Summary
Questo articolo descrive due metodi di fenotipizzazione senza l'uso di peeling epidermici per caratterizzare i geni che controllano lo sviluppo stomatico. Il primo metodo dimostra come analizzare un fenotipo stomatico utilizzando un'epidermide vegetale colorata con O-colorata con toluidina blu. Il secondo metodo descrive come identificare i ligandi stomatici e monitorare le loro attività biologiche.
Abstract
Gli stomi sono piccoli pori sulla superficie delle piante terrestri che sono coinvolti nello scambio di gas e nel rilascio di vapore acqueo e la loro funzione è fondamentale per la produttività e la sopravvivenza delle piante. Come tale, comprendere i meccanismi con cui gli stomi si sviluppano e modellano ha un enorme valore agronomico. Questo articolo descrive due metodi fenotipici che utilizzano Arabidopsis cotiledoni che possono essere utilizzati per caratterizzare i geni che controllano lo sviluppo e il pattern stomatico. Le prime sono le procedure per l'analisi dei fenotipi stomatici utilizzando cotiledoni blu O-colorati con toluidina. Questo metodo è veloce e affidabile e non richiede l'uso di peeling epidermici, che sono ampiamente utilizzati per le analisi fenotipiche ma richiedono una formazione specializzata. A causa della presenza di residui multipli di cisteina, l'identificazione e la generazione di peptidi EPF bioattivi che hanno un ruolo nello sviluppo stomatico sono stati impegnativi. Pertanto, il secondo è presentato è una procedura utilizzata per identificare i ligandi stomatici e monitorare la loro attività biologica mediante saggi biologici. Il vantaggio principale di questo metodo è che produce dati riproducibili in modo relativamente semplice, riducendo la quantità di soluzione peptidica e il tempo necessario per caratterizzare il ruolo dei peptidi nel controllo del pattern e dello sviluppo stomatico. Nel complesso, questi protocolli ben progettati migliorano l'efficienza dello studio dei potenziali regolatori stomatici, compresi i peptidi secretori ricchi di cisteina, che richiedono strutture altamente complesse per la loro attività.
Introduction
Il corretto pattern e differenziazione degli stomi vegetali sono fondamentali per la loro funzione in due processi biologici fondamentali, la fotosintesi e la traspirazione, e sono applicati dalle vie di segnalazione del peptide EPF. In Arabidopsis, tre peptidi ricchi di cisteina secreti, EPF1, EPF2 e STOMAGEN / EPFL9, controllano diversi aspetti dello sviluppo stomatico e sono percepiti dai componenti del recettore della superficie cellulare, tra cui le chinasi del recettore della famiglia ERECTA (ER, ERL1 e ERL2), SERK e TMM 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . Questo riconoscimento porta quindi alla downregulation dei fattori di trascrizione che promuovono la differenziazione stomatica mediante un processo MAPK-dipendente11. La scoperta di questi geni stomatici fondamentali è ottenuta principalmente dallo screening fenotipico di mutanti che presentano difetti epidermici. Questo articolo presenta metodi di fenotipizzazione relativamente semplici ed efficienti per visualizzare gli stomi e altre cellule epidermiche, che sono necessari per identificare e caratterizzare i potenziali geni che controllano il pattern e la differenziazione stomatica.
