Summary
यह पेपर स्टोमेटा विकास को नियंत्रित करने वाले जीन को चिह्नित करने के लिए एपिडर्मल छिलके के उपयोग के बिना दो फेनोटाइपिंग विधियों का वर्णन करता है। पहली विधि दर्शाती है कि टोल्यूडाइन ब्लू ओ-सना हुआ पौधे एपिडर्मिस का उपयोग करके स्टोमेटा फेनोटाइप का विश्लेषण कैसे किया जाए। दूसरी विधि बताती है कि स्टोमेटा लिगेंड की पहचान कैसे करें और उनकी जैविक गतिविधियों की निगरानी करें।
Abstract
स्टोमेटा भूमि पौधों की सतह पर छोटे छिद्र हैं जो गैस विनिमय और जल वाष्प रिलीज में शामिल हैं, और उनका कार्य पौधे की उत्पादकता और अस्तित्व के लिए महत्वपूर्ण है। जैसे, उन तंत्रों को समझना जिनके द्वारा स्टोमेटा विकसित होता है और पैटर्न का जबरदस्त कृषि संबंधी मूल्य है। यह पेपर एराबिडोप्सिस कोटिलेडोन का उपयोग करके दो फेनोटाइपिक तरीकों का वर्णन करता है जिनका उपयोग स्टोमेटा विकास और पैटर्निंग को नियंत्रित करने वाले जीन को चिह्नित करने के लिए किया जा सकता है। पहले प्रस्तुत टोलुइडिन ब्लू ओ-सना हुआ कोटिलेडॉन का उपयोग करके स्टोमेटा फेनोटाइप का विश्लेषण करने के लिए प्रक्रियाएं हैं। यह विधि तेज और विश्वसनीय है और एपिडर्मल छिलके के उपयोग की आवश्यकता नहीं है, जो व्यापक रूप से फेनोटाइपिक विश्लेषण के लिए उपयोग किए जाते हैं लेकिन विशेष प्रशिक्षण की आवश्यकता होती है। कई सिस्टीन अवशेषों की उपस्थिति के कारण, बायोएक्टिव ईपीएफ पेप्टाइड्स की पहचान और उत्पादन जो स्टोमेटा विकास में भूमिका निभाते हैं, चुनौतीपूर्ण रहे हैं। इस प्रकार, प्रस्तुत दूसरा एक प्रक्रिया है जिसका उपयोग स्टोमेटा लिगेंड की पहचान करने और बायोएसेस द्वारा उनकी जैविक गतिविधि की निगरानी के लिए किया जाता है। इस विधि का मुख्य लाभ यह है कि यह पेप्टाइड समाधान की मात्रा को कम करते हुए अपेक्षाकृत आसानी से प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य डेटा का उत्पादन करता है और स्टोमेटा पैटर्निंग और विकास को नियंत्रित करने में पेप्टाइड्स की भूमिका को चिह्नित करने के लिए आवश्यक समय है। कुल मिलाकर, ये अच्छी तरह से डिज़ाइन किए गए प्रोटोकॉल सिस्टीन युक्त स्रावी पेप्टाइड्स सहित संभावित स्टोमेटा नियामकों का अध्ययन करने की दक्षता को बढ़ाते हैं, जिन्हें उनकी गतिविधि के लिए अत्यधिक जटिल संरचनाओं की आवश्यकता होती है।
Introduction
पौधे के स्टोमेटा का उचित पैटर्निंग और भेदभाव दो मौलिक जैविक प्रक्रियाओं, प्रकाश संश्लेषण और वाष्पोत्सर्जन में उनके कार्य के लिए महत्वपूर्ण हैं, और ईपीएफ पेप्टाइड सिग्नलिंग मार्गों द्वारा लागू किए जाते हैं। एराबिडोप्सिस में, तीन स्रावित सिस्टीन युक्त पेप्टाइड्स, ईपीएफ 1, ईपीएफ 2, और स्टोमाजेन / ईपीएफएल 9, स्टोमेटा विकास के विभिन्न पहलुओं को नियंत्रित करते हैं और सेल-सतह रिसेप्टर घटकों द्वारा माना जाता है, जिसमें इरेक्टा-परिवार रिसेप्टर किनेसेस (ईआर, ईआरएल 1, और ईआरएल 2), एसईआरसी और टीएमएम 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 शामिल हैं। . यह मान्यता तब प्रतिलेखन कारकों के डाउनरेग्यूलेशन की ओर ले जाती है जो एक एमएपी-निर्भर प्रक्रिया11 द्वारा स्टोमेटा भेदभाव को बढ़ावा देते हैं। इन कोर स्टोमेटा जीन की खोज मुख्य रूप से एपिडर्मल दोषों का प्रदर्शन करने वाले उत्परिवर्ती की फेनोटाइपिक स्क्रीनिंग द्वारा प्राप्त की जाती है। यह पेपर स्टोमेटा और अन्य एपिडर्मल कोशिकाओं की कल्पना करने के लिए अपेक्षाकृत सरल और कुशल फेनोटाइपिंग विधियों को प्रस्तुत करता है, जो स्टोमेटा पैटर्निंग और भेदभाव को नियंत्रित करने वाले संभावित जीन की पहचान और विशेषता के लिए आवश्यक हैं।
पौधे एपिडर्मिस के विवरण का अवलोकन आमतौर पर टोलुइडिन ब्लू ओ (टीबीओ) या सैफ्रानिन12,13,14 जैसे डाई के साथ या बिना धुंधला किए एपिडर्मल छिलके का उपयोग करके प्राप्त किया गया है। हालांकि, इन विधियों की मुख्य चुनौती यह है कि उन्हें ऊतकों को फाड़े बिना पत्ती एपिडर्मिस को छीलने के लिए विशेष प्रशिक्षण की आवश्यकता होती है और पत्ती के विभिन्न हिस्सों से ली गई छवियों से बचते हुए पैटर्निंग डेटा का सावधानीपूर्वक निरीक्षण और विश्लेषण किया जाता है। क्लोरल हाइड्रेट-आधारित समाशोधन समाधान जैसे अभिकर्मकों के साथ ऊतक के नमूनों को साफ करने के लिए रासायनिक उपचार भी जैविक सामग्री की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए व्यापक रूप से उपयोग किया गया है 8,15; ये उपचार उच्च गुणवत्ता वाली छवियां प्रदान करके फेनोटाइपिक जानकारी का एक बड़ा सौदा उत्पन्न करते हैं, लेकिन खतरनाक रसायनों (जैसे, फॉर्मलाडेहाइड, क्लोरल हाइड्रेट) के उपयोग की भी आवश्यकता होती है। यह पेपर पहले एक अपेक्षाकृत आसान और सुविधाजनक फेनोटाइपिंग विधि प्रस्तुत करता है जो मात्रात्मक विश्लेषण के लिए पर्याप्त छवियों का उत्पादन करता है लेकिन नमूना तैयार करने के लिए खतरनाक रसायनों और एपिडर्मल पत्ती के छिलके के उपयोग की आवश्यकता नहीं होती है। एक टीबीओ-सना हुआ कोटिलेडॉन एपिडर्मिस भी स्टोमेटा विकास के अध्ययन के लिए आदर्श है क्योंकि ट्राइकोम की कमी और कोटिलेडोन में छोटे विकास ढाल एपिडर्मल फेनोटाइप की सरल और वापस लेने योग्य व्याख्या की अनुमति देते हैं।
