Summary
In dieser Arbeit werden zwei Phänotypisierungsmethoden ohne die Verwendung von epidermalen Peelings beschrieben, um die Gene zu charakterisieren, die die Entwicklung der Stomata steuern. Die erste Methode zeigt, wie ein stomataler Phänotyp unter Verwendung einer Toluidinblau-O-gefärbten Pflanzenepidermis analysiert werden kann. Die zweite Methode beschreibt, wie man stomatale Liganden identifiziert und ihre biologischen Aktivitäten überwacht.
Abstract
Stomata sind kleine Poren auf der Oberfläche von Landpflanzen, die am Gasaustausch und der Freisetzung von Wasserdampf beteiligt sind, und ihre Funktion ist entscheidend für die Produktivität und das Überleben von Pflanzen. Daher hat das Verständnis der Mechanismen, durch die sich Stomata entwickeln und mustern, einen enormen agronomischen Wert. In dieser Arbeit werden zwei phänotypische Methoden unter Verwendung von Arabidopsis-Keimblättern beschrieben, die zur Charakterisierung der Gene verwendet werden können, die die Entwicklung und Musterung der Stomata steuern. Zunächst werden Verfahren zur Analyse der stomatalen Phänotypen unter Verwendung von Toluidinblau O-gefärbten Keimblättern vorgestellt. Diese Methode ist schnell und zuverlässig und erfordert keine Verwendung von epidermalen Peelings, die häufig für phänotypische Analysen verwendet werden, aber eine spezielle Schulung erfordern. Aufgrund des Vorhandenseins mehrerer Cysteinreste war die Identifizierung und Erzeugung von bioaktiven EPF-Peptiden, die eine Rolle bei der Entwicklung der Stomata spielen, eine Herausforderung. Als zweites wird ein Verfahren vorgestellt, das zur Identifizierung von stomatalen Liganden und zur Überwachung ihrer biologischen Aktivität durch Bioassays verwendet wird. Der Hauptvorteil dieser Methode besteht darin, dass sie relativ einfach reproduzierbare Daten liefert und gleichzeitig die Menge an Peptidlösung und die Zeit reduziert, die erforderlich ist, um die Rolle der Peptide bei der Kontrolle der stomatalen Musterung und Entwicklung zu charakterisieren. Insgesamt verbessern diese gut konzipierten Protokolle die Effizienz bei der Untersuchung der potenziellen stomatalen Regulatoren, einschließlich Cystein-reicher sekretorischer Peptide, die für ihre Aktivität hochkomplexe Strukturen benötigen.
Introduction
Die richtige Strukturierung und Differenzierung der pflanzlichen Stomata ist entscheidend für ihre Funktion in zwei grundlegenden biologischen Prozessen, Photosynthese und Transpiration, und wird durch EPF-Peptid-Signalwege verstärkt. In Arabidopsis kontrollieren drei sezernierte Cystein-reiche Peptide, EPF1, EPF2 und STOMAGEN/EPFL9, verschiedene Aspekte der stomatalen Entwicklung und werden von Zelloberflächenrezeptorkomponenten wahrgenommen, einschließlich Rezeptorkinasen der ERECTA-Familie (ER, ERL1 und ERL2), SERKs und TMM 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . Diese Erkennung führt dann zur Herunterregulierung der Transkriptionsfaktoren, die die stomatale Differenzierung durch einen MAPK-abhängigen Prozess fördern11. Die Entdeckung dieser stomatalen Kerngene wird in erster Linie durch das phänotypische Screening von Mutanten mit epidermalen Defekten erreicht. In dieser Arbeit werden relativ einfache und effiziente Phänotypisierungsmethoden zur Visualisierung der Stomata und anderer Epidermiszellen vorgestellt, die zur Identifizierung und Charakterisierung der potenziellen Gene erforderlich sind, die die stomatale Musterung und Differenzierung steuern.
