 라인 )는 여기에 제시된 두 가지 표현형 분석의 효과를 입증하는 데 사용되었으며, 이는 기공 발달 및 패턴화에 역할을 하는 유전자를 식별하고 특성화하는 것을 목표로 했습니다. 분석을 위해 다양한 유형의 표피 세포를 정량화하기 위해 표피 껍질을 벗길 필요 없이 고품질 표피 이미지를 생성하기 위해서는 야생형 대조군(Col-0)과 비교하여 표피 표현형이 다를 수 있으므로 각 유전자형에 대해 TBO로 샘플 염색 시간을 사전 조정하는 것이 중요합니다(그림 1A 및 그림 2A). 경험에 비추어 볼 때, 기공이 적은 유전자형은 TBO를 사용한 염색 시간이 더 길어야 하는 반면(그림 1B 및 그림 2D,E), 기공과 클러스터링이 더 많은 유전자형은 염색 시간이 더 짧아야 합니다(그림 1C 및 그림 2B,C). 전체 펩타이드 용액에서 적절하게 폴딩된 펩타이드의 다양한 양이 기공 발달에서 펩타이드의 생물학적 활성을 가릴 수 있으므로, 생물학적 분석을 위해 더 적거나 더 많은 기공 표현형(예: epf2)을 갖는 유전자형뿐만 아니라 추가로 더 높은 총 농도의 펩타이드 용액(예: 2.5μM EPF2)을 사용하는 것이 좋습니다. 기공 개시를 억제하는 역할을 하는 EPF2 펩타이드의 활성은 제조된 EPF2 펩타이드의 특정 배치가 펩타이드의 생리활성 형태가 더 적은 양(예: 그림 4의 EPF2 펩타이드 용액 배치 1)을 가졌음에도 불구하고 Col-0보다 표피 세포가 더 많은 epf2 돌연변이체를 사용하여 쉽게 검출할 수 있었습니다.
그림 1: 다양한 표피 표현형을 나타내는 유전자형에 대한 TBO를 사용한 배양 시간의 영향. 3개의 애기장대 유전자형의 10일 된 묘목의 Abaxial cotyledon 이미지: (A) 야생형(Col-0), (B) STOMAGEN-침묵 계통(STOMAGEN-ami) 및 (C) epf1 epf2 돌연변이. Col-0은 야생형 애기장대 대조군을 나타내고, STOMAGEN-silenced line과 epf1 epf2 돌연변이체는 각각 기공 수가 적거나 높은 유전자형을 나타냅니다. 이미지는 20x 대물 렌즈(0.35mm2 시야)가 있는 도립 현미경을 사용하여 촬영되었습니다. 상이한 유전자형으로부터의 모든 자엽 샘플을 이미징 전에 동일한 시간(2분) 동안 TBO(H2O중 0.5% TBO)로 염색하였지만, 이미지의 품질은 가변적이었다. 따라서 분석을 위해 잘 염색된 이미지를 얻으려면 각 유전자형에 대한 적절한 TBO 염색 시간을 미리 결정하는 것이 중요합니다. 스케일 바 = 50 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 정량 분석을 위해 표피 껍질을 사용하지 않은 TBO 염색 표피 이미지. (A) 야생형(Col-0), (B) tmm 및 (C,D) 에스트라디올 유도성 EPF2(Est::EPF2) 또는 (E) EPF1 과발현 구조체(Est::EPF1)를 운반하는 형질전환 계통의 10일 된 묘목에서 자엽의 대표적인 표피 이미지를 사용하여 표피 표현형을 정량화할 수 있습니다. 3년 이상 동안 고정 용액 중의 자엽을 사용하여 (E)에 제시된 이미지를 촬영하였다. 이미지는 20x 대물 렌즈(0.35mm2 시야)가 있는 도립 현미경을 사용하여 촬영되었습니다. 세포를 TBO 염색으로 윤곽을 잡고, 전체 크기 이미지 너비의 절반을 표시하기 위해 제시하였다. 스케일 바 = 50 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 생물학적 분석 절차 . (A) 씨앗을 두 개의 1/2 MS 한천 플레이트에 뿌리고 10시간 간격으로 꺼냅니다. (B) 1일 된 애기장대 묘목을 모의 또는 두 가지 다른 펩타이드 농도로 1/2 MS 배지가 들어 있는 24웰 플레이트에 이식합니다. (C) 5-7일 후, 묘목은 기공 발달 및 패터닝에서 펩타이드의 생물학적 활성을 결정하기 위한 이미징을 위해 준비됩니다. (D) 자엽 슬라이스를 이미징을 위해 현미경 슬라이드의 프로피듐 요오드화물 용액 한 방울에 넣습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 펩타이드 처리 후 Arabidopsis cotyledons의 축방향 표피의 공초점 현미경. 