Summary
De huidige methoden beschrijven een niet-ratiometrische benadering voor hoge resolutie, sub-compartimentale calciumbeeldvorming in vivo in Caenorhabditis elegans met behulp van direct beschikbare genetisch gecodeerde calciumindicatoren.
Abstract
Calcium (Ca 2+) beeldvorming is grotendeels gebruikt om neuronale activiteit te onderzoeken, maar het wordt steeds duidelijker dat subcellulaire Ca2+ handling een cruciaal onderdeel is van intracellulaire signalering. De visualisatie van subcellulaire Ca2+ dynamica in vivo, waarbij neuronen kunnen worden bestudeerd in hun oorspronkelijke, intacte circuits, is technisch uitdagend gebleken in complexe zenuwstelsels. De transparantie en het relatief eenvoudige zenuwstelsel van de nematode Caenorhabditis elegans maken de celspecifieke expressie en in vivo visualisatie van fluorescerende tags en indicatoren mogelijk. Onder deze zijn fluorescerende indicatoren die zijn aangepast voor gebruik in het cytoplasma, evenals verschillende subcellulaire compartimenten, zoals de mitochondriën. Dit protocol maakt niet-ratiometrische Ca 2+ beeldvorming in vivo mogelijk met een subcellulaire resolutie die de analyse van Ca2+ dynamiek tot op het niveau van individuele dendritische stekels en mitochondriën mogelijk maakt. Hier worden twee beschikbare genetisch gecodeerde indicatoren met verschillende Ca 2+ affiniteiten gebruikt om het gebruik van dit protocol aan te tonen voor het meten van relatieve Ca2+ niveaus binnen het cytoplasma of mitochondriale matrix in een enkel paar exciterende interneuronen (AVA). Samen met de genetische manipulaties en longitudinale observaties die mogelijk zijn bij C. elegans, kan dit beeldvormingsprotocol nuttig zijn voor het beantwoorden van vragen over hoe Ca2+ behandeling de neuronale functie en plasticiteit reguleert.
Introduction
Calciumionen (Ca2+) zijn zeer veelzijdige dragers van informatie in veel celtypen. In neuronen is Ca2+ verantwoordelijk voor de activiteitsafhankelijke afgifte van neurotransmitters, de regulatie van cytoskeletale motiliteit, de fijnafstemming van metabole processen, evenals vele andere mechanismen die nodig zijn voor een goed neuronaal onderhoud en functie 1,2. Om effectieve intracellulaire signalering te garanderen, moeten neuronen lage basale Ca2 + -niveaus in hun cytoplasma3 handhaven. Dit wordt bereikt door coöperatieve Ca 2+ behandelingsmechanismen, waaronder de opname van Ca2+ in organellen zoals het endoplasmatisch reticulum (ER) en mitochondriën. Deze processen, naast de rangschikking van Ca 2+-permeabele ionkanalen in het plasmamembraan, resulteren in heterogene niveaus van cytoplasmatisch Ca2+ door het neuron.
Ca2+ heterogeniteit tijdens rust en neuronale activatie zorgt voor de diverse, locatiespecifieke regulatie van Ca2+-afhankelijke mechanismen1. Een voorbeeld van de concentratiespecifieke effecten van Ca 2 + is de afgifte van Ca2 + uit het ER via inositol 1,4,5-trisfosfaat (InsP3) receptoren. Lage Ca2+ niveaus in combinatie met InsP3 zijn vereist voor het openen van de calciumdoorlatende porie van de receptor. Als alternatief remmen hoge Ca2+ niveaus, zowel direct als indirect, de receptor4. Het belang van Ca 2+ homeostase voor een goede neuronale functie wordt ondersteund door bewijs dat suggereert dat verstoorde intracellulaire Ca2+ behandeling en signalering een vroege stap is in de pathogenese van neurodegeneratieve aandoeningen en natuurlijke veroudering 5,6. In het bijzonder zijn abnormale Ca2+ opname en afgifte door het ER en mitochondriën gekoppeld aan het begin van neuronale disfunctie bij de ziekte van Alzheimer, de ziekte van Parkinson en de ziekte van Huntington 6,7.
De studie van Ca 2+ dyshomeostase tijdens natuurlijke veroudering of neurodegeneratie vereist de longitudinale observatie van Ca2+ niveaus met subcellulaire resolutie in een levend, intact organisme waarin de inheemse cellulaire architectuur (d.w.z. de rangschikking van synapsen en distributie van ionkanalen) wordt gehandhaafd. Hiertoe biedt dit protocol richtlijnen voor het gebruik van twee direct beschikbare, genetisch gecodeerde Ca 2+ sensoren voor het registreren van Ca2+ dynamica in vivo met een hoge ruimtelijke en temporele resolutie. De representatieve resultaten verkregen met behulp van de beschreven methode in C. elegans laten zien hoe de expressie van Ca 2+ indicatoren in het cytoplasma of mitochondriale matrix van afzonderlijke neuronen de snelle verwerving van fluorescerende beelden (tot 50 Hz) mogelijk kan maken die de Ca 2+ dynamiek illustreren met het extra vermogen om de Ca 2+ niveaus te onderscheiden binnen enkele wervelkolomachtige structuren en individuele mitochondriën.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Transgene stammen creëren
- Met behulp van een kloonmethode naar keuze8,9, kloon expressievectoren om de Pflp-18 of Prig-3 promotor te bevatten (voor AVA-specifiek signaal in de ventrale zenuwstreng), gevolgd door de Ca2+ indicator naar keuze, en vervolgens een 3' UTR (zie de discussie voor meer informatie)10. Een lijst van plasmiden en hun bronnen is te vinden in aanvullende tabel 1.