Die Beobachtung der Details der Pflanzenepidermis wurde typischerweise durch die Verwendung von Epidermisschalen mit oder ohne Färbung mit einem Farbstoff wie Toluidinblau O (TBO) oder Safranin12,13,14 erreicht. Die größte Herausforderung dieser Methoden besteht jedoch darin, dass sie ein spezielles Training erfordern, um die Blattepidermis zu schälen, ohne das Gewebe zu zerreißen, und um die Musterdaten sorgfältig zu beobachten und zu analysieren, während die Bilder vermieden werden, die von verschiedenen Teilen des Blattes aufgenommen wurden. Chemische Behandlungen zur Reinigung der Gewebeproben mit Reagenzien wie Chloralhydrat-basierten Reinigungslösungen wurden auch häufig für eine Vielzahl von biologischen Materialien verwendet 8,15; Diese Behandlungen erzeugen zwar viele phänotypische Informationen, indem sie qualitativ hochwertige Bilder liefern, erfordern aber auch den Einsatz gefährlicher Chemikalien (z. B. Formaldehyd, Chloralhydrat). In diesem Artikel wird zunächst eine relativ einfache und bequeme Phänotypisierungsmethode vorgestellt, die Bilder erzeugt, die für eine quantitative Analyse ausreichen, aber nicht die Verwendung gefährlicher Chemikalien und epidermaler Blattschalen für die Probenvorbereitung erfordert. Eine TBO-gefärbte Keimblattepidermis ist auch ideal für die Untersuchung der stomatalen Entwicklung, da das Fehlen von Trichomen und der geringere Entwicklungsgradient in Keimblättern eine einfache und handhabbare Interpretation der epidermalen Phänotypen ermöglichen.
Stomatale EPF-Peptide gehören zur Gruppe der pflanzenspezifischen, cysteinreichen Peptide, die relativ große reife Größen und intramolekulare Disulfidbindungen zwischen konservierten Cysteinresten aufweisen. Die korrekte Konformationsfaltung ist entscheidend für ihre biologische Funktion, aber Cystein-reiche Peptide, die entweder durch chemische Synthese oder ein heterologes Rekombinationssystem hergestellt werden, können inaktiv sein und sind eine Mischung aus richtig gefalteten und ungefalteten Peptiden 3,7,16. Daher war das Screening von bioaktiven Peptiden, die eine Rolle bei der Kontrolle der stomatalen Entwicklung spielen, eine sehr herausfordernde Aufgabe. Dieses Manuskript beschreibt zusätzlich einen Bioassay zur besseren Identifizierung und Charakterisierung von bioaktiven stomatalen Peptiden. Bei dieser Methode werden Arabidopsis-Sämlinge 6-7 Tage lang in einer Multi-Well-Platte gezüchtet, die Medien mit und ohne potenzielle Peptide enthält. Dann wird die Keimblattepidermis mit einem konfokalen Mikroskop sichtbar gemacht. Um die biologische Aktivität potenzieller Peptide in der Entwicklung der Stomata deutlich sichtbar zu machen, werden im Allgemeinen zusätzlich zur Wildtyp-Arabidopsis-Kontrolle (Col-0) zusätzlich zur Wildtyp-Arabidopsis-Kontrolle (Col-0) die Wildtyp-Arabidopsis-Kontrolle (Col-0) verwendet, die mehr Epidermiszellen produziert.
Insgesamt können die beiden hier vorgestellten Protokolle für die schnelle und effiziente Beurteilung verschiedener epidermaler Phänotypen und für das Screening kleiner Peptide und Hormone verwendet werden, die eine Rolle bei der Kontrolle der stomatalen Musterung und Entwicklung spielen.
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Protocol
1. Färbung von Arabidopsis-Keimblättern mit TBO
- Saatgutsterilisation und Wachstumsbedingungen
- Sterilisieren Sie ~ 30 Arabidopsis-Samen pro Genotyp in einem Mikrozentrifugenröhrchen, indem Sie 1 ml einer Samensterilisationslösung (33% handelsübliches Bleichmittel, 0,1% Triton X-100) hinzufügen und 10-12 Minuten lang bei Raumtemperatur (RT) vorsichtig schaukeln.
HINWEIS: Sterilisieren Sie ~ 30 Samen des Wildtyp-Arabidopsis-Beitritts Columbia (Col-0) und/oder ~ 60 Samen transgener Pflanzen, die ein chemisch induzierbares Gen (z. B. Est::EPF27) tragen, um transgene Sämlinge zu verwenden, die auf 1/2 Murashige- und Skoog (MS)-Platten (2,16 g/L mit 0,8% Agar [w/v]) ohne Induktor (z. B. β-Östradiol) als Kontrollen gezüchtet wurden (Abbildung 1 und Abbildung 2). - Entfernen Sie die Sterilisationslösung, waschen Sie die Samen viermal mit 1 ml sterilem Wasser in einer Laminar-Flow-Haube und resuspendieren Sie sie in ~200 μl sterilem 0,1%igem Agar.
- Säen Sie ~30 Samen pro Genotyp auf 1/2 MS-Agarplatten oder 1/2 MS-Agarplatten, die einen Induktor (z. B. 10 μM β-Östradiol) für die chemische Induktion des Transgens (z. B. Est::EPF27) mit einer Pipette enthalten, und versiegeln Sie sie mit Mikroporenband.