स्टोमेटा ईपीएफ पेप्टाइड्स पौधे-विशिष्ट, सिस्टीन-समृद्ध पेप्टाइड्स के समूह से संबंधित हैं जिनमें संरक्षित सिस्टीन अवशेषों के बीच अपेक्षाकृत बड़े परिपक्व आकार और इंट्रामोलेक्यूलर डाइसल्फ़ाइड बॉन्ड होते हैं। सही विरूपण तह उनके जैविक कार्य के लिए महत्वपूर्ण है, लेकिन सिस्टीन युक्त पेप्टाइड्स, जो या तो रासायनिक संश्लेषण या हेटरोलॉगस पुनर्संयोजन प्रणाली द्वारा निर्मित होते हैं, निष्क्रिय हो सकते हैं और ठीक से मुड़े हुए और अनफोल्डेड पेप्टाइड्स 3,7,16 दोनों का मिश्रण हैं। इस प्रकार, बायोएक्टिव पेप्टाइड्स की स्क्रीनिंग जो स्टोमेटा विकास को नियंत्रित करने में भूमिका निभाती है, एक बहुत ही चुनौतीपूर्ण कार्य रहा है। यह पांडुलिपि बायोएक्टिव स्टोमेटा पेप्टाइड्स की बेहतर पहचान और लक्षण वर्णन के लिए एक बायोसेसे का भी वर्णन करती है। इस विधि में, एराबिडोप्सिस रोपाई को 6-7 दिनों के लिए संभावित पेप्टाइड्स के साथ और बिना मीडिया युक्त एक बहु-अच्छी प्लेट में उगाया जाता है। फिर, कोटिलेडॉन एपिडर्मिस को कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके कल्पना की जाती है। सामान्य तौर पर, स्टोमेटा विकास में संभावित पेप्टाइड्स की जैविक गतिविधि को स्पष्ट रूप से देखने के लिए, जीनोटाइप जो अधिक और / या कम स्टोमेटा वंश कोशिकाओं का उत्पादन करते हैं, जैसे कि ईपीएफ 2 उत्परिवर्ती, जो अधिक एपिडर्मल कोशिकाओं का उत्पादन करता है, और स्टोमाजेन-एमी लाइन, जो कम एपिडर्मल सेल घनत्व 2,4,5 प्रदान करता है, का उपयोग बायोसेस के लिए जंगली-प्रकार एराबिडोप्सिस नियंत्रण (कोल -0) के अलावा किया जाता है।
कुल मिलाकर, यहां प्रस्तुत दो प्रोटोकॉल का उपयोग विभिन्न एपिडर्मल फेनोटाइप्स के त्वरित और कुशल मूल्यांकन के लिए और छोटे पेप्टाइड्स और हार्मोन की स्क्रीनिंग के लिए किया जा सकता है जिनकी स्टोमेटा पैटर्निंग और विकास को नियंत्रित करने में भूमिका है।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. टीबीओ के साथ एराबिडोप्सिस कोटिलेडोन को धुंधला करना
- बीज नसबंदी और विकास की स्थिति
- बीज नसबंदी समाधान (33% वाणिज्यिक ब्लीच, 0.1% ट्राइटन एक्स -100) के 1 एमएल को जोड़कर एक माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में प्रति जीनोटाइप ~ 30 एराबिडोप्सिस बीजों को निष्फल करें, और कमरे के तापमान (आरटी) पर 10-12 मिनट के लिए धीरे से चट्टान करें।
नोट: जंगली प्रकार के एराबिडोप्सिस परिग्रहण कोलंबिया (कोल-0) और/या ~ 60 ट्रांसजेनिक पौधों के ~ 30 बीजों को रासायनिक रूप से इंड्यूसेबल जीन (जैसे, एस्ट:: ईपीएफ 27) ले जाने वाले ट्रांसजेनिक पौधों का उपयोग करने के लिए 1/2 मुराशिगे और स्कूग (एमएस) प्लेटों (2.16 ग्राम /एल जिसमें 0.8% एगर [डब्ल्यू /वी]) होता है β) का उपयोग करने के लिए किया जाता है। - नसबंदी समाधान को हटा दें, एक लामिनार प्रवाह हुड में 1 एमएल बाँझ पानी के साथ बीज को चार बार धोएं, और उन्हें ~ 200 μL बाँझ 0.1% आगर में पुन: निलंबित करें।
- पिपेट का उपयोग करके ट्रांसजीन (जैसे, एस्ट:: ईपीएफ 2 7) के रासायनिक प्रेरण के लिए एक इंड्यूसर (जैसे, 10 μM β-एस्ट्राडियोल) युक्त 1/2 एमएस एगर प्लेटों पर प्रति जीनोटाइप ~ 30 बीज बोएं, और माइक्रोपोर टेप के साथ सील करें।
नोट: बीजों को निकट निकटता में रखने से बचने के लिए प्लेट पर समान रूप से वितरित करने की आवश्यकता होती है, क्योंकि यह रोपाई को समान रूप से बढ़ने से रोक देगा। - अंकुरण को सिंक्रनाइज़ करने के लिए प्लेटों को 3-5 दिनों के लिए प्रकाश के बिना 4 डिग्री सेल्सियस पर रखकर बीज को स्ट्रैटिफाई करें।
- स्तरीकरण के बाद, प्लेटों को 10 दिनों के लिए 16 घंटे प्रकाश और 8 घंटे अंधेरे की फोटोअवधि के साथ 120 μmol-m-2.s-1 प्रकाश के तहत 22 डिग्री सेल्सियस पर एक विकास कक्ष में इनक्यूबेट करें।
- बीज नसबंदी समाधान (33% वाणिज्यिक ब्लीच, 0.1% ट्राइटन एक्स -100) के 1 एमएल को जोड़कर एक माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में प्रति जीनोटाइप ~ 30 एराबिडोप्सिस बीजों को निष्फल करें, और कमरे के तापमान (आरटी) पर 10-12 मिनट के लिए धीरे से चट्टान करें।