- Volg het vastgestelde protocol voor de creatie van transgene stammen via de micro-injectie van een DNA-mix (<100 ng / μL; zie aanvullende tabel 1 voor de concentraties van elk plasmide) met het Ca2 + indicatortransgen (~ 20 ng / μL) en het reddings-DNA lin-15 + (selectiemarker) in de gonade van een 1 dag oude volwassene C. elegans10 (genotype: LIN-15 (N765TS); fenotype: multi-vulva)10,11.
NOTITIE. Houd lin-15(n765ts) ouders op 15 °C om temperatuurgevoelige mutaties te onderdrukken. - Houd de geïnjecteerde ouders op 20 °C totdat de F1-nakomelingen de volwassen leeftijd bereiken om transgene selectie mogelijk te maken met behulp van de afwezigheid van het multi-vulvafenotype.
- Klonaal passage13 volwassen F1-nakomelingen die niet het multi-vulvafenotype hebben, omdat dit de expressie aangeeft van de extrachromosomale array die de Ca2+ indicator11 bevat.
- Beoordeel de expressie van de Ca2+ indicator in de F2- of F3-nakomelingen die niet het multi-vulvafenotype hebben door 1 dag oude volwassenen te monteren en in beeld te brengen, zoals verderop in rubriek 3 wordt beschreven.
NOTITIE. Een relatief hoge expressie van de indicator is vereist voor de snelle verwerving van afbeeldingen zoals hier beschreven (zie de discussie voor meer details). - Experimenten uitvoeren op volgende generaties van de transgene stammen met een optimale expressie van de Ca 2+ indicator (zie de discussie voor meer details), waarbij de stammen onder standaardomstandigheden (20 °C op NGM-platen) worden gehandhaafd)12.
2. Optische opstelling
- Gebruik een microscoop die in staat is om op lange termijn time-lapse beeldvorming te maken.
NOTITIE. De representatieve gegevens werden verkregen met behulp van een omgekeerde draaiende schijf confocale microscoop uitgerust met 488 nm en 561 nm excitatielasers. - Gebruik een objectief met lage vergroting (d.w.z. 10x/0,40) voor de ruwe lokalisatie van de worm.
- Om subcellulaire resolutie te bereiken, schakelt u over naar en lokaliseert u de neuronen met behulp van een doel met hoge vergroting.
NOTITIE. Een 100x/1.40 NA oliedoelstelling werd gebruikt om de representatieve gegevens in deze studie te verkrijgen. - Verkrijg de beelden met behulp van een ultragevoelige camera die in staat is tot snelle beeldacquisitie (>50 fps).
- Gebruik een standaard emissiefilter voor de Ca2+ indicator naar keuze (d.w.z. een 525 nm ± 50 nm emissiefilter voor GCaMP6f en mitoGCaMP).
- Voeg een Z-drift corrector (ZDC) toe voor het verkrijgen van beeldstromen langer dan 10 s, omdat de uitdroging van het agarpad tijdens de beeldvormingssessie ervoor zorgt dat het neuriet binnen enkele seconden onscherp wordt.
NOTITIE. Als een microscopie-opstelling geen ZDC toelaat, of als lange (>20 min) beeldvormingsperioden gewenst zijn, breng dan een rand van siliciumvet of gesmolten vaseline rond het agarpad aan om de uitdroging te vertragen.
3. Voorbereiding van wormen voor beeldvorming
- De agarpads voorbereiden
- Maak 3 ml 10% agar door agar van moleculaire kwaliteit op te lossen in M912 in een glazen kweekbuis van 13 mm x 100 mm en gedurende enkele seconden in de magnetron te doen (zie materiaaltabel).
NOTITIE. Gesmolten agar kan tot 1 uur op een warmteblok worden bewaard of kan telkens vers worden gemaakt wanneer agarpads nodig zijn. - Plaats een microscoopglaasje tussen twee extra glaasjes die elk twee lagen laboratoriumtape hebben (zie figuur 1A-i).
- Snijd de punt van een pipetpunt van 1.000 μL (zonder filter) en pipetteer deze om een kleine druppel agar op de middelste coverslip te pipetteren (figuur 1A-i).
- Druk de agar plat door bovenop de agar nog een schuifje naar beneden te drukken (figuur 1A-ii).
- Snijd de agar na afkoeling in een kleine schijf met behulp van de opening van een glazen kweekbuis van 13 mm x 100 mm (figuur 1A-iii) en verwijder vervolgens de omringende agar.
- Maak 3 ml 10% agar door agar van moleculaire kwaliteit op te lossen in M912 in een glazen kweekbuis van 13 mm x 100 mm en gedurende enkele seconden in de magnetron te doen (zie materiaaltabel).
- De wormroloplossing voorbereiden
- Los muscimolpoeder op in M9 om een bouillon van 30 mM te creëren. Scheiden in aliquots van 50 μL en bewaren bij 4 °C.