L'osservazione dei dettagli dell'epidermide vegetale è stata tipicamente ottenuta utilizzando peeling epidermici con o senza colorazione con un colorante come il blu di toluidina O (TBO) o la safranina12,13,14. Tuttavia, la sfida principale di questi metodi è che richiedono una formazione specializzata per sbucciare l'epidermide fogliare senza strappare i tessuti e per osservare e analizzare attentamente i dati di pattern evitando le immagini prese da diverse parti della foglia. Anche i trattamenti chimici per eliminare i campioni di tessuto con reagenti come le soluzioni di clearing a base di cloralio idrato sono stati ampiamente utilizzati per una vasta gamma di materiali biologici 8,15; Questi trattamenti generano una grande quantità di informazioni fenotipiche fornendo immagini di alta qualità, ma richiedono anche l'uso di sostanze chimiche pericolose (ad esempio, formaldeide, idrato di cloralio). Questo documento presenta innanzitutto un metodo di fenotipizzazione relativamente facile e conveniente che produce immagini sufficienti per l'analisi quantitativa, ma non richiede l'uso di sostanze chimiche pericolose e bucce fogliari epidermiche per la preparazione del campione. Un'epidermide cotiledonica colorata con TBO è ideale anche per lo studio dello sviluppo stomatico perché la mancanza di tricomi e il minore gradiente di sviluppo nei cotiledoni consentono l'interpretazione semplice e trattabile dei fenotipi epidermici.
I peptidi EPF stomatici appartengono al gruppo di peptidi ricchi di cisteina specifici per le piante che hanno dimensioni mature relativamente grandi e legami disolfuro intramolecolari tra residui di cisteina conservati. Il corretto ripiegamento conformazionale è fondamentale per la loro funzione biologica, ma i peptidi ricchi di cisteina, che sono prodotti dalla sintesi chimica o da un sistema di ricombinazione eterologo, possono essere inattivi e sono una miscela dipeptidi 3,7,16 correttamente piegati e dispiegati. Pertanto, lo screening dei peptidi bioattivi che hanno un ruolo nel controllo dello sviluppo stomatico è stato un compito molto impegnativo. Questo manoscritto descrive inoltre un saggio biologico per una migliore identificazione e caratterizzazione dei peptidi stomatici bioattivi. In questo metodo, le piantine di Arabidopsis vengono coltivate in una piastra multi-pozzetto contenente mezzi con e senza potenziali peptidi per 6-7 giorni. Quindi, l'epidermide cotiledone viene visualizzata utilizzando un microscopio confocale. In generale, per visualizzare chiaramente l'attività biologica di potenziali peptidi nello sviluppo stomatico, vengono utilizzati i genotipi che producono più e/o meno cellule della linea stomatica, come il mutante epf2, che produce più cellule epidermiche, e la linea STOMAGEN-ami, che conferisce una ridotta densità delle cellule epidermiche 2,4,5, in aggiunta al controllo wild-type Arabidopsis (Col-0) per i saggi biologici.
Nel complesso, i due protocolli qui presentati possono essere utilizzati per la valutazione rapida ed efficiente di vari fenotipi epidermici e per lo screening di piccoli peptidi e ormoni che hanno un ruolo nel controllo del pattern e dello sviluppo stomatico.
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Protocol
1. Colorazione dei cotiledoni di Arabidopsis con TBO
- Sterilizzazione dei semi e condizioni di crescita
- Sterilizzare ~30 semi di Arabidopsis per genotipo in una provetta da microcentrifuga aggiungendo 1 ml di una soluzione di sterilizzazione dei semi (33% di candeggina commerciale, 0,1% Triton X-100) e dosare delicatamente per 10-12 minuti a temperatura ambiente (RT).
NOTA: Sterilizzare ~30 semi di Arabidopsis shire (Col-0) e/o ~60 semi di piante transgeniche portatrici di un gene chimicamente inducibile (ad esempio, Est::EPF27) per utilizzare piantine transgeniche coltivate su 1/2 piastre di Murashige e Skoog (MS) (2,16 g/L contenenti 0,8% di agar [p/v]) senza induttore (ad esempio, β-estradiolo) come controlli (Figura 1 e Figura 2). - Rimuovere la soluzione di sterilizzazione, lavare i semi quattro volte con 1 ml di acqua sterile in una cappa a flusso laminare e risospenderli in ~ 200 μL di agar sterile allo 0,1%.
