Summary
Dette papir beskriver to fænotypemetoder uden brug af epidermale skræl til at karakterisere de gener, der styrer stomatal udvikling. Den første metode demonstrerer, hvordan man analyserer en stomatal fænotype ved hjælp af en toluidinblå O-farvet planteepidermis. Den anden metode beskriver, hvordan man identificerer stomatale ligander og overvåger deres biologiske aktiviteter.
Abstract
Stomata er små porer på overfladen af landplanter, der er involveret i gasudveksling og frigivelse af vanddamp, og deres funktion er kritisk for planteproduktivitet og overlevelse. Som sådan har forståelse af de mekanismer, hvormed stomata udvikler sig og mønster, enorm agronomisk værdi. Dette papir beskriver to fænotypiske metoder ved hjælp af Arabidopsis-cotyledoner , der kan bruges til at karakterisere de gener, der styrer stomatal udvikling og mønster. Præsenteret først er procedurer til analyse af stomatale fænotyper ved anvendelse af toluidinblå O-farvede cotyledoner. Denne metode er hurtig og pålidelig og kræver ikke brug af epidermale skræl, som i vid udstrækning anvendes til fænotypiske analyser, men kræver specialuddannelse. På grund af tilstedeværelsen af flere cysteinrester har identifikation og generering af bioaktive EPF-peptider, der spiller en rolle i stomatal udvikling, været udfordrende. Således præsenteres anden en procedure, der anvendes til at identificere stomatale ligander og overvåge deres biologiske aktivitet ved bioassays. Den største fordel ved denne metode er, at den relativt let producerer reproducerbare data, samtidig med at mængden af peptidopløsning og den tid, der kræves for at karakterisere peptidernes rolle i styringen af stomatal mønster og udvikling, reduceres. Samlet set forbedrer disse veldesignede protokoller effektiviteten ved at studere de potentielle stomatale regulatorer, herunder cysteinrige sekretoriske peptider, som kræver meget komplekse strukturer for deres aktivitet.
Introduction
Korrekt mønster og differentiering af plantestomaterne er afgørende for deres funktion i to grundlæggende biologiske processer, fotosyntese og transpiration, og håndhæves af EPF-peptidsignalveje. I Arabidopsis styrer tre udskillede cysteinrige peptider, EPF1, EPF2 og STOMAGEN / EPFL9, forskellige aspekter af stomatal udvikling og opfattes af celleoverfladereceptorkomponenter, herunder ERECTA-familie receptorkinaser (ER, ERL1 og ERL2), SERK'er og TMM 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . Denne anerkendelse fører derefter til nedregulering af transkriptionsfaktorerne, der fremmer stomatal differentiering ved en MAPK-afhængig proces11. Opdagelsen af disse kernestomatale gener opnås primært ved fænotypisk screening af mutanter, der udviser epidermale defekter. Dette papir præsenterer relativt enkle og effektive fænotypemetoder til visualisering af stomata og andre epidermale celler, som er nødvendige for at identificere og karakterisere de potentielle gener, der styrer stomatal mønster og differentiering.
Observationen af detaljerne i plantens epidermis er typisk opnået ved at bruge epidermale skræl med eller uden farvning med et farvestof som toluidinblåt O (TBO) eller safranin12,13,14. Den største udfordring ved disse metoder er imidlertid, at de kræver specialuddannelse for at skrælle bladepidermis uden at rive vævene og omhyggeligt observere og analysere mønsterdataene, samtidig med at man undgår billederne taget fra forskellige dele af bladet. Kemiske behandlinger til fjernelse af vævsprøver med reagenser såsom chloralhydratbaserede clearingopløsninger er også blevet anvendt i vid udstrækning til en række biologiske materialer 8,15; Disse behandlinger genererer en masse fænotypiske oplysninger ved at give billeder af høj kvalitet, men kræver også brug af farlige kemikalier (f.eks. Formaldehyd, chloralhydrat). Dette papir præsenterer først en relativt nem og bekvem fænotypemetode, der producerer billeder, der er tilstrækkelige til kvantitativ analyse, men ikke kræver brug af farlige kemikalier og epidermale bladskaller til prøveforberedelsen. En TBO-farvet cotyledon epidermis er også ideel til undersøgelse af stomatal udvikling, fordi manglen på trichomer og den mindre udviklingsgradient i cotyledoner muliggør den enkle og medgørlige fortolkning af de epidermale fænotyper.
