Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

التصوير تحت الخلوي للتعامل مع الكالسيوم العصبي في الجسم الحي

Published: March 17, 2023 doi: 10.3791/64928
Automatic Translation
*1, *1,2, 1, 1
1Department of Biomedical Sciences, Colorado State University College of Veterinary Medicine and Biomedical Sciences, 2Cellular and Molecular Biology Graduate Program, Colorado State University College of Veterinary Medicine and Biomedical Sciences
* These authors contributed equally

Summary

تصف الطرق الحالية نهجا غير متناسب لتصوير الكالسيوم عالي الدقة وشبه المجزأ في الجسم الحي في Caenorhabditis elegans باستخدام مؤشرات الكالسيوم المشفرة وراثيا المتاحة بسهولة.

Abstract

تم استخدام تصوير الكالسيوم (Ca 2+) إلى حد كبير لفحص النشاط العصبي ، ولكن أصبح من الواضح بشكل متزايد أن معالجة Ca2+ تحت الخلوية هي عنصر حاسم في الإشارات داخل الخلايا. أثبت تصور ديناميكيات Ca2+ تحت الخلوية في الجسم الحي ، حيث يمكن دراسة الخلايا العصبية في دوائرها الأصلية السليمة ، أنه يمثل تحديا تقنيا في الأنظمة العصبية المعقدة. تتيح الشفافية والجهاز العصبي البسيط نسبيا للديدان الخيطية Caenorhabditis elegans التعبير الخاص بالخلية والتصور في الجسم الحي لعلامات ومؤشرات الفلورسنت. من بين هذه المؤشرات الفلورية التي تم تعديلها للاستخدام في السيتوبلازم وكذلك المقصورات تحت الخلوية المختلفة ، مثل الميتوكوندريا. يتيح هذا البروتوكول التصوير غير النسبي Ca 2+ في الجسم الحي بدقة تحت خلوية تسمح بتحليل ديناميكيات Ca2+ وصولا إلى مستوى العمود الفقري التغصني الفردي والميتوكوندريا. هنا ، يتم استخدام مؤشرين متاحين مشفرين وراثيا مع تقارب Ca 2+ مختلف لإثبات استخدام هذا البروتوكول لقياس مستويات Ca2+ النسبية داخل السيتوبلازم أو مصفوفة الميتوكوندريا في زوج واحد من الخلايا العصبية البينية المثيرة (AVA). جنبا إلى جنب مع التلاعب الجيني والملاحظات الطولية الممكنة في C. elegans ، قد يكون بروتوكول التصوير هذا مفيدا للإجابة على الأسئلة المتعلقة بكيفية تنظيم معالجة Ca2+ لوظيفة الخلايا العصبية واللدونة.

Introduction

أيونات الكالسيوم (Ca2+) هي ناقلات متعددة الاستخدامات للمعلومات في العديد من أنواع الخلايا. في الخلايا العصبية ، يكون Ca2+ مسؤولا عن إطلاق الناقلات العصبية المعتمدة على النشاط ، وتنظيم الحركة الهيكلية الخلوية ، وضبط عمليات التمثيل الغذائي ، بالإضافة إلى العديد من الآليات الأخرى اللازمة للصيانة العصبية المناسبة والوظيفة 1,2. لضمان الإشارات الفعالة داخل الخلايا ، يجب أن تحافظ الخلايا العصبية على مستويات منخفضة من الكالسيومالقاعدي 2+ في السيتوبلازم3. يتم تحقيق ذلك من خلال آليات معالجة Ca 2+ التعاونية ، بما في ذلك امتصاص Ca2+ في العضيات مثل الشبكة الإندوبلازمية (ER) والميتوكوندريا. هذه العمليات ، بالإضافة إلى ترتيب القنوات الأيونية المنفذة للكالسيوم 2+ في غشاء البلازما ، تؤدي إلى مستويات غير متجانسة من السيتوبلازم Ca2+ في جميع أنحاء الخلايا العصبية.

يسمح عدم التجانس Ca 2+ أثناء الراحة والتنشيط العصبي بالتنظيم المتنوع والخاص بالموقع للآليات المعتمدة على Ca 2+ 1. أحد الأمثلة على التأثيرات الخاصة بالتركيز ل Ca 2+ هو إطلاق Ca 2+ من ER من خلال مستقبلات الإينوزيتول 1,4,5-trisphosphate (InsP 3). مطلوب مستويات منخفضة من الكالسيوم2+ بالاشتراك مع InsP3 لفتح مسام مستقبلات الكالسيوم القابلة للاختراق. بدلا من ذلك ، تمنع مستويات الكالسيوم2+ المرتفعة بشكل مباشر وغير مباشر المستقبل4. يتم دعم أهمية توازن Ca 2+ للوظيفة العصبية المناسبة من خلال الأدلة التي تشير إلى أن المعالجة والإشارات داخل الخلايا Ca2+ المعطلة هي خطوة مبكرة في التسبب في الاضطرابات التنكسية العصبية والشيخوخة الطبيعية 5,6. على وجه التحديد ، يرتبط امتصاص الكالسيوم2+ غير الطبيعي والإفراج عنه بواسطة ER والميتوكوندريا ببداية الخلل الوظيفي العصبي في مرض الزهايمر ومرض باركنسون ومرض هنتنغتون 6,7.

