Summary
Dit artikel beschrijft twee fenotyperingsmethoden zonder het gebruik van epidermale peelings om de genen te karakteriseren die de stomatale ontwikkeling regelen. De eerste methode demonstreert hoe een stomataal fenotype kan worden geanalyseerd met behulp van een toluidineblauwe O-gekleurde plantenepidermis. De tweede methode beschrijft hoe stomatale liganden te identificeren en hun biologische activiteiten te volgen.
Abstract
Huidmondjes zijn kleine poriën op het oppervlak van landplanten die betrokken zijn bij gasuitwisseling en waterdampafgifte, en hun functie is van cruciaal belang voor de productiviteit en overleving van planten. Als zodanig heeft het begrijpen van de mechanismen waarmee huidmondjes zich ontwikkelen en patroon een enorme agronomische waarde. Dit artikel beschrijft twee fenotypische methoden met behulp van Arabidopsis zaadlobben die kunnen worden gebruikt om de genen te karakteriseren die de stomatale ontwikkeling en patronen regelen. Eerst worden procedures gepresenteerd voor het analyseren van de stomatale fenotypes met behulp van toluidineblauwe O-gekleurde zaadlobben. Deze methode is snel en betrouwbaar en vereist geen gebruik van epidermale peelings, die veel worden gebruikt voor fenotypische analyses, maar gespecialiseerde training vereisen. Vanwege de aanwezigheid van meerdere cysteïneresiduen is de identificatie en generatie van bioactieve EPF-peptiden die een rol spelen bij de stomatale ontwikkeling een uitdaging geweest. De tweede wordt dus een procedure gepresenteerd die wordt gebruikt om stomatale liganden te identificeren en hun biologische activiteit te controleren door middel van bioassays. Het belangrijkste voordeel van deze methode is dat het relatief gemakkelijk reproduceerbare gegevens produceert, terwijl de hoeveelheid peptide-oplossing en de tijd die nodig is om de rol van de peptiden bij het beheersen van stomatale patronen en ontwikkeling te karakteriseren, worden verminderd. Over het algemeen verbeteren deze goed ontworpen protocollen de efficiëntie van het bestuderen van de potentiële stomatale regulatoren, waaronder cysteïnerijke secretoire peptiden, die zeer complexe structuren vereisen voor hun activiteit.
Introduction
Een goede patroonvorming en differentiatie van de plantenhuidmondjes zijn van cruciaal belang voor hun functie in twee fundamentele biologische processen, fotosynthese en transpiratie, en worden afgedwongen door EPF-peptidesignaleringsroutes. In Arabidopsis controleren drie uitgescheiden cysteïnerijke peptiden, EPF1, EPF2 en STOMAGEEN / EPFL9, verschillende aspecten van stomatale ontwikkeling en worden waargenomen door celoppervlakreceptorcomponenten, waaronder ERECTA-familie receptorkinasen (ER, ERL1 en ERL2), SERKs en TMM 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . Deze herkenning leidt vervolgens tot de downregulatie van de transcriptiefactoren die stomatale differentiatie bevorderen door een MAPK-afhankelijk proces11. De ontdekking van deze kernstomatale genen wordt voornamelijk bereikt door de fenotypische screening van mutanten die epidermale defecten vertonen. Dit artikel presenteert relatief eenvoudige en efficiënte fenotyperingsmethoden voor het visualiseren van de huidmondjes en andere epidermale cellen, die nodig zijn om de potentiële genen te identificeren en te karakteriseren die stomatale patronen en differentiatie regelen.
De observatie van de details van de epidermis van de plant is meestal bereikt door epidermale peelings te gebruiken met of zonder kleuring met een kleurstof zoals toluidineblauw O (TBO) of safranine12,13,14. De grootste uitdaging van deze methoden is echter dat ze gespecialiseerde training vereisen om de bladepidermis te pellen zonder de weefsels te scheuren en om de patroongegevens zorgvuldig te observeren en te analyseren terwijl de afbeeldingen uit verschillende delen van het blad worden vermeden. Chemische behandelingen om de weefselmonsters te zuiveren met reagentia zoals op chloraalhydraat gebaseerde reinigingsoplossingen zijn ook op grote schaal gebruikt voor een verschillende reeks biologische materialen 8,15; Deze behandelingen genereren veel fenotypische informatie door beelden van hoge kwaliteit te leveren, maar vereisen ook het gebruik van gevaarlijke chemicaliën (bijv. Formaldehyde, chloraalhydraat). Dit artikel presenteert eerst een relatief eenvoudige en handige fenotyperingsmethode die beelden produceert die voldoende zijn voor kwantitatieve analyse, maar waarvoor geen gevaarlijke chemicaliën en epidermale bladschillen nodig zijn voor de monstervoorbereiding. Een TBO-gekleurde zaadlobben epidermis is ook ideaal voor de studie van stomatale ontwikkeling omdat het ontbreken van trichomen en de kleinere ontwikkelingsgradiënt in zaadlobben de eenvoudige en handelbare interpretatie van de epidermale fenotypen mogelijk maken.