- एराबिडोप्सिस कोटिलेडॉन का नमूना और टीबीओ धुंधला होना
- अंकुरण के 10 दिनों के बाद, परिवर्तनशीलता को सीमित करने के लिए प्लेट पर अन्य रोपाई के साथ समान रूप से बढ़ रहे व्यक्तिगत रोपाई से कोटिलेडोन में से एक को सावधानीपूर्वक चुनें और काट लें।
नोट: कोटिलेडोन को 10 दिन पुराने रोपाई से नमूना लिया जाता है क्योंकि उनके पास ट्राइकोम और अपरिपक्व एपिडर्मिस कोशिकाएं नहीं होती हैं, जो एपिडर्मल फेनोटाइप की व्याख्या को सरल बनाती हैं। - प्रत्येक कोटिलेडॉन को एक माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में रखें जिसमें फोर्सप्स का उपयोग करके 1 एमएल फिक्सिंग समाधान (9: 1 इथेनॉल से एसिटिक एसिड) होता है, और नमूने को रात भर, न्यूनतम और कमरे के तापमान पर फिक्सिंग समाधान में छोड़ दें।
नोट: नमूने तब इस स्थिति में कुछ वर्षों तक संग्रहीत किए जा सकते हैं। छवि चित्रा 2 ई एक कोटिलेडोन नमूने से लिया गया था जिसे 3 साल से अधिक समय तक समाधान को ठीक करने में संग्रहीत किया गया था। काटने के तुरंत बाद कोटिलेडोन को फिक्सिंग समाधान में रखना और बाद में सजातीय नमूना तैयार करने के लिए प्रत्येक माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में पांच से अधिक कोटिलेडोन नहीं रखना महत्वपूर्ण है। - फिक्सिंग समाधान को हटा दें, और 70% इथेनॉल का 1 एमएल जोड़ें। ट्यूब को एक-दो बार मोड़ने के बाद, नमूने वाले ट्यूब को ~ 30 मिनट के लिए आरटी पर छोड़ दें।
- चरण 1.2.3 को 50% इथेनॉल के 1 एमएल और फिर 20% इथेनॉल का उपयोग करके दोहराएं।
- 20% इथेनॉल के 1 एमएल को 1 एमएल आसुत पानी के साथ बदलें, और फिर ट्यूब को कुछ बार उलटने के बाद ~ 30 मिनट के लिए कोटिलेडॉन नमूने वाले ट्यूब को छोड़ दें।
नोट: नमूने आसुत जल में 24 घंटे से अधिक समय तक रह सकते हैं, लेकिन मात्रात्मक विश्लेषण के लिए अच्छी गुणवत्ता वाली छवियों (विभिन्न एपिडर्मल सेल प्रकारों के लिए अच्छी तरह से सना हुआ चित्र) प्राप्त करने के लिए इसकी सिफारिश नहीं की जाती है। - ट्यूब से सभी आसुत पानी निकालें। फिर, तुरंत ~ 2 मिनट के लिए टीबीओ धुंधला समाधान (एच 2 ओ में 0.5% टीबीओ, फ़िल्टर किया गया) के ~200μL जोड़ें।
नोट: सुनिश्चित करें कि प्रत्येक कोटिलेडोन नमूना इनक्यूबेशन के दौरान ट्यूबों को धीरे से फ्लिक करके टीबीओ समाधान के समान रूप से उजागर होता है। टीबीओ के साथ ओवरस्टेनिंग को रोकने के लिए (धुंधला होने का समय आवश्यक है और प्रत्येक जीनोटाइप के लिए परिवर्तनशील हो सकता है), एक समय में नमूने युक्त छह से अधिक ट्यूबों को संसाधित न करें। - टीबीओ धुंधला समाधान को यथासंभव अच्छी तरह से हटा दें, और फिर तुरंत 1 एमएल ताजा आसुत जल जोड़कर नमूने को दो बार धो लें।
- अंकुरण के 10 दिनों के बाद, परिवर्तनशीलता को सीमित करने के लिए प्लेट पर अन्य रोपाई के साथ समान रूप से बढ़ रहे व्यक्तिगत रोपाई से कोटिलेडोन में से एक को सावधानीपूर्वक चुनें और काट लें।
- इमेजिंग और डेटा विश्लेषण
- एक माइक्रोस्कोप स्लाइड लें, और 15% ग्लिसरॉल (~ 50 μL) की एक बूंद जोड़ें। अक्षीय पक्ष के साथ कोटिलेडोन को ठीक बल का उपयोग करके स्लाइड पर 15% ग्लिसरॉल में रखें। फिर, धीरे से इसे कवरस्लिप के साथ कवर करें ताकि किसी भी हवा के बुलबुले को नमूने से हटाया जा सके।
- ब्राइटफील्ड माइक्रोस्कोप (चित्रा 1 और चित्रा 2) का उपयोग करके कोटिलेडॉन एपिडर्मिस के अक्षीय पक्ष की छवि बनाएं, और फिर स्टोमेटा और अन्य एपिडर्मल सेल प्रकारों की संख्या की गणना करके एपिडर्मल फेनोटाइप की जांच करें।
- प्रत्येक जीनोटाइप के लिए, जांगड़ा एट अल.17 द्वारा वर्णित निम्नलिखित सूत्रों का उपयोग करके एपिडर्मल फेनोटाइप की गणना करें:
स्टोमेटा सूचकांक (%) = (स्टोमेटा की संख्या / एपिडर्मल कोशिकाओं की कुल संख्या) × 100
स्टोमेटा घनत्व (मिमी -2) = स्टोमेटा/क्षेत्र की संख्या (मिमी2)
नोट: प्रत्येक जीनोटाइप के लिए कम से कम आठ कोटिलेडोन (एन = 8) की छवि, और प्रत्येक जीनोटाइप के एपिडर्मल फेनोटाइप की तुलना जंगली प्रकार के पौधे और / या ट्रांसजेनिक पौधों के फेनोटाइप से करके दस्तावेज करें जो बिना किसी इंड्यूसर के उगाए गए रासायनिक रूप से इंड्यूसेबल ट्रांसजीन को व्यक्त करते हैं।
2. स्टोमेटा पेप्टाइड्स के लिए बायोसेस
नोट: बायोएसे के लिए प्रक्रिया चित्रा 3 में दिखाया गया है।
- बीज नसबंदी और विकास की स्थिति
- ऊपर दिए गए अनुसार प्रत्येक उपचार के लिए ~ 25 बीजों को निष्फल करें, और एक लामिनार प्रवाह हुड में दो 1/2 एमएस आगर प्लेटों में से प्रत्येक पर लगभग आधे बीज बोएं।