تتطلب دراسة خلل التشوب Ca 2+ أثناء الشيخوخة الطبيعية أو التنكس العصبي الملاحظة الطولية لمستويات Ca2+ مع دقة تحت خلوية في كائن حي سليم يتم فيه الحفاظ على البنية الخلوية الأصلية (أي ترتيب نقاط الاشتباك العصبي وتوزيع القنوات الأيونية). تحقيقا لهذه الغاية ، يوفر هذا البروتوكول إرشادات حول استخدام مستشعرين Ca 2+ متاحين بسهولة ومشفرين وراثيا لتسجيل ديناميكيات Ca2+ في الجسم الحي بدقة مكانية وزمانية عالية. توضح النتائج التمثيلية التي تم الحصول عليها باستخدام الطريقة الموصوفة في C. elegans كيف يمكن أن يسمح التعبير عن مؤشرات Ca 2+ في السيتوبلازم أو مصفوفة الميتوكوندريا للخلايا العصبية المفردة بالحصول السريع على صور الفلورسنت (حتى 50 هرتز) التي توضح ديناميكيات Ca 2+ مع القدرة الإضافية على تمييز مستويات Ca 2+ داخل هياكل تشبه العمود الفقري الفردي والميتوكوندريا الفردية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. خلق سلالات معدلة وراثيا

  1. باستخدام طريقة الاستنساخ للاختيار 8,9 ، استنساخ متجهات التعبير لاحتواء مروج Pflp-18 أو Prig-3 (للإشارة الخاصة ب AVA في الحبل العصبي البطني) ، متبوعا بمؤشر Ca2+ المفضل ، ثم UTR 3 '(انظر المناقشة لمزيد من المعلومات)10. يمكن العثور على قائمة البلازميدات ومصادرها في الجدول التكميلي 1.
  2. اتبع البروتوكول المعمول به لإنشاء سلالات محورة وراثيا عن طريق الحقن المجهري لمزيج الحمض النووي (<100 نانوغرام / ميكرولتر ؛ انظر الجدول التكميلي 1 لتركيزات كل بلازميد) يحتوي على جين التحوير مؤشر Ca 2+ (~20 نانوغرام / ميكرولتر) والحمض النووي المنقذ lin-15+ (علامة الاختيار) في الغدد التناسلية لشخص بالغ يبلغ من العمر يوما واحدا C. elegans10 (النمط الجيني: لين -15 (N765TS) ؛ النمط الظاهري: متعدد الفرج)10,11.
    ملاحظه. الحفاظ على الآباء lin-15 (n765ts) عند 15 درجة مئوية لقمع الطفرة الحساسة لدرجة الحرارة.
  3. الحفاظ على الوالدين المحقونين عند 20 درجة مئوية حتى تصل ذرية F1 إلى مرحلة البلوغ للسماح بالانتقاء المعدل وراثيا باستخدام عدم وجود النمط الظاهري متعدد الفرج.
  4. الممرالنسيلي 13 ذرية F1 البالغة التي لا تحتوي على النمط الظاهري متعدد الفرج لأن هذا يشير إلى التعبير عن المصفوفة خارج الكروموسومات التي تحتوي على مؤشر Ca2+ 11.
  5. قم بتقييم التعبير عن مؤشر Ca2+ في ذرية F2 أو F3 التي لا تحتوي على النمط الظاهري متعدد الفرج عن طريق تركيب وتصوير البالغين بعمر يوم واحد كما هو موضح لاحقا في القسم 3.
    ملاحظه. مطلوب تعبير مرتفع نسبيا للمؤشر للحصول السريع على الصور كما هو موضح هنا (انظر المناقشة لمزيد من التفاصيل).
  6. إجراء تجارب على الأجيال اللاحقة من السلالات المحورة وراثيا مع التعبير الأمثل لمؤشر Ca 2+ (انظر المناقشة لمزيد من التفاصيل) ، والحفاظ على السلالات في ظل الظروف القياسية (20 درجة مئوية على ألواح NGM) 12.

2. الإعداد البصري

  1. استخدم مجهرا قادرا على التصوير بفاصل زمني طويل المدى.
    ملاحظه. تم الحصول على البيانات التمثيلية باستخدام مجهر متحد البؤر للقرص الدوار مقلوب مجهز بليزر إثارة 488 نانومتر و 561 نانومتر.
  2. استخدم هدف تكبير منخفض (أي 10x / 0.40) للتوطين الخام للدودة.
  3. لتحقيق دقة تحت خلوية ، قم بالتبديل إلى الخلايا العصبية وتحديد موقعها باستخدام هدف تكبير عالي.
    ملاحظه. تم استخدام هدف نفطي 100x / 1.40 NA للحصول على البيانات التمثيلية في هذه الدراسة.
  4. احصل على الصور باستخدام كاميرا فائقة الحساسية قادرة على التقاط الصور بسرعة (>50 إطارا في الثانية).
  5. استخدم مرشح انبعاث قياسي لمؤشر Ca2+ المفضل (على سبيل المثال ، مرشح انبعاثات 525 نانومتر ± 50 نانومتر ل GCaMP6f و mitoGCaMP).
  6. أضف مصحح الانجراف Z (ZDC) للحصول على تدفقات الصور التي تزيد عن 10 ثوان ، حيث يؤدي جفاف وسادة الآجار أثناء جلسة التصوير إلى انحراف الخلايا العصبية عن التركيز في غضون عدة ثوان.
    ملاحظه. إذا كان إعداد الفحص المجهري لا يسمح ب ZDC ، أو إذا كانت فترات التصوير الطويلة (>20 دقيقة) مطلوبة ، فقم بتطبيق حد من شحم السيليكون أو الفازلين المذاب حول وسادة الآجار لإبطاء الجفاف.