- Ontdooi elke 3-5 dagen een nieuw aliquot van 30 mM muscimol (en bewaar bij 20 °C tijdens gebruik).
- Verdun een muscimol-bouillon van 30 mM in een verhouding van 1:1 met polystyreenparels om de walsoplossing te maken.
- Een worm positioneren voor beeldvorming
- Plaats 1,6 μl van de roloplossing op het midden van het agarkussen.
OPMERKING: De hoeveelheid vloeistof moet worden aangepast voor het in beeld brengen van jongere (minder) of oudere dieren (meer). - Gebruik de gewenste wormprikker (d.w.z. een glas- of platinadraadprikker)13 en breng een worm van de gewenste leeftijd zonder het multivulvafenotype11 over in de rollende oplossing op het agarpad (figuur 1A-iv).
NOTITIE. De representatieve gegevens zijn van 1 dag oude hermafrodieten (GCaMP6f stam = FJH185; mitoGCaMP stam; FJH597; zie aanvullende tabel 1), die kan worden geïdentificeerd door de aanwezigheid van slechts één rij eieren. Zie de discussie voor meer informatie over het werken met wormen van verschillende leeftijden. - Wacht ~ 5 minuten tot de muscimol de wormbeweging vermindert en laat vervolgens een 22 mm x 22 mm coverslip op het agarpad vallen, waardoor de beweging van de worm fysiek wordt beperkt.
- Voor het afbeelden van neurieten in het ventrale zenuwkoord rolt u de worm in de oriëntatie die is weergegeven in figuur 1B,C door de dekplaat lichtjes te schuiven.
NOTITIE. Om het ventrale zenuwkoord te visualiseren, plaatst u de worm met het hoofd naar boven en rolt u de worm totdat de darm zich aan de rechterkant van het proximale gedeelte bevindt en de linkerkant voor het distale deel van de worm (vanuit het perspectief van de kijker). Keer deze oriëntatie om (figuur 1C) voor het afbeelden van neurieten in het ruggenwervelstreng.
- Plaats 1,6 μl van de roloplossing op het midden van het agarkussen.
- De worm op een microscoop monteren
- Plaats een druppel dompelolie op de afdekplaat voordat u deze op het microscooppodium monteert.
- Zoek de worm met behulp van een objectief met lage vergroting (10x) in het helderveld.
- Schakel over naar het 100x-objectief en pas de focus aan.
- Lokaliseer de AVA-neuriet met behulp van de verlichting van de GCaMP of mitoGCaMP met de 488 nm-beeldlaser.
OPMERKING: Gebruik kleine aanpassingen om te voorkomen dat de worm wordt dichtgeknepen of de dekslip wordt losgetrokken.
4. Verwerving van beeldstromen met hoge resolutie
- In vivo GCaMP-beeldvorming
- Stel de belichtingstijd in op 20 ms.
- Pas de beeldlaser- en acquisitie-instellingen aan totdat de basale GCaMP-fluorescentie zich in het middenbereik van het dynamische bereik van de camerabevindt 14. Raadpleeg de discussie voor suggesties voor het optimaliseren van de beeldvormingsparameters met behulp van andere microscopie-opstellingen.
NOTITIE. Voor de optische opstelling die in dit onderzoek wordt gebruikt, stelt u de 488 nm-beeldlaser in op de volgende uitvoerinstellingen: laservermogen = 50% en verzwakking = 1. Wijzig de aanvullende acquisitie-instellingen als volgt: EM-versterking = 200 en voorversterkerversterking = 1. - Nadat het AVA-neuriet is gelokaliseerd met behulp van de GCaMP-fluorescentie bij 100x vergroting, stelt u de ZDC (zie materiaaltabel) in op een bereik van ±30 μm en start u continue autofocus. Corrigeer het brandpuntsvlak indien nodig handmatig voordat u een afbeelding maakt.
- Verkrijg een stroom van beelden met een vergroting van 100x. Duurtijden van wel 10 minuten kunnen worden bereikt met de opstelling die in deze studie wordt gebruikt.
- In vivo mitoGCaMP beeldvorming
- Volg de stappen 4.1.1-4.1.2 indien nodig om de basale mitoGCaMP-fluorescentie in het middenbereik te verkrijgen voor het dynamische bereik van de camera14.
NOTITIE. Voor de optische opstelling die in dit onderzoek wordt gebruikt, stelt u de 488 nm-beeldlaser in op de volgende uitvoerinstellingen: laservermogen = 20% en verzwakking = 10. Wijzig de acquisitie-instellingen in het volgende: EM-versterking = 100 en voorversterkerversterking = 2. - Nadat de mitochondriën in het AVA-neuriet zijn gelokaliseerd met behulp van de mitoGCaMP-fluorescentie, stelt u de ZDC in zoals hierboven beschreven in stap 3.3.
- Verkrijg een stroom van beelden met een vergroting van 100x.
- Volg de stappen 4.1.1-4.1.2 indien nodig om de basale mitoGCaMP-fluorescentie in het middenbereik te verkrijgen voor het dynamische bereik van de camera14.
5. Beeldstroom analyse
- Open de afbeeldingsstroom in een geschikte afbeeldingssoftware voor het analyseren van de pixelwaarden in een afbeeldingsreeks (zie Materiaaltabel).
- Definieer met het gereedschap Polygoonselectie het subcellulaire gebied van belang (ROI) dat GCaMP of mitoGCaMP bevat.