Stomatale EPF-peptiden behoren tot de groep van plantspecifieke, cysteïnerijke peptiden met relatief grote volwassen afmetingen en intramoleculaire disulfidebindingen tussen geconserveerde cysteïneresiduen. Correcte conformatievouwing is van cruciaal belang voor hun biologische functie, maar cysteïnerijke peptiden, die worden geproduceerd door chemische synthese of een heterologe recombinatiesysteem, kunnen inactief zijn en zijn een mengsel van zowel correct gevouwen als ongevouwen peptiden 3,7,16. De screening van bioactieve peptiden die een rol spelen bij het beheersen van de stomatale ontwikkeling is dus een zeer uitdagende taak geweest. Dit manuscript beschrijft bovendien een bioassay voor de betere identificatie en karakterisering van bioactieve stomatale peptiden. Bij deze methode worden Arabidopsis-zaailingen gedurende 6-7 dagen gekweekt in een multi-well plaat met media met en zonder potentiële peptiden. Vervolgens wordt de zaadlobben epidermis gevisualiseerd met behulp van een confocale microscoop. In het algemeen, om de biologische activiteit van potentiële peptiden in de stomatale ontwikkeling duidelijk te visualiseren, worden de genotypen die meer en / of minder stomatale afstammingscellen produceren, zoals de epf2-mutant, die meer epidermale cellen produceert, en de STOMAGEN-ami-lijn, die een verminderde epidermale celdichtheid 2,4,5 verleent, gebruikt naast de wild-type Arabidopsis-controle (Col-0) voor de bioassays.
Over het algemeen kunnen de twee hier gepresenteerde protocollen worden gebruikt voor de snelle en efficiënte beoordeling van verschillende epidermale fenotypen en voor het screenen van kleine peptiden en hormonen die een rol spelen bij het beheersen van stomatale patronen en ontwikkeling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Arabidopsis zaadlobben kleuren met TBO
- Zaadsterilisatie en groeiomstandigheden
- Steriliseer ~ 30 Arabidopsis-zaden per genotype in een microcentrifugebuis door 1 ml van een zaadsterilisatieoplossing toe te voegen (33% commercieel bleekmiddel, 0,1% Triton X-100) en rock zachtjes gedurende 10-12 minuten bij kamertemperatuur (RT).
OPMERKING: Steriliseer ~30 zaden van het wildtype Arabidopsis accession Columbia (Col-0) en/of ~60 zaden van transgene planten die een chemisch induceerbaar gen dragen (bijv. Est::EPF27) om transgene zaailingen te gebruiken die zijn gekweekt op 1/2 Murashige en Skoog (MS) platen (2,16 g/L met 0,8% agar [w/v]) zonder inductor (bijv. β-oestradiol) als controles (figuur 1 en figuur 2). - Verwijder de sterilisatieoplossing, was de zaden vier keer met 1 ml steriel water in een laminaire stroomkap en resuspensie ze in ~ 200 μL steriele 0,1% agar.
- Zaai ~30 zaden per genotype op 1/2 MS agarplaten of 1/2 MS agarplaten met een inductor (bijv. 10 μM β-oestradiol) voor de chemische inductie van het transgen (bijv. Est::EPF27) met behulp van een pipet en sluit af met microporiëntape.
OPMERKING: De zaden moeten gelijkmatig op de plaat worden verdeeld om te voorkomen dat ze dicht bij elkaar worden geplaatst, omdat dit voorkomt dat de zaailingen gelijkmatig groeien. - Stratificeer de zaden door de platen 3-5 dagen op 4 °C zonder licht te plaatsen om de kieming te synchroniseren.
- Incubeer de platen na stratificatie in een groeikamer bij 22 °C onder 120 μmol·m−2·s−1 licht met een fotoperiode van 16 uur licht en 8 uur donker gedurende 10 dagen.
- Steriliseer ~ 30 Arabidopsis-zaden per genotype in een microcentrifugebuis door 1 ml van een zaadsterilisatieoplossing toe te voegen (33% commercieel bleekmiddel, 0,1% Triton X-100) en rock zachtjes gedurende 10-12 minuten bij kamertemperatuur (RT).