3. إعداد الديدان للتصوير

  1. تحضير منصات أجار
    1. اصنع 3 مل من أجار 10٪ عن طريق إذابة أجار الدرجة الجزيئية في M912 في أنبوب استزراع زجاجي 13 مم × 100 مم ووضعه في الميكروويف لعدة ثوان (انظر جدول المواد).
      ملاحظه. يمكن الاحتفاظ بالآجار المنصهر على كتلة حرارية لمدة تصل إلى 1 ساعة أو يمكن جعله طازجا في كل مرة تكون هناك حاجة إلى وسادات أجار.
    2. ضع شريحة مجهرية بين شريحتين إضافيتين لكل منهما طبقتان من شريط المختبر (انظر الشكل 1A-i).
    3. اقطع طرف طرف ماصة سعة 1000 ميكرولتر (بدون مرشح) ، واستخدمه لسحب قطرة صغيرة من الآجار على غطاء الغطاء المركزي (الشكل 1A-i).
    4. قم بتسطيح الآجار بالضغط على شريحة أخرى لأسفل أعلى الآجار (الشكل 1A-ii).
    5. بعد التبريد ، قم بقطع الآجار إلى قرص صغير باستخدام فتحة أنبوب ثقافة زجاجي 13 مم × 100 مم (الشكل 1A-iii) ، ثم قم بإزالة الأجار المحيط.
  2. تحضير محلول التدحرج الدودي
    1. قم بإذابة مسحوق موسيمول في M9 لإنشاء مخزون 30 مللي مول. تفصل إلى 50 ميكرولتر من القسامة، وتخزن على حرارة 4 درجات مئوية.
    2. قم بإذابة حصة جديدة من 30 mM muscimol كل 3-5 أيام (وتخزينها في درجة حرارة 20 درجة مئوية أثناء الاستخدام).
    3. قم بتخفيف مخزون 30 مللي متر من muscimol بنسبة 1: 1 باستخدام حبات البوليسترين لصنع محلول الدرفلة.
  3. وضع دودة للتصوير
    1. ضع 1.6 ميكرولتر من محلول الدرفلة في وسط وسادة أجار.
      ملاحظة: يجب ضبط كمية السائل لتصوير الحيوانات الأصغر سنا (أقل) أو الأكبر سنا (أكثر).
    2. باستخدام اختيار الدودة المفضل (أي معول سلك زجاجي أو بلاتيني)13 ، انقل دودة من العمر المطلوب بدون النمط الظاهري متعدد الفرج11 إلى محلول الدرفلة على وسادة أجار (الشكل 1A-IV).
      ملاحظه. البيانات التمثيلية مأخوذة من خنثى عمره يوم واحد (سلالة GCaMP6f = FJH185 ؛ سلالة mitoGCaMP. فجه 597; انظر الجدول التكميلي 1) ، والذي يمكن تحديده من خلال وجود صف واحد فقط من البيض. انظر المناقشة لمزيد من التفاصيل حول العمل مع الديدان من مختلف الأعمار.
    3. انتظر ~ 5 دقائق حتى يقلل muscimol من حركة الدودة ، ثم قم بإسقاط غطاء 22 مم × 22 مم أعلى وسادة الآجار ، مما يقيد حركة الدودة جسديا.
    4. لتصوير الخلايا العصبية في الحبل العصبي البطني ، قم بلف الدودة في الاتجاه الموضح في الشكل 1B ، C عن طريق تحريك غطاء الغطاء برفق.
      ملاحظه. لتصور الحبل العصبي البطني ، ضع الدودة مع الرأس لأعلى ، ولف الدودة حتى تصبح الأمعاء على الجانب الأيمن من الجزء القريب واليسار للجزء البعيد من الدودة (من منظور المشاهد). عكس هذا الاتجاه (الشكل 1C) لتصوير الخلايا العصبية في الحبل العصبي الظهري.
  4. تركيب الدودة على المجهر
    1. ضع قطرة من زيت الغمر على غطاء الغطاء قبل تركيبه على مرحلة المجهر.
    2. ابحث عن الفيروس المتنقل باستخدام هدف تكبير منخفض (10x) في برايتفيلد.
    3. قم بالتبديل إلى هدف 100x ، واضبط التركيز.
    4. حدد موقع عصور AVA باستخدام إضاءة GCaMP أو mitoGCaMP باستخدام ليزر التصوير 488 نانومتر.
      ملاحظة: استخدم تعديلات صغيرة لمنع سحق الدودة أو سحب غطاء الغطاء.

4. الحصول على تدفقات صور عالية الدقة

  1. في الجسم الحي تصوير GCaMP
    1. اضبط وقت التعرض على 20 مللي ثانية.
    2. اضبط ليزر التصوير وإعدادات الاكتساب حتى يصبح مضان GCaMP الأساسي في النطاق المتوسط للنطاق الديناميكيللكاميرا 14. ارجع إلى المناقشة للحصول على اقتراحات حول تحسين معلمات التصوير باستخدام إعدادات الفحص المجهري الأخرى.
      ملاحظه. بالنسبة للإعداد البصري المستخدم في هذه الدراسة ، اضبط ليزر التصوير 488 نانومتر على إعدادات الإخراج التالية: طاقة الليزر = 50٪ والتوهين = 1. قم بتعديل إعدادات الاستحواذ الإضافية على النحو التالي: كسب EM = 200 وكسب مكبر الصوت المسبق = 1.
    3. بعد تحديد موقع عصور AVA باستخدام مضان GCaMP عند تكبير 100x ، اضبط ZDC (انظر جدول المواد) على نطاق ±30 ميكرومتر ، وابدأ التركيز التلقائي المستمر. قم بتصحيح المستوى البؤري يدويا حسب الحاجة قبل التصوير.
    4. احصل على دفق من الصور بتكبير 100x. يمكن تحقيق فترات تصل إلى 10 دقائق من خلال الإعداد المستخدم في هذه الدراسة.
  2. التصوير في الجسم الحي mitoGCaMP
    1. اتبع الخطوات 4.1.1-4.1.2 حسب الحاجة للحصول على مضان mitoGCaMP القاعدي في النطاق المتوسط للنطاق الديناميكيللكاميرا 14.
      ملاحظه. بالنسبة للإعداد البصري المستخدم في هذه الدراسة ، اضبط ليزر التصوير 488 نانومتر على إعدادات الإخراج التالية: طاقة الليزر = 20٪ والتوهين = 10. قم بتعديل إعدادات الاستحواذ إلى ما يلي: كسب EM = 100 وكسب مكبر الصوت المسبق = 2.
    2. بعد وضع الميتوكوندريا في عصفور AVA باستخدام مضان mitoGCaMP ، قم بتعيين ZDC كما هو موضح أعلاه في الخطوة 3.3.
    3. احصل على دفق من الصور بتكبير 100x.

