Summary
מאמר זה מתאר שתי שיטות פנוטיפ ללא שימוש בקליפות אפידרמיס כדי לאפיין את הגנים השולטים בהתפתחות הסטומטלית. השיטה הראשונה מדגימה כיצד לנתח פנוטיפ סטומטלי באמצעות אפידרמיס צמחי מוכתם O כחול טולוידין. השיטה השנייה מתארת כיצד לזהות ליגנדות סטומטיות ולנטר את פעילותן הביולוגית.
Abstract
סטומטות הן נקבוביות קטנות על פני השטח של צמחי יבשה המעורבות בחילופי גזים ובשחרור אדי מים, ותפקידן קריטי לפריון הצמח ולהישרדותו. ככזו, להבנת המנגנונים שבאמצעותם מתפתחות ותבניות הפיוניות יש ערך אגרונומי עצום. מאמר זה מתאר שתי שיטות פנוטיפיות המשתמשות בקוטילדונים Arabidopsis שניתן להשתמש בהן כדי לאפיין את הגנים השולטים בהתפתחות ובתבניות סטומטליות. תחילה מוצגים נהלים לניתוח הפנוטיפים הסטומאטליים באמצעות cotyledons מוכתמים O כחול toluidine. שיטה זו מהירה ואמינה ואינה דורשת שימוש בקליפות אפידרמיס, הנמצאות בשימוש נרחב לניתוחים פנוטיפיים אך דורשות הכשרה מיוחדת. בשל נוכחותן של שאריות ציסטאין מרובות, הזיהוי והייצור של פפטידים ביו-אקטיביים מסוג EPF שיש להם תפקיד בהתפתחות סטומטלית היו מאתגרים. לפיכך, השני הוא הליך המשמש לזיהוי ליגנדות stomatal וניטור הפעילות הביולוגית שלהם על ידי bioassays. יתרונה העיקרי של שיטה זו הוא בכך שהיא מפיקה נתונים הניתנים לשחזור בקלות יחסית, תוך הפחתת כמות תמיסת הפפטיד והזמן הנדרש לאפיון תפקידם של הפפטידים בשליטה על דפוס סטומטלי והתפתחותו. בסך הכל, פרוטוקולים מתוכננים היטב אלה משפרים את היעילות של לימוד הרגולטורים הסטומאטליים הפוטנציאליים, כולל פפטידים מפרישים עשירים בציסטאין, הדורשים מבנים מורכבים ביותר לפעילותם.
Introduction
דפוסים והתמיינות נכונים של הפיוניות של הצמח הם קריטיים לתפקודם בשני תהליכים ביולוגיים בסיסיים, פוטוסינתזה וטרנספירציה, והם נאכפים על ידי מסלולי איתות פפטידים EPF. בארבידופסיס, שלושה פפטידים עשירים בציסטאין המופרשים, EPF1, EPF2 ו-STOMAGEN/EPFL9, שולטים בהיבטים שונים של התפתחות סטומטית ונתפסים על ידי רכיבי קולטן פני השטח של התא, כולל קינאזות קולטן ממשפחת ERECTA (ER, ERL1 ו-ERL2), SERK ו-TMM 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . הכרה זו מובילה לאחר מכן להפחתת הרגולציה של גורמי השעתוק המקדמים התמיינות סטומטית בתהליך תלוי MAPK11. הגילוי של גנים סטומטיים מרכזיים אלה מושג בעיקר על ידי סינון פנוטיפי של מוטנטים המציגים פגמים אפידרמיסים. מאמר זה מציג שיטות פנוטיפ פשוטות ויעילות יחסית להדמיית הפיוניות ותאי אפידרמיס אחרים, הנדרשות כדי לזהות ולאפיין את הגנים הפוטנציאליים השולטים בתבניות ובהתמיינות הסטומטלית.
התצפית על פרטי האפידרמיס של הצמח הושגה בדרך כלל באמצעות קליפות אפידרמיס עם או בלי כתמים בצבע כגון toluidine blue O (TBO) או ספרנין12,13,14. עם זאת, האתגר העיקרי של שיטות אלה הוא שהן דורשות הכשרה מיוחדת כדי לקלף את אפידרמיס העלה מבלי לקרוע את הרקמות ולהתבונן ולנתח בקפידה את נתוני הדפוסים תוך הימנעות מתמונות שצולמו מחלקים שונים של העלה. טיפולים כימיים לניקוי דגימות הרקמה באמצעות ריאגנטים כגון תמיסות ניקוי מבוססות כלורל הידרט היו בשימוש נרחב גם עבור מגוון רחב של חומרים ביולוגיים 8,15; טיפולים אלה אכן מייצרים מידע פנוטיפי רב על ידי מתן תמונות באיכות גבוהה, אך גם דורשים שימוש בכימיקלים מסוכנים (למשל, פורמלדהיד, כלורל הידרט). מאמר זה מציג תחילה שיטת פנוטיפ קלה ונוחה יחסית, המפיקה תמונות המספיקות לניתוח כמותי, אך אינה דורשת שימוש בכימיקלים מסוכנים ובקליפות עלי אפידרמיס להכנת הדגימה. אפידרמיס cotyledon מוכתם TBO הוא גם אידיאלי לחקר התפתחות stomatal כי חוסר טריכומות ואת שיפוע התפתחותי קטן יותר cotyledons לאפשר פרשנות פשוטה ו tractable של פנוטיפים האפידרמיס.