- Klik op > tools analyseren > ROI Manager. Klik in de ROI-manager op Toevoegen en vervolgens op Meer > Multimeting. Klik in het venster Multi Measure op OK om automatisch de gemiddelde, minimale en maximale pixelintensiteiten van de hierboven gedefinieerde ROI voor elk frame van de afbeeldingsstream te verzamelen voor verdere analyse.
NOTITIE. Het wordt aanbevolen dat de gemiddelde pixelintensiteit (F gem) wordt genormaliseerd tot de minimale intensiteit (F min) voor elke ROI met behulp van de verhouding Fgem/Fmin om rekening te houden met fluorescentieverschillen als gevolg van positionering in het z-vlak. Gooi de beeldstromen met wormbeweging tijdens het fotograferen weg, omdat dit ook van invloed zou zijn op de fluorescentiemetingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Deze twee protocollen maken de snelle verwerving van differentiële Ca2+ niveaus binnen de subcellulaire regio's en organellen van individuele neurieten in vivo met hoge ruimtelijke resolutie mogelijk. Het eerste protocol maakt het mogelijk om cytoplasmatisch Ca2+ te meten met een hoge temporele en ruimtelijke resolutie. Dit wordt hier gedemonstreerd met behulp van de celspecifieke expressie van GCaMP6f in het glutamaterge AVA-commandointerneuronen 15, waarvan de neurieten over de gehele lengte van het ventrale zenuwkoord lopen. De snelle acquisitie van GCaMP6f-fluorescentie (50 Hz) maakte de detectie van de directionele voortplanting van Ca 2+ instroom mogelijk (Figuur 2A en Supplemental Video 1). De subcellulaire kwantificering van GCaMP6f-fluorescentie onthulde dat het begin van Ca 2+ instroom vertraagd was in een deel van het neuriet op slechts 10 μm afstand (figuur 2B). Bovendien maakte dit protocol verschillende waarnemingen van gecompartimenteerde Ca 2+ en subthreshold Ca2+ gebeurtenissen mogelijk. Dendritische wervelkolomachtige structuren die langs de AVA-neuriet werden gevonden, bleken bijvoorbeeld flitsen te hebben in GCaMP6f-fluorescentie die onafhankelijk van neurietactivatie optraden en niet leidden tot een voortplanting van Ca 2+ -instroom (figuur 2C, D en aanvullende video 2).
Het tweede protocol was gericht op het snel meten van de relatieve Ca2+ niveaus in de individuele mitochondriën in enkele neurieten. Met behulp van een wormstam met AVA-specifieke expressie van de mitochondriale matrix-gelokaliseerde Ca2+ indicator maakte mitoGCaMP de snelle detectie mogelijk van veranderingen in mitoGCaMP fluorescentie op het niveau van individuele mitochondriën binnen het AVA-neuriet. Dit beeldvormingsprotocol onthulde verschillende vormen van Ca2+ opname in de mitochondriën, althans in dit neuron. Ten eerste geven de resultaten in figuur 3A een voorbeeld van de synchrone opname van een relatief grote hoeveelheid Ca2+ in een subset van mitochondriën. Meer specifiek onthulden deze gegevens dat de opname van Ca2 + in sommige mitochondriën was gesynchroniseerd (Mito1 en Mito2; Figuur 3A,B en Aanvullende Video 3), terwijl naburige mitochondriën Ca2+ (Mito3; Figuur 3A,B). Evenzo werden subsets van mitochondriën gezien om snel kleine hoeveelheden Ca2 + op te nemen en vrij te geven. Dit bleek ook synchroon te zijn (Mito1 en Mito3, Figuur 3C,D en Aanvullende Video 4), maar opnieuw alleen voor een subset van mitochondriën (Mito 2, Figuur 3C,D).
Figuur 1: Montage en rol van C. elegans voor het in beeld brengen van de ventrale zenuwstreng. (A) Een illustratie van de stappen voor het bereiden van de agarpads en het plukken van een enkele worm in een rollende oplossing. (B) Een voorbeeld van een wormpositie voordat deze wordt verplaatst voor beeldvorming. De rode pijl geeft de noodzaak aan van een naar rechts rollende rol van de worm, die kan worden bereikt door de dekslip naar rechts te schuiven (blauwe pijl). Schaalbalk = 50 μm. (C) De juiste oriëntatie die nodig is voor het visualiseren van de ventrale zenuwstreng. Opmerking: De darm bevindt zich aan de rechterkant van de kijker (met behulp van een rechtopstaande microscoop) in de proximale helft en bevindt zich vervolgens aan de linkerkant in de distale helft. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Snelle verwerving van GCaMP6f-fluorescentie met subcellulaire resolutie in AVA-neuriet en wervelkolomachtige structuren. (A) Representatieve beelden van GCaMP6f-fluorescentie bij de AVAL- en VAR-neurietbifurcatie. Schaalbalk = 5 μm. (B) Kwantificering van GCaMP6f-fluorescentie genormaliseerd tot de minimale fluorescentie (F) voor dat gebied (Fmin) voor de proximale (oranje) en distale (blauwe) gebieden gedefinieerd in de onderste afbeelding in paneel A. (C) Representatieve beelden van GCaMP6f-fluorescentie bij een wervelkolomachtige projectie in het AVA-neuriet. (D) Genormaliseerde GCaMP6f-fluorescentie in het neuriet (oranje) en de wervelkolomachtige projectie (blauw) van de overeenkomstige gebieden in de onderste afbeelding van paneel C. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Snelle beeldvorming van calciumopname in individuele mitochondriën binnen het AVA-neuriet. (A,C) Representatieve beelden van mitoGCaMP-fluorescentie in de loop van de tijd. Schaalbalk = 50 μm. (B) Sporen van genormaliseerde GCaMP-fluorescentie (F/F min) voor de overeenkomstige mitochondriën weergegeven in de onderste afbeelding van paneel A. (D) F/Fmin meer dan 40 s beeldvorming in de gebieden gemarkeerd in de onderste afbeelding in paneel C. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullende video 1: GCaMP6f-fluorescentie in het AVA-neuriet. De video werd gerenderd met 2x snelheid. Schaalbalk = 5 μm. Klik hier om deze video te downloaden.