5. تحليل تدفق الصور

  1. افتح تدفق الصور في برنامج صور مناسب لتحليل قيم البكسل في سلسلة صور (انظر جدول المواد).
  2. باستخدام أداة تحديد المضلع ، حدد منطقة الاهتمام دون الخلوية (ROI) التي تحتوي على GCaMP أو mitoGCaMP.
  3. انقر فوق تحليل أدوات > > مدير عائد الاستثمار. في مدير عائد الاستثمار، انقر على إضافة ثم على المزيد > القياس المتعدد. في نافذة القياس المتعدد، انقر فوق موافق لجمع متوسط والحد الأدنى والحد الأقصى لكثافة البكسل لعائد الاستثمار المحدد أعلاه لكل إطار من تدفق الصورة لمزيد من التحليل.
    ملاحظه. يوصى بتسوية متوسط كثافة البكسل (F avg) إلى الحد الأدنى للكثافة (F min) لكل عائد استثمار باستخدام النسبة Favg / Fmin لحساب الاختلافات الفلورية بسبب تحديد المواقع في المستوى z. تجاهل تدفقات الصور بحركة الدودة أثناء التصوير لأن هذا سيؤثر أيضا على قياسات التألق.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يتيح هذان البروتوكولان الاكتساب السريع لمستويات Ca2+ التفاضلية داخل المناطق تحت الخلوية وعضيات الخلايا العصبية الفردية في الجسم الحي بدقة مكانية عالية. يسمح البروتوكول الأول بقياس السيتوبلازم Ca2+ بدقة زمنية ومكانية عالية. يتضح هذا هنا باستخدام التعبير الخاص بالخلية ل GCaMP6f في الخلايا العصبية البينية15 لأمر AVA glutamatergic ، والتي تمتد عصاياها العصبية بطول الحبل العصبي البطني بالكامل. مكن الاكتساب السريع لمضان GCaMP6f (50 هرتز) من اكتشاف الانتشار الاتجاهي لتدفق الكالسيوم 2+ (الشكل 2A والفيديو التكميلي 1). كشف القياس الكمي تحت الخلوي لفلورة GCaMP6f أن بداية تدفق الكالسيوم 2+ قد تأخرت في جزء من الخلايا العصبية على بعد 10 ميكرومتر فقط (الشكل 2B). بالإضافة إلى ذلك ، سمح هذا البروتوكول بالعديد من الملاحظات لأحداث Ca 2+ المجزأة و SubthresholdCa 2+. على سبيل المثال ، شوهدت الهياكل الشبيهة بالعمود الفقري التغصني الموجودة على طول عصبة AVA على أنها تحتوي على ومضات في مضان GCaMP6f حدثت بشكل مستقل عن تنشيط الخلايا العصبية ولم تؤد إلى انتشار تدفق الكالسيوم 2+ (الشكل 2C ، D والفيديو التكميلي 2).

يهدف البروتوكول الثاني إلى القياس السريع لمستويات الكالسيوم2+ النسبية في الميتوكوندريا الفردية في الخلايا العصبية المفردة. مكن استخدام سلالة دودة مع تعبير خاص ب AVA لمؤشر Ca2+ الموضعي لمصفوفة الميتوكوندريا mitoGCaMP من الكشف السريع عن التغيرات في مضان mitoGCaMP على مستوى الميتوكوندريا الفردية داخل عصبة AVA. كشف بروتوكول التصوير هذا عن أوضاع مختلفة من امتصاص الكالسيوم2+ في الميتوكوندريا ، على الأقل في هذه الخلية العصبية. أولا ، تقدم النتائج الموضحة في الشكل 3 أ مثالا على الامتصاص المتزامن لكمية كبيرة نسبيا من الكالسيوم2+ في مجموعة فرعية من الميتوكوندريا. وبشكل أكثر تحديدا ، كشفت هذه البيانات أن امتصاص الكالسيوم2+ في بعض الميتوكوندريا كان متزامنا (Mito1 و Mito2; الشكل 3A و B والفيديو التكميلي 3) ، في حين لا يبدو أن الميتوكوندريا المجاورة تتناول Ca2+ (Mito3; الشكل 3 أ ، ب). وبالمثل ، شوهدت مجموعات فرعية من الميتوكوندريا تمتص بسرعة وتطلق كميات صغيرة من الكالسيوم2+. يبدو أن هذا أيضا متزامن (Mito1 و Mito3 ، الشكل 3C ، D والفيديو التكميلي 4) ، ولكن مرة أخرى فقط لمجموعة فرعية من الميتوكوندريا (Mito 2 ، الشكل 3C ، D).