Stomatale EPF-peptider tilhører gruppen af plantespecifikke, cysteinrige peptider, der har relativt store modne størrelser og intramolekylære disulfidbindinger mellem konserverede cysteinrester. Korrekt konformationel foldning er afgørende for deres biologiske funktion, men cysteinrige peptider, der produceres ved enten kemisk syntese eller et heterologt rekombinationssystem, kan være inaktive og er en blanding af både korrekt foldede og ufoldede peptider 3,7,16. Således har screening af bioaktive peptider, der spiller en rolle i at kontrollere stomatal udvikling, været en meget udfordrende opgave. Dette manuskript beskriver desuden et bioassay til bedre identifikation og karakterisering af bioaktive stomatale peptider. I denne metode dyrkes Arabidopsis-frøplanter i en multibrøndplade indeholdende medier med og uden potentielle peptider i 6-7 dage. Derefter visualiseres cotyledon epidermis ved hjælp af et konfokalmikroskop. For klart at visualisere den biologiske aktivitet af potentielle peptider i stomatal udvikling anvendes generelt de genotyper, der producerer mere og / eller mindre stomatale afstamningsceller, såsom epf2-mutanten, der producerer flere epidermale celler, og STOMAGEN-ami-linjen, der giver reduceret epidermal celletæthed 2,4,5, ud over vildtype Arabidopsis-kontrollen (Col-0) til bioassays.
Samlet set kan de to protokoller, der præsenteres her, bruges til hurtig og effektiv vurdering af forskellige epidermale fænotyper og til screening af små peptider og hormoner, der spiller en rolle i styringen af stomatal mønster og udvikling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Farvning af Arabidopsis-cotyledoner med TBO
- Frøsterilisering og vækstbetingelser
- Steriliser ~ 30 Arabidopsis frø pr. Genotype i et mikrocentrifugerør ved at tilsætte 1 ml af en frøsteriliseringsopløsning (33% kommercielt blegemiddel, 0,1% Triton X-100), og rock forsigtigt i 10-12 minutter ved stuetemperatur (RT).
BEMÆRK: Steriliser ~ 30 frø af vildtypen Arabidopsis tiltrædelse Columbia (Col-0) og / eller ~ 60 frø af transgene planter, der bærer et kemisk inducerbart gen (f.eks. Est:: EPF27) for at bruge transgene frøplanter dyrket på 1/2 Murashige og Skoog (MS) plader (2,16 g / L indeholdende 0,8% agar [w / v]) uden inducer (f.eks. β-østradiol) som kontroller (figur 1 og figur 2). - Fjern steriliseringsopløsningen, vask frøene fire gange med 1 ml sterilt vand i en laminær strømningshætte, og resuspender dem i ~ 200 μL steril 0,1% agar.
- Så ~30 frø pr. genotype på 1/2 MS agarplader eller 1/2 MS agarplader indeholdende en inducer (f.eks. 10 μM β-østradiol) til kemisk induktion af transgenet (f.eks. Est::EPF27) ved hjælp af en pipette og forsegles med mikroporetape.
BEMÆRK: Frøene skal fordeles jævnt på pladen for at undgå at placere dem i nærheden, da dette forhindrer frøplanterne i at vokse ensartet. - Stratificere frøene ved at placere pladerne ved 4 °C uden lys i 3-5 dage for at synkronisere spiringen.
- Efter stratificering inkuberes pladerne i et vækstkammer ved 22 °C under 120 μmol·m−2·s−1 lys med en fotoperiode på 16 timers lys og 8 timers mørke i 10 dage.
- Steriliser ~ 30 Arabidopsis frø pr. Genotype i et mikrocentrifugerør ved at tilsætte 1 ml af en frøsteriliseringsopløsning (33% kommercielt blegemiddel, 0,1% Triton X-100), og rock forsigtigt i 10-12 minutter ved stuetemperatur (RT).
- Prøveudtagning og TBO-farvning af Arabidopsis-cotyledoner
- 10 dage efter spiring skal du omhyggeligt vælge og skære en af cotyledonerne ud af de enkelte frøplanter, der vokser ensartet med andre frøplanter på pladen for at begrænse variabiliteten.