완충 용액에서 6-7일 동안 성장한 (A) 야생형 및 (B) epf2 자엽 표피 및 EPF2 펩티드의 두 가지 다른 배치로 성장한 (C-F) epf2 자엽 표피의 대표적인 공초점 이미지. 이미지는 40x 대물 렌즈(561nm 여기 및 561nm 장역 통과 방출 필터)를 사용하여 공초점 현미경을 사용하여 프로피듐 요오드화물 염색을 캡처하고 세포 윤곽을 시각화했습니다. 제조된 각각의 EPF2 펩타이드 용액은 펩타이드의 적절하게 접힌(생리활성) 형태와 미스폴딩된(비활성) 형태의 상이한 양을 갖는다. 따라서 기공 발달에 잠재적인 역할을 하는 펩타이드의 초기 스크리닝을 위해 생물학적 분석에 표시된 대로 총 펩타이드 용액의 두 가지 다른 농도를 사용하는 것이 좋습니다. 스케일 바 = 30 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
여기에 제시된 기공 패턴 및 분화를 제어하는 유전자를 식별하고 특성화하기 위한 두 가지 표현형 분석 방법은 프로토콜이 표피 박리 및 특수 장비(시간이 많이 걸리고 샘플 준비를 위한 특별 교육이 필요함)를 사용할 필요가 없지만 표피 표현형의 정량적 분석을 위한 고품질 이미지를 생성하기 때문에 편리하고 신뢰할 수 있는 분석입니다.
TBO 염색 애기장대 자엽을 사용한 표현형 분석을 위한 이 기술의 한계는 다양한 표피 세포 유형에 대해 시각적 대비가 있는 고품질 이미지를 얻는 것이 염색 시간과 종의 다양성과 유전자형에 따라 달라질 수 있는 조직의 고유한 특성에 따라 달라진다는 것입니다(그림 1)18 . 표피 껍질을 사용하여 표피 세포를 관찰하는 다른 표현형 분석 방법은 동일한 문제를 가지고 있으며 더 많은 시간과 특별한 훈련이 필요합니다. 더 오랜 기간 동안 더 적은 수의 기공을 가진 유전자형에서 자엽을 염색하고 더 짧은 기간 동안 더 많은 기공을 가진 유전자형에서 샘플을 염색함으로써 데이터 분석에 충분한 적절하게 염색된 표피 이미지를 얻는 데 어려움을 피할 수 있습니다. 각 유전자형에 대한 염색 시간은 유사한 표피 표현형을 가진 유전자형에 대한 염색 시간을 최적화하기 위해 먼저 몇 개의 샘플만 확인하여 조정할 수도 있습니다.
충분한 양의 잘 접힌 생리활성 펩타이드, 특히 시스테인이 풍부한 펩타이드(기공 패터닝을 포함하여 식물 발달을 조절하는 다양한 기능을 하는 리간드)를 얻는 것은 어려운 일이었다 1,2,3,4,5,6,19,20,21,22,23 . 또한, 생리활성 펩타이드가 생성되더라도 생성된 생리활성 펩타이드가 종종 잘 접히고 활성이며 비활성 펩타이드가 혼합되어 있기 때문에 특정 생물학적 공정에서 잠재적인 기능을 갖는 펩타이드를 스크리닝하는 것은 또 다른 어려운 작업입니다. 이 논문은 잠재적인 기공 펩타이드를 발견하고 특성화하기 위한 효율적인 생물학적 분석 방법을 제시합니다. 이 방법은 애기장대에서 기공 발달의 다양한 측면을 제어하는 다양한 중요한 펩타이드와 풀 Brachypodium 3,4,7,17을 식별하는 데 성공했습니다. 그러나 이 기술의 주요 한계는 표현형 반응의 가변성이며, 이는 발달 단계가 약간 다른 묘목과 다양한 양의 생리 활성 펩타이드를 포함하는 펩타이드 용액을 사용하기 때문에 발생할 가능성이 큽니다. 이 방법에 대한 초기 시도는 성층화 후 펩타이드 용액을 함유하는 플레이트의 웰에 야생형 종자를 직접 배치하는 것과 관련이 있습니다. 표피 세포가 더 많거나 적은 유전자형(예: epf2 2, 그림 4)과 1/2 MS 한천 플레이트에서 발아한 1일 된 애기장대 묘목을 사용하지 않으면 더 적은 수의 묘목이 성장할 수 있고 펩타이드 적용 후 명확한 표현형 반응을 나타낼 수 있습니다. 이 프로토콜에서는 두 가지 다른 발달 단계를 가진 ~20개의 하루 된 애기장대 묘목을 사용하고 두 가지 다른 농도의 펩타이드 용액(1μM 및 2.5μM)을 사용하여 가변성 문제를 해결했습니다.