פפטידים סטומאטליים EPF שייכים לקבוצה של פפטידים ספציפיים לצמחים, עשירים בציסטאין, בעלי גדלים בוגרים גדולים יחסית וקשרים דיסולפידים תוך-מולקולריים בין שאריות ציסטאין משומרות. קיפול קונפורמטיבי נכון הוא קריטי לתפקודם הביולוגי, אך פפטידים עשירים בציסטאין, המיוצרים על ידי סינתזה כימית או מערכת רקומבינציה הטרולוגית, יכולים להיות לא פעילים והם תערובת של פפטידים מקופלים כראוי ולא מקופלים 3,7,16. לפיכך, סינון של פפטידים ביו-אקטיביים שיש להם תפקיד בבקרת התפתחות סטומטית היה משימה מאתגרת מאוד. כתב יד זה מתאר בנוסף בדיקה ביולוגית לזיהוי ואפיון טוב יותר של פפטידים סטומאטליים ביו-אקטיביים. בשיטה זו, שתילי Arabidopsis גדלים בצלחת רב באר המכילה מדיה עם וללא פפטידים פוטנציאליים במשך 6-7 ימים. לאחר מכן, אפידרמיס cotyledon הוא דמיינו באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי. באופן כללי, כדי להמחיש בבירור את הפעילות הביולוגית של פפטידים פוטנציאליים בהתפתחות סטומטלית, הגנוטיפים המייצרים יותר ו / או פחות תאי שושלת סטומטלית, כגון מוטנט epf2, המייצר יותר תאי אפידרמיס, וקו STOMAGEN-ami, המקנה צפיפות תאי אפידרמיס מופחתת 2,4,5, משמשים בנוסף לבקרת Arabidopsis מסוג פראי (Col-0) עבור bioassays.
בסך הכל, שני הפרוטוקולים המוצגים כאן יכולים לשמש להערכה מהירה ויעילה של פנוטיפים אפידרמליים שונים ולסינון פפטידים קטנים והורמונים שיש להם תפקיד בבקרת דפוס סטומטלי והתפתחות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. צביעת ארבידופסיס קוטילדונים עם TBO
- עיקור זרעים ותנאי גידול
- יש לעקר ~30 זרעי Arabidopsis לכל גנוטיפ בצינור מיקרוצנטריפוגה על ידי הוספת 1 מ"ל של תמיסת עיקור זרעים (33% אקונומיקה מסחרית, 0.1% Triton X-100), ולנענע בעדינות במשך 10-12 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
הערה: יש לעקר ~30 זרעים של ה-Arabidopsis Columbia (Col-0) ו/או ~60 זרעים של צמחים טרנסגניים הנושאים גן כימי (לדוגמה, Est::EPF27) כדי להשתמש בשתילים טרנסגניים שגדלו על 1/2 לוחות Murashige ו-Skoog (MS) (2.16 גרם/ליטר המכילים 0.8% אגר [w/v]) ללא השראה (למשל, β-אסטרדיול) כביקורת (איור 1 ואיור 2). - הסר את תמיסת העיקור, שטוף את הזרעים ארבע פעמים עם 1 מ"ל של מים סטריליים במכסה מנוע זרימה למינרית, והשהה אותם מחדש ב~ 200 מיקרוליטר של אגר סטרילי 0.1%.
- זרעו ~ 30 זרעים לכל גנוטיפ על 1/2 לוחות אגר MS או 1/2 לוחות אגר MS המכילים משרה (למשל, 10 מיקרומטר β-אסטרדיול) להשראות כימית של הטרנסגן (למשל, Est::EPF27) באמצעות פיפטה, ואטמו עם סרט מיקרו-נקבוביות.
הערה: הזרעים צריכים להיות מפוזרים באופן שווה על הצלחת כדי למנוע הצבתם בקרבה, שכן זה ימנע מהשתילים לגדול באופן אחיד. - לרבד את הזרעים על ידי הצבת הצלחות ב 4 ° C ללא אור במשך 3-5 ימים כדי לסנכרן את הנביטה.
- לאחר הריבוד, יש לדגור על הלוחות בתא גידול בטמפרטורה של 22°C מתחת ל-120 μmol·m−2·s−1 אור עם פוטו-תקופה של 16 שעות אור ו-8 שעות חושך למשך 10 ימים.