Aanvullende video 2: GCaMP6f-fluorescentie in een wervelkolomachtige projectie op het AVA-neuriet. De video werd gerenderd met 2x snelheid. Schaalbalk = 5 μm. Klik hier om deze video te downloaden.
Aanvullende video 3: MitoGCaMP fluorescentie in de AVA neuriet-gesynchroniseerde mitochondriale calciumopname. De video werd gerenderd met 4x snelheid. Schaalbalk = 5 μm. Klik hier om deze video te downloaden.
Aanvullende video 4: MitoGCaMP fluorescentie in de AVA neuriet-snelle opname en afgifte van calcium door de mitochondriën. De video werd gerenderd met 4x snelheid. Schaalbalk = 5 μm. Klik hier om deze video te downloaden.
Aanvullende tabel 1: Genetische reagentia en stammen die in dit onderzoek zijn gebruikt. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De eerste overweging bij het implementeren van de beschreven methode betreft de selectie van een Ca2+ indicator met ideale eigenschappen voor de gegeven onderzoeksvraag. Cytoplasmatische Ca 2+ indicatoren hebben doorgaans een hoge affiniteit voor Ca 2+, en de gevoeligheid van deze indicatoren voor Ca 2+ is omgekeerd evenredig met de kinetiek (aan/uit snelheid)16,17. Dit betekent dat Ca2+ gevoeligheid of kinetiek prioriteit moet krijgen op basis van het fenomeen van interesse. Voor subcellulaire compartimenten met relatief hoge basale Ca 2+ niveaus, zoals de ER, moeten Ca 2+ indicatoren met lage Ca 2+ affiniteit worden beschouwd als18. Om recombinant DNA te genereren voor de celspecifieke expressie van een Ca 2+ indicator, moet de voorkeurskloontechniek worden gebruikt om een celspecifieke promotor19,20 in te brengen, gevolgd door de Ca 2+ indicator naar keuze en een 3' UTR. Relatief hoge expressieniveaus in de AVA-neuronen kunnen worden bereikt door een plasmide te construeren met de promotors Pflp-18 of Prig-3, een let-858 of unc-54 3' UTR en dit plasmide te micro-injecteren bij 15-25 ng / μL (zie aanvullende tabel 1).
De succesvolle micro-injectie van de plasmiden met de Ca 2+ indicator en lin-15+ in de gonade van lin-15(n765ts) mutante wormen zal een F1 nageslacht opleveren dat de Ca 2+ indicator tot expressie brengt en gered wordt voor het multi-vulva fenotype. Slechts een subset (30%-80%) van de F1-generatie zal het synthetische DNA doorgeven aan de F2-generatie. De expressie van de Ca2+ indicator moet worden beoordeeld in het geredde F2- of F3-nageslacht op platen met <60% overdracht van het synthetische DNA door de fluorescentie te monteren en in beeld te brengen bij 1 dag oude volwassenen die worden gered voor het multi-vulvafenotype. Het ideale expressieniveau wordt bepaald op basis van de eigenschappen en locatie van de Ca2+ indicator, evenals de biologische vraag. Als snelle beeldacquisitie gewenst is, dan is een relatief hoge expressie ideaal. Er is echter gebleken dat een extreem hoge expressie van Ca2 + -indicatoren subcellulaire mislokalisatie veroorzaakt, evenals niet-specifieke expressie in andere cellen of weefsels.
Genetisch gecodeerde Ca 2+ indicatoren zijn op grote schaal gebruikt voor in vivo analyses van Ca2+ in C. elegans, evenals in andere modelorganismen. Sommige van deze studies hebben eencellige resolutiemonitoring van Ca2 + -niveaus in het neuronale cellichaam bereikt21,22,23,24. Metingen van Ca 2+ instroom in neuronale subcompartimenten zijn in vivo bereikt in zowel C. elegans als gewervelde systemen, maar alleen door de Ca 2+ indicatoractiviteit te registreren in een volledige neuriet 25,26 of populaties van dendrieten 27. Hoewel het meten van Ca 2+ activiteit in neuronale cellichamen en dendrieten als geheel een weerspiegeling is van de spiking-activiteit van de cel, maakt het niet mogelijk om de dynamiek van Ca 2+ instroom (d.w.z. de richting of snelheid van voortplanting) of subdrempel Ca2+ transiënten te observeren. Weinig in vivo studies zijn in staat geweest om Ca2+ handling in neuronen te onderscheiden van de ruimtelijke en temporele resolutie die hier wordt aangetoond. Opgemerkt moet worden dat de temporele dynamiek van Ca 2+ instroom in de meeste C. elegans neuronen28 langzamer lijkt te zijn dan in gewervelde neuronen29, dus het is waarschijnlijk dat dit snelle beeldvormingsprotocol onvoldoende zou zijn voor het vastleggen van vergelijkbare temporele dynamiek in gewervelde systemen. Recente ontwikkelingen in twee-fotonenmicroscopie maken echter de ultrasnelle (120 Hz), subcellulaire beeldvorming van calcium in individuele hippocampusdendrieten in vrij gedragende muizen30 mogelijk, wat veelbelovend is voor het bereiken van vergelijkbare hoge resolutie Ca2 + beeldvorming bij gewervelde dieren.