HINWEIS: Die Samen müssen gleichmäßig auf dem Teller verteilt werden, um zu vermeiden, dass sie in unmittelbarer Nähe platziert werden, da dies verhindert, dass die Sämlinge gleichmäßig wachsen. - Schichten Sie die Samen, indem Sie die Platten 3-5 Tage lang bei 4 °C ohne Licht platzieren, um die Keimung zu synchronisieren.
- Nach der Schichtung werden die Platten in einer Wachstumskammer bei 22 °C unter 120 μmol·m−2·s−1 Licht mit einer Photoperiode von 16 h Licht und 8 h Dunkelheit für 10 Tage inkubiert.
- Sterilisieren Sie ~ 30 Arabidopsis-Samen pro Genotyp in einem Mikrozentrifugenröhrchen, indem Sie 1 ml einer Samensterilisationslösung (33% handelsübliches Bleichmittel, 0,1% Triton X-100) hinzufügen und 10-12 Minuten lang bei Raumtemperatur (RT) vorsichtig schaukeln.
- Probenahme und TBO-Färbung von Arabidopsis-Keimblättern
- Wählen Sie 10 Tage nach der Keimung sorgfältig eines der Keimblätter aus den einzelnen Sämlingen aus und schneiden Sie sie aus, die gleichmäßig mit anderen Sämlingen auf dem Teller wachsen, um die Variabilität zu begrenzen.
HINWEIS: Keimblätter werden von 10 Tage alten Sämlingen entnommen, da sie keine Trichome und unreife Epidermiszellen aufweisen, was die Interpretation der epidermalen Phänotypen vereinfacht. - Jedes Keimblatt wird mit einer Pinzette in ein Mikrozentrifugenröhrchen gegeben, das 1 ml einer Fixierlösung (9:1 Ethanol zu Essigsäure) enthält, und die Probe mindestens über Nacht und bei Raumtemperatur in der Fixierlösung belassen.
HINWEIS: In diesem Zustand können die Proben dann bis zu einigen Jahren gelagert werden. Das Bild Abbildung 2E wurde aus einer Keimblattprobe entnommen, die über 3 Jahre in Fixierlösung gelagert wurde. Es ist wichtig, das Keimblatt unmittelbar nach dem Schneiden in einer Fixierlösung aufzubewahren und nicht mehr als fünf Keimblätter in jedes Mikrozentrifugenröhrchen zu legen, um später eine homogene Probenvorbereitung zu gewährleisten. - Entfernen Sie die Fixierlösung und fügen Sie 1 ml 70% Ethanol hinzu. Nachdem Sie das Röhrchen ein paar Mal umgedreht haben, lassen Sie das Röhrchen mit den Proben ~ 30 Minuten lang bei RT.
- Wiederholen Sie Schritt 1.2.3 mit 1 ml 50% Ethanol und dann 20% Ethanol.
- Ersetzen Sie die 1 ml 20% Ethanol durch 1 ml destilliertes Wasser und lassen Sie dann das Röhrchen mit den Keimblattproben für ~ 30 Minuten stehen, nachdem Sie das Röhrchen einige Male umgedreht haben.
HINWEIS: Die Proben können länger als 24 Stunden in destilliertem Wasser verbleiben, dies wird jedoch nicht empfohlen, um qualitativ hochwertige Bilder (gut gefärbte Bilder für verschiedene epidermale Zelltypen) für die quantitative Analyse zu erhalten. - Entfernen Sie das gesamte destillierte Wasser aus dem Röhrchen. Fügen Sie dann sofort ~200 μl TBO-Färbelösung (0,5% TBO in H 2 O, filtriert) für ~2min hinzu.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass jede Keimblattprobe gleichmäßig der TBO-Lösung ausgesetzt ist, indem Sie die Röhrchen während der Inkubation vorsichtig schnippen. Um eine Überfärbung mit TBO zu vermeiden (der Zeitpunkt der Färbung ist wichtig und kann für jeden Genotyp variabel sein), verarbeiten Sie nicht mehr als sechs Röhrchen mit Proben gleichzeitig. - Entfernen Sie die TBO-Färbelösung so gründlich wie möglich und waschen Sie die Proben dann sofort einige Male, indem Sie 1 ml frisches destilliertes Wasser hinzufügen.
- Wählen Sie 10 Tage nach der Keimung sorgfältig eines der Keimblätter aus den einzelnen Sämlingen aus und schneiden Sie sie aus, die gleichmäßig mit anderen Sämlingen auf dem Teller wachsen, um die Variabilität zu begrenzen.