- יש לעקר ~30 זרעי Arabidopsis לכל גנוטיפ בצינור מיקרוצנטריפוגה על ידי הוספת 1 מ"ל של תמיסת עיקור זרעים (33% אקונומיקה מסחרית, 0.1% Triton X-100), ולנענע בעדינות במשך 10-12 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
- דגימה וצביעת TBO של Arabidopsis cotyledons
- ב 10 ימים לאחר הנביטה, בזהירות לבחור ולחתוך אחד cotyledons מן שתילים בודדים כי הם גדלים באופן אחיד עם שתילים אחרים על הצלחת כדי להגביל את השונות.
הערה: Cotyledons נדגמים שתילים בני 10 ימים כי אין להם טריכומות ותאי אפידרמיס לא בוגרים, אשר מפשט את הפרשנות של פנוטיפים האפידרמיס. - הכניסו כל קוטילדון לצינור מיקרוצנטריפוגה המכיל 1 מ"ל של תמיסת קיבוע (אתנול 9:1 לחומצה אצטית) באמצעות מלקחיים, והשאירו את הדגימה בתמיסת הקיבוע למשך הלילה, לכל הפחות ובטמפרטורת החדר.
הערה: לאחר מכן ניתן לאחסן את הדגימות עד כמה שנים במצב זה. התמונה איור 2E נלקחה מדגימת קוטילדון שאוחסנה בתמיסת קיבוע במשך יותר מ-3 שנים. חשוב לשמור את הקוטילדון בתמיסת קיבוע מיד לאחר החיתוך ולהניח לא יותר מחמישה קוטילדונים בכל צינור מיקרוצנטריפוגה להכנת דגימה הומוגנית מאוחר יותר. - הסר את פתרון הקיבוע, ולהוסיף 1 מ"ל של 70% אתנול. לאחר היפוך הצינור כמה פעמים, השאר את הצינור המכיל את הדגימות ב- RT למשך ~ 30 דקות.
- חזור על שלב 1.2.3 באמצעות 1 מ"ל של 50% אתנול ולאחר מכן 20% אתנול.
- החלף את 1 מ"ל של אתנול 20% עם 1 מ"ל של מים מזוקקים, ולאחר מכן להשאיר את הצינור המכיל את דגימות cotyledon במשך ~ 30 דקות לאחר היפוך הצינור כמה פעמים.
הערה: הדגימות עשויות להישאר במים מזוקקים במשך יותר מ -24 שעות, אך זה לא מומלץ לקבלת תמונות באיכות טובה (תמונות מוכתמות היטב עבור סוגים שונים של תאי אפידרמיס) לניתוח כמותי. - מוציאים את כל המים המזוקקים מהצינור. לאחר מכן, הוסף מיד ~ 200 μL של תמיסת צביעת TBO (0.5% TBO ב- H2O, מסונן) למשך ~2 דקות.
הערה: ודא שכל דגימת קוטילדון נחשפת באופן שווה לתמיסת TBO על ידי תנועה עדינה של הצינורות במהלך הדגירה. כדי למנוע הכתמת יתר עם TBO (תזמון הצביעה חיוני ויכול להיות משתנה עבור כל גנוטיפ), אין לעבד יותר משש מבחנות המכילות דגימות בכל פעם. - הסר את תמיסת צביעת TBO ביסודיות ככל האפשר, ולאחר מכן מיד לשטוף את הדגימות כמה פעמים על ידי הוספת 1 מ"ל של מים מזוקקים טריים.
- ב 10 ימים לאחר הנביטה, בזהירות לבחור ולחתוך אחד cotyledons מן שתילים בודדים כי הם גדלים באופן אחיד עם שתילים אחרים על הצלחת כדי להגביל את השונות.
- הדמיה וניתוח נתונים
- קח שקופית מיקרוסקופ, והוסף טיפה של 15% גליצרול (~ 50 μL). מניחים את הקוטילדון עם הצד האבקסיאלי כלפי מעלה ל-15% גליצרול על המגלשה בעזרת מלקחיים עדינים. לאחר מכן, כסו אותו בעדינות עם כיסוי כך שניתן יהיה להסיר את כל בועות האוויר שנוצרו מהדגימה.
- דמיינו את הצד האבקסיאלי של אפידרמיס הקוטילדון באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר (איור 1 ואיור 2), ולאחר מכן בחנו את הפנוטיפ של האפידרמיס על-ידי ספירת מספר הפיוניות וסוגי תאי אפידרמיס אחרים.
- עבור כל גנוטיפ, חשב את הפנוטיפ האפידרמלי באמצעות הנוסחאות הבאות המתוארות על ידי Jangra et al.17:
אינדקס סטומטלי (%) = (מספר הפיוניות/המספר הכולל של תאי האפידרמיס) × 100
צפיפות סטומטית (mm−2) = מספר הפיוניות/שטח (מ"מ2)
הערה: צלם לפחות שמונה קוטילדונים (N = 8) עבור כל גנוטיפ, ותעד את הפנוטיפ האפידרמלי של כל גנוטיפ על ידי השוואתו לפנוטיפ של צמח מסוג בר ו / או צמחים טרנסגניים המבטאים טרנסגן המושרה כימית שגדל ללא השראה.