- Seminare ~30 semi per genotipo su piastre di agar 1/2 MS o 1/2 piastre di agar MS contenenti un induttore (ad esempio, 10 μM β-estradiolo) per l'induzione chimica del transgene (ad esempio, Est::EPF27) usando una pipetta e sigillare con nastro micropore.
NOTA: I semi devono essere distribuiti uniformemente sul piatto per evitare di metterli nelle immediate vicinanze, in quanto ciò impedirà alle piantine di crescere uniformemente. - Stratificare i semi ponendo le piastre a 4 °C senza luce per 3-5 giorni per sincronizzare la germinazione.
- Dopo la stratificazione, incubare le placche in una camera di crescita a 22 °C sotto 120 μmol·m−2·s−1 di luce con un fotoperiodo di 16 ore di luce e 8 ore di buio per 10 giorni.
- Sterilizzare ~30 semi di Arabidopsis per genotipo in una provetta da microcentrifuga aggiungendo 1 ml di una soluzione di sterilizzazione dei semi (33% di candeggina commerciale, 0,1% Triton X-100) e dosare delicatamente per 10-12 minuti a temperatura ambiente (RT).
- Campionamento e colorazione TBO di Arabidopsis cotiledoni
- A 10 giorni dalla germinazione, selezionare attentamente e ritagliare uno dei cotiledoni dalle singole piantine che crescono uniformemente con altre piantine sul piatto per limitare la variabilità.
NOTA: I cotiledoni sono campionati da piantine di 10 giorni perché non hanno tricomi e cellule epidermiche immature, il che semplifica l'interpretazione dei fenotipi epidermici. - Porre ciascun cotiledone in una provetta da microcentrifuga contenente 1 mL di una soluzione di fissaggio (etanolo 9:1 in acido acetico) usando una pinza e lasciare il campione nella soluzione di fissaggio per una notte, almeno e a temperatura ambiente.
NOTA: I campioni possono quindi essere conservati fino a un paio d'anni in questa condizione. L'immagine Figura 2E è stata presa da un campione di cotiledone che è stato conservato in soluzione di fissaggio per oltre 3 anni. È importante conservare il cotiledone in una soluzione di fissaggio immediatamente dopo il taglio e posizionare non più di cinque cotiledoni in ciascuna provetta da microcentrifuga per una successiva preparazione omogenea del campione. - Rimuovere la soluzione di fissaggio e aggiungere 1 mL di etanolo al 70%. Dopo aver invertito il tubo un paio di volte, lasciare il tubo contenente i campioni a RT per ~ 30 min.
- Ripetere il passaggio 1.2.3 utilizzando 1 ml di etanolo al 50% e poi al 20% di etanolo.
- Sostituire 1 mL di etanolo al 20% con 1 mL di acqua distillata, quindi lasciare il tubo contenente i campioni di cotiledone per ~ 30 minuti dopo aver invertito il tubo alcune volte.
NOTA: I campioni possono rimanere in acqua distillata per più di 24 ore, ma questo non è raccomandato per ottenere immagini di buona qualità (immagini ben colorate per diversi tipi di cellule epidermiche) per l'analisi quantitativa. - Rimuovere tutta l'acqua distillata dal tubo. Quindi, aggiungere immediatamente ~ 200 μL di soluzione colorante TBO (0,5% TBO in H 2 O, filtrato) per ~2min.
NOTA: Assicurarsi che ogni campione di cotiledone sia uniformemente esposto alla soluzione TBO facendo scorrere delicatamente le provette durante l'incubazione. Per evitare la sovracolorazione con TBO (la tempistica della colorazione è essenziale e può essere variabile per ciascun genotipo), non elaborare più di sei provette contenenti campioni alla volta. - Rimuovere la soluzione colorante TBO il più accuratamente possibile, quindi lavare immediatamente i campioni un paio di volte aggiungendo 1 ml di acqua distillata fresca.
- A 10 giorni dalla germinazione, selezionare attentamente e ritagliare uno dei cotiledoni dalle singole piantine che crescono uniformemente con altre piantine sul piatto per limitare la variabilità.