- Bildgebung und Datenanalyse
- Nehmen Sie einen Objektträger und fügen Sie einen Tropfen 15% Glycerin (~50 μl) hinzu. Legen Sie das Keimblatt mit der abaxialen Seite nach oben mit einer feinen Pinzette in 15% Glycerin auf den Objektträger. Decken Sie es dann vorsichtig mit einem Deckglas ab, damit gebildete Luftblasen aus der Probe entfernt werden können.
- Stellen Sie die abaxiale Seite der Keimblattepidermis mit einem Hellfeldmikroskop dar (Abbildung 1 und Abbildung 2) und untersuchen Sie dann den epidermalen Phänotyp, indem Sie die Anzahl der Stomata und anderer epidermaler Zelltypen zählen.
- Berechnen Sie für jeden Genotyp den epidermalen Phänotyp mit den folgenden Formeln, die von Jangra et al.17 beschrieben werden:
Stomataindex (%) = (Anzahl der Stomata/Gesamtzahl der Epidermiszellen) × 100
Stomatadichte (mm−2) = Anzahl der Stomata/Fläche (mm 2)
ANMERKUNG: Stellen Sie mindestens acht Keimblätter (N = 8) für jeden Genotyp dar und dokumentieren Sie den epidermalen Phänotyp jedes Genotyps, indem Sie ihn mit dem Phänotyp der Wildtyppflanze und/oder transgenen Pflanzen vergleichen, die ein chemisch induzierbares Transgen exprimieren, das ohne Induktor gezüchtet wurde.
2. Bioassays für stomatale Peptide
HINWEIS: Das Verfahren für Bioassays ist in Abbildung 3 dargestellt.
- Saatgutsterilisation und Wachstumsbedingungen
- Sterilisieren Sie ~ 25 Samen für jede Behandlung wie oben beschrieben und säen Sie ungefähr die Hälfte der Samen auf jede der zwei 1/2 MS-Agarplatten in einer Laminar-Flow-Haube.
HINWEIS: Verwenden Sie den Genotyp mit hohen und/oder niedrigen Epidermiszellen (z. B. epf22), anstatt einen Wildtyp-Hintergrund (z. B. Col-0) zu verwenden, um die biologischen Aktivitäten der Peptide auf die epidermale Zellstrukturierung und -differenzierung leicht zu erkennen (Abbildung 4). - Die Samen 3 Tage bei 4 °C im Dunkeln schichten.
- Nehmen Sie jede der beiden Platten in Abständen von ~10 h heraus und inkubieren Sie die Samen auf Platten bei 22 °C unter 120 μmol·m−2·s−1 Licht mit einer Photoperiode von 16 h Licht und 8 h Dunkelheit für 1 Tag.
- Sterilisieren Sie ~ 25 Samen für jede Behandlung wie oben beschrieben und säen Sie ungefähr die Hälfte der Samen auf jede der zwei 1/2 MS-Agarplatten in einer Laminar-Flow-Haube.
- Peptidbehandlung und Bildgebung
- Verpflanzen Sie in einer Laminar-Flow-Haube vorsichtig 10-12 einen Tag alte Arabidopsis-Sämlinge von jeder der beiden vorbereiteten Platten in eine 24-Well-Platte, die 1,5 ml 1/2 MS flüssiges Medium in jeder Vertiefung enthält (~ 20 Sämlinge pro Vertiefung).
HINWEIS: Der Zeitpunkt der Peptidbehandlung für die Sämlinge ist entscheidend für die phänotypischen Ergebnisse der Peptidbehandlung, also bereiten Sie die Samen auf zwei separaten Tellern vor, um zwei verschiedene Entwicklungsstadien der Sämlinge für die Behandlung zu erhalten. - Geben Sie entweder einen Puffer allein (50 mM Tris-HCl [pH 8,0]) oder zwei verschiedene Konzentrationen des Peptids (typischerweise 1 μM und 2,5 μM Peptid in 50 mM Tris-HCl [pH 8,0]) in jede Vertiefung, die ~20 einen Tag alte Arabidopsis-Sämlinge enthält, die auf 1/2 MS-Agarplatten gekeimt wurden.