Figure 1
الشكل 1: تركيب ولف C. elegans لتصوير الحبل العصبي البطني. (أ) توضيح لخطوات تحضير وسادات الآجار واختيار دودة واحدة في محلول متداول. ب: مثال على موضع دودة قبل تغيير موضعها للتصوير. يشير السهم الأحمر إلى الحاجة إلى لفة لليمين من الدودة ، والتي يمكن تحقيقها عن طريق تحريك غطاء الغطاء إلى اليمين (السهم الأزرق). شريط المقياس = 50 ميكرومتر. ج: الاتجاه الصحيح اللازم لتصور الحبل العصبي البطني. ملاحظة: الأمعاء على الجانب الأيمن للمشاهد (باستخدام مجهر مستقيم) في النصف القريب ثم على الجانب الأيسر في النصف البعيد. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: الاكتساب السريع لمضان GCaMP6f مع دقة تحت خلوية في الخلايا العصبية AVA والهياكل الشبيهة بالعمود الفقري. (أ) صور تمثيلية لمضان GCaMP6f عند تشعب الخلايا العصبية AVAL و VAR. شريط المقياس = 5 ميكرومتر. (ب) القياس الكمي لمضان GCaMP6f الطبيعي إلى الحد الأدنى من التألق (F) لتلك المنطقة (Fmin) للمناطق القريبة (البرتقالية) والبعيدة (الزرقاء) المحددة في الصورة السفلية في اللوحة A. (C) صور تمثيلية لمضان GCaMP6f عند إسقاط يشبه العمود الفقري في عصبة AVA. (د) مضان GCaMP6f الطبيعي في النوريت (البرتقالي) والإسقاط الشبيه بالعمود الفقري (الأزرق) من المناطق المقابلة في الصورة السفلية للوحة C. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 3
الشكل 3. التصوير السريع لامتصاص الكالسيوم في الميتوكوندريا الفردية داخل عصفور AVA. (أ، ج) صور تمثيلية لمضان mitoGCaMP بمرور الوقت. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. (B) آثار مضان GCaMP الطبيعي (F / Fmin) للميتوكوندريا المقابلة الموضحة في الصورة السفلية للوحة A. (D) F / Fدقيقة أكثر من 40 ثانية من التصوير في المناطق الموضحة في الصورة السفلية في اللوحة C. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الفيديو التكميلي 1: مضان GCaMP6f في عصبة AVA. تم تقديم الفيديو بسرعة 2x. شريط المقياس = 5 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الفيديو.

الفيديو التكميلي 2: مضان GCaMP6f في إسقاط يشبه العمود الفقري على عصبة AVA. تم تقديم الفيديو بسرعة 2x. شريط المقياس = 5 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الفيديو.

الفيديو التكميلي 3: مضان MitoGCaMP في امتصاص الكالسيوم المتزامن مع الميتوكوندريا المتزامنة مع AVA. تم تقديم الفيديو بسرعة 4x. شريط المقياس = 5 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الفيديو.

الفيديو التكميلي 4: مضان MitoGCaMP في امتصاص AVA السريع للأعصاب وإطلاق الكالسيوم بواسطة الميتوكوندريا. تم تقديم الفيديو بسرعة 4x. شريط المقياس = 5 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الفيديو.

الجدول التكميلي 1: الكواشف الجينية والسلالات المستخدمة في هذه الدراسة. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يتضمن الاعتبار الأول عند تنفيذ الطريقة الموضحة اختيار مؤشر Ca2+ بخصائص مثالية لسؤال البحث المحدد. عادة ما يكون لمؤشرات Ca 2+ السيتوبلازمية تقارب كبير مع Ca 2+ ، وترتبط حساسية هذه المؤشرات تجاه Ca2+ عكسيا بالحركية (معدل التشغيل / الإيقاف)16,17. هذا يعني أنه يجب تحديد أولويات حساسية Ca2+ أو الحركية بناء على ظاهرة الاهتمام. بالنسبة للمقصورات تحت الخلوية ذات مستويات Ca2+ القاعدية العالية نسبيا ، مثل ER ، يجب اعتبار مؤشرات Ca 2+ ذات التقارب المنخفضCa 2+ 18. لتوليد الحمض النووي المؤتلف للتعبير الخاص بالخلية لمؤشر Ca 2+ ، يجب استخدام تقنية الاستنساخ المفضلة لإدخال مروج خاص بالخلية19,20 متبوعا بمؤشر Ca 2+ المفضل و 3 'UTR. يمكن تحقيق مستويات تعبير عالية نسبيا في الخلايا العصبية AVA عن طريق بناء بلازميد مع المروجين Pflp-18 أو Prig-3 أو let-858 أو unc-54 3' UTR وحقن هذا البلازميد الدقيق عند 15-25 نانوغرام / ميكرولتر (انظر الجدول التكميلي 1).

إن الحقن المجهري الناجح للبلازميدات التي تحتوي على مؤشر Ca 2+ و lin-15 + في الغدد التناسلية للديدان الطافرة lin-15 (n765ts) سينتج ذرية F1 تعبر عن مؤشر Ca 2+ ويتم إنقاذها للنمط الظاهري متعدد الفرج. فقط مجموعة فرعية (30٪ -80٪) من جيل F1 ستنقل الحمض النووي الاصطناعي إلى جيل F2. يجب تقييم التعبير عن مؤشر Ca2+ في ذرية F2 أو F3 التي تم إنقاذها على لوحات مع انتقال <60٪ من الحمض النووي الاصطناعي عن طريق تركيب وتصوير التألق في البالغين من العمر يوم واحد الذين يتم إنقاذهم للنمط الظاهري متعدد الفرج. يتم تحديد مستوى التعبير المثالي بناء على خصائص وموقع مؤشر Ca2+ ، بالإضافة إلى السؤال البيولوجي. إذا كان الحصول على الصور السريع مطلوبا ، فإن التعبير العالي نسبيا مثالي. ومع ذلك ، فقد وجد أن تعبيرا عاليا للغاية لمؤشرات Ca2+ يسبب سوء توطين تحت الخلايا ، بالإضافة إلى تعبير غير محدد في الخلايا أو الأنسجة الأخرى.

