Summary
De nuværende metoder beskriver en ikke-ratiometrisk tilgang til calciumbilleddannelse i høj opløsning i subcompartment in vivo i Caenorhabditis elegans ved hjælp af let tilgængelige genetisk kodede calciumindikatorer.
Abstract
Calcium (Ca 2+) billeddannelse er i vid udstrækning blevet brugt til at undersøge neuronal aktivitet, men det bliver stadig mere klart, at subcellulær Ca2+ håndtering er en afgørende komponent i intracellulær signalering. Visualiseringen af subcellulær Ca2+ dynamik in vivo, hvor neuroner kan studeres i deres oprindelige, intakte kredsløb, har vist sig teknisk udfordrende i komplekse nervesystemer. Gennemsigtigheden og det relativt enkle nervesystem hos nematoden Caenorhabditis elegans muliggør cellespecifik ekspression og in vivo-visualisering af fluorescerende tags og indikatorer. Blandt disse er fluorescerende indikatorer, der er blevet modificeret til brug i cytoplasmaet, såvel som forskellige subcellulære rum, såsom mitokondrier. Denne protokol muliggør ikke-ratiometrisk Ca 2+ billeddannelse in vivo med en subcellulær opløsning, der tillader analyse af Ca2+ dynamik ned til niveauet for individuelle dendritiske rygsøjler og mitokondrier. Her bruges to tilgængelige genetisk kodede indikatorer med forskellige Ca 2+ affiniteter til at demonstrere brugen af denne protokol til måling af relative Ca2+ niveauer inden for cytoplasma eller mitokondriematrix i et enkelt par excitatoriske interneuroner (AVA). Sammen med de genetiske manipulationer og langsgående observationer, der er mulige i C. elegans, kan denne billeddannelsesprotokol være nyttig til at besvare spørgsmål om, hvordan Ca2+ håndtering regulerer neuronal funktion og plasticitet.
Introduction
Calciumioner (Ca2+) er meget alsidige bærere af information i mange celletyper. I neuroner er Ca2+ ansvarlig for den aktivitetsafhængige frigivelse af neurotransmittere, reguleringen af cytoskeletal motilitet, finjustering af metaboliske processer samt mange andre mekanismer, der kræves for korrekt neuronal vedligeholdelse og funktion 1,2. For at sikre effektiv intracellulær signalering skal neuroner opretholde lave basale Ca2+ niveauer i deres cytoplasma3. Dette opnås ved hjælp af kooperative Ca 2+ håndteringsmekanismer, herunder optagelse af Ca2+ i organeller såsom endoplasmatisk retikulum (ER) og mitokondrier. Disse processer, ud over arrangementet af Ca 2+-permeable ionkanaler i plasmamembranen, resulterer i heterogene niveauer af cytoplasmatisk Ca2+ i hele neuronen.
Ca 2+ heterogenitet under hvile og neuronal aktivering giver mulighed for forskelligartet, placeringsspecifik regulering af Ca 2+-afhængige mekanismer 1. Et eksempel på de koncentrationsspecifikke virkninger af Ca 2+ er frigivelsen af Ca 2+ fra ER gennem inositol 1,4,5-trisphosphat (InsP 3) receptorer. Lave Ca2+ niveauer i kombination med InsP3 er nødvendige for åbningen af receptorens calciumgennemtrængelige pore. Alternativt hæmmer høje Ca2+ niveauer både direkte og indirekte receptoren4. Betydningen af Ca 2+ homeostase for korrekt neuronal funktion understøttes af beviser, der tyder på, at forstyrret intracellulær Ca2+ håndtering og signalering er et tidligt skridt i patogenesen af neurodegenerative lidelser og naturlig aldring 5,6. Specifikt er unormal Ca2+ optagelse og frigivelse af ER og mitokondrier forbundet med begyndelsen af neuronal dysfunktion ved Alzheimers sygdom, Parkinsons sygdom og Huntingtons sygdom 6,7.
Undersøgelsen af Ca 2+ dyshomeostase under naturlig aldring eller neurodegeneration kræver langsgående observation af Ca2+ niveauer med subcellulær opløsning i en levende, intakt organisme, hvor den oprindelige cellulære arkitektur (dvs. arrangementet af synapser og fordeling af ionkanaler) opretholdes. Til dette formål giver denne protokol vejledning om brugen af to let tilgængelige, genetisk kodede Ca 2+ sensorer til registrering af Ca2+ dynamik in vivo med høj rumlig og tidsmæssig opløsning. De repræsentative resultater opnået ved hjælp af den beskrevne metode i C. elegans demonstrerer, hvordan ekspressionen af Ca 2+ indikatorer i cytoplasma eller mitokondriematrix af enkelte neuroner kan muliggøre hurtig erhvervelse af fluorescerende billeder (op til 50 Hz), der illustrerer Ca 2+ dynamikken med den ekstra evne til at skelne Ca 2+ niveauerne inden for enkelt rygsøjlelignende strukturer og individuelle mitokondrier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Oprettelse af transgene stammer
- Ved hjælp af en kloningsmetode efter eget valg8,9, klonekspressionsvektorer til at indeholde Pflp-18- eller Prig-3-promotoren (for AVA-specifikt signal i ventralnervestrengen) efterfulgt af den valgte Ca2+-indikator og derefter en 3' UTR (se diskussionen for mere information)10. En liste over plasmider og deres kilder findes i supplerende tabel 1.