HINWEIS: Nehmen Sie die Peptidlösungsaliquote aus einem Gefrierschrank und bewahren Sie sie vor der Behandlung einige Minuten lang auf RT auf. Peptide, die in einem Gefrierschrank bei -80 °C gelagert werden, sind einige Jahre lang stabil, aber Frost-Tau-Zyklen sollten vermieden werden, indem die Peptidlösung in kleinen Aliquoten gelagert wird. - Nachdem Sie die Sämlinge vorsichtig mit einem Puffer allein oder einer Peptidlösung mit einer Pipette gemischt haben, verschließen Sie die Platte mit Mikroporenband. Inkubation der Assay-Platte unter Langzeitbedingungen (16 h Photoperiode, 120 μmol·m−2·s−1 Licht) für 5-7 Tage bei 22 °C.
HINWEIS: Verhindern Sie, dass die Sämlinge zu nahe beieinander wachsen, damit jeder Sämling der Peptidlösung ausgesetzt ist. Drehen Sie die Platte vorsichtig für 2-3 Stunden, bevor Sie die Platte in einer Wachstumskammer inkubieren, um die Belüftung zu erhöhen. - Übertragen Sie jeden Sämling aus der Vertiefung, die entweder Puffer allein oder Peptid enthält, auf einen Objektträger und sezieren Sie das Keimblatt des Sämlings. Legen Sie die abaxiale Seite des Keimblatts mit einer Pinzette nach oben und schneiden Sie sie in kleine Stücke.
- Nehmen Sie einen weiteren sauberen Objektträger und geben Sie einen Tropfen Propidiumiodidlösung (~25 μl, 2 mg/ml in H2O) darauf.
- Legen Sie eines der kleinen Keimblattstücke mit einer Pinzette in einen Tropfen Propidiumiodidlösung und legen Sie das Deckglas vorsichtig auf. Tragen Sie zusätzliche Propidiumiodidlösung auf den Rand des Deckglases auf, um gebildete Luftblasen zu entfernen.
- Bilden Sie die abaxiale Seite des Keimblatts mit einem konfokalen Mikroskop ab und vergleichen Sie die Bilder mit den Bildern von Sämlingen, die in 1/2 MS-Medium gezüchtet wurden, das nur Puffer enthält.
HINWEIS: Die in Abbildung 4 dargestellten Bilder wurden von Wildtyp-Keimlingen des Typs Col-0 oder epf22,5 aufgenommen, die nur mit Puffer (Abbildung 4A, B) oder zwei Chargen EPF2-Peptidlösung (Abbildung 4C-F) behandelt und bei -80 °C über 1 Jahr gelagert wurden.
- Verpflanzen Sie in einer Laminar-Flow-Haube vorsichtig 10-12 einen Tag alte Arabidopsis-Sämlinge von jeder der beiden vorbereiteten Platten in eine 24-Well-Platte, die 1,5 ml 1/2 MS flüssiges Medium in jeder Vertiefung enthält (~ 20 Sämlinge pro Vertiefung).
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Representative Results
Verschiedene stomatale transgene Pflanzen und Mutanten, von denen bekannt ist, dass sie weniger oder mehr stomatale Dichte und Clusterbildung aufweisen (epf2 2,5, epf1, epf22,5, tmm 12, eine STOMAGEN-stummgeschaltete Linie4, und transgene Linien, die das Estradiol-induzierbare Est::EPF1- oder Est::EPF2-Überexpressionskonstrukt 7 tragen; ) wurden verwendet, um die Wirksamkeit der beiden hier vorgestellten phänotypischen Analysen zu demonstrieren, die darauf abzielten, die Gene zu identifizieren und zu charakterisieren, die eine Rolle bei der Entwicklung und Musterung der Stomata spielen. Um qualitativ hochwertige Epidermisbilder zu erstellen, ohne dass epidermale Peelings erforderlich sind, um die verschiedenen Arten von Epidermiszellen für die Analyse zu quantifizieren, ist es wichtig, die Probenfärbezeit mit TBO für jeden Genotyp vorab einzustellen, da jeder Genotyp unterschiedliche epidermale Phänotypen aufweisen kann als der Wildtyp-Kontrolltyp (Col-0) (Abbildung 1A und Abbildung 2A). Erfahrungsgemäß erfordern Genotypen mit weniger Stomata längere Färbezeiten mit TBO (Abbildung 1B und Abbildung 2D,E), während Genotypen mit mehr Stomata und Clusterbildung kürzere Färbezeiten erfordern (Abbildung 1C und Abbildung 2B,C). Da unterschiedliche Mengen an richtig gefalteten Peptiden in der Gesamtpeptidlösung die biologische Aktivität der Peptide in der stomatalen Entwicklung maskieren können, empfiehlt es sich, zusätzliche, höhere Gesamtkonzentrationen der Peptidlösung (z. B. 2,5 μM EPF2) sowie Genotypen zu verwenden, die weniger oder mehr stomatale Phänotypen (z. B. EPF2) für die Bioassays aufweisen. Die Aktivität von EPF2-Peptiden, die eine Rolle bei der Hemmung der stomatalen Initiation spielen, wurde leicht durch die Verwendung von epf2-Mutanten mit mehr Epidermiszellen als Col-0 nachgewiesen, selbst wenn bestimmte Chargen der hergestellten EPF2-Peptide geringere Mengen der bioaktiven Formen des Peptids aufwiesen (z. B. EPF2-Peptidlösung Charge 1 in Abbildung 4).