- Bemonstering en TBO-kleuring van Arabidopsis zaadlobben
- Selecteer en knip 10 dagen na het ontkiemen zorgvuldig een van de zaadlobben uit de individuele zaailingen die uniform groeien met andere zaailingen op de plaat om de variabiliteit te beperken.
OPMERKING: Cotyledons worden bemonsterd van 10 dagen oude zaailingen omdat ze geen trichomen en onrijpe epidermiscellen hebben, wat de interpretatie van de epidermale fenotypen vereenvoudigt. - Plaats elke zaadlob met behulp van een tang in een microcentrifugebuis met 1 ml fixatieoplossing (9:1 ethanol tot azijnzuur) en laat het monster een nacht in de fixatieoplossing zitten, minimaal en bij kamertemperatuur.
OPMERKING: De monsters kunnen dan tot een paar jaar in deze toestand worden bewaard. De afbeelding Figuur 2E is genomen van een zaadlobbenmonster dat meer dan 3 jaar in een fixatieoplossing is opgeslagen. Het is belangrijk om de zaadlob onmiddellijk na het snijden in een fixatieoplossing te houden en niet meer dan vijf zaadlobben in elke microcentrifugebuis te plaatsen voor een homogene monstervoorbereiding later. - Verwijder de fixatieoplossing en voeg 1 ml 70% ethanol toe. Nadat u de buis een paar keer hebt omgekeerd, laat u de buis met de monsters ~ 30 minuten op RT staan.
- Herhaal stap 1.2.3 met 1 ml 50% ethanol en vervolgens 20% ethanol.
- Vervang de 1 ml 20% ethanol door 1 ml gedestilleerd water en laat de buis met de zaadlobbige monsters gedurende ~ 30 minuten na het omkeren van de buis een paar keer.
OPMERKING: De monsters kunnen langer dan 24 uur in gedestilleerd water blijven, maar dit wordt niet aanbevolen voor het verkrijgen van afbeeldingen van goede kwaliteit (goed gekleurde afbeeldingen voor verschillende epidermale celtypen) voor kwantitatieve analyse. - Verwijder al het gedestilleerde water uit de buis. Voeg vervolgens onmiddellijk ~ 200 μL TBO-kleuringsoplossing (0,5% TBO in H 2 O, gefilterd) toe gedurende ~2minuten.
OPMERKING: Zorg ervoor dat elk zaadlobbigmonster gelijkmatig wordt blootgesteld aan TBO-oplossing door de buizen tijdens de incubatie voorzichtig te laten flikkeren. Om overkleuring met TBO te voorkomen (de timing van de kleuring is essentieel en kan variabel zijn voor elk genotype), verwerk niet meer dan zes buizen met monsters tegelijk. - Verwijder de TBO-kleuringsoplossing zo grondig mogelijk en was de monsters onmiddellijk een paar keer door 1 ml vers gedestilleerd water toe te voegen.
- Selecteer en knip 10 dagen na het ontkiemen zorgvuldig een van de zaadlobben uit de individuele zaailingen die uniform groeien met andere zaailingen op de plaat om de variabiliteit te beperken.
- Beeldvorming en data-analyse
- Neem een microscoopglaasje en voeg een druppel van 15% glycerol (~ 50 μL) toe. Leg de zaadlob met de abaxiale kant omhoog in 15% glycerol op de dia met behulp van een fijne tang. Bedek het vervolgens voorzichtig met een afdekbrief, zodat eventuele gevormde luchtbellen uit het monster kunnen worden verwijderd.
- Stel de abaxiale kant van de zaadlobben epidermis voor met behulp van een brightfield-microscoop (figuur 1 en figuur 2) en onderzoek vervolgens het epidermale fenotype door het aantal huidmondjes en andere epidermale celtypen te tellen.
- Bereken voor elk genotype het epidermale fenotype met behulp van de volgende formules beschreven door Jangra et al.17:
Stomatale index (%) = (Aantal huidmondjes/Totaal aantal epidermale cellen) × 100
Stomatale dichtheid (mm−2) = Aantal huidmondjes/oppervlakte (mm2)
OPMERKING: Afbeelding van ten minste acht zaadlobben (N = 8) voor elk genotype en documenteer het epidermale fenotype van elk genotype door het te vergelijken met het fenotype van de wilde plant en / of transgene planten die een chemisch induceerbaar transgen tot expressie brengen dat zonder inductor is gekweekt.
2. Bioassays voor stomatale peptiden
OPMERKING: De procedure voor bioassays is weergegeven in figuur 3.