Het is belangrijk op te merken dat deze niet-ratiometrische benadering van in vivo Ca2 + beeldvorming het gebruik van muscimol vereist, dat de samentrekking van de lichaamswandspieren remt, waardoor de wormbeweging tijdens beeldvormingwordt beperkt 31. Als er overmatige beweging is tijdens het beeldgebruik (consistente beweging in meer dan ~ 20% van de wormen), moet een nieuwe roloplossing worden gemaakt met een nieuw ontdooid aliquot muscimol en moet de tijd gedurende welke een worm in de roloplossing baadt voorafgaand aan het rollen worden verlengd. Muscimol is een GABA-receptoragonist, wat betekent dat het GABAerge neuronen remt, inclusief die welke input leveren aan de AVA-neuronen. Bovendien drukken veel exciterende neuronen, waaronder AVA, lage niveaus van GABA-receptoren uit, dus het is waarschijnlijk dat het gebruik van muscimol in dit protocol de neuronale activiteit vermindert. Met behulp van dit protocol wordt de algehele spontane activering van AVA echter met slechts ~ 29% verminderd in aanwezigheid van muscimol (ongepubliceerde gegevens). De activering van andere neuronen kan drastischer worden verminderd door muscimol, en dit kan worden getest door muscimol te vervangen door M9 in de rollende oplossing en beeldvorming uit te voeren in het neuronale cellichaam bij lage vergroting32. Een alternatief voor het gebruik van muscimol zou zijn om een ratiometrische Ca2+ indicator33,34 te gebruiken, die fluorescentiecorrectie als gevolg van wormbeweging mogelijk zou maken. Het nadeel van deze aanpak is dat het een optische opstelling vereist die in staat is tot beeldvorming met twee golflengten en de mogelijkheid beperkt om een Ca2 + -indicator te gebruiken in combinatie met vele andere fluorescerende hulpmiddelen.
Een belangrijke beperking van het beschreven microscopiesysteem is de vermindering van uitgezonden licht door de draaiende schijf, wat resulteert in een verlies van informatie. Dit systeem kan worden aangepast om een betere opvang van uitgestraald licht mogelijk te maken door een schijf met pengaten met een grotere diameter te implementeren. Deze wijziging zou echter de axiale (z-vlak) resolutie verlagen en de achtergrondfluorescentie verhogen. Een andere mogelijke microscopie-opstelling voor dit doel zou de snel scannende lichtplaatmicroscoop zijn, die de afgelopen jaren is verbeterd om snelle (tot 50 Hz) beeldvorming in situ en in vivo35 mogelijk te maken.
Het beoordelen van de spatiotemporale dynamiek van cytoplasmatisch en mitochondriaal Ca 2+ zal een beter begrip mogelijk maken van hoe lokale Ca2+ transiënten, en zelfs subthreshold events, calciumafhankelijke signalering kunnen veroorzaken of mitochondriale biologie kunnen moduleren. Deze subcellulaire, in vivo Ca2+ beeldvorming zou bijzonder nuttig kunnen zijn voor de studie van synaptische plasticiteit, activiteitsafhankelijke veranderingen in neuronaal metabolisme en de homeostatische modulatie van neuronale prikkelbaarheid. Verder onderzoek naar hoe lokale, subcellulaire omgevingen zich aanpassen rond gedefinieerde toestanden van neuronale activiteit (d.w.z. ruimtelijk specifieke concentraties en levensduur van Ca 2 +) zou inzicht geven in hoe Ca2 + dyshomeostase leidt tot pathogene veranderingen in neuronale functie. Het vermogen om dit te bestuderen in een levend, intact organisme is vooral nuttig omdat het longitudinale studies mogelijk maakt die licht zouden werpen op hoe en waarom Ca2 + homeostase verandert met natuurlijke veroudering en ziektegerelateerde neurodegeneratie. Het toepassen van deze methode om veroudering en neurodegeneratie te bestuderen is enigszins beperkt tot de vroege biologische leeftijden bij C. elegans (<4 dagen volwassenheid). Inderdaad, de fysieke manipulatie tijdens het monteren en positioneren van de wormen voor beeldvorming is moeilijk na ongeveer 5 dagen volwassenheid wanneer de wormen slap worden vanwege verminderde spiertonus en integriteit van de nagelriem.