2. בדיקות ביולוגיות לפפטידים סטומאטליים
הערה: הליך הבדיקות הביולוגיות מוצג באיור 3.
- עיקור זרעים ותנאי גידול
- יש לעקר ~25 זרעים לכל טיפול כנ"ל, ולזרוע כמחצית מהזרעים על כל אחת משתי צלחות אגר 1/2 MS במכסה מנוע זרימה למינרית.
הערה: השתמשו בגנוטיפ עם תאי אפידרמיס גבוהים ו/או נמוכים (למשל, epf22) במקום להשתמש ברקע פראי (למשל, Col-0) כדי לזהות בקלות את הפעילות הביולוגית של הפפטידים על התבנית וההתמיינות של תאי האפידרמיס (איור 4). - לרבד את הזרעים במשך 3 ימים ב 4 °C (75 °F) בחושך.
- הוציאו כל אחת משתי הצלחות במרווחים של ~10 שעות, ודגרו על הזרעים על צלחות בטמפרטורה של 22°C מתחת ל-120 μmol·m−2·s−1 אור עם תקופת צילום של 16 שעות אור ו-8 שעות חושך למשך יום אחד.
- יש לעקר ~25 זרעים לכל טיפול כנ"ל, ולזרוע כמחצית מהזרעים על כל אחת משתי צלחות אגר 1/2 MS במכסה מנוע זרימה למינרית.
- טיפול והדמיית פפטיד
- במכסה מנוע זרימה למינרית, השתילו בזהירות 10-12 שתילי ארבידופסיס בני יום אחד מכל אחת משתי הצלחות המוכנות לצלחת בת 24 בארות המכילה 1.5 מ"ל של 1/2 מדיום נוזלי MS בכל באר (~ 20 שתילים לבאר).
הערה: עיתוי הטיפול בפפטיד עבור השתילים הוא קריטי לתוצאות הפנוטיפיות של הטיפול בפפטידים, לכן הכינו את הזרעים בשתי צלחות נפרדות כדי לקבל שני שלבי התפתחות שתילים שונים לטיפול. - הוסף חיץ בלבד (50 mM Tris-HCl [pH 8.0]) או שני ריכוזים שונים של הפפטיד (בדרך כלל, 1 μM ו- 2.5 μM פפטיד ב- 50 mM Tris-HCl [pH 8.0]) לכל באר המכילה ~ 20 שתילי Arabidopsis בני יום אחד שנבטו על 1/2 צלחות אגר MS.
הערה: הוציאו את תמיסת הפפטיד מהמקפיא, ושמרו אותם ב-RT למשך מספר דקות לפני הטיפול. פפטידים המאוחסנים במקפיא בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס יציבים למשך מספר שנים, אך יש להימנע ממחזורי הקפאה-הפשרה על ידי אחסון תמיסת הפפטיד באליציטוטים קטנים. - לאחר ערבוב עדין של השתילים עם חיץ בלבד או תמיסת פפטיד באמצעות פיפטה, אטמו את הצלחת בסרט מיקרו-נקבוביות. לדגור על צלחת הבדיקה בתנאים של יום ארוך (16 שעות פוטופריוד, 120 μmol·m−2·s−1 אור) במשך 5-7 ימים ב 22 ° C.
הערה: מנעו מהשתילים לגדול קרוב מדי זה לזה כדי לאפשר לכל שתיל חשיפה אחידה לתמיסת הפפטידים. סובבו בעדינות את הצלחת במשך 2-3 שעות לפני הדגירה על הצלחת בתא גדילה כדי להגביר את האוורור. - מעבירים כל שתיל מהבאר המכילה חיץ בלבד או פפטיד על שקופית כיסוי, ומנתחים את הקוטילדון של השתיל. מניחים את הצד האבקסיאלי של הקוטילדון בעזרת מלקחיים, וחותכים אותו לחתיכות קטנות.
- קחו עוד שקופית מיקרוסקופ נקייה, והניחו עליה טיפה של תמיסת יודיד פרופידיום (~25 μL, 2 מ"ג/מ"ל ב-H2O).
- מניחים את אחת החתיכות הקטנות של קוטילדון לתוך טיפה של תמיסת יודיד פרופידיום באמצעות מלקחיים, ומניחים בעדינות את הכיסוי. יש למרוח תמיסת פרופידיום יודיד נוספת על קצה הכיסוי כדי להסיר בועות אוויר שנוצרו.
- דמיינו את הצד האבקסיאלי של הקוטילדון באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי, והשוו את התמונות לתמונות משתילים שגדלו בתווך של 1/2 MS המכיל חיץ בלבד.
הערה: התמונות שהוצגו באיור 4 נלקחו משתילי Col-0 או epf22,5 מסוג בר שטופלו בחיץ בלבד (איור 4A, B) או בשתי אצוות של תמיסת פפטיד EPF2 (איור 4C-F) ואוחסנו בטמפרטורה של -80°C במשך שנה אחת.