- Følg den etablerede protokol for dannelse af transgene stammer via mikroinjektion af en DNA-blanding (<100 ng/μL; se supplerende tabel 1 for koncentrationerne af hvert plasmid), der indeholder Ca2+ indikatortransgenet (~20 ng/μL) og rednings-DNA'et lin-15+ (selektionsmarkør) i gonaden på en 1 dag gammel voksen C. elegans10 (genotype: LIN-15 (N765TS); fænotype: multi-vulva)10,11.
SEDDEL. Oprethold lin-15 (n765ts) forældre ved 15 ° C for at undertrykke temperaturfølsom mutation. - De injicerede forældre opretholdes ved 20 °C, indtil F1-afkommets voksenalder giver mulighed for transgen selektion ved fravær af multivulvafænotypen.
- Klonalt passage13 voksne F1-afkom, der ikke har multivulva-fænotypen, da dette indikerer ekspressionen af det ekstrakromosomale array, der indeholder Ca2+ indikatoren11.
- Vurder ekspressionen af Ca2+ indikatoren i F2 eller F3 afkom, der ikke har multi-vulva fænotypen ved at montere og billeddannelse 1 dag gamle voksne som beskrevet senere i afsnit 3.
SEDDEL. Et relativt højt udtryk for indikatoren er nødvendig for hurtig erhvervelse af billeder som beskrevet her (se diskussionen for flere detaljer). - Udfør eksperimenter på efterfølgende generationer af de transgene stammer med en optimal ekspression af Ca 2+-indikatoren (se diskussionen for flere detaljer), idet stammerne opretholdes under standardbetingelser (20 °C på NGM-plader)12.
2. Optisk opsætning
- Brug et mikroskop, der er i stand til langsigtet time-lapse-billeddannelse.
SEDDEL. De repræsentative data blev erhvervet ved hjælp af et inverteret spindeskivekonfokalmikroskop udstyret med 488 nm og 561 nm excitationslasere. - Brug et mål med lav forstørrelse (dvs. 10x/0,40) til den rå lokalisering af ormen.
- For at opnå subcellulær opløsning skal du skifte til og lokalisere neuronerne ved hjælp af et højt forstørrelsesmål.
SEDDEL. Et 100x/1,40 NA-oliemål blev brugt til at indsamle de repræsentative data i denne undersøgelse. - Hent billederne ved hjælp af et ultrafølsomt kamera, der er i stand til hurtig billedoptagelse (>50 fps).
- Brug et standardemissionsfilter til den valgte Ca2+ -indikator (dvs. et 525 nm ± 50 nm emissionsfilter til GCaMP6f og mitoGCaMP).
- Tilføj en Z-drift corrector (ZDC) til erhvervelse af billedstrømme længere end 10 s, da udtørringen af agarpuden under billeddannelsessessionen får neuritten til at glide ud af fokus inden for flere sekunder.
SEDDEL. Hvis en mikroskopiopsætning ikke tillader ZDC, eller hvis der ønskes lange (>20 min) billeddannelsesperioder, skal du anvende en kant af siliciumfedt eller smeltet vaselin omkring agarpuden for at bremse udtørringen.
3. Forberedelse af orme til billeddannelse
- Klargøring af agarpuderne
- Der fremstilles 3 ml 10% agar ved at opløse agar af molekylær kvalitet i M912 i et 13 mm x 100 mm glaskulturrør og mikrobølgeovn i flere sekunder (se materialetabel).
SEDDEL. Smeltet agar kan opbevares på en varmeblok i op til 1 time eller kan gøres frisk hver gang agarpuder er nødvendige. - Placer et mikroskopglas mellem to ekstra dias, der hver har to lag laboratorietape (se figur 1A-i).
- Skær spidsen af en 1.000 μL pipettespids (uden filter), og brug den til at pipette en lille dråbe agar på midterdækslet (figur 1A-i).
- Agaren gøres flad ved at trykke endnu et objektglas ned oven på agaren (figur 1A-ii).
- Efter afkøling skæres agaren i en lille skive ved hjælp af åbningen af et 13 mm x 100 mm glaskulturrør (figur 1A-iii), og derefter fjernes den omgivende agar.
- Der fremstilles 3 ml 10% agar ved at opløse agar af molekylær kvalitet i M912 i et 13 mm x 100 mm glaskulturrør og mikrobølgeovn i flere sekunder (se materialetabel).
- Forberedelse af ormvalseopløsningen
- Muscimolpulver opløses i M9 for at skabe en 30 mM bestand. Der inddeles i 50 μL alikvoter, og den opbevares ved 4 °C.