Snelle in vivo beeldvorming van de dynamiek en subcellulaire behandeling van Ca2+ zal een belangrijke rol spelen bij ons begrip van hoe neuronale prikkelbaarheid en intracellulaire signalering ruimtelijk en temporeel fijn worden gereguleerd. Dit protocol zou een breed scala aan onderzoek en onderzoekers op veel gebieden ten goede kunnen komen vanwege de diversiteit van Ca2 + -afhankelijke processen en hun centrale rol in de neuronale functie. De toepassing van deze methode in gezonde neuronen zou bijvoorbeeld inzicht geven in waarom verhoogde cytoplasmatische Ca2+ tijdens veroudering optreedt in combinatie met stoornissen in synaptische plasticiteit, inefficiënte mitochondriale ademhaling en andere disfuncties36,37. Bovendien kan deze methode worden gebruikt om de oorzaken van leeftijdsgebonden Ca2 + dyshomeostase38 te onderzoeken. De toepassing van deze methode voor vragen met betrekking tot veroudering en neurodegeneratie is echter enigszins beperkt tot de vroege stadia van veroudering (<5 dagen volwassenheid)38. Zoals hierboven vermeld, is de beeldvorming van oudere volwassen wormen (>5 dagen volwassenheid) moeilijk met behulp van onze rolmethode, maar vooruitgang in C. elegans microfluidics is veelbelovend voor beeldvorming met een vergelijkbare ruimtelijke resolutie voor maximaal 12 dagen volwassenheid39,40.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen tegenstrijdige belangen te hebben.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health (NIH) (R01- NS115947 toegekend aan F. Hoerndli). We willen ook Dr. Attila Stetak bedanken voor het pAS1 plasmide.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100x/1.40 Oil objective | Olympus | UPlanSApo | |
| 10x/0.40 Objective | Olympus | UPlanSApo | |
| 22 mm x 22 mm Cover glass | VWR | 48366-227 | |
| Agarose SFR | VWR | J234-100G | |
| Beam homogenizer | Andor Technologies | Borealis upgrade to CSU-X1 | |
| CleanBench laboratory table | TMC | With vibration control | |
| Disposable culture tubes | VWR | 47729-572 | 13 mm x 100 mm |
| Environmental chamber | Thermo Scientific | 3940 | Set to 20 °C |
| Filter wheel or slider | ASI | For 25 mm diameter filters | |
| FJH 185 | Caenorhabditis Genetics Center | FJH 185 | Worm strain |
| FJH 597 | Caenorhabditis Genetics Center | FJH 597 | Worm strain |
| GFP bandpass emission filter | Chroma | 525 ± 50 nm (25 mm diameter) | |
| ILE laser combiner | Andor Technologies | 4 laser lines | |
| ILE solid state 488 nm laser | Andor Technologies | 50 mW | |
| ImageJ | National Institutes of Health | Version 1.52a | |
| IX83 Spinning disk confocal microscope | Olympus | With Yokogawa CSU-X1 spinning disc | |
| iXon Ultra EMCCD camera | Andor Technologies | ||
| Low auto-fluorescence immersion oil | Olympus | Z-81226 | |
| MetaMorph | Molecular Devices | Version 7.10.1 | |
| Microscope control box | Olympus | IX3-CBH | |
| Muscimol | MP Biomedical / Sigma | 02195336-CF | |
| pAS1 | AddGene | 194970 | Plasmid |
| pBSKS | Stratagene | ||
| pCT61 | Plasmid available from Hoerndli/Maricq lab upon request | ||
| pJM23 | Plasmid available from Hoerndli/Maricq lab upon request | ||
| pKK1 | AddGene | 194969 | Plasmid |
| Polybead microspheres | Polysciences Inc. | 00876-15 | 0.094 µm |
| Stability chamber | Norlake Scientific | NSRI241WSW/8H | Set to 15 °C |
| Stage controller | ASI | With filter wheel control | |
| Standard microscope slide | Premiere | 9108W-E | 75 mm x 25 mm x 1 mm |
| Touch panel controller | Olympus | I3-TPC | |
| Z-drift corrector | Olympus | IX3-ZDC2 |
References
- Berridge, M. J.
- Brini, M., Calì, T., Ottolini, D., Carafoli, E. Neuronal calcium signaling: Function and dysfunction. Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (15), 2787-2814 (2014).
- Brini, M., Calì, T., Ottolini, D., Carafoli, E. Intracellular calcium homeostasis and signaling. Metal Ions in Life Sciences. 12, 119-168 (2013).
- Berridge, M. J. The inositol trisphosphate/calcium signaling pathway in health and disease. Physiological Reviews. 96 (4), 1261-1296 (2016).
- Schrank, S., Barrington, N., Stutzmann, G. E. Calcium-handling defects and neurodegenerative disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 12 (7), 035212 (2020).
- Pchitskaya, E., Popugaeva, E., Bezprozvanny, I. Calcium signaling and molecular mechanisms underlying neurodegenerative diseases. Cell Calcium. 70, 87-94 (2018).
- Jadiya, P., et al. Impaired mitochondrial calcium efflux contributes to disease progression in models of Alzheimer's disease. Nature Communications. 10 (1), 3885 (2019).
- Zeiser, E., Frøkjær-Jensen, C., Jorgensen, E., Ahringer, J. MosSCI and gateway compatible plasmid toolkit for constitutive and inducible expression of transgenes in the C. elegans germline. PLoS One. 6 (5), 20082 (2011).