BEMÆRK: Cotyledoner udtages fra 10 dage gamle frøplanter, fordi de ikke har trichomer og umodne epidermisceller, hvilket forenkler fortolkningen af epidermale fænotyper. - Hver cotyledon anbringes i et mikrocentrifugerør indeholdende 1 ml fikseringsopløsning (9:1 ethanol til eddikesyre) ved hjælp af pincet, og prøven efterlades i fikseringsopløsningen natten over, som minimum og ved stuetemperatur.
BEMÆRK: Prøverne kan derefter opbevares i op til et par år i denne tilstand. Billedet figur 2E blev taget fra en cotyledonprøve, der blev opbevaret i fikseringsopløsning i over 3 år. Det er vigtigt at opbevare cotyledonen i en fikseringsopløsning umiddelbart efter skæring og ikke placere mere end fem cotyledoner i hvert mikrocentrifugerør til homogen prøveforberedelse senere. - Fjern fikseringsopløsningen, og tilsæt 1 ml 70% ethanol. Efter at have vendt røret et par gange, skal du lade røret med prøverne stå ved RT i ~ 30 minutter.
- Gentag trin 1.2.3 med 1 ml 50% ethanol og derefter 20% ethanol.
- Udskift 1 ml 20% ethanol med 1 ml destilleret vand, og lad derefter røret indeholdende cotyledonprøverne stå i ~ 30 minutter efter invertering af røret et par gange.
BEMÆRK: Prøverne kan forblive i destilleret vand i mere end 24 timer, men dette anbefales ikke for at opnå billeder af god kvalitet (velfarvede billeder til forskellige epidermale celletyper) til kvantitativ analyse. - Fjern alt destilleret vand fra røret. Derefter tilsættes straks ~ 200 μL TBO-farvningsopløsning (0,5% TBO i H 2 O, filtreret) i ~2minutter.
BEMÆRK: Sørg for, at hver cotyledonprøve udsættes jævnt for TBO-opløsning ved forsigtigt at knipse rørene under inkubation. For at forhindre overfarvning med TBO (tidspunktet for farvningen er afgørende og kan variere for hver genotype), må du ikke behandle mere end seks rør, der indeholder prøver ad gangen. - Fjern TBO-farvningsopløsningen så grundigt som muligt, og vask derefter straks prøverne et par gange ved at tilsætte 1 ml frisk destilleret vand.
- 10 dage efter spiring skal du omhyggeligt vælge og skære en af cotyledonerne ud af de enkelte frøplanter, der vokser ensartet med andre frøplanter på pladen for at begrænse variabiliteten.
- Billedbehandling og dataanalyse
- Tag et mikroskopglas, og tilsæt en dråbe 15% glycerol (~ 50 μL). Placer cotyledonen med den abaxiale side op i 15% glycerol på diaset ved hjælp af fine tang. Dæk det derefter forsigtigt med et dæksel, så eventuelle dannede luftbobler kan fjernes fra prøven.
- Forestil dig den abaxiale side af cotyledonepidermis ved hjælp af et brightfield-mikroskop (figur 1 og figur 2), og undersøg derefter den epidermale fænotype ved at tælle antallet af stomata og andre epidermale celletyper.
- For hver genotype beregnes den epidermale fænotype ved hjælp af følgende formler beskrevet af Jangra et al.17:
Stomatalindeks (%) = (Antal stomata/Samlet antal epidermale celler) × 100
Stomatal massefylde (mm−2) = Antal stomata/areal (mm2)
BEMÆRK: Afbild mindst otte kimblade (N = 8) for hver genotype, og dokumentér epidermalfænotypen for hver genotype ved at sammenligne den med fænotypen af vildtypeplanten og/eller transgene planter, der udtrykker et kemisk inducerbart transgen dyrket uden inducer.
2. Bioassays for stomatale peptider
BEMÆRK: Proceduren for bioassays er vist i figur 3.
- Frøsterilisering og vækstbetingelser
- Steriliser ~ 25 frø til hver behandling som ovenfor, og så ca. halvdelen af frøene på hver af to 1/2 MS agarplader i en laminar strømningshætte.