- Optø en ny prøve på 30 mM muscimol hver 3.-5. dag (og opbevar ved 20 °C under brug).
- Fortynd en 30 mM muscimolbestand i forholdet 1: 1 med polystyrenperler for at fremstille rulleopløsningen.
- Placering af en orm til billeddannelse
- 1,6 μL af rulleopløsningen anbringes på midten af agarpuden.
BEMÆRK: Mængden af væske bør justeres for billeddannelse af yngre (mindre) eller ældre dyr (mere). - Brug den foretrukne snekkeplukker (dvs. en glas- eller platintrådpluk)13 til at overføre en orm af den ønskede alder uden multivulvafænotype11 til den rullende opløsning på agarpuden (figur 1A-iv).
SEDDEL. De repræsentative data er fra 1 dag gamle hermafroditter (GCaMP6f stamme = FJH185; mitoGCaMP stamme; FJH597; se supplerende tabel 1), som kan identificeres ved tilstedeværelsen af kun en række æg. Se diskussionen for flere detaljer om at arbejde med orme i forskellige aldre. - Vent i ~ 5 minutter på, at muscimol reducerer ormens bevægelse, og slip derefter en 22 mm x 22 mm dæksel oven på agarpuden, hvilket fysisk begrænser ormens bevægelse.
- Til billeddannelse af neuritter i den ventrale nerveledning rulles ormen ind i retningen vist i figur 1B, C ved let at skubbe dæksedlen.
SEDDEL. For at visualisere den ventrale nerveledning skal du placere ormen med hovedet opad og rulle ormen, indtil tarmen er på højre side af den proksimale del og venstre for den distale del af ormen (fra seerens perspektiv). Inverter denne retning (figur 1C) til billeddannelse af neuritter i rygnerveledningen.
- 1,6 μL af rulleopløsningen anbringes på midten af agarpuden.
- Montering af ormen på et mikroskop
- Placer en dråbe nedsænkningsolie på dæksedlen, før du monterer den på mikroskoptrinnet.
- Find ormen ved hjælp af målsætningen med lav forstørrelse (10x) i brightfield.
- Skift til 100x-målet, og juster fokus.
- Find AVA-neuritten ved hjælp af belysningen af GCaMP eller mitoGCaMP med 488 nm billedlaseren.
BEMÆRK: Brug små justeringer for at forhindre, at ormen klemmer eller trækker dækslet af.
4. Erhvervelse af billedstrømme i høj opløsning
- In vivo GCaMP-billeddannelse
- Indstil eksponeringstiden til 20 ms.
- Juster indstillingerne for billedlaser og optagelse, indtil den basale GCaMP-fluorescens er i mellemområdet for kameraets dynamiske område14. Se diskussionen for forslag til optimering af billeddannelsesparametrene ved hjælp af andre mikroskopiopsætninger.
SEDDEL. For den optiske opsætning, der blev brugt i denne undersøgelse, skal du indstille 488 nm billedlaseren til følgende outputindstillinger: lasereffekt = 50% og dæmpning = 1. Rediger de ekstra anskaffelsesindstillinger som følger: EM-forstærkning = 200 og forforstærkerforstærkning = 1. - Når AVA-neuritten er lokaliseret ved hjælp af GCaMP-fluorescensen ved 100x forstørrelse, skal du indstille ZDC (se materialetabel) til et område på ±30 μm og starte kontinuerlig autofokusering. Korriger brændplanet manuelt efter behov før billeddannelse.
- Få en strøm af billeder ved 100x forstørrelse. Varigheder så lange som 10 min kan opnås med den opsætning, der blev brugt i denne undersøgelse.
- In vivo mitoGCaMP-billeddannelse
- Følg trin 4.1.1-4.1.2 efter behov for at opnå den basale mitoGCaMP-fluorescens i mellemområdet for kameraets dynamiske område14.
SEDDEL. For den optiske opsætning, der anvendes i denne undersøgelse, skal du indstille 488 nm billedlaseren til følgende outputindstillinger: lasereffekt = 20% og dæmpning = 10. Rediger anskaffelsesindstillingerne til følgende: EM-forstærkning = 100 og forforstærkerforstærkning = 2. - Når mitokondrierne i AVA-neuritten er placeret ved hjælp af mitoGCaMP-fluorescensen, indstilles ZDC som beskrevet ovenfor i trin 3.3.
- Få en strøm af billeder ved 100x forstørrelse.
- Følg trin 4.1.1-4.1.2 efter behov for at opnå den basale mitoGCaMP-fluorescens i mellemområdet for kameraets dynamiske område14.
5. Analyse af billedstrøm
- Åbn billedstrømmen i en passende billedsoftware til analyse af pixelværdierne i en billedserie (se Materialetabel).
- Brug Polygonmarkeringsværktøjet til at definere det subcellulære interesseområde (ROI), der indeholder GCaMP eller mitoGCaMP.