펩티드 처리된 샘플의 표피 표현형은 TBO-염색된 샘플을 사용하여 제시된 첫 번째 표현형 분석 방법에 의해서도 분석될 수 있다. 이 방법을 사용하면 각 샘플의 비교적 넓은 영역을 분석할 수 있기 때문에 비교적 쉬운 정량적 표현형 분석이 가능합니다. 또한 이 방법은 이미징을 위해 동일한 조건에서 준비된 샘플을 수확한 후 샘플 준비에 유연성을 제공합니다. 그러나 이 방법으로 촬영한 이미지는 일반적으로 최고 품질이 아닙니다. 반면, 프로피듐 요오드화물 염색 후 컨포칼 이미징은 표피 디테일이 있는 고품질 이미지를 제공합니다. 그러나 이 방법은 분석을 위해 조직의 작은 영역에만 초점을 맞출 수 있습니다. 또한, 준비된 특정 수의 살아있는 조직 만 한 번에 분석 할 수 있습니다.
결론적으로, 여기에 제시된 표현형 분석은 기공 패턴화 및 분화를 제어하는 잠재적 유전자의 빠르고 효과적인 검사에 사용될 수 있으므로 기공 발달 및 펩타이드 기능의 메커니즘에 대한 이해를 향상시킬 수 있습니다. 또한, 이 생물학적 분석 프로토콜은 표피 조직 패터닝에서 역할을 하는 다른 소분자를 식별하고 잘 접힌 생리활성 펩타이드의 구조를 결정하기 위한 초기 스크리닝 방법으로 사용할 수 있습니다.
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Disclosures
이해 상충은 선언되지 않았습니다.
Acknowledgments
이 연구는 캐나다 천연 자원 및 공학 연구위원회 (NSERC) 디스커버리 프로그램과 Concordia University를 통해 자금을 지원받았습니다. K.B.는 인도의 National Overseas Scholarship의 지원을 받습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18 mm x 18 mm cover slip | VWR | 16004-326 | |
| 24-well sterile plates with lid | VWR | CA62406-183 | |
| 3M Micropore surgical tape | Fisher Scientific | 19-027-761 | Microporous surgical paper tape used to seal MS plates |
| 76 x 26 mm Microscope slide | TLG | GEW90-2575-03 | |
| Acetic acid, ≥99.8% | Fisher Scientific | A38-212 | |
| Agar | BioShop | AGR001.1 | |
| Bleech | Household bleach (e.g., Clorox) | ||
| Confocal microscope | Nikon | Nikon C2 operated by NIS-Elements | |
| Ethanol | Greenfield | P210EAAN | |
| FIJI | Open-srouce | (Fiji Is Just) ImageJ v2.1/1.5.3j | Downloaded from https://imagej.net/software/fiji/ |
| Forceps | Sigma-Aldrich | F6521 | |
| Gamborg's vitamin mixture | Cassson Labs | GBL01-100ML | Store at 4 °C |
| Glycerol | Fisher Scientific | G33-4 | |
| Growth chambers | Conviron, model E15 | 16h light cycle, set at 21°C with a light intensity of 120 µmol·m-2·s-1. | |
| Lights | HD Supply | 25272 | Fluorescent lights in growth chambers, Sylvania F72T12/CW/VHO 72"T12 VHO 4200K |
| Microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 14-222-155 | Tubes in which Arabidopsis thaliana seeds are placed to perform sterilization |
| Microscope | Nikon | Nikon Eclipse TiE equipped with a DsRi2 digital camera | |
| Murashige and Skoog basal salts | Cassson Labs | MSP01-1LT | Store at 4 °C |
| Petri Dish 100 mm x 20 mm | Fisher Scientific | 08-757-11Z | Petri dishes in which MS media is poured for the purpose of growing Arabidopsis thaliana |
| Propidium Iodide | VWR | 39139-064 | |
| Scalpel | Fisher Scientific | 08-916-5A | |
| Sucrose | BioShop | SUC700.5 | |
| Toluidine blue O | Sigma-Aldrich | T3260-5G | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-100ML | |
| β-Estradiol | Sigma-Aldrich | E2758 |
References
- Hara, K., Kajita, R., Torii, K. U., Bergmann, D. C., Kakimoto, T. The secretory peptide gene EPF1 enforces the stomatal one-cell-spacing rule. Genes & Development. 21 (14), 1720-1725 (2007).