تم استخدام مؤشرات Ca 2+ المشفرة وراثيا على نطاق واسع في تحليلات الجسم الحي ل Ca2+ في C. elegans ، وكذلك في الكائنات النموذجية الأخرى. حققت بعض هذه الدراسات مراقبة دقة الخلية الواحدة لمستويات Ca 2+ في جسم الخلية العصبية21،22،23،24. تم تحقيق قياسات تدفق الكالسيوم 2+ في المقصورات الفرعية العصبية في الجسم الحي في C. elegans وكذلك أنظمة الفقاريات ولكن فقط عن طريق تسجيل نشاط مؤشر Ca 2+ في عصبة كاملة 25,26 أو مجموعات من التشعبات 27. على الرغم من أن قياس نشاط Ca 2+ في أجسام الخلايا العصبية والتشعبات ككل يعكس نشاط ارتفاع الخلية ، إلا أنه لا يسمح بمراقبة ديناميكيات تدفق Ca 2+ (أي اتجاه أو معدل الانتشار) أو العتبة الفرعية Ca2+ العابرة. قلة من الدراسات في الجسم الحي تمكنت من تمييز معالجة Ca2+ في الخلايا العصبية إلى الدقة المكانية والزمانية الموضحة هنا. تجدر الإشارة إلى أن الديناميات الزمنية لتدفق Ca 2+ في معظم الخلايا العصبية C. elegans 28 تبدو أبطأ من الخلايا العصبية الفقارية29 ، لذلك من المحتمل أن يكون بروتوكول التصوير السريع هذا غير كاف لالتقاط ديناميكيات زمنية مماثلة في أنظمة الفقاريات. ومع ذلك ، فإن التطورات الحديثة في الفحص المجهري ثنائي الفوتون تسمح بالتصوير فائق السرعة (120 هرتز) ، تحت الخلوي للكالسيوم في التشعبات الحصين الفردية في الفئران30 التي تتصرف بحرية ، مما يوفر وعدا لتحقيق تصوير Ca2+ عالي الدقة مماثل في الفقاريات.

من المهم ملاحظة أن هذا النهج غير النسبي للتصوير في الجسم الحي Ca2+ يتطلب استخدام muscimol ، الذي يمنع تقلص عضلات جدار الجسم ، وبالتالي الحد من حركة الدودة أثناء التصوير31. إذا كانت هناك حركة مفرطة أثناء التصوير (حركة متسقة في أكثر من ~ 20٪ من الديدان) ، فيجب عمل محلول درفلة جديد باستخدام حصصة مذاب حديثا من muscimol ، ويجب تمديد الوقت الذي تستحم فيه الدودة في محلول الدرفلة قبل التدحرج. Muscimol هو ناهض مستقبلات GABA ، مما يعني أنه يثبط الخلايا العصبية GABAergic ، بما في ذلك تلك التي توفر مدخلات للخلايا العصبية AVA. بالإضافة إلى ذلك ، فإن العديد من الخلايا العصبية المثيرة ، بما في ذلك AVA ، تعبر عن مستويات منخفضة من مستقبلات GABA ، لذلك من المحتمل أن استخدام muscimol في هذا البروتوكول يقلل من النشاط العصبي. ومع ذلك ، باستخدام هذا البروتوكول ، يتم تقليل التنشيط التلقائي الكلي ل AVA بنسبة ~ 29٪ فقط في وجود muscimol (بيانات غير منشورة). قد يتم تقليل تنشيط الخلايا العصبية الأخرى بشكل كبير بواسطة muscimol ، ويمكن اختبار ذلك عن طريق استبدال muscimol ب M9 في المحلول المتداول وإجراء التصوير في جسم الخلية العصبية عند التكبيرالمنخفض 32. بديل لاستخدام muscimol هو استخدام مؤشر Ca2+ النسبي33,34 ، والذي من شأنه أن يسمح بتصحيح مضان بسبب حركة الدودة. الجانب السلبي لهذا النهج هو أنه يتطلب إعدادا بصريا قادرا على التصوير بالطول الموجي المزدوج ويحد من القدرة على استخدام مؤشر Ca2+ مع العديد من أدوات الفلورسنت الأخرى.

أحد القيود الرئيسية لنظام الفحص المجهري الموصوف هو تقليل الضوء المنبعث بواسطة قرص الغزل ، مما يؤدي إلى فقدان المعلومات. يمكن تعديل هذا النظام للسماح بزيادة التقاط الضوء المنبعث عن طريق تنفيذ قرص به فتحات دبوس ذات قطر أكبر. ومع ذلك ، فإن هذا التغيير من شأنه أن يقلل من الدقة المحورية (z-plane) ويزيد من مضان الخلفية. ومن الإعدادات المجهرية المحتملة الأخرى لهذا الغرض مجهر ورقة الضوء سريع المسح ، والذي تم تحسينه في السنوات الأخيرة للسماح بالتصوير السريع (حتى 50 هرتز) في الموقع وفي الجسم الحي35.

سيسمح تقييم الديناميات الزمانية المكانية للسيتوبلازم والميتوكوندريا Ca 2+ بفهم أفضل لكيفية قيام عابرات Ca2+ المحلية ، وحتى الأحداث دون العتبة ، بإطلاق إشارات تعتمد على الكالسيوم أو تعديل بيولوجيا الميتوكوندريا. يمكن أن يكون هذا التصوير تحت الخلوي ، في الجسم الحي Ca2+ مفيدا بشكل خاص لدراسة اللدونة المشبكية ، والتغيرات المعتمدة على النشاط في التمثيل الغذائي للخلايا العصبية ، والتعديل التماثلي لاستثارة الخلايا العصبية. مزيد من التحقيق في كيفية تكيف البيئات المحلية تحت الخلوية حول حالات محددة من النشاط العصبي (أي تركيزات محددة مكانيا وعمر Ca 2+) من شأنه أن يوفر نظرة ثاقبة حول كيف يؤدي خلل التوازن Ca2+ إلى تغيرات مسببة للأمراض في وظيفة الخلايا العصبية. تعد القدرة على دراسة هذا في كائن حي سليم مفيدة بشكل خاص لأنها تمكن من إجراء دراسات طولية من شأنها أن تلقي الضوء على كيف ولماذا يتغير توازن الكالسيوم2+ مع الشيخوخة الطبيعية والتنكس العصبي المرتبط بالمرض. يقتصر تطبيق هذه الطريقة لدراسة الشيخوخة والتنكس العصبي إلى حد ما على الأعمار البيولوجية المبكرة في C. elegans (<4 أيام من مرحلة البلوغ). في الواقع ، يكون التلاعب الجسدي أثناء تركيب الديدان ووضعها للتصوير أمرا صعبا بعد حوالي 5 أيام من مرحلة البلوغ عندما تصبح الديدان رخوة بسبب انخفاض قوة العضلات وسلامة البشرة.