- Klik på Analyser > værktøjer > ROI Manager. I ROI Manager skal du klikke på Tilføj og derefter på Mere > Multimåling. I vinduet Multimåling skal du klikke på OK for automatisk at indsamle de gennemsnitlige, minimale og maksimale pixelintensiteter for det investeringsafkast, der er defineret ovenfor, for hvert billede i billedstrømmen til yderligere analyse.
SEDDEL. Det anbefales, at den gennemsnitlige pixelintensitet (Favg) normaliseres til minimumsintensiteten (F min) for hver ROI ved hjælp af forholdet Fgns/Fmin for at tage højde for fluorescensforskelle på grund af positionering i z-planet. Kassér billedstrømmene med ormbevægelse under billeddannelse, da dette også ville påvirke fluorescensmålingerne.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Disse to protokoller muliggør hurtig erhvervelse af differentielle Ca2+ niveauer inden for de subcellulære regioner og organeller af individuelle neuritter in vivo med høj rumlig opløsning. Den første protokol muliggør måling af cytoplasmatisk Ca2+ med høj tidsmæssig og rumlig opløsning. Dette demonstreres her ved hjælp af det cellespecifikke udtryk for GCaMP6f i den glutamaterge AVA-kommando interneuroner15, hvis neuritter løber hele længden af den ventrale nerveledning. Den hurtige erhvervelse af GCaMP6f-fluorescens (50 Hz) muliggjorde detektion af retningsbestemt udbredelse af Ca 2+ tilstrømning (figur 2A og supplerende video 1). Den subcellulære kvantificering af GCaMP6f fluorescens afslørede, at begyndelsen af Ca 2+ tilstrømning blev forsinket i en del af neuritten kun 10 μm væk (figur 2B). Derudover tillod denne protokol flere observationer af opdelte Ca 2+ og subthreshold Ca2+ hændelser. For eksempel blev dendritiske rygsøjlelignende strukturer fundet langs AVA-neuritten set at have blink i GCaMP6f-fluorescens, der opstod uafhængigt af neuritaktivering og ikke førte til en udbredelse af Ca 2+ tilstrømning (figur 2C, D og supplerende video 2).
Den anden protokol havde til formål hurtigt at måle de relative Ca2+ niveauer i de enkelte mitokondrier i enkelte neuritter. Brug af en ormstamme med AVA-specifik ekspression af mitokondriematrix-lokaliseret Ca2+-indikator mitoGCaMP muliggjorde hurtig påvisning af ændringer i mitoGCaMP-fluorescens på niveauet af individuelle mitokondrier inden for AVA-neuritten. Denne billeddannelsesprotokol afslørede forskellige tilstande af Ca2+ optagelse i mitokondrierne, i det mindste i denne neuron. For det første giver resultaterne vist i figur 3A et eksempel på den synkrone optagelse af en relativt stor mængde Ca2+ i en delmængde af mitokondrier. Mere specifikt afslørede disse data, at Ca2+ optagelse i nogle mitokondrier blev synkroniseret (Mito1 og Mito2; Figur 3A, B og supplerende video 3), mens nærliggende mitokondrier ikke syntes at optage Ca2+ (Mito3; Figur 3A,B). På samme måde blev undergrupper af mitokondrier set hurtigt optage og frigive små mængder Ca2+. Dette syntes også at være synkront (Mito1 og Mito3, figur 3C, D og supplerende video 4), men igen kun for en delmængde af mitokondrier (Mito 2, figur 3C, D).
Figur 1: Montering og rulning af C. elegans til billeddannelse af ventral nerveledning. (A) En illustration af trinnene til klargøring af agarpuderne og plukning af en enkelt orm i en rullende opløsning. (B) Et eksempel på en ormposition, før den omplaceres til billeddannelse. Den røde pil angiver behovet for en højre rulle af ormen, hvilket kan opnås ved at skubbe dækselen til højre (blå pil). Skalabjælke = 50 μm. (C) Den korrekte retning, der er nødvendig for at visualisere den ventrale nerveledning. Bemærk: Tarmen er på seerens højre side (ved hjælp af et opretstående mikroskop) i den proksimale halvdel og er derefter på venstre side i den distale halvdel. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Hurtig erhvervelse af GCaMP6f-fluorescens med subcellulær opløsning i AVA-neurit og rygsøjlelignende strukturer. (A) Repræsentative billeder af GCaMP6f-fluorescens ved AVAL og AVAR neurit bifurcation. Skalabjælke = 5 μm. (B) Kvantificering af GCaMP6f-fluorescens normaliseret til den minimale fluorescens (F) for det pågældende område (Fmin) for de proksimale (orange) og distale (blå) områder, der er defineret i det nederste billede i panel A. (C) Repræsentative billeder af GCaMP6f-fluorescens ved en rygsøjlelignende projektion i AVA-neuritten. (D) Normaliseret GCaMP6f-fluorescens i neuritten (orange) og den rygsøjlelignende projektion (blå) fra de tilsvarende områder i det nederste billede af panel C. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3. Hurtig billeddannelse af calciumoptagelse i individuelle mitokondrier i AVA neuritten. (A,C) Repræsentative billeder af mitoGCaMP fluorescens over tid. Skalabjælke = 50 μm. (B) Spor af normaliseret GCaMP-fluorescens (F/F min) for de tilsvarende mitokondrier vist på det nederste billede af panel A. (D) F/Fmin over 40 s billeddannelse i de områder, der er fremhævet på det nederste billede i panel C. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende video 1: GCaMP6f fluorescens i AVA neuritten. Videoen blev gengivet med 2x hastighed. Skalabjælke = 5 μm. Klik her for at downloade denne video.