- Zaadsterilisatie en groeiomstandigheden
- Steriliseer ~ 25 zaden voor elke behandeling zoals hierboven, en zaai ongeveer de helft van de zaden op elk van de twee 1/2 MS agarplaten in een laminaire stroomkap.
OPMERKING: Gebruik het genotype met hoge en/of lage epidermale cellen (bijv. epf22) in plaats van een wild-type achtergrond (bijv. Col-0) om gemakkelijk de biologische activiteiten van de peptiden op de epidermale celpatronen en differentiatie te detecteren (figuur 4). - Stratificeer de zaden gedurende 3 dagen bij 4 °C in het donker.
- Haal elk van de twee platen eruit met intervallen van ~10 uur en incuber de zaden op platen bij 22 °C onder 120 μmol·m−2·s−1 licht met een fotoperiode van 16 uur licht en 8 uur donker gedurende 1 dag.
- Steriliseer ~ 25 zaden voor elke behandeling zoals hierboven, en zaai ongeveer de helft van de zaden op elk van de twee 1/2 MS agarplaten in een laminaire stroomkap.
- Peptide behandeling en beeldvorming
- Transplanteer in een laminaire stroomkap zorgvuldig 10-12 aramidopsis-zaailingen van een dag oud van elk van de twee voorbereide platen in een 24-putplaat met 1,5 ml 1/2 MS vloeibaar medium in elke put (~ 20 zaailingen per put).
OPMERKING: De timing van de peptidebehandeling voor de zaailingen is van cruciaal belang voor de fenotypische resultaten van de peptidebehandeling, dus bereid de zaden op twee afzonderlijke platen voor om twee verschillende ontwikkelingsstadia van zaailingen voor de behandeling te verkrijgen. - Voeg ofwel een buffer alleen (50 mM Tris-HCl [pH 8,0]) of twee verschillende concentraties van het peptide (typisch 1 μM en 2,5 μM peptide in 50 mM Tris-HCl [pH 8,0]) toe aan elke put met ~ 20 een dag oude Arabidopsis-zaailingen ontkiemd op 1/2 MS agarplaten.
OPMERKING: Verwijder de aliquots van de peptideoplossing uit een vriezer en bewaar ze een paar minuten voor de behandeling bij RT. Peptiden die in een vriezer bij −80 °C worden bewaard, zijn een paar jaar stabiel, maar vries-dooicycli moeten worden vermeden door de peptideoplossing in kleine aliquots op te slaan. - Nadat u de zaailingen voorzichtig hebt gemengd met alleen een buffer of een peptideoplossing met behulp van een pipet, sluit u de plaat af met microporiëntape. Incubeer de testplaat onder langdurige omstandigheden (16 uur fotoperiode, 120 μmol·m−2·s−1 licht) gedurende 5-7 dagen bij 22 °C.
OPMERKING: Voorkom dat de zaailingen te dicht bij elkaar groeien om elke zaailing gelijkmatig bloot te stellen aan de peptide-oplossing. Draai de plaat voorzichtig gedurende 2-3 uur voordat u de plaat in een groeikamer incubeert om de beluchting te verhogen. - Breng elke zaailing over uit de put met alleen buffer of peptide op een afdekplaat en ontleed de zaadlob van de zaailing. Plaats de abaxiale kant van de zaadlob omhoog met een tang en snijd deze in kleine stukjes.
- Neem nog een schone microscoopglaasje en plaats daarop een druppel propidiumjodide-oplossing (~ 25 μL, 2 mg / ml in H2O).
- Plaats een van de kleine stukjes zaadlob in een druppel propidiumjodide-oplossing met een tang en plaats voorzichtig de dekslip. Breng extra propidiumjodide-oplossing aan op de rand van de afdekplaat om eventuele luchtbellen te verwijderen.
- Beeld de abaxiale kant van de zaadlob af met een confocale microscoop en vergelijk de afbeeldingen met de afbeeldingen van zaailingen gekweekt in 1/2 MS-medium dat alleen buffer bevat.
OPMERKING: De afbeeldingen in figuur 4 zijn genomen van wild-type Col-0 of epf22,5 zaailingen die werden behandeld met alleen buffer (figuur 4A, B) of twee partijen EPF2-peptideoplossing (figuur 4C-F) en werden opgeslagen bij −80 °C gedurende 1 jaar.