Abbildung 1: Der Einfluss der Inkubationszeit mit TBO auf die Genotypen, die unterschiedliche epidermale Phänotypen aufweisen. Abaxiale Keimblattbilder von 10 Tage alten Sämlingen von drei Arabidopsis-Genotypen: (A) Wildtyp (Col-0), (B) eine STOMAGEN-stummgeschaltete Linie (STOMAGEN-ami) und (C) epf1-epf2-Mutanten. Col-0 repräsentiert die Wildtyp-Arabidopsis-Kontrolle, und die STOMAGEN-Stummschaltungslinie und die epf1-epf2-Mutanten repräsentieren die Genotypen mit niedriger bzw. hoher Anzahl von Stomata. Die Bilder wurden mit einem inversen Mikroskop mit einem 20-fach Objektiv (0,35 mm2 Gesichtsfeld) aufgenommen. Die Qualität der Bilder war variabel, obwohl alle Keimblattproben der verschiedenen Genotypen für die gleiche Zeit (2 min) vor der Bildgebung mit TBO (0,5% TBO in H2O) gefärbt wurden. Um gut gefärbte Bilder für die Analyse zu erhalten, ist es daher wichtig, die angemessene TBO-Färbezeit für jeden Genotyp im Voraus festzulegen. Maßstabsbalken = 50 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: TBO-gefärbte Epidermisbilder ohne Verwendung von Epidermis-Peelings für die quantitative Analyse. Für die quantitative Analyse des epidermalen Phänotyps können repräsentative Epidermisbilder von Keimblättern von 10 Tage alten Keimlingen von (A) Wildtyp (Col-0), (B) tmm und (C,D) transgenen Linien verwendet werden, die ein Estradiol-induzierbares EPF2 (Est::EPF2) oder (E) EPF1-Überexpressionskonstrukt (Est::EPF1) tragen. Ein Keimblatt in einer Fixierlösung wurde über 3 Jahre lang verwendet, um das in (E) dargestellte Bild aufzunehmen. Die Bilder wurden mit einem inversen Mikroskop mit einem 20-fach Objektiv (0,35 mm2 Gesichtsfeld) aufgenommen. Die Zellen wurden durch TBO-Färbung umrissen, und die Hälfte der Breite der Bilder in voller Größe wird zur Anzeige präsentiert. Maßstabsbalken = 50 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Verfahren für die Bioassays . (A) Die Samen werden auf zwei 1/2 MS-Agarplatten ausgesät und in Abständen von 10 Stunden entnommen. (B) Die 1 Tag alten Arabidopsis-Keimlinge werden auf 24-Well-Platten mit 1/2 MS-Medium mit entweder Schein- oder zwei verschiedenen Peptidkonzentrationen transplantiert. (C) Nach 5-7 Tagen sind die Keimlinge bereit für die Bildgebung, um die biologische Aktivität der Peptide bei der Entwicklung und Musterung der Stomata zu bestimmen. (D) Eine Keimblattscheibe wird zur Bildgebung in einen Tropfen Propidiumiodidlösung auf einen Objektträger gelegt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Konfokalmikroskopie der abaxialen Epidermis von Arabidopsis-Keimblättern nach Peptidbehandlung. Repräsentative konfokale Bilder von (A) Wildtyp- und (B) epf2-Keimblattepidermis, die 6-7 Tage lang in einer Pufferlösung gezüchtet wurde, und einer (C-F) epf2-Keimblattepidermis, die mit zwei verschiedenen Chargen von EPF2-Peptiden gezüchtet wurde. Die Bilder wurden mit einem konfokalen Mikroskop unter Verwendung einer 40-fachen Objektivlinse (Anregung von 561 nm und einem 561 nm Langpass-Emissionsfilter) aufgenommen, um die Propidiumiodid-Färbung zu erfassen und die Zellumrisse sichtbar zu machen. Jede hergestellte EPF2-Peptidlösung weist unterschiedliche Mengen an richtig gefalteten (bioaktiven) und fehlgefalteten (inaktiven) Formen der Peptide auf. Daher wird für das anfängliche Screening von Peptiden mit einer potenziellen Rolle bei der Entwicklung der Stomata empfohlen, zwei verschiedene Konzentrationen der gesamten Peptidlösungen zu verwenden, wie für die Bioassays angegeben. Maßstabsbalken = 30 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
Die beiden hier vorgestellten phänotypischen Analysemethoden zur Identifizierung und Charakterisierung der Gene, die die stomatale Musterung und Differenzierung steuern, sind praktische und zuverlässige Assays, da die Protokolle nicht die Verwendung von epidermalen Peelings und speziellen Geräten erfordern (die zeitaufwändig sind und eine spezielle Schulung für die Probenvorbereitung erfordern), aber qualitativ hochwertige Bilder für die quantitative Analyse von epidermalen Phänotypen erzeugen.