Supplerende video 2: GCaMP6f fluorescens i en rygsøjlelignende projektion på AVA neuritten. Videoen blev gengivet med 2x hastighed. Skalabjælke = 5 μm. Klik her for at downloade denne video.
Supplerende video 3: MitoGCaMP-fluorescens i AVA neuritsynkroniseret mitokondriel calciumoptagelse. Videoen blev gengivet med 4x hastighed. Skalabjælke = 5 μm. Klik her for at downloade denne video.
Supplerende video 4: MitoGCaMP fluorescens i AVA neurit-hurtig optagelse og frigivelse af calcium af mitokondrierne. Videoen blev gengivet med 4x hastighed. Skalabjælke = 5 μm. Klik her for at downloade denne video.
Supplerende tabel 1: Genetiske reagenser og stammer anvendt i denne undersøgelse. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den første overvejelse ved implementering af den beskrevne metode indebærer valg af en Ca2+ indikator med ideelle egenskaber for det givne forskningsspørgsmål. Cytoplasmatiske Ca 2+ indikatorer har typisk en høj affinitet for Ca 2+, og følsomheden af disse indikatorer over for Ca2+ er omvendt relateret til kinetikken (on/off rate)16,17. Det betyder, at enten Ca2+ følsomhed eller kinetik skal prioriteres ud fra fænomenet interesse. For subcellulære rum med relativt høje basale Ca 2+ niveauer, såsom ER, bør Ca 2+ indikatorer med lav Ca2+ affinitet overvejes18. For at generere rekombinant DNA til cellespecifik ekspression af en Ca 2+-indikator bør den foretrukne kloningsteknik anvendes til at indsætte en cellespecifik promotor19,20 efterfulgt af den valgteCa2+-indikator og en 3' UTR. Relativt høje ekspressionsniveauer i AVA-neuronerne kan opnås ved at konstruere et plasmid med promotorerne Pflp-18 eller Prig-3, en let-858 eller unc-54 3' UTR og mikroinjicere dette plasmid ved 15-25 ng/μL (se supplerende tabel 1).
Den vellykkede mikroinjektion af plasmiderne indeholdende Ca 2+ indikatoren og lin-15+ i gonaden af lin-15 (n765ts) mutante orme vil give et F1 afkom, der udtrykker Ca 2+ indikatoren og reddes for multi-vulva fænotypen. Kun en delmængde (30% -80%) af F1-generationen vil overføre det syntetiske DNA til F2-generationen. Ekspressionen af Ca2+ indikatoren bør vurderes i det reddede F2 eller F3 afkom på plader med <60% transmission af det syntetiske DNA ved montering og billeddannelse af fluorescensen hos 1 dag gamle voksne, der reddes for multi-vulva fænotypen. Det ideelle ekspressionsniveau bestemmes ud fra egenskaberne og placeringen af Ca2+ indikatoren samt det biologiske spørgsmål. Hvis der ønskes hurtig billedoptagelse, er relativt højt udtryk ideelt. Imidlertid har et ekstremt højt udtryk for Ca2+ indikatorer vist sig at forårsage subcellulær fejllokalisering såvel som ikke-specifik ekspression i andre celler eller væv.
Genetisk kodede Ca 2+ indikatorer er blevet anvendt i vid udstrækning til in vivo analyser af Ca2+ i C. elegans, såvel som i andre modelorganismer. Nogle af disse undersøgelser har opnået enkeltcelleopløsningsovervågning af Ca 2+ niveauer i neuroncellekroppen21,22,23,24. Målinger af Ca 2+ tilstrømning i neuronale underrum er opnået in vivo i C. elegans såvel som hvirveldyrsystemer, men kun ved at registrere Ca 2+ indikatoraktiviteten i en hel neurit 25,26 eller populationer af dendritter 27. Selvom måling af Ca 2+ aktivitet i neuronale cellelegemer og dendritter som helhed afspejler cellens spidsaktivitet, tillader det ikke observation af dynamikken i Ca 2+ tilstrømning (dvs. retningen eller udbredelseshastigheden) eller sub-tærskel Ca2+ transienter. Få in vivo-studier har været i stand til at skelne Ca2+ håndtering i neuroner til den rumlige og tidsmæssige opløsning, der er demonstreret her. Det skal bemærkes, at den tidsmæssige dynamik af Ca 2+ tilstrømning i de fleste C. elegans neuroner 28 synes at være langsommere end i hvirveldyrneuroner 29, så det er sandsynligt, at denne hurtige billeddannelsesprotokol ville være utilstrækkelig til at fange lignende tidsmæssig dynamik i hvirveldyrsystemer. Imidlertid giver nylige fremskridt inden for to-fotonmikroskopi mulighed for ultrahurtig (120 Hz), subcellulær billeddannelse af calcium i individuelle hippocampale dendritter i frit opførte mus30, hvilket giver løfte om at opnå lignende høj opløsning Ca2+ billeddannelse hos hvirveldyr.