BEMÆRK: Brug genotypen med høje og / eller lave epidermale celler (f.eks. epf22) i stedet for at bruge en vildtypebaggrund (f.eks. Col-0) til let at detektere peptidernes biologiske aktiviteter på epidermal cellemønster og differentiering (figur 4). - Stratificere frøene i 3 dage ved 4 °C i mørke.
- Tag hver af de to plader ud med ~ 10 timers mellemrum, og inkuber frøene på plader ved 22 ° C under 120 μmol · m-2 · s-1 lys med en fotoperiode på 16 timers lys og 8 timers mørke i 1 dag.
- Steriliser ~ 25 frø til hver behandling som ovenfor, og så ca. halvdelen af frøene på hver af to 1/2 MS agarplader i en laminar strømningshætte.
- Peptidbehandling og billeddannelse
- I en laminær strømningshætte transplanteres omhyggeligt 10-12 en dag gamle Arabidopsis-frøplanter fra hver af de to forberedte plader i en 24-brøndplade indeholdende 1,5 ml 1/2 MS flydende medium i hver brønd (~ 20 frøplanter pr. Brønd).
BEMÆRK: Tidspunktet for peptidbehandlingen af frøplanterne er afgørende for de fænotypiske resultater af peptidbehandlingen, så forbered frøene på to separate plader for at opnå to forskellige frøplanteudviklingsstadier til behandlingen. - Tilsæt enten en buffer alene (50 mM Tris-HCl [pH 8,0]) eller to forskellige koncentrationer af peptidet (typisk 1 μM og 2,5 μM peptid i 50 mM Tris-HCl [pH 8,0]) til hver brønd, der indeholder ~ 20 en dag gamle Arabidopsis-frøplanter spiret på 1/2 MS agarplader.
BEMÆRK: Fjern peptidopløsningsallikkvoterne fra en fryser, og opbevar dem på RT i et par minutter før behandlingen. Peptider, der opbevares i en fryser ved -80 °C, er stabile i et par år, men fryse-optøningscyklusser bør undgås ved at opbevare peptidopløsningen i små alikvoter. - Efter forsigtigt at have blandet kimplanterne med en buffer alene eller en peptidopløsning ved hjælp af en pipette, forsegles pladen med mikroporebånd. Analysepladen inkuberes under langvarige dagforhold (16 timers fotoperiode, 120 μmol·m−2·s−1 lys) i 5-7 dage ved 22 °C.
BEMÆRK: Undgå, at frøplanterne vokser for tæt sammen, så hver frøplante kan have jævn eksponering for peptidopløsningen. Drej forsigtigt pladen i 2-3 timer, før du inkuberer pladen i et vækstkammer for at øge luftningen. - Overfør hver frøplante fra brønden, der indeholder enten buffer alene eller peptid på et dækglas, og dissekere plantens cotyledon. Placer den abaxiale side af cotyledonen op ved hjælp af tang, og skær den i små stykker.
- Tag et andet rent mikroskopglas, og læg en dråbe propidiumiodidopløsning (~ 25 μL, 2 mg / ml i H2O).
- Placer et af de små stykker cotyledon i en dråbe propidiumiodidopløsning ved hjælp af tang, og læg forsigtigt dæksedlen. Påfør yderligere propidiumiodidopløsning på kanten af dæksedlen for at fjerne eventuelle luftbobler, der er dannet.
- Billede den abaxiale side af cotyledonen ved hjælp af et konfokalmikroskop, og sammenlign billederne med billederne fra frøplanter dyrket i 1/2 MS medium indeholdende buffer kun.
BEMÆRK: Billederne vist i figur 4 blev taget fra vildtype Col-0 eller epf22,5 frøplanter, der kun blev behandlet med buffer (figur 4A, B) eller to batcher EPF2-peptidopløsning (figur 4C-F) og blev opbevaret ved -80 °C over 1 år.