Eine Einschränkung dieser Technik für die phänotypische Analyse mit TBO-gefärbten Arabidopsis-Keimblättern besteht darin, dass die Gewinnung qualitativ hochwertiger Bilder mit visuellem Kontrast für verschiedene epidermale Zelltypen von der Färbezeit und den einzigartigen Eigenschaften des Gewebes abhängt, die sowohl speziesabhängig als auch genotypabhängig sein können (Abbildung 1)18 . Andere Phänotypisierungsmethoden zur Beobachtung von Epidermiszellen mit epidermalen Peelings haben die gleichen Herausforderungen und erfordern auch mehr Zeit und spezielles Training. Schwierigkeiten bei der Gewinnung von richtig gefärbten Epidermisbildern, die für die Datenanalyse ausreichen, können vermieden werden, indem Keimblätter von Genotypen mit weniger Spaltöffnungen für längere Zeiträume und Proben von Genotypen mit mehr Spaltöffnungen für kürzere Zeiträume gefärbt werden. Die Färbezeit für jeden Genotyp kann auch angepasst werden, indem zunächst nur wenige Proben überprüft werden, um die Färbezeit für Genotypen mit ähnlichen epidermalen Phänotypen zu optimieren.
Die Gewinnung einer ausreichenden Menge gut gefalteter bioaktiver Peptide, insbesondere Cystein-reicher Peptide (bei denen es sich um Liganden handelt, die verschiedene Funktionen bei der Steuerung der Pflanzenentwicklung haben, einschließlich der stomatalen Musterung), war eine Herausforderung 1,2,3,4,5,6,19,20,21,22,23 . Selbst wenn bioaktive Peptide erzeugt werden, ist das Screening von Peptiden, die potenzielle Funktionen in bestimmten biologischen Prozessen haben, eine weitere herausfordernde Aufgabe, da die produzierten bioaktiven Peptide oft eine Mischung aus gut gefalteten, aktiven und inaktiven Peptiden sind. In diesem Artikel wird eine effiziente Bioassay-Methode zur Entdeckung und Charakterisierung potenzieller stomataler Peptide vorgestellt. Mit dieser Methode konnten verschiedene wichtige Peptide identifiziert werden, die verschiedene Aspekte der stomatalen Entwicklung in Arabidopsis sowie im Gras Brachypodium 3,4,7,17 steuern. Die Haupteinschränkung dieser Technik ist jedoch die Variabilität der phänotypischen Reaktionen, die höchstwahrscheinlich auf die Verwendung von Sämlingen mit leicht unterschiedlichen Entwicklungsstadien und Peptidlösungen zurückzuführen ist, die unterschiedliche Mengen an bioaktiven Peptiden enthalten. Frühe Versuche mit dieser Methode beinhalteten die Platzierung von Wildtyp-Samen direkt in den Vertiefungen einer Platte, die nach der Schichtung eine Peptidlösung enthielt. Ohne die Verwendung von Genotypen, die mehr und/oder weniger Epidermiszellen aufweisen (z. B. epf2 2, Abbildung 4) und 1 Tag alte Arabidopsis-Keimlinge, die auf 1/2 MS-Agarplatten gekeimt wurden, kann eine geringere Anzahl von Sämlingen wachsen und zeigt nach der Peptidapplikation deutliche phänotypische Reaktionen. In diesem Protokoll wurde das Variabilitätsproblem durch die Verwendung von ~20 eintägigen Arabidopsis-Sämlingen mit zwei verschiedenen Entwicklungsstadien und durch die Verwendung von zwei verschiedenen Konzentrationen der Peptidlösung (1 μM und 2,5 μM) behoben.