Det er vigtigt at bemærke, at denne ikke-ratiometriske tilgang til in vivo Ca2+ billeddannelse kræver brug af muscimol, som hæmmer sammentrækningen af kroppens vægmuskler og dermed begrænser ormens bevægelse under billeddannelse31. Hvis der er overdreven bevægelse under billeddannelse (ensartet bevægelse i mere end ~ 20% af ormene), skal der laves en ny rulleopløsning med en nyligt optøet alikvote muscimol, og den tid, hvor en orm bader i rulleopløsningen før rulning, skal forlænges. Muscimol er en GABA-receptoragonist, hvilket betyder, at det hæmmer GABAerge neuroner, herunder dem, der giver input til AVA-neuronerne. Derudover udtrykker mange excitatoriske neuroner, herunder AVA, lave niveauer af GABA-receptorer, så det er sandsynligt, at brugen af muscimol i denne protokol nedsætter neuronaktiviteten. Ved hjælp af denne protokol reduceres den samlede spontane aktivering af AVA imidlertid kun med ~29% i nærvær af muscimol (upublicerede data). Aktiveringen af andre neuroner kan reduceres mere drastisk af muscimol, og dette kan testes ved at erstatte muscimol med M9 i den rullende opløsning og udføre billeddannelse i neuroncellelegemet ved lav forstørrelse32. Et alternativ til at bruge muscimol ville være at bruge en ratiometrisk Ca2+ indikator33,34, hvilket ville muliggøre fluorescenskorrektion på grund af ormens bevægelse. Ulempen ved denne tilgang er, at den kræver en optisk opsætning, der er i stand til billeddannelse med dobbelt bølgelængde og begrænser muligheden for at bruge en Ca2+ indikator i kombination med mange andre fluorescerende værktøjer.
En væsentlig begrænsning af det beskrevne mikroskopisystem er reduktionen af udsendt lys fra den roterende skive, hvilket resulterer i tab af information. Dette system kan ændres for at muliggøre øget optagelse af udsendt lys ved at implementere en skive med stifthuller med større diameter. Denne ændring ville imidlertid reducere den aksiale (z-plan) opløsning og øge baggrundsfluorescensen. En anden mulig mikroskopiopsætning til dette formål ville være det hurtigscannende lysarkmikroskop, som er blevet forbedret i de senere år for at muliggøre hurtig (op til 50 Hz) billeddannelse in situ og in vivo35.
Vurdering af den spatiotemporale dynamik af cytoplasmatisk og mitokondriel Ca 2+ vil give mulighed for en bedre forståelse af, hvordan lokale Ca2+ transienter og endda subthreshold begivenheder kan udløse calciumafhængig signalering eller modulere mitokondriel biologi. Denne subcellulære in vivo Ca2+ billeddannelse kan være særlig nyttig til undersøgelse af synaptisk plasticitet, aktivitetsafhængige ændringer i neuronal metabolisme og den homeostatiske modulering af neuronal excitabilitet. Yderligere undersøgelse af, hvordan lokale, subcellulære miljøer tilpasser sig omkring definerede tilstande af neuronal aktivitet (dvs. rumligt specifikke koncentrationer og levetid for Ca 2+) ville give indsigt i, hvordan Ca2+ dyshomeostase fører til patogene ændringer i neuronal funktion. Evnen til at studere dette i en levende, intakt organisme er især nyttig, da det muliggør langsgående undersøgelser, der vil kaste lys over, hvordan og hvorfor Ca2+ homeostase ændrer sig med naturlig aldring og sygdomsrelateret neurodegeneration. Anvendelse af denne metode til at studere aldring og neurodegeneration er noget begrænset til de tidlige biologiske aldre i C. elegans (<4 dage af voksenalderen). Faktisk er den fysiske manipulation under montering og placering af ormene til billeddannelse vanskelig efter ca. 5 dages voksenalder, når ormene bliver slappe på grund af nedsat muskeltonus og neglebåndsintegritet.