- Imaging e analisi dei dati
- Prendi un vetrino da microscopio e aggiungi una goccia di glicerolo al 15% (~ 50 μL). Posizionare il cotiledone con il lato abassiale verso l'alto in glicerolo al 15% sul vetrino usando una pinza fine. Quindi, coprirlo delicatamente con un vetrino di copertura in modo che eventuali bolle d'aria formate possano essere rimosse dal campione.
- Immagine del lato abassiale dell'epidermide cotiledone utilizzando un microscopio a campo luminoso (Figura 1 e Figura 2), quindi esaminare il fenotipo epidermico contando il numero di stomi e altri tipi di cellule epidermiche.
- Per ogni genotipo, calcolare il fenotipo epidermico utilizzando le seguenti formule descritte da Jangra et al.17:
Indice stomatico (%) = (Numero di stomi/Numero totale di cellule epidermiche) × 100
Densità stomatica (mm−2) = Numero di stomi/Area (mm2)
NOTA: Immagine di almeno otto cotiledoni (N = 8) per ciascun genotipo e documentare il fenotipo epidermico di ciascun genotipo confrontandolo con il fenotipo della pianta wild-type e/o delle piante transgeniche che esprimono un transgene chimicamente inducibile coltivato senza induttore.
2. Biosaggi per peptidi stomatici
NOTA: la procedura per i test biologici è illustrata nella Figura 3.
- Sterilizzazione dei semi e condizioni di crescita
- Sterilizzare ~ 25 semi per ogni trattamento come sopra e seminare circa la metà dei semi su ciascuna delle due piastre di agar 1/2 MS in una cappa a flusso laminare.
NOTA: Utilizzare il genotipo con cellule epidermiche alte e/o basse (ad esempio, epf22) invece di utilizzare uno sfondo wild-type (ad esempio, Col-0) per rilevare facilmente le attività biologiche dei peptidi sul pattern e sulla differenziazione delle cellule epidermiche (Figura 4). - Stratificare i semi per 3 giorni a 4 °C al buio.
- Estrarre ciascuna delle due piastre ad intervalli di ~10 ore e incubare i semi su piastre a 22 °C sotto 120 μmol·m−2·s−1 di luce con un fotoperiodo di 16 ore di luce e 8 ore di buio per 1 giorno.
- Sterilizzare ~ 25 semi per ogni trattamento come sopra e seminare circa la metà dei semi su ciascuna delle due piastre di agar 1/2 MS in una cappa a flusso laminare.
- Trattamento e imaging dei peptidi
- In una cappa a flusso laminare, trapiantare con cura 10-12 piantine di Arabidopsis vecchie di un giorno da ciascuna delle due piastre preparate in una piastra a 24 pozzetti contenente 1,5 ml di mezzo liquido 1/2 MS in ciascun pozzetto (~ 20 piantine per pozzetto).
NOTA: La tempistica del trattamento peptidico per le piantine è fondamentale per gli esiti fenotipici del trattamento peptidico, quindi preparare i semi su due piastre separate per ottenere due diverse fasi di sviluppo della piantina per il trattamento. - Aggiungere un tampone da solo (50 mM Tris-HCl [pH 8,0]) o due diverse concentrazioni del peptide (tipicamente, 1 μM e 2,5 μM peptide in 50 mM Tris-HCl [pH 8,0]) a ciascun pozzetto contenente ~ 20 piantine di Arabidopsis di un giorno germinate su piastre di agar 1/2 MS.
NOTA: Rimuovere le aliquote della soluzione peptidica da un congelatore e tenerle a RT per alcuni minuti prima del trattamento. I peptidi conservati in un congelatore a -80 °C sono stabili per un paio d'anni, ma i cicli di congelamento-scongelamento dovrebbero essere evitati conservando la soluzione peptidica in piccole aliquote. - Dopo aver mescolato delicatamente le piantine con un tampone da solo o una soluzione peptidica usando una pipetta, sigillare la piastra con nastro a micropori. Incubare la piastra di analisi in condizioni di lunga giornata (fotoperiodo 16 ore, 120 μmol·m−2·s−1 luce) per 5-7 giorni a 22 °C.