Die epidermalen Phänotypen der peptidbehandelten Proben können auch mit der ersten phänotypischen Analysemethode analysiert werden, die unter Verwendung von TBO-gefärbten Proben vorgestellt wird. Diese Methode ermöglicht eine relativ einfache quantitative phänotypische Analyse, da ein relativ großer Bereich jeder Probe analysiert werden kann. Darüber hinaus bietet diese Methode Flexibilität bei der Probenvorbereitung nach der Entnahme von Proben, die unter den gleichen Bedingungen für die Bildgebung vorbereitet wurden. Die mit dieser Methode aufgenommenen Bilder sind jedoch im Allgemeinen nicht von höchster Qualität. Auf der anderen Seite liefert die konfokale Bildgebung nach Propidiumiodid-Färbung qualitativ hochwertigere Bilder mit epidermalen Details. Bei dieser Methode kann jedoch nur ein kleiner Bereich des Gewebes für die Analyse fokussiert werden. Darüber hinaus kann nur eine bestimmte Anzahl der präparierten lebenden Gewebe auf einmal analysiert werden.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die hier vorgestellte phänotypische Analyse für die schnelle und effektive Untersuchung der potentiellen Gene verwendet werden kann, die die stomatale Musterung und Differenzierung steuern, wodurch das Verständnis der Mechanismen der stomatalen Entwicklung und der Peptidfunktion verbessert wird. Darüber hinaus kann dieses Bioassay-Protokoll verwendet werden, um andere kleine Moleküle zu identifizieren, die eine Rolle bei der epidermalen Gewebestrukturierung spielen, und als erste Screening-Methode zur Bestimmung der Struktur von gut gefalteten bioaktiven Peptiden.
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Disclosures
Es wurden keine Interessenkonflikte festgestellt.
Acknowledgments
Diese Forschung wurde durch das Discovery-Programm des Natural Resources and Engineering Research Council of Canada (NSERC) und der Concordia University finanziert. K.B. wird durch das National Overseas Scholarship aus Indien unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18 mm x 18 mm cover slip | VWR | 16004-326 | |
| 24-well sterile plates with lid | VWR | CA62406-183 | |
| 3M Micropore surgical tape | Fisher Scientific | 19-027-761 | Microporous surgical paper tape used to seal MS plates |
| 76 x 26 mm Microscope slide | TLG | GEW90-2575-03 | |
| Acetic acid, ≥99.8% | Fisher Scientific | A38-212 | |
| Agar | BioShop | AGR001.1 | |
| Bleech | Household bleach (e.g., Clorox) | ||
| Confocal microscope | Nikon | Nikon C2 operated by NIS-Elements | |
| Ethanol | Greenfield | P210EAAN | |
| FIJI | Open-srouce | (Fiji Is Just) ImageJ v2.1/1.5.3j | Downloaded from https://imagej.net/software/fiji/ |
| Forceps | Sigma-Aldrich | F6521 | |
| Gamborg's vitamin mixture | Cassson Labs | GBL01-100ML | Store at 4 °C |
| Glycerol | Fisher Scientific | G33-4 | |
| Growth chambers | Conviron, model E15 | 16h light cycle, set at 21°C with a light intensity of 120 µmol·m-2·s-1. | |
| Lights | HD Supply | 25272 | Fluorescent lights in growth chambers, Sylvania F72T12/CW/VHO 72"T12 VHO 4200K |
| Microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 14-222-155 | Tubes in which Arabidopsis thaliana seeds are placed to perform sterilization |
| Microscope | Nikon | Nikon Eclipse TiE equipped with a DsRi2 digital camera | |
| Murashige and Skoog basal salts | Cassson Labs | MSP01-1LT | Store at 4 °C |
| Petri Dish 100 mm x 20 mm | Fisher Scientific | 08-757-11Z | Petri dishes in which MS media is poured for the purpose of growing Arabidopsis thaliana |
| Propidium Iodide | VWR | 39139-064 | |
| Scalpel | Fisher Scientific | 08-916-5A | |
| Sucrose | BioShop | SUC700.5 | |
| Toluidine blue O | Sigma-Aldrich | T3260-5G | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-100ML | |
| β-Estradiol | Sigma-Aldrich | E2758 |
References
- Hara, K., Kajita, R., Torii, K. U., Bergmann, D. C., Kakimoto, T. The secretory peptide gene EPF1 enforces the stomatal one-cell-spacing rule. Genes & Development. 21 (14), 1720-1725 (2007).
- Hara, K., et al. Epidermal cell density is autoregulated via a secretory peptide, EPIDERMAL PATTERNING FACTOR 2 in Arabidopsis leaves. Plant & Cell Physiology. 50 (6), 1019-1031 (2009).
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