- I en laminær strømningshætte transplanteres omhyggeligt 10-12 en dag gamle Arabidopsis-frøplanter fra hver af de to forberedte plader i en 24-brøndplade indeholdende 1,5 ml 1/2 MS flydende medium i hver brønd (~ 20 frøplanter pr. Brønd).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Forskellige transgene stomatale planter og mutanter, der vides at have mindre eller mere stomatal tæthed og klyngedannelse (epf2 2,5, epf1 epf2 2,5, tmm12, en STOMAGEN-tavs linje4 og transgene linjer, der bærer den østradiol-inducerbare Est::EPF1 eller Est::EPF2 overekspressionskonstruktion7 ) blev brugt til at demonstrere effektiviteten af de to fænotypiske analyser, der præsenteres her, og som havde til formål at identificere og karakterisere de gener, der spiller en rolle i stomatal udvikling og mønster. For at producere epidermisbilleder af høj kvalitet uden behov for epidermale peelinger til at kvantificere de forskellige typer epidermale celler til analyse, er det afgørende at forudjustere prøvefarvningstiden med TBO for hver genotype, da hver enkelt kan have forskellige epidermale fænotyper sammenlignet med vildtypekontrollen (Col-0) (figur 1A og figur 2A). Baseret på erfaring kræver genotyper med færre stomata længere farvningstider med TBO (figur 1B og figur 2D, E), mens genotyper med mere stomata og klyngedannelse kræver kortere farvningstider (figur 1C og figur 2B, C). Da varierende mængder korrekt foldede peptider i den samlede peptidopløsning kan maskere peptidernes biologiske aktivitet i stomatal udvikling, er det god praksis at anvende yderligere, højere samlede koncentrationer af peptidopløsningen (f.eks. 2,5 μM EPF2) samt genotyper, der har mindre eller flere stomatale fænotyper (f.eks. epf2) til bioassays. Aktiviteten af EPF2-peptider, som har en rolle i at hæmme stomatal initiering, blev let detekteret ved anvendelse af epf2-mutanter med flere epidermale celler end Col-0, selvom visse batcher af de fremstillede EPF2-peptider havde mindre mængder af peptidets bioaktive former (fx EPF2-peptidopløsningsbatch 1 i figur 4).
Figur 1: Effekten af inkubationstiden med TBO på de genotyper, der udviser forskellige epidermale fænotyper. Abaxiale cotyledonbilleder fra 10 dage gamle frøplanter af tre Arabidopsis-genotyper: (A) vildtype (Col-0), (B) en STOMAGEN-tavs linje (STOMAGEN-ami) og (C) epf1 epf2-mutanter. Col-0 repræsenterer vildtypen Arabidopsis-kontrol, og den STOMAGEN-tavse linje og epf1 epf2-mutanterne repræsenterer genotyperne med henholdsvis lavt og højt antal stomata. Billederne blev taget ved hjælp af et omvendt mikroskop med en 20x objektiv linse (0,35 mm2 synsfelt). Kvaliteten af billederne varierede, selvom alle cotyledonprøverne fra de forskellige genotyper blev farvet med TBO (0,5% TBO i H 2 O) i samme tid (2min) før billeddannelse. For at opnå velfarvede billeder til analyse er det derfor vigtigt at forudbestemme den passende TBO-farvningstid for hver genotype. Skalabjælke = 50 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: TBO-farvede epidermisbilleder uden brug af epidermale peelinger til kvantitativ analyse. Repræsentative epidermisbilleder af kimblade fra 10 dage gamle frøplanter af (A) vildtype (Col-0), (B) tmm og (C,D) transgene linjer, der bærer en østradiol-inducerbar EPF2 (Est::EPF2) eller (E) EPF1 overekspressionskonstruktion (Est::EPF1) kan anvendes til kvantitativ analyse af epidermalfænotypen. En cotyledon i en fikseringsopløsning i over 3 år blev brugt til at tage billedet præsenteret i (E). Billederne blev taget ved hjælp af et omvendt mikroskop med en 20x objektiv linse (0,35 mm2 synsfelt). Cellerne blev skitseret ved TBO-farvning, og halvdelen af bredden af billederne i fuld størrelse præsenteres til visning. Skalabjælke = 50 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Procedure for bioassays . (A) Frøene sås på to 1/2 MS agarplader og tages ud med 10 timers mellemrum. (B) De 1 dag gamle Arabidopsis-frøplanter transplanteres til plader med 24 brønde indeholdende 1/2 MS-medium med enten mock eller to forskellige peptidkoncentrationer. (C) Efter 5-7 dage er frøplanterne klar til billeddannelse for at bestemme peptidernes biologiske aktivitet i stomatal udvikling og mønster. (D) En cotyledon skive anbringes i en dråbe propidiumiodidopløsning på et mikroskopglas til billeddannelse. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Konfokal mikroskopi af den abaxiale epidermis af Arabidopsis-cotyledoner efter peptidbehandling. Repræsentative konfokale billeder af (A) vildtype og (B) epf2 cotyledon epidermis dyrket i 6-7 dage i en bufferopløsning og en (C-F) epf2 cotyledon epidermis dyrket med to forskellige batcher af EPF2 peptider. Billederne blev taget ved hjælp af et konfokalmikroskop ved hjælp af en 40x objektiv linse (excitation på 561 nm og et 561 nm langpasemissionsfilter) for at fange propidiumiodidfarvningen og visualisere cellekonturerne. Hver EPF2-peptidopløsning, der fremstilles, har forskellige mængder korrekt foldede (bioaktive) og fejlfoldede (inaktive) former af peptiderne. Til den indledende screening af peptider med en potentiel rolle i stomatal udvikling anbefales det derfor at anvende to forskellige koncentrationer af de samlede peptidopløsninger som angivet for bioassays. Skalabjælke = 30 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De to fænotypiske analysemetoder til identifikation og karakterisering af de gener, der styrer stomatal mønster og differentiering, der præsenteres her, er praktiske og pålidelige assays, da protokollerne ikke kræver brug af epidermale skræl og specialudstyr (som er tidskrævende og kræver særlig træning til prøveforberedelse), men producerer billeder af høj kvalitet til kvantitativ analyse af epidermale fænotyper.
En begrænsning af denne teknik til fænotypisk analyse ved hjælp af TBO-farvede Arabidopsis-cotyledoner er, at opnåelse af billeder af høj kvalitet med visuel kontrast til forskellige epidermale celletyper afhænger af farvningstiden og vævets unikke egenskaber, som kan være både artsafhængige og genotypeafhængige (figur 1)18 . Andre fænotypemetoder til at observere epidermale celler ved hjælp af epidermale peelinger har de samme udfordringer, og de kræver også mere tid og særlig træning. Vanskeligheder med at opnå korrekt farvede epidermisbilleder, der er tilstrækkelige til dataanalyse, kan undgås ved at farve cotyledoner fra genotyper med færre stomata i længere perioder og prøver fra genotyper med mere stomata i kortere perioder. Farvningstiden for hver genotype kan også justeres ved først at kontrollere kun nogle få prøver for at optimere farvningstiden for genotyper med lignende epidermale fænotyper.
At opnå en tilstrækkelig mængde velfoldede bioaktive peptider, især cysteinrige peptider (som er ligander, der har forskellige funktioner til styring af planteudvikling, herunder stomatal mønster), har været en udfordring 1,2,3,4,5,6,19,20,21,22,23 . Selvom der genereres bioaktive peptider, er screening af peptider, der har potentielle funktioner i specifikke biologiske processer, en anden udfordrende opgave, fordi de producerede bioaktive peptider ofte er en blanding af velfoldede, aktive og inaktive peptider. Dette papir præsenterer en effektiv bioassay-metode til at opdage og karakterisere potentielle stomatale peptider. Denne metode har haft succes med at identificere forskellige vigtige peptider, der styrer forskellige aspekter af stomatal udvikling i Arabidopsis, samt græsset Brachypodium 3,4,7,17. Den største begrænsning af denne teknik er imidlertid variabiliteten i fænotypiske reaktioner, som sandsynligvis opstår på grund af brugen af kimplanter med lidt forskellige udviklingsstadier og peptidopløsninger indeholdende forskellige mængder bioaktive peptider. Tidlige forsøg på denne metode involverede placering af vildtypefrø direkte i brøndene på en plade indeholdende en peptidopløsning efter stratificering. Uden brug af genotyper, der har mere og / eller mindre epidermale celler (f.eks. epf2 2, figur 4) og 1 dag gamle Arabidopsis-frøplanter spiret på 1/2 MS agarplader, er et lavere antal frøplanter i stand til at vokse og vise klare fænotypiske reaktioner efter peptidapplikationen. I denne protokol blev variabilitetsproblemet løst ved at bruge ~ 20 en dag gamle Arabidopsis-frøplanter med to forskellige udviklingsstadier og ved at bruge to forskellige koncentrationer af peptidopløsning (1 μM og 2,5 μM).