سيكون التصوير السريع في الجسم الحي لديناميكيات ومعالجة الخلايا الفرعية ل Ca2+ مفيدا في فهمنا لكيفية تنظيم استثارة الخلايا العصبية والإشارات داخل الخلايا بدقة مكانيا وزمانيا. يمكن أن يفيد هذا البروتوكول مجموعة واسعة من الأبحاث والباحثين في العديد من المجالات بسبب تنوع العمليات المعتمدة على الكالسيوم2+ ودورها المركزي في وظيفة الخلايا العصبية. على سبيل المثال ، سيوفر تطبيق هذه الطريقة في الخلايا العصبية السليمة نظرة ثاقبة حول سبب حدوث ارتفاع السيتوبلازم Ca2+ أثناء الشيخوخة بالتزامن مع ضعف في اللدونة المشبكية ، وتنفس الميتوكوندريا غير الفعال ، بالإضافة إلى اختلالات وظيفية أخرى36,37. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام هذه الطريقة للتحقيق في أسباب خلل التوازن الداخلي Ca2+ المرتبط بالعمر38. ومع ذلك ، فإن تطبيق هذه الطريقة للأسئلة المتعلقة بالشيخوخة والتنكس العصبي يقتصر إلى حد ما على المراحل المبكرة من الشيخوخة (<5 أيام من مرحلة البلوغ)38. كما ذكر أعلاه ، فإن تصوير الديدان البالغة الأكبر سنا (>5 أيام من مرحلة البلوغ) أمر صعب باستخدام طريقة التدحرج الخاصة بنا ، ولكن التقدم في C. elegans microfluidics يظهر وعدا للتصوير بدقة مكانية مماثلة لمدة تصل إلى 12 يوما من مرحلة البلوغ39,40.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

يعلن المؤلفون عدم وجود مصالح متنافسة.