NOTA: Evitare che le piantine crescano troppo vicine tra loro per consentire a ciascuna piantina di avere un'esposizione uniforme alla soluzione peptidica. Ruotare delicatamente la piastra per 2-3 ore prima di incubare la piastra in una camera di crescita per aumentare l'aerazione. - Trasferire ogni piantina dal pozzetto contenente tampone da solo o peptide su un vetrino di copertura e sezionare il cotiledone della piantina. Posizionare il lato abassiale del cotiledone usando una pinza e tagliarlo a pezzetti.
- Prendi un altro vetrino da microscopio pulito e posiziona su di esso una goccia di soluzione di ioduro di propidio (~ 25 μL, 2 mg / ml in H2O).
- Posizionare uno dei piccoli pezzi di cotiledone in una goccia di soluzione di ioduro di propidio usando una pinza e posizionare delicatamente il vetrino di copertura. Applicare un'ulteriore soluzione di ioduro di propidio sul bordo del coprivetrino per rimuovere eventuali bolle d'aria che si sono formate.
- Immagine del lato abassiale del cotiledone usando un microscopio confocale e confronta le immagini con le immagini di piantine coltivate in mezzo 1/2 MS contenente solo tampone.
NOTA: Le immagini presentate nella Figura 4 sono state prese da piantine selvatiche Col-0 o epf22,5 che sono state trattate solo con tampone (Figura 4A, B) o due lotti di soluzione peptidica EPF2 (Figura 4C-F) e sono state conservate a -80 °C per 1 anno.
- In una cappa a flusso laminare, trapiantare con cura 10-12 piantine di Arabidopsis vecchie di un giorno da ciascuna delle due piastre preparate in una piastra a 24 pozzetti contenente 1,5 ml di mezzo liquido 1/2 MS in ciascun pozzetto (~ 20 piantine per pozzetto).
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Representative Results
Varie piante transgeniche stomatiche e mutanti noti per avere meno o più densità stomatica e clustering (epf2 2,5, epf1 epf22,5, tmm12, una linea STOMAGEN-silenziata 4, e linee transgeniche che trasportano il costrutto di sovraespressione Est::EPF1 o Est::EPF2 7 ) sono stati utilizzati per dimostrare l'efficacia delle due analisi fenotipiche qui presentate, che miravano a identificare e caratterizzare i geni che hanno un ruolo nello sviluppo e nel pattern stomatico. Al fine di produrre immagini epidermiche di alta qualità senza la necessità di peeling epidermici per quantificare i diversi tipi di cellule epidermiche per l'analisi, è fondamentale pre-regolare il tempo di colorazione del campione con TBO per ciascun genotipo, poiché ognuno può avere fenotipi epidermici diversi rispetto a quello del controllo wild-type (Col-0) (Figura 1A e Figura 2A). Sulla base dell'esperienza, i genotipi con meno stomi richiedono tempi di colorazione più lunghi con TBO (Figura 1B e Figura 2D,E), mentre i genotipi con più stomi e clustering richiedono tempi di colorazione più brevi (Figura 1C e Figura 2B,C). Poiché quantità variabili di peptidi opportunamente ripiegati nella soluzione peptidica totale possono mascherare l'attività biologica dei peptidi nello sviluppo stomatico, è buona norma utilizzare concentrazioni totali aggiuntive e più elevate della soluzione peptidica (ad esempio, 2,5 μM EPF2), nonché genotipi che hanno meno o più fenotipi stomatici (ad esempio, EPF2), per i saggi biologici. L'attività dei peptidi EPF2, che hanno un ruolo nell'inibire l'inizio stomatico, è stata facilmente rilevata utilizzando mutanti di epf2 con più cellule epidermiche di Col-0, anche se alcuni lotti dei peptidi EPF2 preparati avevano quantità minori delle forme bioattive del peptide (ad esempio, EPF2 peptide soluzione batch 1 in Figura 4).