Hurtig in vivo-billeddannelse af dynamikken og den subcellulære håndtering af Ca2+ vil være medvirkende til vores forståelse af, hvordan neuronal excitabilitet og intracellulær signalering reguleres fint rumligt og tidsmæssigt. Denne protokol kan gavne en bred vifte af forskning og forskere på mange områder på grund af mangfoldigheden af Ca2+-afhængige processer og deres centrale rolle i neuronal funktion. For eksempel ville anvendelsen af denne metode i raske neuroner give indsigt i, hvorfor forhøjet cytoplasmatisk Ca2+ under aldring opstår i forbindelse med forringelser i synaptisk plasticitet, ineffektiv mitokondriel respiration samt andre dysfunktioner36,37. Derudover kan denne metode bruges til at undersøge årsagerne til aldersrelateret Ca2+ dyshomeostase38. Anvendelsen af denne metode til spørgsmål vedrørende aldring og neurodegeneration er imidlertid noget begrænset til de tidlige stadier af aldring (<5 dage i voksenalderen)38. Som nævnt ovenfor er billeddannelse af ældre voksne orme (>5 dage i voksenalderen) vanskelig ved hjælp af vores rullemetode, men fremskridt inden for C. elegans mikrofluidik viser løfte om billeddannelse med en lignende rumlig opløsning i op til 12 dage af voksenalderen 39,40.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health (NIH) (R01- NS115947 tildelt F. Hoerndli). Vi vil også gerne takke Dr. Attila Stetak for pAS1-plasmidet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100x/1.40 Oil objective | Olympus | UPlanSApo | |
| 10x/0.40 Objective | Olympus | UPlanSApo | |
| 22 mm x 22 mm Cover glass | VWR | 48366-227 | |
| Agarose SFR | VWR | J234-100G | |
| Beam homogenizer | Andor Technologies | Borealis upgrade to CSU-X1 | |
| CleanBench laboratory table | TMC | With vibration control | |
| Disposable culture tubes | VWR | 47729-572 | 13 mm x 100 mm |
| Environmental chamber | Thermo Scientific | 3940 | Set to 20 °C |
| Filter wheel or slider | ASI | For 25 mm diameter filters | |
| FJH 185 | Caenorhabditis Genetics Center | FJH 185 | Worm strain |
| FJH 597 | Caenorhabditis Genetics Center | FJH 597 | Worm strain |
| GFP bandpass emission filter | Chroma | 525 ± 50 nm (25 mm diameter) | |
| ILE laser combiner | Andor Technologies | 4 laser lines | |
| ILE solid state 488 nm laser | Andor Technologies | 50 mW | |
| ImageJ | National Institutes of Health | Version 1.52a | |
| IX83 Spinning disk confocal microscope | Olympus | With Yokogawa CSU-X1 spinning disc | |
| iXon Ultra EMCCD camera | Andor Technologies | ||
| Low auto-fluorescence immersion oil | Olympus | Z-81226 | |
| MetaMorph | Molecular Devices | Version 7.10.1 | |
| Microscope control box | Olympus | IX3-CBH | |
| Muscimol | MP Biomedical / Sigma | 02195336-CF | |
| pAS1 | AddGene | 194970 | Plasmid |
| pBSKS | Stratagene | ||
| pCT61 | Plasmid available from Hoerndli/Maricq lab upon request | ||
| pJM23 | Plasmid available from Hoerndli/Maricq lab upon request | ||
| pKK1 | AddGene | 194969 | Plasmid |
| Polybead microspheres | Polysciences Inc. | 00876-15 | 0.094 µm |
| Stability chamber | Norlake Scientific | NSRI241WSW/8H | Set to 15 °C |
| Stage controller | ASI | With filter wheel control | |
| Standard microscope slide | Premiere | 9108W-E | 75 mm x 25 mm x 1 mm |
| Touch panel controller | Olympus | I3-TPC | |
| Z-drift corrector | Olympus | IX3-ZDC2 |
References
- Berridge, M. J.
- Brini, M., Calì, T., Ottolini, D., Carafoli, E. Neuronal calcium signaling: Function and dysfunction. Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (15), 2787-2814 (2014).
- Brini, M., Calì, T., Ottolini, D., Carafoli, E. Intracellular calcium homeostasis and signaling. Metal Ions in Life Sciences. 12, 119-168 (2013).
- Berridge, M. J. The inositol trisphosphate/calcium signaling pathway in health and disease. Physiological Reviews. 96 (4), 1261-1296 (2016).
- Schrank, S., Barrington, N., Stutzmann, G. E. Calcium-handling defects and neurodegenerative disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 12 (7), 035212 (2020).
- Pchitskaya, E., Popugaeva, E., Bezprozvanny, I. Calcium signaling and molecular mechanisms underlying neurodegenerative diseases. Cell Calcium. 70, 87-94 (2018).
- Jadiya, P., et al. Impaired mitochondrial calcium efflux contributes to disease progression in models of Alzheimer's disease. Nature Communications. 10 (1), 3885 (2019).
- Zeiser, E., Frøkjær-Jensen, C., Jorgensen, E., Ahringer, J. MosSCI and gateway compatible plasmid toolkit for constitutive and inducible expression of transgenes in the C. elegans germline. PLoS One. 6 (5), 20082 (2011).
- Zhu, B., Cai, G., Hall, E. O., Freeman, G. J. In-FusionTM assembly: Seamless engineering of multidomain fusion proteins, modular vectors, and mutations. Biotechniques. 43 (3), 354-359 (2007).
- Evans, T. C.