नोट: एपिडर्मल सेल पैटर्निंग और भेदभाव पर पेप्टाइड्स की जैविक गतिविधियों का आसानी से पता लगाने के लिए जंगली-प्रकार की पृष्ठभूमि (जैसे, कोल -0) का उपयोग करने के बजाय उच्च और / या कम एपिडर्मल कोशिकाओं (जैसे, ईपीएफ2 2) के साथ जीनोटाइप का उपयोग करें (चित्रा 4)। - अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 दिनों के लिए बीज को स्ट्रैटिफाई करें।
- ~ 10 घंटे के अंतराल पर दो प्लेटों में से प्रत्येक को निकालें, और 1 दिन के लिए 16 घंटे प्रकाश और 8 घंटे अंधेरे की फोटोअवधि के साथ 120 μmol-m-2.s-1 प्रकाश के तहत 22 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटों पर बीजों को इनक्यूबेट करें।
- ऊपर दिए गए अनुसार प्रत्येक उपचार के लिए ~ 25 बीजों को निष्फल करें, और एक लामिनार प्रवाह हुड में दो 1/2 एमएस आगर प्लेटों में से प्रत्येक पर लगभग आधे बीज बोएं।
- पेप्टाइड उपचार और इमेजिंग
- एक लैमिनार प्रवाह हुड में, दो तैयार प्लेटों में से प्रत्येक से 10-12 एक दिन पुराने एराबिडोप्सिस पौधों को सावधानीपूर्वक 24-वेल प्लेट में प्रत्यारोपित करें, जिसमें प्रत्येक कुएं में 1.5 एमएल 1/2 एमएस तरल माध्यम (~ 20 रोपाई प्रति कुआं) होता है।
नोट: रोपाई के लिए पेप्टाइड उपचार का समय पेप्टाइड उपचार के फेनोटाइपिक परिणामों के लिए महत्वपूर्ण है, इसलिए उपचार के लिए दो अलग-अलग अंकुर विकास चरणों को प्राप्त करने के लिए दो अलग-अलग प्लेटों पर बीज तैयार करें। - 1/2 एमएस एगर प्लेटों पर अंकुरित ~ 20 एक दिन पुराने एराबिडोप्सिस पौधों वाले प्रत्येक कुएं में या तो अकेले एक बफर (50 एमएम ट्राइस-एचसीएल [पीएच 8.0]) या पेप्टाइड की दो अलग-अलग सांद्रता (आमतौर पर, 1 μM और 2.5 μM पेप्टाइड) जोड़ें।
नोट: पेप्टाइड समाधान एलिकोट को फ्रीजर से निकालें, और उपचार से पहले उन्हें कुछ मिनटों के लिए आरटी पर रखें। -80 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीजर में संग्रहीत पेप्टाइड्स कुछ वर्षों के लिए स्थिर होते हैं, लेकिन पेप्टाइड समाधान को छोटे एलिकोट में संग्रहीत करके फ्रीज-पिघलना चक्र से बचा जाना चाहिए। - धीरे से रोपाई को अकेले एक बफर या पिपेट का उपयोग करके पेप्टाइड समाधान के साथ मिलाने के बाद, माइक्रोपोर टेप के साथ प्लेट को सील करें। परख प्लेट को लंबे समय तक स्थितियों (16 घंटे फोटोपीरियड, 120 μmol.m-2.s-1 प्रकाश) के तहत 22 डिग्री सेल्सियस पर 5-7 दिनों के लिए इनक्यूबेट करें।
नोट: प्रत्येक अंकुर को पेप्टाइड समाधान के संपर्क में आने की अनुमति देने के लिए रोपाई को एक साथ बढ़ने से रोकें। वातन बढ़ाने के लिए प्लेट को विकास कक्ष में डालने से पहले प्लेट को धीरे से 2-3 घंटे तक घुमाएं। - प्रत्येक अंकुर को कुएं से स्थानांतरित करें जिसमें या तो बफर या पेप्टाइड होता है, कवर स्लाइड पर, और अंकुर के कोटाइलडॉन को विच्छेदित करें। कोटिलेडॉन के अक्षीय पक्ष को बल का उपयोग करके रखें, और इसे छोटे टुकड़ों में काट लें।
- एक और साफ माइक्रोस्कोप स्लाइड लें, और उस पर प्रोपिडियम आयोडाइड समाधान की एक बूंद रखें (~ 25 μL, H 2 O में2mg / mL)।
- कोटिलेडॉन के छोटे टुकड़ों में से एक को फोर्सप्स का उपयोग करके प्रोपिडियम आयोडाइड समाधान की एक बूंद में रखें, और धीरे से कवरस्लिप रखें। किसी भी हवा के बुलबुले को हटाने के लिए कवरस्लिप के किनारे पर अतिरिक्त प्रोपिडियम आयोडाइड समाधान लागू करें।
- कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके कोटिलेडॉन के अक्षीय पक्ष को चित्रित करें, और केवल बफर युक्त 1/2 एमएस माध्यम में उगाए गए पौधों से छवियों के साथ छवियों की तुलना करें।
नोट: चित्रा 4 में प्रस्तुत छवियों को जंगली प्रकार के कोल -0 या ईपीएफ 2 2,5 रोपाई से लिया गया था, जिन्हें केवल बफर (चित्रा 4 ए, बी) या ईपीएफ 2 पेप्टाइड समाधान (चित्रा 4 सी-एफ) के दो बैचों के साथ इलाज किया गया था और 1 वर्ष में -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया गया था।
- एक लैमिनार प्रवाह हुड में, दो तैयार प्लेटों में से प्रत्येक से 10-12 एक दिन पुराने एराबिडोप्सिस पौधों को सावधानीपूर्वक 24-वेल प्लेट में प्रत्यारोपित करें, जिसमें प्रत्येक कुएं में 1.5 एमएल 1/2 एमएस तरल माध्यम (~ 20 रोपाई प्रति कुआं) होता है।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