- Transplanteer in een laminaire stroomkap zorgvuldig 10-12 aramidopsis-zaailingen van een dag oud van elk van de twee voorbereide platen in een 24-putplaat met 1,5 ml 1/2 MS vloeibaar medium in elke put (~ 20 zaailingen per put).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Verschillende stomatale transgene planten en mutanten waarvan bekend is dat ze minder of meer stomatale dichtheid en clustering hebben (epf2 2,5, epf1 epf2 2,5, tmm12, een STOMAGEN-gedempte lijn4, en transgene lijnen met de estradiol-induceerbare Est::EPF1 of Est::EPF2 overexpressieconstruct7 ) werden gebruikt om de effectiviteit aan te tonen van de twee fenotypische analyses die hier worden gepresenteerd, die gericht waren op het identificeren en karakteriseren van de genen die een rol spelen bij de stomatale ontwikkeling en patroonvorming. Om epidermisbeelden van hoge kwaliteit te produceren zonder dat epidermale peelings nodig zijn om de verschillende soorten epidermale cellen voor analyse te kwantificeren, is het van cruciaal belang om de monsterkleuringstijd vooraf aan te passen met TBO voor elk genotype, omdat elk type verschillende epidermale fenotypen kan hebben in vergelijking met die van de wild-type controle (Col-0) (figuur 1A en figuur 2A). Op basis van ervaring vereisen genotypen met minder huidmondjes langere kleuringstijden met TBO (figuur 1B en figuur 2D,E), terwijl genotypen met meer huidmondjes en clustering kortere kleuringstijden vereisen (figuur 1C en figuur 2B,C). Aangezien verschillende hoeveelheden goed gevouwen peptiden in de totale peptideoplossing de biologische activiteit van de peptiden in de stomatale ontwikkeling kunnen maskeren, is het een goede gewoonte om aanvullende, hogere totale concentraties van de peptideoplossing (bijv. 2,5 μM EPF2) te gebruiken, evenals genotypen met minder of meer stomatale fenotypen (bijv. epf2), voor de bioassays. De activiteit van EPF2-peptiden, die een rol spelen bij het remmen van stomatale initiatie, werd gemakkelijk gedetecteerd door epf2-mutanten te gebruiken met meer epidermale cellen dan Col-0, zelfs als bepaalde batches van de bereide EPF2-peptiden kleinere hoeveelheden van de bioactieve vormen van het peptide hadden (bijv. EPF2-peptideoplossing batch 1 in figuur 4).
Figuur 1: Het effect van de incubatietijd met TBO op de genotypen die verschillende epidermale fenotypen vertonen. Abaxiale zaadlobben beelden van 10 dagen oude zaailingen van drie Arabidopsis genotypes: (A) wild-type (Col-0), (B) een STOMAGEN-silenced line (STOMAGEN-ami), en (C) epf1 epf2 mutanten. Col-0 vertegenwoordigt de wild-type Arabidopsis controle, en de STOMAGEN-silenced lijn en de epf1 epf2 mutanten vertegenwoordigen de genotypen met respectievelijk lage en hoge aantallen huidmondjes. De beelden zijn gemaakt met een omgekeerde microscoop met een 20x objectieflens (0,35 mm2 gezichtsveld). De kwaliteit van de beelden was variabel, hoewel alle zaadlobbmonsters van de verschillende genotypen gedurende dezelfde tijd (2 min) vóór de beeldvorming werden gekleurd met TBO (0,5% TBO in H2O). Daarom is het belangrijk om, om goed gekleurde beelden voor analyse te verkrijgen, vooraf de juiste TBO-kleuringstijd voor elk genotype te bepalen. Schaalbalk = 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: TBO-gekleurde epidermisbeelden zonder het gebruik van epidermale peelings voor kwantitatieve analyse. Representatieve epidermisbeelden van zaadlobben van 10 dagen oude zaailingen van (A) wild-type (Col-0), (B) tmm en (C,D) transgene lijnen met een oestradiol-induceerbare EPF2 (Est::EPF2) of (E) EPF1 overexpressieconstruct (Est::EPF1) kunnen worden gebruikt voor de kwantitatieve analyse van het epidermale fenotype. Een zaadlob in een fixatieoplossing gedurende meer dan 3 jaar werd gebruikt om het beeld te maken dat in (E) wordt gepresenteerd. De beelden zijn gemaakt met een omgekeerde microscoop met een 20x objectieflens (0,35 mm2 gezichtsveld). De cellen werden omlijnd door TBO-kleuring en de helft van de breedte van de afbeeldingen op ware grootte wordt gepresenteerd voor weergave. Schaalbalk = 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Procedure voor de bioassays . (A) De zaden worden gezaaid op twee 1/2 MS agarplaten en met tussenpozen van 10 uur verwijderd. (B) De 1 dag oude Arabidopsis-zaailingen worden getransplanteerd naar 24-putplaten met 1/2 MS-medium met nep- of twee verschillende peptideconcentraties. (C) Na 5-7 dagen zijn de zaailingen klaar voor beeldvorming om de biologische activiteit van de peptiden in stomatale ontwikkeling en patronen te bepalen. (D) Een schijfje zaadlob wordt in een druppel propidiumjodide-oplossing op een microscoopglaasje geplaatst voor beeldvorming. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Confocale microscopie van de abaxiale epidermis van Arabidopsis cotyledons na peptidebehandeling. Representatieve confocale beelden van (A) wild-type en (B) epf2 cotyledon epidermis gekweekt gedurende 6-7 dagen in een bufferoplossing en een (C-F) epf2 cotyledon epidermis gekweekt met twee verschillende partijen EPF2 peptiden. De beelden werden genomen met een confocale microscoop met behulp van een 40x objectieve lens (excitatie van 561 nm en een 561 nm long-pass emissiefilter) om de propidiumjodidekleuring vast te leggen en de celcontouren te visualiseren. Elke bereide EPF2-peptideoplossing heeft verschillende hoeveelheden goed gevouwen (bioactieve) en verkeerd gevouwen (inactieve) vormen van de peptiden. Daarom wordt voor de eerste screening van peptiden met een mogelijke rol in de stomatale ontwikkeling aanbevolen om twee verschillende concentraties van de totale peptideoplossingen te gebruiken zoals aangegeven voor de bioassays. Schaalbalk = 30 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De twee fenotypische analysemethoden voor het identificeren en karakteriseren van de genen die stomatale patronen en differentiatie regelen, die hier worden gepresenteerd, zijn handige en betrouwbare testen, omdat de protocollen geen epidermale peelings en gespecialiseerde apparatuur vereisen (die tijdrovend zijn en speciale training vereisen voor monstervoorbereiding), maar wel beelden van hoge kwaliteit produceren voor de kwantitatieve analyse van epidermale fenotypen.
Een beperking van deze techniek voor fenotypische analyse met behulp van TBO-gekleurde Arabidopsis zaadlobben is dat het verkrijgen van hoogwaardige beelden met visueel contrast voor verschillende epidermale celtypen afhankelijk is van de kleuringstijd en de unieke kenmerken van het weefsel, die zowel soortafhankelijk als genotype-afhankelijk kunnen zijn (figuur 1)18 . Andere fenotyperingsmethoden om epidermale cellen te observeren met behulp van epidermale peelings hebben dezelfde uitdagingen en vereisen ook meer tijd en speciale training. Moeilijkheden bij het verkrijgen van goed gekleurde epidermisbeelden die voldoende zijn voor gegevensanalyse kunnen worden vermeden door zaadlobben van genotypen met minder huidmondjes gedurende langere tijd en monsters van genotypen met meer huidmondjes gedurende kortere perioden te kleuren. De kleuringstijd voor elk genotype kan ook worden aangepast door eerst slechts enkele monsters te controleren om de kleuringstijd voor genotypen met vergelijkbare epidermale fenotypen te optimaliseren.
Het verkrijgen van een voldoende hoeveelheid goed gevouwen bioactieve peptiden, met name cysteïnerijke peptiden (liganden die verschillende functies hebben bij het beheersen van de ontwikkeling van planten, waaronder stomatale patronen), is een uitdaging geweest 1,2,3,4,5,6,19,20,21,22,23 . Bovendien, zelfs als bioactieve peptiden worden gegenereerd, is het screenen van peptiden die potentiële functies hebben in specifieke biologische processen een andere uitdagende taak omdat de geproduceerde bioactieve peptiden vaak een mengsel zijn van goed gevouwen, actieve en inactieve peptiden. Dit artikel presenteert een efficiënte bioassaymethode om potentiële stomatale peptiden te ontdekken en te karakteriseren. Deze methode is succesvol geweest in het identificeren van verschillende belangrijke peptiden die verschillende aspecten van stomatale ontwikkeling in Arabidopsis beheersen, evenals het gras Brachypodium 3,4,7,17. De belangrijkste beperking van deze techniek is echter de variabiliteit in de fenotypische reacties, die hoogstwaarschijnlijk optreedt als gevolg van het gebruik van zaailingen met enigszins verschillende ontwikkelingsstadia en peptideoplossingen die verschillende hoeveelheden bioactieve peptiden bevatten. Vroege pogingen tot deze methode betroffen de plaatsing van wilde zaden direct in de putten van een plaat met een peptide-oplossing na stratificatie. Zonder het gebruik van genotypen met meer en/of minder epidermale cellen (bijv. epf2 2, figuur 4) en 1 dag oude Arabidopsis-zaailingen ontkiemd op 1/2 MS agarplaten, kan een lager aantal zaailingen groeien en duidelijke fenotypische reacties vertonen na de peptidetoepassing. In dit protocol werd het variabiliteitsprobleem aangepakt door ~ 20 één dag oude Arabidopsis-zaailingen met twee verschillende ontwikkelingsstadia te gebruiken en door twee verschillende concentraties peptideoplossing (1 μM en 2,5 μM) te gebruiken.