De epidermale fænotyper af de peptidbehandlede prøver kan også analyseres ved den første fænotypiske analysemetode præsenteret under anvendelse af TBO-farvede prøver. Denne metode giver mulighed for relativt let kvantitativ fænotypisk analyse, fordi et relativt stort område af hver prøve kan analyseres. Derudover giver denne metode fleksibilitet i prøveforberedelsen efter høst af prøver tilberedt under de samme betingelser for billeddannelse. Imidlertid er billederne taget ved denne metode generelt ikke af højeste kvalitet. På den anden side giver konfokal billeddannelse efter propidiumiodidfarvning billeder af højere kvalitet med epidermale detaljer. Denne metode tillader dog kun, at der fokuseres på et lille område af væv til analyse. Derudover kan kun et vist antal af de fremstillede levende væv analyseres på én gang.
Afslutningsvis kan den fænotypiske analyse, der præsenteres her, bruges til hurtig og effektiv undersøgelse af de potentielle gener, der styrer stomatal mønster og differentiering, hvilket forbedrer forståelsen af mekanismerne for stomatal udvikling og peptidfunktion. Derudover kan denne bioassayprotokol bruges til at identificere andre små molekyler, der har en rolle i epidermal vævsmønster og som en indledende screeningsmetode til bestemmelse af strukturen af velfoldede bioaktive peptider.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Der blev ikke erklæret interessekonflikter.
Acknowledgments
Denne forskning blev finansieret gennem Natural Resources and Engineering Research Council of Canada (NSERC) Discovery-programmet og Concordia University. K.B. støttes af National Overseas Scholarship fra Indien.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18 mm x 18 mm cover slip | VWR | 16004-326 | |
| 24-well sterile plates with lid | VWR | CA62406-183 | |
| 3M Micropore surgical tape | Fisher Scientific | 19-027-761 | Microporous surgical paper tape used to seal MS plates |
| 76 x 26 mm Microscope slide | TLG | GEW90-2575-03 | |
| Acetic acid, ≥99.8% | Fisher Scientific | A38-212 | |
| Agar | BioShop | AGR001.1 | |
| Bleech | Household bleach (e.g., Clorox) | ||
| Confocal microscope | Nikon | Nikon C2 operated by NIS-Elements | |
| Ethanol | Greenfield | P210EAAN | |
| FIJI | Open-srouce | (Fiji Is Just) ImageJ v2.1/1.5.3j | Downloaded from https://imagej.net/software/fiji/ |
| Forceps | Sigma-Aldrich | F6521 | |
| Gamborg's vitamin mixture | Cassson Labs | GBL01-100ML | Store at 4 °C |
| Glycerol | Fisher Scientific | G33-4 | |
| Growth chambers | Conviron, model E15 | 16h light cycle, set at 21°C with a light intensity of 120 µmol·m-2·s-1. | |
| Lights | HD Supply | 25272 | Fluorescent lights in growth chambers, Sylvania F72T12/CW/VHO 72"T12 VHO 4200K |
| Microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 14-222-155 | Tubes in which Arabidopsis thaliana seeds are placed to perform sterilization |
| Microscope | Nikon | Nikon Eclipse TiE equipped with a DsRi2 digital camera | |
| Murashige and Skoog basal salts | Cassson Labs | MSP01-1LT | Store at 4 °C |
| Petri Dish 100 mm x 20 mm | Fisher Scientific | 08-757-11Z | Petri dishes in which MS media is poured for the purpose of growing Arabidopsis thaliana |
| Propidium Iodide | VWR | 39139-064 | |
| Scalpel | Fisher Scientific | 08-916-5A | |
| Sucrose | BioShop | SUC700.5 | |
| Toluidine blue O | Sigma-Aldrich | T3260-5G | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-100ML | |
| β-Estradiol | Sigma-Aldrich | E2758 |
References
- Hara, K., Kajita, R., Torii, K. U., Bergmann, D. C., Kakimoto, T. The secretory peptide gene EPF1 enforces the stomatal one-cell-spacing rule. Genes & Development. 21 (14), 1720-1725 (2007).