विभिन्न स्टोमेटा ट्रांसजेनिक पौधों और उत्परिवर्ती में कम या अधिक स्टोमेटा घनत्व और क्लस्टरिंग (ईपीएफ 2,5, ईपीएफ 1 ईपीएफ2,5, टीएमएम 12, एक स्टोमाजेन-साइलेंस लाइन4, और एस्ट्राडियोल-इंड्यूसेबल एस्ट को ले जाने वाली ट्रांसजेनिक लाइनें:: ईपीएफ 1 या ईएसटी:: ईपीएफ 2 ओवरएक्प्रेशन7) के रूप में जाना जाता है। ) का उपयोग यहां प्रस्तुत दो फेनोटाइपिक विश्लेषणों की प्रभावशीलता को प्रदर्शित करने के लिए किया गया था, जिसका उद्देश्य उन जीनों की पहचान करना और चिह्नित करना था जिनकी स्टोमेटा विकास और पैटर्निंग में भूमिका है। विश्लेषण के लिए विभिन्न प्रकार की एपिडर्मल कोशिकाओं को निर्धारित करने के लिए एपिडर्मल छिलके की आवश्यकता के बिना उच्च गुणवत्ता वाले एपिडर्मिस छवियों का उत्पादन करने के लिए, प्रत्येक जीनोटाइप के लिए टीबीओ के साथ नमूना धुंधला समय को पूर्व-समायोजित करना महत्वपूर्ण है, क्योंकि प्रत्येक में जंगली-प्रकार के नियंत्रण (कोल -0) (चित्रा 1 ए और चित्रा 2 ए) की तुलना में अलग-अलग एपिडर्मल फेनोटाइप हो सकते हैं। अनुभव के आधार पर, कम स्टोमेटा वाले जीनोटाइप को टीबीओ (चित्रा 1 बी और चित्रा 2 डी, ई) के साथ लंबे समय तक धुंधला समय की आवश्यकता होती है, जबकि अधिक स्टोमेटा और क्लस्टरिंग वाले जीनोटाइप को कम धुंधला समय (चित्रा 1 सी और चित्रा 2 बी, सी) की आवश्यकता होती है। चूंकि कुल पेप्टाइड समाधान में ठीक से मुड़े हुए पेप्टाइड्स की अलग-अलग मात्रा स्टोमेटा विकास में पेप्टाइड्स की जैविक गतिविधि को मुखौटा कर सकती है, इसलिए बायोएसेस के लिए पेप्टाइड समाधान की अतिरिक्त, उच्च कुल सांद्रता (जैसे, 2.5 μM EPF2) के साथ-साथ जीनोटाइप का उपयोग करना अच्छा अभ्यास है, जिसमें कम या अधिक स्टोमेटा फेनोटाइप (जैसे, epf2) होते हैं। ईपीएफ 2 पेप्टाइड्स की गतिविधि, जिनकी स्टोमेटा दीक्षा को रोकने में भूमिका है, कोल -0 की तुलना में अधिक एपिडर्मल कोशिकाओं के साथ ईपीएफ 2 उत्परिवर्ती का उपयोग करके आसानी से पता लगाया गया था, भले ही तैयार ईपीएफ 2 पेप्टाइड्स के कुछ बैचों में पेप्टाइड के बायोएक्टिव रूपों की कम मात्रा हो (उदाहरण के लिए, चित्रा 4 में ईपीएफ 2 पेप्टाइड समाधान बैच 1)।
चित्रा 1: विभिन्न एपिडर्मल फेनोटाइप का प्रदर्शन करने वाले जीनोटाइप पर टीबीओ के साथ इनक्यूबेशन समय का प्रभाव। तीन एराबिडोप्सिस जीनोटाइप के 10 दिन पुराने पौधों से अक्षीय कोटिलेडॉन छवियां: (ए) वाइल्ड-टाइप (कोल -0), (बी) एक स्टोमाजेन-साइलेंस्ड लाइन (स्टोमाजेन-एमी), और (सी) ईपीएफ 1 ईपीएफ 2 उत्परिवर्ती। कोल-0 जंगली प्रकार के एराबिडोप्सिस नियंत्रण का प्रतिनिधित्व करता है, और स्टोमाजेन-साइलेंस्ड लाइन और ईपीएफ 1 ईपीएफ 2 उत्परिवर्ती क्रमशः स्टोमेटा की कम और उच्च संख्या वाले जीनोटाइप का प्रतिनिधित्व करते हैं। छवियों को 20x उद्देश्य लेंस (0.35 मिमी2 क्षेत्र के दृश्य) के साथ एक उल्टे माइक्रोस्कोप का उपयोग करके लिया गया था। छवियों की गुणवत्ता परिवर्तनशील थी, हालांकि इमेजिंग से पहले विभिन्न जीनोटाइप से सभी कोटिलेडोन नमूने टीबीओ (एच2ओ में 0.5% टीबीओ) के साथ समान समय (2 मिनट) के लिए दाग दिए गए थे। इसलिए, विश्लेषण के लिए अच्छी तरह से दाग वाली छवियों को प्राप्त करने के लिए, प्रत्येक जीनोटाइप के लिए पर्याप्त टीबीओ धुंधला समय निर्धारित करना महत्वपूर्ण है। स्केल बार = 50 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
चित्रा 2: मात्रात्मक विश्लेषण के लिए एपिडर्मल छिलके के उपयोग के बिना टीबीओ-सना एपिडर्मिस छवियां। एपिडर्मल फेनोटाइप के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए एस्ट्राडियोल-इंड्यूसेबल ईपीएफ 2 (ईएसटी:: ईपीएफ 2) या (ई) ईपीएफ 1 ओवरएक्प्रेशन निर्माण (ईएसटी:: ईपीएफ 1) ले जाने वाली ट्रांसजेनिक लाइनों से 10 दिन पुराने पौधों से कोटिलेडॉन की प्रतिनिधि एपिडर्मिस छवियों का उपयोग किया जा सकता है। (ई) में प्रस्तुत छवि लेने के लिए 3 साल से अधिक समय तक फिक्सिंग समाधान में एक कोटिलेडोन का उपयोग किया गया था। छवियों को 20x उद्देश्य लेंस (0.35 मिमी2 क्षेत्र के दृश्य) के साथ एक उल्टे माइक्रोस्कोप का उपयोग करके लिया गया था। कोशिकाओं को टीबीओ धुंधला द्वारा रेखांकित किया गया था, और पूर्ण आकार की छवियों की आधी चौड़ाई प्रदर्शन के लिए प्रस्तुत की गई है। स्केल बार = 50 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