- במכסה מנוע זרימה למינרית, השתילו בזהירות 10-12 שתילי ארבידופסיס בני יום אחד מכל אחת משתי הצלחות המוכנות לצלחת בת 24 בארות המכילה 1.5 מ"ל של 1/2 מדיום נוזלי MS בכל באר (~ 20 שתילים לבאר).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
צמחים טרנסגניים סטומטיים שונים ומוטנטים הידועים כבעלי צפיפות סטומטית ואשכולות נמוכים או יותר (epf2 2,5, epf1 epf22,5, tmm12, קו 4 מושתק STOMAGEN, וקווים טרנסגניים הנושאים את מבנה ביטוי היתר Est::EPF1 או Est::EPF2 7 ) שימשו להדגמת יעילותם של שני הניתוחים הפנוטיפיים שהוצגו כאן, שמטרתם לזהות ולאפיין את הגנים שיש להם תפקיד בהתפתחות ובתבניות סטומטליות. על מנת להפיק תמונות אפידרמיס באיכות גבוהה ללא צורך בקליפות אפידרמיס כדי לכמת את הסוגים השונים של תאי אפידרמיס לניתוח, חיוני להתאים מראש את זמן צביעת הדגימה עם TBO עבור כל גנוטיפ, מאחר שלכל אחד מהם עשויים להיות פנוטיפים אפידרמיסים שונים בהשוואה לזה של קבוצת ביקורת מסוג בר (Col-0) (איור 1A ואיור 2A). בהתבסס על ניסיון, גנוטיפים עם פחות פיוניות דורשים זמני צביעה ארוכים יותר עם TBO (איור 1B ואיור 2D,E), בעוד שגנוטיפים עם יותר פיוניות והתקבצות דורשים זמני צביעה קצרים יותר (איור 1C ואיור 2B,C). מכיוון שכמויות משתנות של פפטידים מקופלים כראוי בתמיסת הפפטיד הכוללת יכולות להסוות את הפעילות הביולוגית של הפפטידים בהתפתחות סטומטלית, מומלץ להשתמש בריכוזים כוללים נוספים, גבוהים יותר, של תמיסת הפפטיד (למשל, 2.5 מיקרומטר EPF2), כמו גם בגנוטיפים שיש להם פחות או יותר פנוטיפים סטומטיים (למשל, epf2), עבור הבדיקות הביולוגיות. הפעילות של פפטידים מסוג EPF2, שיש להם תפקיד בעיכוב התחלת פעילות סטומטלית, זוהתה בקלות על-ידי שימוש במוטנטים מסוג epf2 עם יותר תאי אפידרמיס מאשר Col-0, אפילו אם באצוות מסוימות של פפטידים EPF2 מוכנים היו כמויות קטנות יותר של הצורות הביו-אקטיביות של הפפטיד (לדוגמה, תמיסת פפטיד EPF2 אצווה 1 באיור 4).
איור 1: ההשפעה של זמן הדגירה עם TBO על גנוטיפים המציגים פנוטיפים אפידרמיסים שונים. תמונות אבקסיאל קוטילדון משתילים בני 10 ימים של שלושה גנוטיפים של Arabidopsis: (A) סוג בר (Col-0), (B) קו מושתק STOMAGEN (STOMAGEN-ami) ו-(C) מוטציות epf1 epf2. Col-0 מייצג את בקרת Arabidopsis מסוג פראי, והמוטציות המושתקות STOMAGEN ומוטציות epf1 epf2 מייצגות את הגנוטיפים עם מספר נמוך וגבוה של פיוניות, בהתאמה. התמונות צולמו באמצעות מיקרוסקופ הפוך עם עדשת 20x אובייקטיבית (0.35 מ"מ2 שדה ראייה). איכות התמונות הייתה משתנה, אם כי כל דגימות הקוטילדון מהגנוטיפים השונים הוכתמו ב-TBO (0.5% TBO ב-H 2 O) למשך אותה כמות זמן (2דקות) לפני ההדמיה. לכן, כדי לקבל תמונות מוכתמות היטב לניתוח, חשוב לקבוע מראש את זמן צביעת TBO המתאים עבור כל גנוטיפ. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: תמונות אפידרמיס מוכתמות ב-TBO ללא שימוש בקליפות אפידרמיס לצורך ניתוח כמותי. תמונות אפידרמיס מייצגות של קוטילדונים משתילים בני 10 ימים של (A) מסוג בר (Col-0), (B) tmm ו-(C,D) קווים טרנסגניים הנושאים EPF2 (Est::EPF2) או (E) EPF1 מבנה ביטוי יתר (Est::EPF1) יכולות לשמש לניתוח כמותי של פנוטיפ האפידרמיס. קוטילדון בתמיסת תיקון במשך למעלה מ-3 שנים שימש לצילום התמונה המוצגת ב-(E). התמונות צולמו באמצעות מיקרוסקופ הפוך עם עדשת 20x אובייקטיבית (0.35 מ"מ2 שדה ראייה). התאים שורטטו על ידי צביעת TBO, וחצי מרוחב התמונות בגודל מלא מוצג לתצוגה. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: נוהל הבדיקות הביולוגיות . (A) הזרעים נזרעים על שתי צלחות אגר של 1/2 MS ומוציאים אותם במרווחים של 10 שעות. (B) שתילי ארבידופסיס בני יום אחד מושתלים בצלחות בנות 24 בארות המכילות 1/2 מדיום טרשת נפוצה עם ריכוזי פפטיד מדומים או שניים. (C) לאחר 5-7 ימים, השתילים מוכנים להדמיה כדי לקבוע את הפעילות הביולוגית של הפפטידים בהתפתחות ובדפוס. (D) פרוסת קוטילדון מונחת בטיפת תמיסת יודיד פרופידיום על שקופית מיקרוסקופ לצורך הדמיה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: מיקרוסקופ קונפוקלי של האפידרמיס האבקסיאלי של Arabidopsis cotyledons לאחר טיפול בפפטידים. תמונות קונפוקליות מייצגות של (A) אפידרמיס מסוג בר ו-(B) אפידרמיס קוטילדון מסוג epf2 שגודלו במשך 6-7 ימים בתמיסת חיץ ואפידרמיס (C-F) epf2 cotyledon שגדל עם שתי אצוות שונות של פפטידים מסוג EPF2. התמונות צולמו באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי באמצעות עדשה אובייקטיבית 40x (עירור של 561 ננומטר ומסנן פליטה של 561 ננומטר במעבר ארוך) כדי ללכוד את צביעת היודיד פרופידיום ולדמיין את קווי המתאר של התא. כל תמיסת פפטיד EPF2 שהוכנה מכילה כמויות שונות של צורות מקופלות כראוי (ביו-אקטיביות) ומקופלות בצורה שגויה (לא פעילות) של הפפטידים. לכן, לצורך סינון ראשוני של פפטידים בעלי תפקיד פוטנציאלי בהתפתחות סטומטלית, מומלץ להשתמש בשני ריכוזים שונים של סך תמיסות הפפטידים כפי שמצוין עבור הבדיקות הביולוגיות. סרגל קנה מידה = 30 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
שתי שיטות הניתוח הפנוטיפיות לזיהוי ואפיון הגנים השולטים בתבניות ובהתמיינות הסטומטית המוצגות כאן הן בדיקות נוחות ואמינות, שכן הפרוטוקולים אינם דורשים שימוש בקליפות אפידרמיס ובציוד ייעודי (הגוזלים זמן רב ודורשים הכשרה מיוחדת להכנת דגימות) אך כן מפיקים תמונות איכותיות לניתוח כמותי של פנוטיפים אפידרמליים.
מגבלה של טכניקה זו לאנליזה פנוטיפית באמצעות ארבידופסיס קוטילדונים מוכתמים ב-TBO היא שקבלת תמונות באיכות גבוהה עם ניגודיות חזותית עבור סוגי תאי אפידרמיס שונים תלויה בזמן הצביעה ובמאפיינים הייחודיים של הרקמה, שעשויים להיות גם תלויי מין וגם תלויי גנוטיפ (איור 1)18 . שיטות פנוטיפ אחרות לצפייה בתאי אפידרמיס באמצעות קליפות אפידרמיס הן בעלות אותם אתגרים, והן גם דורשות יותר זמן והכשרה מיוחדת. ניתן להימנע מקשיים בהשגת תמונות אפידרמיס מוכתמות כראוי המספיקות לניתוח נתונים על ידי צביעת קוטילדונים מגנוטיפים עם פחות פיוניות לפרקי זמן ארוכים יותר ודגימות מגנוטיפים עם יותר פיוניות לפרקי זמן קצרים יותר. ניתן גם להתאים את זמן הצביעה עבור כל גנוטיפ על ידי בדיקה ראשונית של דגימות ספורות בלבד כדי לייעל את זמן הצביעה של גנוטיפים עם פנוטיפים אפידרמיסים דומים.