De epidermale fenotypen van de met peptiden behandelde monsters kunnen ook worden geanalyseerd met behulp van de eerste fenotypische analysemethode die wordt gepresenteerd met behulp van TBO-gekleurde monsters. Deze methode maakt een relatief eenvoudige kwantitatieve fenotypische analyse mogelijk omdat een relatief groot gebied van elk monster kan worden geanalyseerd. Bovendien biedt deze methode flexibiliteit bij de monstervoorbereiding na het oogsten van monsters die onder dezelfde omstandigheden zijn voorbereid voor beeldvorming. De foto's die met deze methode worden gemaakt, zijn echter over het algemeen niet van de hoogste kwaliteit. Aan de andere kant geeft confocale beeldvorming na propidiumjodidekleuring beelden van hogere kwaliteit met epidermale details. Deze methode maakt het echter alleen mogelijk om op een klein gebied van weefsel te focussen voor analyse. Bovendien kan slechts een bepaald aantal van de bereide levende weefsels in één keer worden geanalyseerd.
Kortom, de hier gepresenteerde fenotypische analyse kan worden gebruikt voor het snelle en effectieve onderzoek van de potentiële genen die stomatale patronen en differentiatie regelen, waardoor het begrip van de mechanismen van stomatale ontwikkeling en peptidefunctie wordt verbeterd. Bovendien kan dit bioassay-protocol worden gebruikt om andere kleine moleculen te identificeren die een rol spelen bij epidermale weefselpatronen en als een eerste screeningsmethode om de structuur van goed gevouwen bioactieve peptiden te bepalen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Er werden geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd gefinancierd door het Natural Resources and Engineering Research Council of Canada (NSERC) Discovery-programma en Concordia University. K.B. wordt ondersteund door de National Overseas Scholarship uit India.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18 mm x 18 mm cover slip | VWR | 16004-326 | |
| 24-well sterile plates with lid | VWR | CA62406-183 | |
| 3M Micropore surgical tape | Fisher Scientific | 19-027-761 | Microporous surgical paper tape used to seal MS plates |
| 76 x 26 mm Microscope slide | TLG | GEW90-2575-03 | |
| Acetic acid, ≥99.8% | Fisher Scientific | A38-212 | |
| Agar | BioShop | AGR001.1 | |
| Bleech | Household bleach (e.g., Clorox) | ||
| Confocal microscope | Nikon | Nikon C2 operated by NIS-Elements | |
| Ethanol | Greenfield | P210EAAN | |
| FIJI | Open-srouce | (Fiji Is Just) ImageJ v2.1/1.5.3j | Downloaded from https://imagej.net/software/fiji/ |
| Forceps | Sigma-Aldrich | F6521 | |
| Gamborg's vitamin mixture | Cassson Labs | GBL01-100ML | Store at 4 °C |
| Glycerol | Fisher Scientific | G33-4 | |
| Growth chambers | Conviron, model E15 | 16h light cycle, set at 21°C with a light intensity of 120 µmol·m-2·s-1. | |
| Lights | HD Supply | 25272 | Fluorescent lights in growth chambers, Sylvania F72T12/CW/VHO 72"T12 VHO 4200K |
| Microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 14-222-155 | Tubes in which Arabidopsis thaliana seeds are placed to perform sterilization |
| Microscope | Nikon | Nikon Eclipse TiE equipped with a DsRi2 digital camera | |
| Murashige and Skoog basal salts | Cassson Labs | MSP01-1LT | Store at 4 °C |
| Petri Dish 100 mm x 20 mm | Fisher Scientific | 08-757-11Z | Petri dishes in which MS media is poured for the purpose of growing Arabidopsis thaliana |
| Propidium Iodide | VWR | 39139-064 | |
| Scalpel | Fisher Scientific | 08-916-5A | |
| Sucrose | BioShop | SUC700.5 | |
| Toluidine blue O | Sigma-Aldrich | T3260-5G | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-100ML | |
| β-Estradiol | Sigma-Aldrich | E2758 |
References
- Hara, K., Kajita, R., Torii, K. U., Bergmann, D. C., Kakimoto, T. The secretory peptide gene EPF1 enforces the stomatal one-cell-spacing rule. Genes & Development. 21 (14), 1720-1725 (2007).