- Zhu, B., Cai, G., Hall, E. O., Freeman, G. J. In-FusionTM assembly: Seamless engineering of multidomain fusion proteins, modular vectors, and mutations. Biotechniques. 43 (3), 354-359 (2007).
- Evans, T. C.
- Giordano-Santini, R., Dupuy, D. Selectable genetic markers for nematode transgenesis. Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (11), 1917-1927 (2011).
- Stiernagle, T.
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans: Transferring worms grown on NGM plates. WormBook. , (2006).
- Ogama, T. A beginner's guide to improving image acquisition in fluorescence microscopy. The Biochemist. 42 (6), 22-27 (2020).
- Mellem, J. E., Brockie, P. J., Madsen, D. M., Maricq, A. v Action potentials contribute to neuronal signaling in C. elegans. Nature Neuroscience. 11 (8), 865-867 (2009).
- Zhang, Y., et al. Fast and sensitive GCaMP calcium indicators for imaging neural populations. bioRxiv. , (2021).
- Kerruth, S., Coates, C., Dürst, C. D., Oertner, T. G., Török, K. The kinetic mechanisms of fast-decay red-fluorescent genetically encoded calcium indicators. Journal of Biological Chemistry. 294 (11), 3934-3946 (2019).
- de Juan-Sanz, J., et al. Axonal endoplasmic reticulum Ca2+ content controls release probability in CNS nerve terminals. Neuron. 93 (4), 867-881 (2017).
- Bhatla, N. C. elegans neural network. , Available from: http://wormweb.org/neurainet#c=BAG&m=1 (2014).
- Fung, W., Wexler, L., Heiman, M. G. Cell-type-specific promoters for C. elegans glia. Journal of Neurogenetics. 34 (3-4), 335-346 (2020).
- Ali, F., Kwan, A. C. Interpreting in vivo calcium signals from neuronal cell bodies, axons, and dendrites: a review. Neurophotonics. 7 (1), 011402 (2019).
- Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
- Mank, M., et al. A genetically encoded calcium indicator for chronic in vivo two-photon imaging. Nature Methods. 5 (9), 805-811 (2008).
- Birkner, A., Tischbirek, C. H., Konnerth, A. Improved deep two-photon calcium imaging in vivo. Cell Calcium. 64, 29-35 (2017).
- Ryan, K. C., Laboy, J. T., Norman, K. R. Deregulation of mitochondrial calcium handling due to presenilin loss disrupts redox homeostasis and promotes neuronal dysfunction. Antioxidants. 11 (9), 1642 (2022).
- Yang, H. H., et al. Subcellular imaging of voltage and calcium signals reveals neural processing in vivo. Cell. 166 (1), 245-257 (2016).
- Takahashi, N., Oertner, T. G., Hegemann, P., Larkum, M. E. Active cortical dendrites modulate perception. Science. 354 (6319), 1587-1590 (2016).
- Nicoletti, M., et al. Biophysical modeling of C. elegans neurons: Single ion currents and whole-cell dynamics of AWCon and RMD. PLoS One. 14 (7), 0218738 (2019).
- Church, P. J., Stanley, E. F. Single L-type calcium channel conductance with physiological levels of calcium in chick ciliary ganglion neurons. The Journal of Physiology. 496, 59-68 (1996).
- O'Hare, J. K., et al. Compartment-specific tuning of dendritic feature selectivity by intracellular Ca 2+ release. Science. 375 (6586), (2022).
- Mclntire, S. L., Jorgensen, E., Horvitz, H. R. Genes required for GABA function in Caenorhabditis elegans. Nature. 364 (6435), 334-337 (1993).
- Doser, R. L., Amberg, G. C., Hoerndli, F. J. Reactive oxygen species modulate activity-dependent AMPA receptor transport in C. elegans. The Journal of Neuroscience. 40 (39), 7405-7420 (2020).
- Wu, J., et al. A long Stokes shift red fluorescent Ca2+ indicator protein for two-photon and ratiometric imaging. Nature Communications. 5, 5262 (2014).
- Cho, J. -H., et al. The GCaMP-R family of genetically encoded ratiometric calcium indicators. ACS Chemical Biology. 12 (4), 1066-1074 (2017).
- Smith, J. J., et al. A light sheet fluorescence microscopy protocol for Caenorhabditis elegans larvae and adults. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 1012820 (2022).
- Müller, M., et al. Mitochondria and calcium regulation as basis of neurodegeneration associated with aging. Frontiers in Neuroscience. 12, 470 (2018).
- Nikoletopoulou, V., Tavernarakis, N.
- Chen, C. -H., Chen, Y. -C., Jiang, H. -C., Chen, C. -K., Pan, C. -L. Neuronal aging: Learning from C. elegans. Journal of Molecular Signaling. 8 (1), 14 (2013).
- Saberi-Bosari, S., Huayta, J., San-Miguel, A. A microfluidic platform for lifelong high-resolution and high throughput imaging of subtle aging phenotypes in C. elegans. Lab on a Chip. 18 (20), 3090-3100 (2018).
- Sridhar, N., Fajrial, A. K., Doser, R. L., Hoerndli, F. J., Ding, X. Surface acoustic wave microfluidics for repetitive and reversible temporary immobilization of C. elegans. Lab on a Chip. 22 (24), 4882-4893 (2022).