Figura 1: L'effetto del tempo di incubazione con TBO sui genotipi che presentano diversi fenotipi epidermici. Immagini di cotiledoni abassiali da piantine di 10 giorni di tre genotipi di Arabidopsis: (A) wild-type (Col-0), (B) una linea silenziata STOMAGEN (STOMAGEN-ami) e (C) mutanti epf1 epf2. Col-0 rappresenta il controllo wild-type di Arabidopsis, e la linea silenziata STOMAGEN e i mutanti epf1 epf2 rappresentano rispettivamente i genotipi con un numero basso e alto di stomi. Le immagini sono state scattate utilizzando un microscopio invertito con un obiettivo 20x (campo visivo di 0,35 mm2). La qualità delle immagini era variabile, sebbene tutti i campioni di cotiledone dei diversi genotipi fossero colorati con TBO (0,5% TBO in H 2 O) per lo stesso periodo di tempo (2minuti) prima dell'imaging. Pertanto, per ottenere immagini ben colorate per l'analisi, è importante predeterminare il tempo di colorazione TBO adeguato per ciascun genotipo. Barra di scala = 50 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Immagini dell'epidermide colorata con TBO senza l'uso di peeling epidermici per l'analisi quantitativa. Per l'analisi quantitativa del fenotipo epidermico possono essere utilizzate immagini rappresentative dell'epidermide di cotiledoni da piantine di 10 giorni di (A) wild-type (Col-0), (B) tmm e (C,D) portatrici di un costrutto di sovraespressione EPF2 (Est::EPF2) o (E) EPF1 (Est::EPF1) inducibile da estradiolo. Un cotiledone in una soluzione di fissaggio per oltre 3 anni è stato utilizzato per prendere l'immagine presentata in (E). Le immagini sono state scattate utilizzando un microscopio invertito con un obiettivo 20x (campo visivo di 0,35 mm2). Le celle sono state delineate dalla colorazione TBO e metà della larghezza delle immagini a grandezza naturale viene presentata per la visualizzazione. Barra di scala = 50 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Procedura per i saggi biologici . (A) I semi vengono seminati su due piastre di agar da 1/2 MS ed estratti ad intervalli di 10 ore. (B) Le piantine di Arabidopsis di 1 giorno vengono trapiantate in piastre da 24 pozzetti contenenti 1/2 MS di terreno con finta o due diverse concentrazioni di peptidi. (C) Dopo 5-7 giorni, le piantine sono pronte per l'imaging per determinare l'attività biologica dei peptidi nello sviluppo e nel pattern stomatico. (D) Una fetta di cotiledone viene posta in una goccia di soluzione di ioduro di propidio su un vetrino da microscopio per l'imaging. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Microscopia confocale dell'epidermide abassiale di Arabidopsis cotiledoni dopo trattamento peptidico. Immagini confocali rappresentative di (A) epidermide wild-type e (B) epf2 cotiledone coltivate per 6-7 giorni in una soluzione tampone e un'epidermide cotiledone (C-F) epf2 coltivata con due diversi lotti di peptidi EPF2. Le immagini sono state scattate utilizzando un microscopio confocale utilizzando una lente obiettiva 40x (eccitazione di 561 nm e un filtro di emissione passa-lungo 561 nm) per catturare la colorazione dello ioduro di propidio e visualizzare i contorni delle cellule. Ogni soluzione peptidica EPF2 preparata ha diverse quantità di forme correttamente piegate (bioattive) e mal ripiegate (inattive) dei peptidi. Pertanto, per lo screening iniziale di peptidi con un potenziale ruolo nello sviluppo stomatico, si raccomanda di utilizzare due diverse concentrazioni delle soluzioni peptidiche totali come indicato per i saggi biologici. Barra di scala = 30 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
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Discussion
I due metodi di analisi fenotipica per identificare e caratterizzare i geni che controllano il pattern stomatico e la differenziazione qui presentati sono saggi convenienti e affidabili poiché i protocolli non richiedono l'uso di peeling epidermici e attrezzature specializzate (che richiedono tempo e richiedono una formazione speciale per la preparazione del campione) ma producono immagini di alta qualità per l'analisi quantitativa dei fenotipi epidermici.