השגת כמות מספקת של פפטידים ביו-אקטיביים מקופלים היטב, במיוחד פפטידים עשירים בציסטאין (שהם ליגנדות שיש להן תפקידים מגוונים בבקרת התפתחות צמחים, כולל תבניות סטומטליות), הייתה אתגר 1,2,3,4,5,6,19,20,21,22,23 . יתר על כן, גם אם נוצרים פפטידים ביו-אקטיביים, סינון של פפטידים בעלי תפקידים פוטנציאליים בתהליכים ביולוגיים ספציפיים הוא משימה מאתגרת נוספת, מכיוון שהפפטידים הביו-אקטיביים המיוצרים הם לעתים קרובות תערובת של פפטידים מקופלים היטב, פעילים ולא פעילים. מאמר זה מציג שיטת bioassay יעילה לגילוי ואפיון פפטידים סטומטיים פוטנציאליים. שיטה זו הצליחה לזהות פפטידים חשובים שונים השולטים בהיבטים שונים של התפתחות סטומטלית בארבידופסיס, כמו גם את העשב Brachypodium 3,4,7,17. עם זאת, המגבלה העיקרית של טכניקה זו היא השונות בתגובות הפנוטיפיות, אשר מתרחשת ככל הנראה עקב שימוש בשתילים עם שלבי התפתחות שונים במקצת ותמיסות פפטידים המכילות כמויות שונות של פפטידים ביו-אקטיביים. ניסיונות מוקדמים בשיטה זו כללו הצבת זרעים מסוג בר ישירות בבארות של צלחת המכילה תמיסה פפטידית לאחר ריבוד. ללא שימוש בגנוטיפים שיש להם יותר ו/או פחות תאי אפידרמיס (למשל, epf2 2, איור 4) ושתילי Arabidopsis בני יום אחד שנבטו על 1/2 צלחות אגר MS, מספר נמוך יותר של שתילים מסוגלים לגדול ולהראות תגובות פנוטיפיות ברורות לאחר יישום הפפטידים. בפרוטוקול זה, בעיית השונות טופלה על ידי שימוש ב~20 שתילי ארבידופסיס בני יום אחד עם שני שלבי התפתחות שונים ועל ידי שימוש בשני ריכוזים שונים של תמיסת פפטיד (1 מיקרומטר ו -2.5 מיקרומטר).
הפנוטיפים האפידרמיסיים של הדגימות המטופלות בפפטידים, ניתנים לניתוח גם על ידי שיטת הניתוח הפנוטיפית הראשונה שהוצגה באמצעות דגימות מוכתמות TBO. שיטה זו מאפשרת ניתוח פנוטיפי כמותי קל יחסית מכיוון שניתן לנתח שטח גדול יחסית מכל דגימה. בנוסף, שיטה זו מציעה גמישות בהכנת הדגימות לאחר קצירת דגימות שהוכנו באותם תנאים להדמיה. עם זאת, התמונות שצולמו בשיטה זו בדרך כלל אינן באיכות הגבוהה ביותר. מצד שני, הדמיה קונפוקלית לאחר צביעת יודיד פרופידיום נותנת תמונות באיכות גבוהה יותר עם פרטי אפידרמיס. עם זאת, שיטה זו מאפשרת רק שטח קטן של רקמה להיות ממוקד לניתוח. בנוסף, רק מספר מסוים של רקמות חיות מוכן ניתן לנתח בבת אחת.
לסיכום, הניתוח הפנוטיפי המוצג כאן יכול לשמש לבחינה מהירה ויעילה של הגנים הפוטנציאליים השולטים בתבניות ובהתמיינות סטומטלית, ובכך לשפר את הבנת מנגנוני ההתפתחות הסטומטית ותפקוד הפפטידים. בנוסף, פרוטוקול bioassay זה יכול לשמש לזיהוי מולקולות קטנות אחרות שיש להן תפקיד בדפוס רקמת האפידרמיס וכשיטת סינון ראשונית כדי לקבוע את המבנה של פפטידים ביו-אקטיביים מקופלים היטב.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
לא הוכרז על ניגוד עניינים.
Acknowledgments
מחקר זה מומן באמצעות תוכנית גילוי משאבי הטבע וההנדסה של קנדה (NSERC) ואוניברסיטת קונקורדיה. K.B. נתמך על ידי המלגה הלאומית בחו"ל מהודו.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18 mm x 18 mm cover slip | VWR | 16004-326 | |
| 24-well sterile plates with lid | VWR | CA62406-183 | |
| 3M Micropore surgical tape | Fisher Scientific | 19-027-761 | Microporous surgical paper tape used to seal MS plates |
| 76 x 26 mm Microscope slide | TLG | GEW90-2575-03 | |
| Acetic acid, ≥99.8% | Fisher Scientific | A38-212 | |
| Agar | BioShop | AGR001.1 | |
| Bleech | Household bleach (e.g., Clorox) | ||
| Confocal microscope | Nikon | Nikon C2 operated by NIS-Elements | |
| Ethanol | Greenfield | P210EAAN | |
| FIJI | Open-srouce | (Fiji Is Just) ImageJ v2.1/1.5.3j | Downloaded from https://imagej.net/software/fiji/ |
| Forceps | Sigma-Aldrich | F6521 | |
| Gamborg's vitamin mixture | Cassson Labs | GBL01-100ML | Store at 4 °C |
| Glycerol | Fisher Scientific | G33-4 | |
| Growth chambers | Conviron, model E15 | 16h light cycle, set at 21°C with a light intensity of 120 µmol·m-2·s-1. | |
| Lights | HD Supply | 25272 | Fluorescent lights in growth chambers, Sylvania F72T12/CW/VHO 72"T12 VHO 4200K |
| Microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 14-222-155 | Tubes in which Arabidopsis thaliana seeds are placed to perform sterilization |
| Microscope | Nikon | Nikon Eclipse TiE equipped with a DsRi2 digital camera | |
| Murashige and Skoog basal salts | Cassson Labs | MSP01-1LT | Store at 4 °C |
| Petri Dish 100 mm x 20 mm | Fisher Scientific | 08-757-11Z | Petri dishes in which MS media is poured for the purpose of growing Arabidopsis thaliana |
| Propidium Iodide | VWR | 39139-064 | |
| Scalpel | Fisher Scientific | 08-916-5A | |
| Sucrose | BioShop | SUC700.5 | |
| Toluidine blue O | Sigma-Aldrich | T3260-5G | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-100ML | |
| β-Estradiol | Sigma-Aldrich | E2758 |
References
- Hara, K., Kajita, R., Torii, K. U., Bergmann, D. C., Kakimoto, T. The secretory peptide gene EPF1 enforces the stomatal one-cell-spacing rule. Genes & Development. 21 (14), 1720-1725 (2007).