चित्र 3: बायोएस के लिए प्रक्रिया। (A) बीज दो 1/2 एमएस आगर प्लेटों पर बोए जाते हैं और 10 घंटे के अंतराल पर निकाले जाते हैं। (बी) 1 दिन पुराने एराबिडोप्सिस रोपाई को 24-वेल प्लेटों में प्रत्यारोपित किया जाता है जिसमें 1/2 एमएस माध्यम होता है जिसमें मॉक या दो अलग-अलग पेप्टाइड सांद्रता होती है। (सी) 5-7 दिनों के बाद, रोपाई स्टोमेटा विकास और पैटर्निंग में पेप्टाइड्स की जैविक गतिविधि को निर्धारित करने के लिए इमेजिंग के लिए तैयार हैं। (डी) इमेजिंग के लिए माइक्रोस्कोप स्लाइड पर प्रोपिडियम आयोडाइड समाधान की एक बूंद में एक कोटिलेडॉन स्लाइस रखा जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 4: पेप्टाइड उपचार के बाद एराबिडोप्सिस कोटिलेडॉन के अक्षीय एपिडर्मिस की कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी। (ए) जंगली-प्रकार और (बी) ईपीएफ 2 कोटिलेडोन एपिडर्मिस की प्रतिनिधि कॉन्फोकल छवियां एक बफर समाधान में 6-7 दिनों के लिए उगाई जाती हैं और ईपीएफ 2 पेप्टाइड्स के दो अलग-अलग बैचों के साथ उगाई गई (सी-एफ) ईपीएफ 2 कोटिलेडोन एपिडर्मिस। प्रोपिडियम आयोडाइड धुंधला होने को पकड़ने और सेल की रूपरेखा की कल्पना करने के लिए 40x उद्देश्य लेंस (561 एनएम की उत्तेजना और 561 एनएम लॉन्ग-पास उत्सर्जन फिल्टर) का उपयोग करके एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके छवियों को लिया गया था। तैयार किए गए प्रत्येक ईपीएफ 2 पेप्टाइड समाधान में पेप्टाइड्स के ठीक से मुड़े हुए (बायोएक्टिव) और मिसफोल्डेड (निष्क्रिय) रूपों की अलग-अलग मात्रा होती है। इसलिए, स्टोमेटा विकास में संभावित भूमिका के साथ पेप्टाइड्स की प्रारंभिक स्क्रीनिंग के लिए, बायोएसेस के लिए संकेत के रूप में कुल पेप्टाइड समाधानों की दो अलग-अलग सांद्रता का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है। स्केल बार = 30 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
यहां प्रस्तुत स्टोमेटा पैटर्निंग और भेदभाव को नियंत्रित करने वाले जीन की पहचान और विशेषता के लिए दो फेनोटाइपिक विश्लेषण विधियां सुविधाजनक और विश्वसनीय परख हैं क्योंकि प्रोटोकॉल को एपिडर्मल छिलके और विशेष उपकरणों के उपयोग की आवश्यकता नहीं होती है (जो समय लेने वाले होते हैं और नमूना तैयार करने के लिए विशेष प्रशिक्षण की आवश्यकता होती है) लेकिन एपिडर्मल फेनोटाइप के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए उच्च गुणवत्ता वाली छवियों का उत्पादन करते हैं।
टीबीओ-सना हुआ एराबिडोप्सिस कोटिलेडॉन का उपयोग करके फेनोटाइपिक विश्लेषण के लिए इस तकनीक की एक सीमा यह है कि विभिन्न एपिडर्मल सेल प्रकारों के लिए दृश्य कंट्रास्ट के साथ उच्च गुणवत्ता वाली छवियां प्राप्त करना धुंधला समय और ऊतक की अनूठी विशेषताओं पर निर्भर करता है, जो प्रजातियों पर निर्भर और जीनोटाइप-निर्भर दोनों हो सकते हैं (चित्रा 1)18 . एपिडर्मल छिलके का उपयोग करके एपिडर्मल कोशिकाओं का निरीक्षण करने के लिए अन्य फेनोटाइपिंग विधियों में समान चुनौतियां हैं, और उन्हें अधिक समय और विशेष प्रशिक्षण की भी आवश्यकता होती है। डेटा विश्लेषण के लिए पर्याप्त ठीक से सना हुआ एपिडर्मिस छवियों को प्राप्त करने में कठिनाइयों से लंबे समय तक कम स्टोमेटा वाले जीनोटाइप से कोटिलेडोन और कम समय के लिए अधिक स्टोमेटा वाले जीनोटाइप के नमूने को धुंधला करके टाला जा सकता है। प्रत्येक जीनोटाइप के लिए धुंधला समय भी समान एपिडर्मल फेनोटाइप वाले जीनोटाइप के लिए धुंधला समय को अनुकूलित करने के लिए केवल कुछ नमूनों की जांच करके समायोजित किया जा सकता है।
अच्छी तरह से मुड़े हुए बायोएक्टिव पेप्टाइड्स की पर्याप्त मात्रा प्राप्त करना, विशेष रूप से सिस्टीन युक्त पेप्टाइड्स (जो लिगेंड हैं जिनके पास पौधे के विकास को नियंत्रित करने में विविध कार्य हैं, जिसमें स्टोमेटा पैटर्निंग भी शामिल है), एक चुनौती रही है 1,2,3,4,5,6,19,20,21,22,23 . इसके अलावा, भले ही बायोएक्टिव पेप्टाइड्स उत्पन्न होते हैं, विशिष्ट जैविक प्रक्रियाओं में संभावित कार्य करने वाले पेप्टाइड्स की स्क्रीनिंग एक और चुनौतीपूर्ण कार्य है क्योंकि उत्पादित बायोएक्टिव पेप्टाइड्स अक्सर अच्छी तरह से मुड़े हुए, सक्रिय और निष्क्रिय पेप्टाइड्स का मिश्रण होते हैं। यह पेपर संभावित स्टोमेटा पेप्टाइड्स की खोज और विशेषता के लिए एक कुशल बायोसेसे विधि प्रस्तुत करता है। यह विधि विभिन्न महत्वपूर्ण पेप्टाइड्स की पहचान करने में सफल रही है जो एराबिडोप्सिस में स्टोमेटा विकास के विभिन्न पहलुओं को नियंत्रित करते हैं, साथ ही घास ब्रैकीपोडियम 3,4,7,17 भी। हालांकि, इस तकनीक की प्रमुख सीमा फेनोटाइपिक प्रतिक्रियाओं में परिवर्तनशीलता है, जो सबसे अधिक संभावना थोड़ा अलग विकास चरणों और पेप्टाइड समाधानों के साथ रोपाई के उपयोग के कारण होती है जिसमें विभिन्न मात्रा में बायोएक्टिव पेप्टाइड्स होते हैं। इस पद्धति के शुरुआती प्रयासों में स्तरीकरण के बाद पेप्टाइड समाधान युक्त प्लेट के कुओं में सीधे जंगली प्रकार के बीजों का प्लेसमेंट शामिल था। जीनोटाइप के उपयोग के बिना जिनमें अधिक और / या कम एपिडर्मल कोशिकाएं होती हैं (जैसे, ईपीएफ2 2, चित्रा 4) और 1 दिन पुराने एराबिडोप्सिस रोपाई 1/2 एमएस एगर प्लेटों पर अंकुरित होते हैं, कम संख्या में रोपाई बढ़ने और पेप्टाइड अनुप्रयोग के बाद स्पष्ट फेनोटाइपिक प्रतिक्रियाएं दिखाने में सक्षम होती हैं। इस प्रोटोकॉल में, परिवर्तनशीलता के मुद्दे को दो अलग-अलग विकास चरणों के साथ ~ 20 एक दिन पुराने एराबिडोप्सिस रोपाई का उपयोग करके और पेप्टाइड समाधान की दो अलग-अलग सांद्रता (1 μM और 2.5 μM) का उपयोग करके संबोधित किया गया था।