Una limitazione di questa tecnica per l'analisi fenotipica con cotiledoni di Arabidopsis colorati con TBO è che l'ottenimento di immagini di alta qualità con contrasto visivo per diversi tipi di cellule epidermiche dipende dal tempo di colorazione e dalle caratteristiche uniche del tessuto, che può essere sia specie-dipendente che genotipo-dipendente (Figura 1)18 . Altri metodi di fenotipizzazione per osservare le cellule epidermiche usando peeling epidermici hanno le stesse sfide e richiedono anche più tempo e una formazione speciale. Le difficoltà nell'ottenere immagini dell'epidermide correttamente colorate sufficienti per l'analisi dei dati possono essere evitate colorando cotiledoni da genotipi con meno stomi per periodi di tempo più lunghi e campioni da genotipi con più stomi per periodi di tempo più brevi. Il tempo di colorazione per ciascun genotipo può anche essere regolato controllando prima solo alcuni campioni per ottimizzare il tempo di colorazione per genotipi con fenotipi epidermici simili.
Ottenere una quantità sufficiente di peptidi bioattivi ben piegati, in particolare peptidi ricchi di cisteina (che sono ligandi che hanno diverse funzioni nel controllo dello sviluppo delle piante, incluso il pattern stomatico), è stata una sfida 1,2,3,4,5,6,19,20,21,22,23 . Inoltre, anche se vengono generati peptidi bioattivi, lo screening di peptidi che hanno potenziali funzioni in specifici processi biologici è un altro compito impegnativo perché i peptidi bioattivi prodotti sono spesso una miscela di peptidi ben ripiegati, attivi e inattivi. Questo articolo presenta un metodo di bioanalisi efficiente per scoprire e caratterizzare potenziali peptidi stomatici. Questo metodo ha avuto successo nell'identificare vari importanti peptidi che controllano diversi aspetti dello sviluppo stomatico in Arabidopsis, così come l'erba Brachypodium 3,4,7,17. Tuttavia, il principale limite di questa tecnica è la variabilità delle risposte fenotipiche, che molto probabilmente si verifica a causa dell'uso di piantine con stadi di sviluppo leggermente diversi e soluzioni peptidiche contenenti diverse quantità di peptidi bioattivi. I primi tentativi di questo metodo prevedevano il posizionamento di semi wild-type direttamente nei pozzetti di una piastra contenente una soluzione peptidica dopo la stratificazione. Senza l'uso di genotipi che hanno più e/o meno cellule epidermiche (ad esempio, epf2 2, Figura 4) e piantine di Arabidopsis di 1 giorno germinate su piastre di agar MS 1/2, un numero inferiore di piantine è in grado di crescere e mostrare chiare risposte fenotipiche dopo l'applicazione del peptide. In questo protocollo, il problema della variabilità è stato affrontato utilizzando ~ 20 piantine di Arabidopsis di un giorno con due diversi stadi di sviluppo e utilizzando due diverse concentrazioni di soluzione peptidica (1 μM e 2,5 μM).