- Hara, K., et al. Epidermal cell density is autoregulated via a secretory peptide, EPIDERMAL PATTERNING FACTOR 2 in Arabidopsis leaves. Plant & Cell Physiology. 50 (6), 1019-1031 (2009).
- Kondo, T., et al. Stomatal density is controlled by a mesophyll-derived signaling molecule. Plant & Cell Physiology. 51 (1), 1-8 (2010).
- Sugano, S. S., et al. Stomagen positively regulates stomatal density in Arabidopsis. Nature. 463 (7278), 241-244 (2010).
- Hunt, L., Gray, J. E. The signaling peptide EPF2 controls asymmetric cell divisions during stomatal development. Current Biology. 19 (10), 864-869 (2009).
- Hunt, L., Bailey, K. J., Gray, J. E. The signalling peptide EPFL9 is a positive regulator of stomatal development. New Phytologist. 186 (3), 609-614 (2010).
- Lee, J. S., et al. Direct interaction of ligand-receptor pairs specifying stomatal patterning. Genes & Development. 26 (2), 126-136 (2012).
- Shpak, E. D., McAbee, J. M., Pillitteri, L. J., Torii, K. U. Stomatal patterning and differentiation by synergistic interactions of receptor kinases. Science. 309 (5732), 290-293 (2005).
- Nadeau, J. A., Sack, F. D. Control of stomatal distribution on the Arabidopsis leaf surface. Science. 296 (5573), 1697-1700 (2002).
- Meng, X., et al. Differential function of Arabidopsis SERK family receptor-like kinases in stomatal patterning. Current Biology. 25 (18), 2361-2372 (2015).
- Lampard, G. R., Macalister, C. A., Bergmann, D. C. Arabidopsis stomatal initiation is controlled by MAPK-mediated regulation of the bHLH SPEECHLESS. Science. 322 (5904), 1113-1116 (2008).
- Yang, M., Sack, F. D. The too many mouths and four lips mutations affect stomatal production in Arabidopsis. The Plant Cell. 7 (12), 2227-2239 (1995).
- Theunissen, J. D. An improved method for studying grass leaf epidermis. Stain Technology. 64 (5), 239-242 (1989).
- Venkata, B. P., et al. crw1--A novel maize mutant highly susceptible to foliar damage by the western corn rootworm beetle. PLoS One. 8 (8), 71296 (2013).
- Tucker, M. R., et al. Somatic small RNA pathways promote the mitotic events of megagametogenesis during female reproductive development in Arabidopsis. Development. 139 (8), 1399-1404 (2012).
- Ohki, S., Takeuchi, M., Mori, M. The NMR structure of stomagen reveals the basis of stomatal density regulation by plant peptide hormones. Nature Communications. 2, 512 (2011).
- Jangra, R., et al. Duplicated antagonistic EPF peptides optimize grass stomatal initiation. Development. 148 (16), (2021).
- Zhao, C., Craig, J. C., Petzold, H. E., Dickerman, A. W., Beers, E. P. The xylem and phloem transcriptomes from secondary tissues of the Arabidopsis root-hypocotyl. Plant Physiology. 138 (2), 803-818 (2005).
- Uchida, N., et al. Regulation of inflorescence architecture by intertissue layer ligand-receptor communication between endodermis and phloem. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (16), 6337-6342 (2012).
- Tameshige, T., et al. A secreted peptide and its receptors shape the auxin response pattern and leaf margin morphogenesis. Current Biology. 26 (18), 2478-2485 (2016).
- Abrash, E. B., Davies, K. A., Bergmann, D. C. Generation of signaling specificity in Arabidopsis by spatially restricted buffering of ligand-receptor interactions. The Plant Cell. 23 (8), 2864-2879 (2011).
- Uchida, N., Tasaka, M. Regulation of plant vascular stem cells by endodermis-derived EPFL-family peptide hormones and phloem-expressed ERECTA-family receptor kinases. Journal of Experimental Botany. 64 (17), 5335-5343 (2013).
- Kosentka, P. Z., Overholt, A., Maradiaga, R., Mitoubsi, O., Shpak, E. D. EPFL Signals in the boundary region of the SAM restrict its size and promote leaf initiation. Plant Physiology. 179 (1), 265-279 (2019).