- Hara, K., et al. Epidermal cell density is autoregulated via a secretory peptide, EPIDERMAL PATTERNING FACTOR 2 in Arabidopsis leaves. Plant & Cell Physiology. 50 (6), 1019-1031 (2009).
- Kondo, T., et al. Stomatal density is controlled by a mesophyll-derived signaling molecule. Plant & Cell Physiology. 51 (1), 1-8 (2010).
- Sugano, S. S., et al. Stomagen positively regulates stomatal density in Arabidopsis. Nature. 463 (7278), 241-244 (2010).
- Hunt, L., Gray, J. E. The signaling peptide EPF2 controls asymmetric cell divisions during stomatal development. Current Biology. 19 (10), 864-869 (2009).
- Hunt, L., Bailey, K. J., Gray, J. E. The signalling peptide EPFL9 is a positive regulator of stomatal development. New Phytologist. 186 (3), 609-614 (2010).
- Lee, J. S., et al. Direct interaction of ligand-receptor pairs specifying stomatal patterning. Genes & Development. 26 (2), 126-136 (2012).
- Shpak, E. D., McAbee, J. M., Pillitteri, L. J., Torii, K. U. Stomatal patterning and differentiation by synergistic interactions of receptor kinases. Science. 309 (5732), 290-293 (2005).
- Nadeau, J. A., Sack, F. D. Control of stomatal distribution on the Arabidopsis leaf surface. Science. 296 (5573), 1697-1700 (2002).
- Meng, X., et al. Differential function of Arabidopsis SERK family receptor-like kinases in stomatal patterning. Current Biology. 25 (18), 2361-2372 (2015).
- Lampard, G. R., Macalister, C. A., Bergmann, D. C. Arabidopsis stomatal initiation is controlled by MAPK-mediated regulation of the bHLH SPEECHLESS. Science. 322 (5904), 1113-1116 (2008).
- Yang, M., Sack, F. D. The too many mouths and four lips mutations affect stomatal production in Arabidopsis. The Plant Cell. 7 (12), 2227-2239 (1995).
- Theunissen, J. D. An improved method for studying grass leaf epidermis. Stain Technology. 64 (5), 239-242 (1989).
- Venkata, B. P., et al. crw1--A novel maize mutant highly susceptible to foliar damage by the western corn rootworm beetle. PLoS One. 8 (8), 71296 (2013).
- Tucker, M. R., et al. Somatic small RNA pathways promote the mitotic events of megagametogenesis during female reproductive development in Arabidopsis. Development. 139 (8), 1399-1404 (2012).
- Ohki, S., Takeuchi, M., Mori, M. The NMR structure of stomagen reveals the basis of stomatal density regulation by plant peptide hormones. Nature Communications. 2, 512 (2011).
- Jangra, R., et al. Duplicated antagonistic EPF peptides optimize grass stomatal initiation. Development. 148 (16), (2021).
- Zhao, C., Craig, J. C., Petzold, H. E., Dickerman, A. W., Beers, E. P. The xylem and phloem transcriptomes from secondary tissues of the Arabidopsis root-hypocotyl. Plant Physiology. 138 (2), 803-818 (2005).
- Uchida, N., et al. Regulation of inflorescence architecture by intertissue layer ligand-receptor communication between endodermis and phloem. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (16), 6337-6342 (2012).
- Tameshige, T., et al. A secreted peptide and its receptors shape the auxin response pattern and leaf margin morphogenesis. Current Biology. 26 (18), 2478-2485 (2016).
- Abrash, E. B., Davies, K. A., Bergmann, D. C. Generation of signaling specificity in Arabidopsis by spatially restricted buffering of ligand-receptor interactions. The Plant Cell. 23 (8), 2864-2879 (2011).
- Uchida, N., Tasaka, M. Regulation of plant vascular stem cells by endodermis-derived EPFL-family peptide hormones and phloem-expressed ERECTA-family receptor kinases. Journal of Experimental Botany. 64 (17), 5335-5343 (2013).
- Kosentka, P. Z., Overholt, A., Maradiaga, R., Mitoubsi, O., Shpak, E. D. EPFL Signals in the boundary region of the SAM restrict its size and promote leaf initiation. Plant Physiology. 179 (1), 265-279 (2019).