I fenotipi epidermici dei campioni trattati con peptidi possono anche essere analizzati con il primo metodo di analisi fenotipica presentato utilizzando campioni colorati con TBO. Questo metodo consente un'analisi fenotipica quantitativa relativamente semplice perché è possibile analizzare un'area relativamente ampia di ciascun campione. Inoltre, questo metodo offre flessibilità nella preparazione dei campioni dopo la raccolta dei campioni preparati nelle stesse condizioni per l'imaging. Tuttavia, le immagini scattate con questo metodo non sono generalmente della massima qualità. D'altra parte, l'imaging confocale dopo la colorazione con ioduro di propidio fornisce immagini di qualità superiore con dettagli epidermici. Tuttavia, questo metodo consente solo una piccola area di tessuto da focalizzare per l'analisi. Inoltre, solo un certo numero di tessuti vivi preparati può essere analizzato contemporaneamente.
In conclusione, l'analisi fenotipica qui presentata può essere utilizzata per l'esame rapido ed efficace dei potenziali geni che controllano il pattern e il differenziamento stomatico, migliorando così la comprensione dei meccanismi di sviluppo stomatico e della funzione peptidica. Inoltre, questo protocollo di bioanalisi può essere utilizzato per identificare altre piccole molecole che hanno un ruolo nel pattern del tessuto epidermico e come metodo di screening iniziale per determinare la struttura di peptidi bioattivi ben ripiegati.
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Disclosures
Non sono stati dichiarati conflitti di interesse.
Acknowledgments
Questa ricerca è stata finanziata attraverso il programma Natural Resources and Engineering Research Council of Canada (NSERC) Discovery e la Concordia University. K.B. è supportato dalla borsa di studio nazionale d'oltremare dall'India.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18 mm x 18 mm cover slip | VWR | 16004-326 | |
| 24-well sterile plates with lid | VWR | CA62406-183 | |
| 3M Micropore surgical tape | Fisher Scientific | 19-027-761 | Microporous surgical paper tape used to seal MS plates |
| 76 x 26 mm Microscope slide | TLG | GEW90-2575-03 | |
| Acetic acid, ≥99.8% | Fisher Scientific | A38-212 | |
| Agar | BioShop | AGR001.1 | |
| Bleech | Household bleach (e.g., Clorox) | ||
| Confocal microscope | Nikon | Nikon C2 operated by NIS-Elements | |
| Ethanol | Greenfield | P210EAAN | |
| FIJI | Open-srouce | (Fiji Is Just) ImageJ v2.1/1.5.3j | Downloaded from https://imagej.net/software/fiji/ |
| Forceps | Sigma-Aldrich | F6521 | |
| Gamborg's vitamin mixture | Cassson Labs | GBL01-100ML | Store at 4 °C |
| Glycerol | Fisher Scientific | G33-4 | |
| Growth chambers | Conviron, model E15 | 16h light cycle, set at 21°C with a light intensity of 120 µmol·m-2·s-1. | |
| Lights | HD Supply | 25272 | Fluorescent lights in growth chambers, Sylvania F72T12/CW/VHO 72"T12 VHO 4200K |
| Microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 14-222-155 | Tubes in which Arabidopsis thaliana seeds are placed to perform sterilization |
| Microscope | Nikon | Nikon Eclipse TiE equipped with a DsRi2 digital camera | |
| Murashige and Skoog basal salts | Cassson Labs | MSP01-1LT | Store at 4 °C |
| Petri Dish 100 mm x 20 mm | Fisher Scientific | 08-757-11Z | Petri dishes in which MS media is poured for the purpose of growing Arabidopsis thaliana |
| Propidium Iodide | VWR | 39139-064 | |
| Scalpel | Fisher Scientific | 08-916-5A | |
| Sucrose | BioShop | SUC700.5 | |
| Toluidine blue O | Sigma-Aldrich | T3260-5G | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-100ML | |
| β-Estradiol | Sigma-Aldrich | E2758 |
References
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- Kondo, T., et al. Stomatal density is controlled by a mesophyll-derived signaling molecule. Plant & Cell Physiology. 51 (1), 1-8 (2010).
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