- Giordano-Santini, R., Dupuy, D. Selectable genetic markers for nematode transgenesis. Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (11), 1917-1927 (2011).
- Stiernagle, T.
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans: Transferring worms grown on NGM plates. WormBook. , (2006).
- Ogama, T. A beginner's guide to improving image acquisition in fluorescence microscopy. The Biochemist. 42 (6), 22-27 (2020).
- Mellem, J. E., Brockie, P. J., Madsen, D. M., Maricq, A. v Action potentials contribute to neuronal signaling in C. elegans. Nature Neuroscience. 11 (8), 865-867 (2009).
- Zhang, Y., et al. Fast and sensitive GCaMP calcium indicators for imaging neural populations. bioRxiv. , (2021).
- Kerruth, S., Coates, C., Dürst, C. D., Oertner, T. G., Török, K. The kinetic mechanisms of fast-decay red-fluorescent genetically encoded calcium indicators. Journal of Biological Chemistry. 294 (11), 3934-3946 (2019).
- de Juan-Sanz, J., et al. Axonal endoplasmic reticulum Ca2+ content controls release probability in CNS nerve terminals. Neuron. 93 (4), 867-881 (2017).
- Bhatla, N. C. elegans neural network. , Available from: http://wormweb.org/neurainet#c=BAG&m=1 (2014).
- Fung, W., Wexler, L., Heiman, M. G. Cell-type-specific promoters for C. elegans glia. Journal of Neurogenetics. 34 (3-4), 335-346 (2020).
- Ali, F., Kwan, A. C. Interpreting in vivo calcium signals from neuronal cell bodies, axons, and dendrites: a review. Neurophotonics. 7 (1), 011402 (2019).
- Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
- Mank, M., et al. A genetically encoded calcium indicator for chronic in vivo two-photon imaging. Nature Methods. 5 (9), 805-811 (2008).
- Birkner, A., Tischbirek, C. H., Konnerth, A. Improved deep two-photon calcium imaging in vivo. Cell Calcium. 64, 29-35 (2017).
- Ryan, K. C., Laboy, J. T., Norman, K. R. Deregulation of mitochondrial calcium handling due to presenilin loss disrupts redox homeostasis and promotes neuronal dysfunction. Antioxidants. 11 (9), 1642 (2022).
- Yang, H. H., et al. Subcellular imaging of voltage and calcium signals reveals neural processing in vivo. Cell. 166 (1), 245-257 (2016).
- Takahashi, N., Oertner, T. G., Hegemann, P., Larkum, M. E. Active cortical dendrites modulate perception. Science. 354 (6319), 1587-1590 (2016).
- Nicoletti, M., et al. Biophysical modeling of C. elegans neurons: Single ion currents and whole-cell dynamics of AWCon and RMD. PLoS One. 14 (7), 0218738 (2019).
- Church, P. J., Stanley, E. F. Single L-type calcium channel conductance with physiological levels of calcium in chick ciliary ganglion neurons. The Journal of Physiology. 496, 59-68 (1996).
- O'Hare, J. K., et al. Compartment-specific tuning of dendritic feature selectivity by intracellular Ca 2+ release. Science. 375 (6586), (2022).
- Mclntire, S. L., Jorgensen, E., Horvitz, H. R. Genes required for GABA function in Caenorhabditis elegans. Nature. 364 (6435), 334-337 (1993).
- Doser, R. L., Amberg, G. C., Hoerndli, F. J. Reactive oxygen species modulate activity-dependent AMPA receptor transport in C. elegans. The Journal of Neuroscience. 40 (39), 7405-7420 (2020).
- Wu, J., et al. A long Stokes shift red fluorescent Ca2+ indicator protein for two-photon and ratiometric imaging. Nature Communications. 5, 5262 (2014).
- Cho, J. -H., et al. The GCaMP-R family of genetically encoded ratiometric calcium indicators. ACS Chemical Biology. 12 (4), 1066-1074 (2017).
- Smith, J. J., et al. A light sheet fluorescence microscopy protocol for Caenorhabditis elegans larvae and adults. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 1012820 (2022).
- Müller, M., et al. Mitochondria and calcium regulation as basis of neurodegeneration associated with aging. Frontiers in Neuroscience. 12, 470 (2018).
- Nikoletopoulou, V., Tavernarakis, N.
- Chen, C. -H., Chen, Y. -C., Jiang, H. -C., Chen, C. -K., Pan, C. -L. Neuronal aging: Learning from C. elegans. Journal of Molecular Signaling. 8 (1), 14 (2013).
- Saberi-Bosari, S., Huayta, J., San-Miguel, A. A microfluidic platform for lifelong high-resolution and high throughput imaging of subtle aging phenotypes in C. elegans. Lab on a Chip. 18 (20), 3090-3100 (2018).
- Sridhar, N., Fajrial, A. K., Doser, R. L., Hoerndli, F. J., Ding, X. Surface acoustic wave microfluidics for repetitive and reversible temporary immobilization of C. elegans. Lab on a Chip. 22 (24), 4882-4893 (2022).