- Hara, K., et al. Epidermal cell density is autoregulated via a secretory peptide, EPIDERMAL PATTERNING FACTOR 2 in Arabidopsis leaves. Plant & Cell Physiology. 50 (6), 1019-1031 (2009).
- Kondo, T., et al. Stomatal density is controlled by a mesophyll-derived signaling molecule. Plant & Cell Physiology. 51 (1), 1-8 (2010).
- Sugano, S. S., et al. Stomagen positively regulates stomatal density in Arabidopsis. Nature. 463 (7278), 241-244 (2010).
- Hunt, L., Gray, J. E. The signaling peptide EPF2 controls asymmetric cell divisions during stomatal development. Current Biology. 19 (10), 864-869 (2009).
- Hunt, L., Bailey, K. J., Gray, J. E. The signalling peptide EPFL9 is a positive regulator of stomatal development. New Phytologist. 186 (3), 609-614 (2010).
- Lee, J. S., et al. Direct interaction of ligand-receptor pairs specifying stomatal patterning. Genes & Development. 26 (2), 126-136 (2012).
- Shpak, E. D., McAbee, J. M., Pillitteri, L. J., Torii, K. U. Stomatal patterning and differentiation by synergistic interactions of receptor kinases. Science. 309 (5732), 290-293 (2005).
- Nadeau, J. A., Sack, F. D. Control of stomatal distribution on the Arabidopsis leaf surface. Science. 296 (5573), 1697-1700 (2002).
- Meng, X., et al. Differential function of Arabidopsis SERK family receptor-like kinases in stomatal patterning. Current Biology. 25 (18), 2361-2372 (2015).
- Lampard, G. R., Macalister, C. A., Bergmann, D. C. Arabidopsis stomatal initiation is controlled by MAPK-mediated regulation of the bHLH SPEECHLESS. Science. 322 (5904), 1113-1116 (2008).
- Yang, M., Sack, F. D. The too many mouths and four lips mutations affect stomatal production in Arabidopsis. The Plant Cell. 7 (12), 2227-2239 (1995).
- Theunissen, J. D. An improved method for studying grass leaf epidermis. Stain Technology. 64 (5), 239-242 (1989).
- Venkata, B. P., et al. crw1--A novel maize mutant highly susceptible to foliar damage by the western corn rootworm beetle. PLoS One. 8 (8), 71296 (2013).
- Tucker, M. R., et al. Somatic small RNA pathways promote the mitotic events of megagametogenesis during female reproductive development in Arabidopsis. Development. 139 (8), 1399-1404 (2012).
- Ohki, S., Takeuchi, M., Mori, M. The NMR structure of stomagen reveals the basis of stomatal density regulation by plant peptide hormones. Nature Communications. 2, 512 (2011).
- Jangra, R., et al. Duplicated antagonistic EPF peptides optimize grass stomatal initiation. Development. 148 (16), (2021).
- Zhao, C., Craig, J. C., Petzold, H. E., Dickerman, A. W., Beers, E. P. The xylem and phloem transcriptomes from secondary tissues of the Arabidopsis root-hypocotyl. Plant Physiology. 138 (2), 803-818 (2005).
- Uchida, N., et al. Regulation of inflorescence architecture by intertissue layer ligand-receptor communication between endodermis and phloem. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (16), 6337-6342 (2012).
- Tameshige, T., et al. A secreted peptide and its receptors shape the auxin response pattern and leaf margin morphogenesis. Current Biology. 26 (18), 2478-2485 (2016).
- Abrash, E. B., Davies, K. A., Bergmann, D. C. Generation of signaling specificity in Arabidopsis by spatially restricted buffering of ligand-receptor interactions. The Plant Cell. 23 (8), 2864-2879 (2011).
- Uchida, N., Tasaka, M. Regulation of plant vascular stem cells by endodermis-derived EPFL-family peptide hormones and phloem-expressed ERECTA-family receptor kinases. Journal of Experimental Botany. 64 (17), 5335-5343 (2013).
- Kosentka, P. Z., Overholt, A., Maradiaga, R., Mitoubsi, O., Shpak, E. D. EPFL Signals in the boundary region of the SAM restrict its size and promote leaf initiation. Plant Physiology. 179 (1), 265-279 (2019).