पेप्टाइड-उपचारित नमूनों के एपिडर्मल फेनोटाइप्स का विश्लेषण टीबीओ-दाग वाले नमूनों का उपयोग करके प्रस्तुत पहली फेनोटाइपिक विश्लेषण विधि द्वारा भी किया जा सकता है। यह विधि अपेक्षाकृत आसान मात्रात्मक फेनोटाइपिक विश्लेषण की अनुमति देती है क्योंकि प्रत्येक नमूने के अपेक्षाकृत बड़े क्षेत्र का विश्लेषण किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, यह विधि इमेजिंग के लिए समान परिस्थितियों में तैयार किए गए नमूनों की कटाई के बाद नमूना तैयारी में लचीलापन प्रदान करती है। हालांकि, इस विधि द्वारा ली गई छवियां आम तौर पर उच्चतम गुणवत्ता की नहीं होती हैं। दूसरी ओर, प्रोपिडियम आयोडाइड धुंधला होने के बाद कॉन्फोकल इमेजिंग एपिडर्मल विवरण के साथ उच्च गुणवत्ता वाली छवियां देती है। हालांकि, यह विधि केवल विश्लेषण के लिए ऊतक के एक छोटे से क्षेत्र पर ध्यान केंद्रित करने की अनुमति देती है। इसके अलावा, तैयार किए गए जीवित ऊतकों की केवल एक निश्चित संख्या का एक बार में विश्लेषण किया जा सकता है।
निष्कर्ष में, यहां प्रस्तुत फेनोटाइपिक विश्लेषण का उपयोग स्टोमेटा पैटर्निंग और भेदभाव को नियंत्रित करने वाले संभावित जीनों की त्वरित और प्रभावी परीक्षा के लिए किया जा सकता है, इस प्रकार स्टोमेटा विकास और पेप्टाइड फ़ंक्शन के तंत्र की समझ में सुधार होता है। इसके अलावा, इस बायोसेसे प्रोटोकॉल का उपयोग अन्य छोटे अणुओं की पहचान करने के लिए किया जा सकता है जिनकी एपिडर्मल ऊतक पैटर्निंग में भूमिका होती है और अच्छी तरह से मुड़े हुए बायोएक्टिव पेप्टाइड्स की संरचना निर्धारित करने के लिए प्रारंभिक स्क्रीनिंग विधि के रूप में।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
हितों के टकराव की कोई घोषणा नहीं की गई।
Acknowledgments
इस शोध को प्राकृतिक संसाधन और इंजीनियरिंग अनुसंधान परिषद कनाडा (एनएसईआरसी) डिस्कवरी कार्यक्रम और कॉनकॉर्डिया विश्वविद्यालय के माध्यम से वित्त पोषित किया गया था। के.बी. को भारत से राष्ट्रीय प्रवासी छात्रवृत्ति द्वारा समर्थित किया जाता है।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18 mm x 18 mm cover slip | VWR | 16004-326 | |
| 24-well sterile plates with lid | VWR | CA62406-183 | |
| 3M Micropore surgical tape | Fisher Scientific | 19-027-761 | Microporous surgical paper tape used to seal MS plates |
| 76 x 26 mm Microscope slide | TLG | GEW90-2575-03 | |
| Acetic acid, ≥99.8% | Fisher Scientific | A38-212 | |
| Agar | BioShop | AGR001.1 | |
| Bleech | Household bleach (e.g., Clorox) | ||
| Confocal microscope | Nikon | Nikon C2 operated by NIS-Elements | |
| Ethanol | Greenfield | P210EAAN | |
| FIJI | Open-srouce | (Fiji Is Just) ImageJ v2.1/1.5.3j | Downloaded from https://imagej.net/software/fiji/ |
| Forceps | Sigma-Aldrich | F6521 | |
| Gamborg's vitamin mixture | Cassson Labs | GBL01-100ML | Store at 4 °C |
| Glycerol | Fisher Scientific | G33-4 | |
| Growth chambers | Conviron, model E15 | 16h light cycle, set at 21°C with a light intensity of 120 µmol·m-2·s-1. | |
| Lights | HD Supply | 25272 | Fluorescent lights in growth chambers, Sylvania F72T12/CW/VHO 72"T12 VHO 4200K |
| Microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 14-222-155 | Tubes in which Arabidopsis thaliana seeds are placed to perform sterilization |
| Microscope | Nikon | Nikon Eclipse TiE equipped with a DsRi2 digital camera | |
| Murashige and Skoog basal salts | Cassson Labs | MSP01-1LT | Store at 4 °C |
| Petri Dish 100 mm x 20 mm | Fisher Scientific | 08-757-11Z | Petri dishes in which MS media is poured for the purpose of growing Arabidopsis thaliana |
| Propidium Iodide | VWR | 39139-064 | |
| Scalpel | Fisher Scientific | 08-916-5A | |
| Sucrose | BioShop | SUC700.5 | |
| Toluidine blue O | Sigma-Aldrich | T3260-5G | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-100ML | |
| β-Estradiol | Sigma-Aldrich | E2758 |
References
- Hara, K., Kajita, R., Torii, K. U., Bergmann, D. C., Kakimoto, T. The secretory peptide gene EPF1 enforces the stomatal one-cell-spacing rule. Genes & Development. 21 (14), 1720-1725 (2007).
- Hara, K., et al. Epidermal cell density is autoregulated via a secretory peptide, EPIDERMAL PATTERNING FACTOR 2 in Arabidopsis leaves. Plant & Cell Physiology. 50 (6), 1019-1031 (2009).
- Kondo, T., et al. Stomatal density is controlled by a mesophyll-derived signaling molecule. Plant & Cell Physiology. 51 (1), 1-8 (2010).
- Sugano, S. S., et al. Stomagen positively regulates stomatal density in Arabidopsis. Nature. 463 (7278), 241-244 (2010).
- Hunt, L., Gray, J. E. The signaling peptide EPF2 controls asymmetric cell divisions during stomatal development. Current Biology. 19 (10), 864-869 (2009).
- Hunt, L., Bailey, K. J., Gray, J. E. The signalling peptide EPFL9 is a positive regulator of stomatal development. New Phytologist. 186 (3), 609-614 (2010).
- Lee, J. S., et al. Direct interaction of ligand-receptor pairs specifying stomatal patterning. Genes & Development. 26 (2), 126-136 (2012).
- Shpak, E. D., McAbee, J. M., Pillitteri, L. J., Torii, K. U. Stomatal patterning and differentiation by synergistic interactions of receptor kinases. Science. 309 (5732), 290-293 (2005).
- Nadeau, J. A., Sack, F. D. Control of stomatal distribution on the Arabidopsis leaf surface. Science. 296 (5573), 1697-1700 (2002).
- Meng, X., et al. Differential function of Arabidopsis SERK family receptor-like kinases in stomatal patterning. Current Biology. 25 (18), 2361-2372 (2015).
- Lampard, G. R., Macalister, C. A., Bergmann, D. C. Arabidopsis stomatal initiation is controlled by MAPK-mediated regulation of the bHLH SPEECHLESS. Science. 322 (5904), 1113-1116 (2008).
- Yang, M., Sack, F. D. The too many mouths and four lips mutations affect stomatal production in Arabidopsis. The Plant Cell. 7 (12), 2227-2239 (1995).
- Theunissen, J. D. An improved method for studying grass leaf epidermis. Stain Technology. 64 (5), 239-242 (1989).
- Venkata, B. P., et al. crw1--A novel maize mutant highly susceptible to foliar damage by the western corn rootworm beetle. PLoS One. 8 (8), 71296 (2013).
- Tucker, M. R., et al. Somatic small RNA pathways promote the mitotic events of megagametogenesis during female reproductive development in Arabidopsis. Development. 139 (8), 1399-1404 (2012).
- Ohki, S., Takeuchi, M., Mori, M. The NMR structure of stomagen reveals the basis of stomatal density regulation by plant peptide hormones. Nature Communications. 2, 512 (2011).
- Jangra, R., et al. Duplicated antagonistic EPF peptides optimize grass stomatal initiation. Development. 148 (16), (2021).
- Zhao, C., Craig, J. C., Petzold, H. E., Dickerman, A. W., Beers, E. P. The xylem and phloem transcriptomes from secondary tissues of the Arabidopsis root-hypocotyl. Plant Physiology. 138 (2), 803-818 (2005).
- Uchida, N., et al. Regulation of inflorescence architecture by intertissue layer ligand-receptor communication between endodermis and phloem. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (16), 6337-6342 (2012).
- Tameshige, T., et al. A secreted peptide and its receptors shape the auxin response pattern and leaf margin morphogenesis. Current Biology. 26 (18), 2478-2485 (2016).
- Abrash, E. B., Davies, K. A., Bergmann, D. C. Generation of signaling specificity in Arabidopsis by spatially restricted buffering of ligand-receptor interactions. The Plant Cell. 23 (8), 2864-2879 (2011).
- Uchida, N., Tasaka, M. Regulation of plant vascular stem cells by endodermis-derived EPFL-family peptide hormones and phloem-expressed ERECTA-family receptor kinases. Journal of Experimental Botany. 64 (17), 5335-5343 (2013).
- Kosentka, P. Z., Overholt, A., Maradiaga, R., Mitoubsi, O., Shpak, E. D. EPFL Signals in the boundary region of the SAM restrict its size and promote leaf initiation. Plant Physiology. 179 (1), 265-279 (2019).