- Hara, K., et al. Epidermal cell density is autoregulated via a secretory peptide, EPIDERMAL PATTERNING FACTOR 2 in Arabidopsis leaves. Plant & Cell Physiology. 50 (6), 1019-1031 (2009).
- Kondo, T., et al. Stomatal density is controlled by a mesophyll-derived signaling molecule. Plant & Cell Physiology. 51 (1), 1-8 (2010).
- Sugano, S. S., et al. Stomagen positively regulates stomatal density in Arabidopsis. Nature. 463 (7278), 241-244 (2010).
- Hunt, L., Gray, J. E. The signaling peptide EPF2 controls asymmetric cell divisions during stomatal development. Current Biology. 19 (10), 864-869 (2009).
- Hunt, L., Bailey, K. J., Gray, J. E. The signalling peptide EPFL9 is a positive regulator of stomatal development. New Phytologist. 186 (3), 609-614 (2010).
- Lee, J. S., et al. Direct interaction of ligand-receptor pairs specifying stomatal patterning. Genes & Development. 26 (2), 126-136 (2012).
- Shpak, E. D., McAbee, J. M., Pillitteri, L. J., Torii, K. U. Stomatal patterning and differentiation by synergistic interactions of receptor kinases. Science. 309 (5732), 290-293 (2005).
- Nadeau, J. A., Sack, F. D. Control of stomatal distribution on the Arabidopsis leaf surface. Science. 296 (5573), 1697-1700 (2002).
- Meng, X., et al. Differential function of Arabidopsis SERK family receptor-like kinases in stomatal patterning. Current Biology. 25 (18), 2361-2372 (2015).
- Lampard, G. R., Macalister, C. A., Bergmann, D. C. Arabidopsis stomatal initiation is controlled by MAPK-mediated regulation of the bHLH SPEECHLESS. Science. 322 (5904), 1113-1116 (2008).
- Yang, M., Sack, F. D. The too many mouths and four lips mutations affect stomatal production in Arabidopsis. The Plant Cell. 7 (12), 2227-2239 (1995).
- Theunissen, J. D. An improved method for studying grass leaf epidermis. Stain Technology. 64 (5), 239-242 (1989).
- Venkata, B. P., et al. crw1--A novel maize mutant highly susceptible to foliar damage by the western corn rootworm beetle. PLoS One. 8 (8), 71296 (2013).
- Tucker, M. R., et al. Somatic small RNA pathways promote the mitotic events of megagametogenesis during female reproductive development in Arabidopsis. Development. 139 (8), 1399-1404 (2012).
- Ohki, S., Takeuchi, M., Mori, M. The NMR structure of stomagen reveals the basis of stomatal density regulation by plant peptide hormones. Nature Communications. 2, 512 (2011).
- Jangra, R., et al. Duplicated antagonistic EPF peptides optimize grass stomatal initiation. Development. 148 (16), (2021).
- Zhao, C., Craig, J. C., Petzold, H. E., Dickerman, A. W., Beers, E. P. The xylem and phloem transcriptomes from secondary tissues of the Arabidopsis root-hypocotyl. Plant Physiology. 138 (2), 803-818 (2005).
- Uchida, N., et al. Regulation of inflorescence architecture by intertissue layer ligand-receptor communication between endodermis and phloem. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (16), 6337-6342 (2012).
- Tameshige, T., et al. A secreted peptide and its receptors shape the auxin response pattern and leaf margin morphogenesis. Current Biology. 26 (18), 2478-2485 (2016).
- Abrash, E. B., Davies, K. A., Bergmann, D. C. Generation of signaling specificity in Arabidopsis by spatially restricted buffering of ligand-receptor interactions. The Plant Cell. 23 (8), 2864-2879 (2011).
- Uchida, N., Tasaka, M. Regulation of plant vascular stem cells by endodermis-derived EPFL-family peptide hormones and phloem-expressed ERECTA-family receptor kinases. Journal of Experimental Botany. 64 (17), 5335-5343 (2013).
- Kosentka, P. Z., Overholt, A., Maradiaga, R., Mitoubsi, O., Shpak, E. D. EPFL Signals in the boundary region of the SAM restrict its size and promote leaf initiation. Plant Physiology. 179 (1), 265-279 (2019).