Acknowledgments

تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة (NIH) (R01- NS115947 الممنوحة ل F. Hoerndli). نود أيضا أن نشكر الدكتور أتيلا ستيتاك على بلازميد pAS1.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100x/1.40 Oil objective   Olympus   UPlanSApo
10x/0.40 Objective  Olympus   UPlanSApo
22 mm x 22 mm Cover glass  VWR  48366-227 
Agarose SFR  VWR  J234-100G 
Beam homogenizer Andor Technologies Borealis upgrade to CSU-X1
CleanBench laboratory table  TMC  With vibration control
Disposable culture tubes VWR  47729-572  13 mm x 100 mm
Environmental chamber Thermo Scientific 3940 Set to 20 °C
Filter wheel or slider ASI For 25 mm diameter filters
FJH 185 Caenorhabditis Genetics Center  FJH 185 Worm strain
FJH 597 Caenorhabditis Genetics Center FJH 597 Worm strain
GFP bandpass emission filter  Chroma  525 ± 50 nm (25 mm diameter)
ILE laser combiner  Andor Technologies  4 laser lines 
ILE solid state 488 nm laser Andor Technologies  50 mW
ImageJ National Institutes of Health Version 1.52a
IX83 Spinning disk confocal microscope  Olympus  With Yokogawa CSU-X1 spinning disc
iXon Ultra EMCCD camera  Andor Technologies 
Low auto-fluorescence immersion oil  Olympus  Z-81226
MetaMorph  Molecular Devices  Version 7.10.1 
Microscope control box Olympus IX3-CBH
Muscimol  MP Biomedical / Sigma 02195336-CF 
pAS1 AddGene 194970 Plasmid
pBSKS Stratagene
pCT61 Plasmid available from Hoerndli/Maricq lab upon request
pJM23 Plasmid available from Hoerndli/Maricq lab upon request
pKK1  AddGene  194969 Plasmid
Polybead microspheres  Polysciences Inc.  00876-15  0.094 µm
Stability chamber Norlake Scientific NSRI241WSW/8H Set to 15 °C
Stage controller ASI With filter wheel control
Standard microscope slide Premiere 9108W-E 75 mm x 25 mm x 1 mm
Touch panel controller Olympus I3-TPC
Z-drift corrector  Olympus  IX3-ZDC2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Berridge, M. J. Neuronal calcium signaling. Neuron. 21 (1), 13-26 (1998).
  2. Brini, M., Calì, T., Ottolini, D., Carafoli, E. Neuronal calcium signaling: Function and dysfunction. Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (15), 2787-2814 (2014).
  3. Brini, M., Calì, T., Ottolini, D., Carafoli, E. Intracellular calcium homeostasis and signaling. Metal Ions in Life Sciences. 12, 119-168 (2013).
  4. Berridge, M. J. The inositol trisphosphate/calcium signaling pathway in health and disease. Physiological Reviews. 96 (4), 1261-1296 (2016).
  5. Schrank, S., Barrington, N., Stutzmann, G. E. Calcium-handling defects and neurodegenerative disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 12 (7), 035212 (2020).
  6. Pchitskaya, E., Popugaeva, E., Bezprozvanny, I. Calcium signaling and molecular mechanisms underlying neurodegenerative diseases. Cell Calcium. 70, 87-94 (2018).
  7. Jadiya, P., et al. Impaired mitochondrial calcium efflux contributes to disease progression in models of Alzheimer's disease. Nature Communications. 10 (1), 3885 (2019).
  8. Zeiser, E., Frøkjær-Jensen, C., Jorgensen, E., Ahringer, J. MosSCI and gateway compatible plasmid toolkit for constitutive and inducible expression of transgenes in the C. elegans germline. PLoS One. 6 (5), 20082 (2011).
  9. Zhu, B., Cai, G., Hall, E. O., Freeman, G. J. In-FusionTM assembly: Seamless engineering of multidomain fusion proteins, modular vectors, and mutations. Biotechniques. 43 (3), 354-359 (2007).
  10. Evans, T. C. Transformation and Microinjection. WormBook. , (2006).
  11. Giordano-Santini, R., Dupuy, D. Selectable genetic markers for nematode transgenesis. Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (11), 1917-1927 (2011).
  12. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , (2006).
  13. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans: Transferring worms grown on NGM plates. WormBook. , (2006).
  14. Ogama, T. A beginner's guide to improving image acquisition in fluorescence microscopy. The Biochemist. 42 (6), 22-27 (2020).
  15. Mellem, J. E., Brockie, P. J., Madsen, D. M., Maricq, A. v Action potentials contribute to neuronal signaling in C. elegans. Nature Neuroscience. 11 (8), 865-867 (2009).
  16. Zhang, Y., et al. Fast and sensitive GCaMP calcium indicators for imaging neural populations. bioRxiv. , (2021).
  17. Kerruth, S., Coates, C., Dürst, C. D., Oertner, T. G., Török, K. The kinetic mechanisms of fast-decay red-fluorescent genetically encoded calcium indicators. Journal of Biological Chemistry. 294 (11), 3934-3946 (2019).
  18. de Juan-Sanz, J., et al. Axonal endoplasmic reticulum Ca2+ content controls release probability in CNS nerve terminals. Neuron. 93 (4), 867-881 (2017).
  19. Bhatla, N. C. elegans neural network. , Available from: http://wormweb.org/neurainet#c=BAG&m=1 (2014).
  20. Fung, W., Wexler, L., Heiman, M. G. Cell-type-specific promoters for C. elegans glia. Journal of Neurogenetics. 34 (3-4), 335-346 (2020).
  21. Ali, F., Kwan, A. C. Interpreting in vivo calcium signals from neuronal cell bodies, axons, and dendrites: a review. Neurophotonics. 7 (1), 011402 (2019).
  22. Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
  23. Mank, M., et al. A genetically encoded calcium indicator for chronic in vivo two-photon imaging. Nature Methods. 5 (9), 805-811 (2008).
  24. Birkner, A., Tischbirek, C. H., Konnerth, A. Improved deep two-photon calcium imaging in vivo. Cell Calcium. 64, 29-35 (2017).
  25. Ryan, K. C., Laboy, J. T., Norman, K. R. Deregulation of mitochondrial calcium handling due to presenilin loss disrupts redox homeostasis and promotes neuronal dysfunction. Antioxidants. 11 (9), 1642 (2022).
  26. Yang, H. H., et al. Subcellular imaging of voltage and calcium signals reveals neural processing in vivo. Cell. 166 (1), 245-257 (2016).
  27. Takahashi, N., Oertner, T. G., Hegemann, P., Larkum, M. E. Active cortical dendrites modulate perception. Science. 354 (6319), 1587-1590 (2016).
  28. Nicoletti, M., et al. Biophysical modeling of C. elegans neurons: Single ion currents and whole-cell dynamics of AWCon and RMD. PLoS One. 14 (7), 0218738 (2019).
  29. Church, P. J., Stanley, E. F. Single L-type calcium channel conductance with physiological levels of calcium in chick ciliary ganglion neurons. The Journal of Physiology. 496, 59-68 (1996).
  30. O'Hare, J. K., et al. Compartment-specific tuning of dendritic feature selectivity by intracellular Ca 2+ release. Science. 375 (6586), (2022).
  31. Mclntire, S. L., Jorgensen, E., Horvitz, H. R. Genes required for GABA function in Caenorhabditis elegans. Nature. 364 (6435), 334-337 (1993).
  32. Doser, R. L., Amberg, G. C., Hoerndli, F. J. Reactive oxygen species modulate activity-dependent AMPA receptor transport in C. elegans. The Journal of Neuroscience. 40 (39), 7405-7420 (2020).
  33. Wu, J., et al. A long Stokes shift red fluorescent Ca2+ indicator protein for two-photon and ratiometric imaging. Nature Communications. 5, 5262 (2014).
  34. Cho, J. -H., et al. The GCaMP-R family of genetically encoded ratiometric calcium indicators. ACS Chemical Biology. 12 (4), 1066-1074 (2017).
  35. Smith, J. J., et al. A light sheet fluorescence microscopy protocol for Caenorhabditis elegans larvae and adults. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 1012820 (2022).
  36. Müller, M., et al. Mitochondria and calcium regulation as basis of neurodegeneration associated with aging. Frontiers in Neuroscience. 12, 470 (2018).
  37. Nikoletopoulou, V., Tavernarakis, N. Calcium homeostasis in aging neurons. Frontiers in Genetics. 3, 200 (2012).
  38. Chen, C. -H., Chen, Y. -C., Jiang, H. -C., Chen, C. -K., Pan, C. -L. Neuronal aging: Learning from C. elegans. Journal of Molecular Signaling. 8 (1), 14 (2013).
  39. Saberi-Bosari, S., Huayta, J., San-Miguel, A. A microfluidic platform for lifelong high-resolution and high throughput imaging of subtle aging phenotypes in C. elegans. Lab on a Chip. 18 (20), 3090-3100 (2018).
  40. Sridhar, N., Fajrial, A. K., Doser, R. L., Hoerndli, F. J., Ding, X. Surface acoustic wave microfluidics for repetitive and reversible temporary immobilization of C. elegans. Lab on a Chip. 22 (24), 4882-4893 (2022).

Tags

علم الأعصاب ، العدد 193 ،
التصوير تحت الخلوي للتعامل مع الكالسيوم العصبي <em>في الجسم الحي</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Doser, R., Knight, K. M., Deihl, E., … More

Doser, R., Knight, K. M., Deihl, E., Hoerndli, F. Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo. J. Vis. Exp. (193), e64928, doi:10.3791/64928 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter