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Neuroscience

Imagerie subcellulaire de la manipulation neuronale du calcium in vivo

Published: March 17, 2023 doi: 10.3791/64928
Automatic Translation
*1, *1,2, 1, 1
1Department of Biomedical Sciences, Colorado State University College of Veterinary Medicine and Biomedical Sciences, 2Cellular and Molecular Biology Graduate Program, Colorado State University College of Veterinary Medicine and Biomedical Sciences
* These authors contributed equally

Summary

Les méthodes actuelles décrivent une approche non ratiométrique pour l’imagerie calcique sous-compartimentale à haute résolution in vivo chez Caenorhabditis elegans à l’aide d’indicateurs de calcium génétiquement codés facilement disponibles.

Abstract

L’imagerie calcique (Ca 2+) a été largement utilisée pour examiner l’activité neuronale, mais il devient de plus en plus clair que la manipulation subcellulaire du Ca2+ est un élément crucial de la signalisation intracellulaire. La visualisation de la dynamique subcellulaire Ca2+ in vivo, où les neurones peuvent être étudiés dans leurs circuits natifs intacts, s’est avérée techniquement difficile dans des systèmes nerveux complexes. La transparence et le système nerveux relativement simple du nématode Caenorhabditis elegans permettent l’expression spécifique de la cellule et la visualisation in vivo de marqueurs fluorescents et d’indicateurs. Parmi ceux-ci figurent des indicateurs fluorescents qui ont été modifiés pour être utilisés dans le cytoplasme ainsi que dans divers compartiments subcellulaires, tels que les mitochondries. Ce protocole permet l’imagerie non ratiométrique Ca 2+ in vivo avec une résolution subcellulaire qui permet l’analyse de la dynamique Ca2+ jusqu’au niveau des épines dendritiques individuelles et des mitochondries. Ici, deux indicateurs génétiquement codés disponibles avec des affinités Ca 2+ différentes sont utilisés pour démontrer l’utilisation de ce protocole pour mesurer les niveaux relatifs de Ca2+ dans le cytoplasme ou la matrice mitochondriale dans une seule paire d’interneurones excitateurs (AVA). Avec les manipulations génétiques et les observations longitudinales possibles chez C. elegans, ce protocole d’imagerie peut être utile pour répondre aux questions sur la façon dont la manipulation du Ca2+ régule la fonction neuronale et la plasticité.

Introduction

Les ions calcium (Ca2+) sont des vecteurs d’information très polyvalents dans de nombreux types de cellules. Dans les neurones, Ca2+ est responsable de la libération dépendante de l’activité des neurotransmetteurs, de la régulation de la motilité cytosquelettique, du réglage fin des processus métaboliques, ainsi que de nombreux autres mécanismes nécessaires au bon entretien et au bon fonctionnementneuronal 1,2. Pour assurer une signalisation intracellulaire efficace, les neurones doivent maintenir de faibles niveaux basaux de Ca2+ dans leur cytoplasme3. Ceci est accompli par des mécanismes coopératifs de manipulation du Ca 2+, y compris l’absorption de Ca2+ dans des organites tels que le réticulum endoplasmique (RE) et les mitochondries. Ces processus, en plus de l’arrangement des canaux ioniques perméables Ca 2+ dans la membrane plasmique, entraînent des niveaux hétérogènes de Ca2+ cytoplasmique dans tout le neurone.

L’hétérogénéité Ca 2+ pendant le repos et l’activation neuronale permet la régulation diversifiée et spécifique à l’emplacement des mécanismes dépendants de Ca 2+ 1. Un exemple des effets spécifiques à la concentration de Ca 2+ est la libération de Ca 2+ du RE par les récepteurs de l’inositol 1,4,5-trisphosphate (InsP 3). De faibles niveaux de Ca2+ en combinaison avec InsP3 sont nécessaires pour l’ouverture du pore perméable au calcium du récepteur. Alternativement, des niveaux élevés de Ca2+ inhibent directement et indirectement le récepteur4. L’importance de l’homéostasie Ca 2+ pour la fonction neuronale appropriée est étayée par des preuves suggérant que la manipulation et la signalisation intracellulaires du Ca2+ perturbées constituent une étape précoce de la pathogenèse des troubles neurodégénératifs et du vieillissement naturel 5,6. Plus précisément, l’absorption et la libération anormales de Ca2+ par le RE et les mitochondries sont liées à l’apparition d’un dysfonctionnement neuronal dans la maladie d’Alzheimer, la maladie de Parkinson et la maladie de Huntington 6,7.

L’étude de la dyshoméostasie Ca 2+ au cours du vieillissement naturel ou de la neurodégénérescence nécessite l’observation longitudinale des niveaux de Ca2+ avec une résolution subcellulaire dans un organisme vivant et intact dans lequel l’architecture cellulaire native (c’est-à-dire la disposition des synapses et la distribution des canaux ioniques) est maintenue. À cette fin, ce protocole fournit des conseils sur l’utilisation de deux capteurs Ca 2+ génétiquement codés facilement disponibles pour enregistrer la dynamique Ca2+ in vivo avec une résolution spatiale et temporelle élevée. Les résultats représentatifs obtenus à l’aide de la méthode décrite chez C. elegans démontrent comment l’expression des indicateurs Ca 2+ dans le cytoplasme ou la matrice mitochondriale de neurones individuels peut permettre l’acquisition rapide d’images fluorescentes (jusqu’à 50 Hz) qui illustrent la dynamique Ca 2+ avec la capacité supplémentaire de discerner les niveaux de Ca 2+ dans des structures semblables à une seule colonne vertébrale et des mitochondries individuelles.

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Protocol

1. Création de souches transgéniques

  1. En utilisant une méthode de clonage de choix8,9, cloner des vecteurs d’expression pour contenir le promoteur Pflp-18 ou Prig-3 (pour le signal spécifique à AVA dans le cordon nerveux ventral), suivi de l’indicateur Ca2+ de choix, puis d’un UTR 3' (voir la discussion pour plus d’informations)10. Une liste des plasmides et de leurs sources se trouve dans le tableau supplémentaire 1.
  2. Suivre le protocole établi pour la création de souches transgéniques par microinjection d’un mélange d’ADN (<100 ng/μL; voir le tableau supplémentaire 1 pour les concentrations de chaque plasmide) contenant le transgène indicateur Ca2+ (~20 ng/μL) et l’ADN de secours lin-15+ (marqueur de sélection) dans la gonade d’un adulte de 1 jour C. elegans10 (génotype: lin-15(N765TS); phénotype: multi-vulve)10,11.
    NOTE. Maintenir les parents de la lignée 15(n765ts) à 15 °C pour supprimer les mutations sensibles à la température.
  3. Maintenir les parents injectés à 20 °C jusqu’à ce que la descendance F1 atteigne l’âge adulte pour permettre une sélection transgénique en utilisant l’absence du phénotype multi-vulvaire.
  4. Passage clonal13 descendants adultes F1 qui n’ont pas le phénotype multi-vulve car cela indique l’expression du réseau extrachromosomique contenant l’indicateur Ca2+ 11.
  5. Évaluer l’expression de l’indicateur Ca2+ dans la descendance F2 ou F3 qui n’a pas le phénotype multi-vulve en montant et en imageant des adultes âgés de 1 jour, comme décrit plus loin dans la section 3.
    NOTE. Une expression relativement élevée de l’indicateur est requise pour l’acquisition rapide d’images comme décrit ici (voir la discussion pour plus de détails).
  6. Effectuer des expériences sur les générations suivantes de souches transgéniques avec une expression optimale de l’indicateur Ca 2+ (voir la discussion pour plus de détails), en maintenant les souches dans des conditions standard (20 °C sur plaques NGM)12.

2. Configuration optique

  1. Utilisez un microscope capable d’imager en accéléré à long terme.
    NOTE. Les données représentatives ont été acquises à l’aide d’un microscope confocale à disque rotatif inversé équipé de lasers d’excitation de 488 nm et 561 nm.
  2. Utilisez un objectif de faible grossissement (c.-à-d. 10x/0,40) pour la localisation brute du ver.
  3. Pour obtenir une résolution subcellulaire, passez et localisez les neurones à l’aide d’un objectif de grossissement élevé.
    NOTE. Un objectif de pétrole 100x/1,40 NA a été utilisé pour acquérir les données représentatives de cette étude.
  4. Acquérir les images à l’aide d’une caméra ultra-sensible capable d’acquérir rapidement des images (>50 ips).
  5. Utilisez un filtre antipollution standard pour l’indicateur Ca2+ de votre choix (c.-à-d. un filtre antipollution de 525 nm ± 50 nm pour GCaMP6f et mitoGCaMP).
  6. Ajoutez un correcteur Z-drift (ZDC) pour l’acquisition de flux d’images de plus de 10 s, car la dessiccation du tampon de gélose pendant la séance d’imagerie provoque la dérive floue du neurite en quelques secondes.
    NOTE. Si une installation de microscopie ne permet pas le ZDC, ou si de longues périodes d’imagerie (>20 min) sont souhaitées, appliquez une bordure de graisse de silicium ou de vaseline fondue autour du tampon de gélose pour ralentir la dessiccation.

3. Préparation des vers pour l’imagerie

  1. Préparation des tampons d’agar
    1. Préparer 3 mL de gélose à 10 % en dissolvant de la gélose de qualité moléculaire dans M912 dans un tube de culture en verre de 13 mm x 100 mm et en faisant passer au micro-ondes pendant plusieurs secondes (voir le tableau des matières).
      NOTE. La gélose fondue peut être conservée sur un bloc thermique jusqu’à 1 h ou peut être préparée fraîche chaque fois que des tampons d’agar sont nécessaires.
    2. Placez une lame de microscope entre deux lames supplémentaires comportant chacune deux couches de ruban de laboratoire (voir la figure 1A-i).
    3. Coupez l’embout d’une pipette de 1 000 μL (sans filtre) et utilisez-le pour pipeter une petite goutte de gélose sur la glissière centrale (Figure 1A-i).
    4. Aplatir la gélose en appuyant sur une autre glissière sur la gélose (Figure 1A-ii).
    5. Après refroidissement, couper la gélose en un petit disque à l’aide de l’ouverture d’un tube de culture en verre de 13 mm x 100 mm (figure 1A-iii), puis retirer la gélose environnante.
  2. Préparation de la solution de laminage de la vis sans fin
    1. Dissoudre la poudre de muscimol dans M9 pour créer un stock de 30 mM. Séparer en aliquotes de 50 μL et conserver à 4 °C.
    2. Décongeler une nouvelle partie aliquote de 30 mM de muscimol tous les 3 à 5 jours (et conserver à 20 °C pendant l’utilisation).
    3. Diluer un stock de muscimol de 30 mM dans un rapport de 1:1 avec des billes de polystyrène pour obtenir la solution de laminage.
  3. Positionnement d’un ver pour l’imagerie
    1. Placer 1,6 μL de la solution à rouler au centre du tampon de gélose
      REMARQUE : La quantité de liquide doit être ajustée pour l’imagerie des animaux plus jeunes (moins) ou plus âgés (plus).
    2. À l’aide du pic de vermifuge préféré (c.-à-d. un pic en verre ou en platine)13, transvaser un ver de l’âge désiré sans le phénotype multivulvaire11 dans la solution à rouler sur le tampon de gélose (figure 1A-iv).
      NOTE. Les données représentatives proviennent d’hermaphrodites âgés de 1 jour (souche GCaMP6f = FJH185; souche mitoGCaMP; FJH597; voir le tableau supplémentaire 1), qui peut être identifié par la présence d’une seule rangée d’œufs. Voir la discussion pour plus de détails sur le travail avec des vers d’âges différents.
    3. Attendez ~5 minutes que le muscimol réduise le mouvement du ver, puis déposez une glissière de 22 mm x 22 mm sur le dessus du tampon de gélose limitant physiquement le mouvement du ver.
    4. Pour l’imagerie des neurites dans le cordon nerveux ventral, rouler le ver dans l’orientation indiquée à la figure 1B,C en faisant glisser légèrement la lamelle de couverture.
      NOTE. Pour visualiser le cordon nerveux ventral, positionnez le ver avec la tête vers le haut et roulez le ver jusqu’à ce que l’intestin soit du côté droit de la partie proximale et de la partie gauche de la partie distale du ver (du point de vue du spectateur). Inverser cette orientation (Figure 1C) pour l’imagerie des neurites dans le cordon nerveux dorsal.
  4. Montage du ver sur un microscope
    1. Placez une goutte d’huile d’immersion sur la lamelle de couverture avant de la monter sur la platine du microscope.
    2. Recherchez le ver à l’aide d’un objectif à faible grossissement (10x) en fond clair.
    3. Passez à l’objectif 100x et ajustez la mise au point.
    4. Localisez le neurite AVA à l’aide de l’éclairage de la GCaMP ou de la mitoGCaMP avec le laser d’imagerie de 488 nm.
      REMARQUE : Utilisez de petits ajustements pour éviter d’écraser le ver ou de retirer la lamelle de couverture.

4. Acquisition de flux d’images haute résolution

  1. In vivo Imagerie GCaMP
    1. Réglez le temps d’exposition sur 20 ms.
    2. Ajustez les paramètres du laser d’imagerie et d’acquisition jusqu’à ce que la fluorescence GCaMP basale se situe dans la plage médiane de la plage dynamique de la caméra14. Reportez-vous à la discussion pour obtenir des suggestions sur l’optimisation des paramètres d’imagerie à l’aide d’autres configurations de microscopie.
      NOTE. Pour la configuration optique utilisée dans cette étude, réglez le laser d’imagerie 488 nm sur les paramètres de sortie suivants : puissance laser = 50 % et atténuation = 1. Modifiez les paramètres d’acquisition supplémentaires comme suit : gain EM = 200 et gain préamplificateur = 1.
    3. Une fois que la neurite AVA est localisée à l’aide de la fluorescence GCaMP à un grossissement de 100x, réglez le ZDC (voir le tableau des matériaux) sur une plage de ±30 μm et lancez la mise au point automatique continue. Corrigez manuellement le plan focal si nécessaire avant l’imagerie.
    4. Acquérir un flux d’images à un grossissement de 100x. Des durées allant jusqu’à 10 min peuvent être atteintes avec la configuration utilisée dans cette étude.
  2. Imagerie mitoGCaMP in vivo
    1. Suivez les étapes 4.1.1 à 4.1.2 au besoin pour acquérir la fluorescence mitoGCaMP basale dans le milieu de gamme pour la plage dynamique14 de la caméra.
      NOTE. Pour la configuration optique utilisée dans cette étude, réglez le laser d’imagerie 488 nm sur les paramètres de sortie suivants : puissance laser = 20 % et atténuation = 10. Modifiez les paramètres d’acquisition comme suit : gain EM = 100 et gain préamplificateur = 2.
    2. Une fois que les mitochondries dans le neurite AVA sont localisées à l’aide de la fluorescence mitoGCaMP, définissez le ZDC comme décrit ci-dessus à l’étape 3.3.
    3. Acquérir un flux d’images à un grossissement de 100x.

5. Analyse du flux d’images

  1. Ouvrez le flux d’images dans un logiciel d’imagerie approprié pour analyser les valeurs de pixels dans une série d’images (voir Tableau des matériaux).
  2. À l’aide de l’outil Sélection de polygones , définissez la région d’intérêt subcellulaire (ROI) contenant GCaMP ou mitoGCaMP.
  3. Cliquez sur Analyser > Outils > Gestionnaire de retour sur investissement. Dans le Gestionnaire de retour sur investissement, cliquez sur Ajouter , puis sur Plus > Multimesure. Dans la fenêtre Multimesure, cliquez sur OK pour collecter automatiquement les intensités de pixels moyenne, minimale et maximale du retour sur investissement défini ci-dessus pour chaque image du flux d’images en vue d’une analyse plus approfondie.
    NOTE. Il est recommandé de normaliser l’intensité moyenne des pixels (moyenne F) à l’intensité minimale (F min) pour chaque retour sur investissement en utilisant le rapport Fmoyenne / F min pour tenir compte des différences de fluorescence dues au positionnement dans le plan z. Jetez les flux d’image avec le mouvement du ver pendant l’imagerie, car cela affecterait également les mesures de fluorescence.

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Representative Results

Ces deux protocoles permettent l’acquisition rapide de niveaux différentiels de Ca2+ dans les régions subcellulaires et les organites des neurites individuels in vivo avec une résolution spatiale élevée. Le premier protocole permet la mesure du Ca2+ cytoplasmique avec une résolution temporelle et spatiale élevée. Ceci est démontré ici en utilisant l’expression spécifique à la cellule de GCaMP6f dans les interneurones de commande AVA glutamatergiques15, dont les neurites courent sur toute la longueur du cordon nerveux ventral. L’acquisition rapide de la fluorescence GCaMP6f (50 Hz) a permis de détecter la propagation directionnelle de l’afflux de Ca 2+ (Figure 2A et Vidéo supplémentaire 1). La quantification subcellulaire de la fluorescence GCaMP6f a révélé que l’apparition de l’afflux de Ca 2+ était retardée dans une partie du neurite à seulement 10 μm (Figure 2B). De plus, ce protocole a permis plusieurs observations d’événements Ca 2+ compartimentés et Ca2+ sous-seuil. Par exemple, les structures dendritiques ressemblant à des épines trouvées le long du neurite AVA ont été observées comme présentant des éclairs de fluorescence GCaMP6f qui se sont produits indépendamment de l’activation des neurites et n’ont pas conduit à une propagation de l’afflux de Ca 2+ (Figure 2C, D et Vidéo supplémentaire 2).

Le deuxième protocole visait à mesurer rapidement les niveaux relatifs de Ca2+ dans les mitochondries individuelles dans des névrites simples. L’utilisation d’une souche de ver avec expression spécifique AVA de l’indicateur Ca2+ localisé dans la matrice mitochondriale mitoGCaMP a permis la détection rapide des changements dans la fluorescence mitoGCaMP au niveau des mitochondries individuelles dans le neurite AVA. Ce protocole d’imagerie a révélé différents modes d’absorption de Ca2+ dans les mitochondries, du moins dans ce neurone. Tout d’abord, les résultats présentés à la figure 3A fournissent un exemple de l’absorption synchrone d’une quantité relativement importante de Ca2+ dans un sous-ensemble de mitochondries. Plus précisément, ces données ont révélé que l’absorption de Ca2+ dans certaines mitochondries était synchronisée (Mito1 et Mito2; Figure 3A,B et Supplemental Video 3), alors que les mitochondries voisines ne semblaient pas absorber Ca2+ (Mito3; Figure 3A, B). De même, des sous-ensembles de mitochondries ont été observés pour absorber et libérer rapidement de petites quantités de Ca2+. Cela semblait également être synchrone (Mito1 et Mito3, Figure 3C,D et Vidéo supplémentaire 4), mais encore une fois seulement pour un sous-ensemble de mitochondries (Mito 2, Figure 3C,D).

Figure 1
Figure 1 : Montage et roulage de C. elegans pour l’imagerie du cordon nerveux ventral. (A) Une illustration des étapes de préparation des tampons de gélose et de prélèvement d’un seul ver dans une solution de laminage. (B) Un exemple de position d’un ver avant qu’il ne soit repositionné pour l’imagerie. La flèche rouge indique la nécessité d’un roulement du ver vers la droite, ce qui peut être réalisé en faisant glisser le couvercle vers la droite (flèche bleue). Barre d’échelle = 50 μm. (C) L’orientation correcte nécessaire pour visualiser le cordon nerveux ventral. Remarque: L’intestin est sur le côté droit du spectateur (à l’aide d’un microscope vertical) dans la moitié proximale et est ensuite sur le côté gauche dans la moitié distale. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Acquisition rapide de la fluorescence GCaMP6f avec résolution subcellulaire dans les structures de neurite AVA et de type colonne vertébrale. (A) Images représentatives de la fluorescence GCaMP6f à la bifurcation des neurites AVAL et AVAR. Barre d’échelle = 5 μm. (B) Quantification de la fluorescence GCaMP6f normalisée à la fluorescence minimale (F) pour cette région (Fmin) pour les régions proximale (orange) et distale (bleue) définies dans l’image du bas du panneau A. (C) Images représentatives de la fluorescence GCaMP6f à une projection semblable à la colonne vertébrale dans le neurite AVA. (D) Fluorescence normalisée de GCaMP6f dans le neurite (orange) et projection en forme d’épine (bleu) des régions correspondantes dans l’image du bas du panneau C. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Graphique 3. Imagerie rapide de l’absorption du calcium dans les mitochondries individuelles dans le neurite AVA. (A,C) Images représentatives de la fluorescence mitoGCaMP au fil du temps. Barre d’échelle = 50 μm. (B) Traces de fluorescence GCaMP normalisée (F/F min) pour les mitochondries correspondantes montrées dans l’image du bas du panneau A. (D) F/Fmin sur 40 s d’imagerie dans les régions mises en évidence dans l’image du bas du panneau C. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Vidéo supplémentaire 1 : Fluorescence GCaMP6f dans le neurite AVA. La vidéo a été rendue à une vitesse 2x. Barre d’échelle = 5 μm. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.

Vidéo supplémentaire 2 : Fluorescence GCaMP6f dans une projection semblable à une colonne vertébrale sur le neurite AVA. La vidéo a été rendue à une vitesse 2x. Barre d’échelle = 5 μm. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.

Vidéo supplémentaire 3 : Fluorescence MitoGCaMP dans l’absorption du calcium mitochondrial synchronisé par les neurites AVA. La vidéo a été rendue à une vitesse 4x. Barre d’échelle = 5 μm. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.

Vidéo supplémentaire 4 : Fluorescence MitoGCaMP dans l’AVA absorption rapide des neurites et libération de calcium par les mitochondries. La vidéo a été rendue à une vitesse 4x. Barre d’échelle = 5 μm. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.

Tableau supplémentaire 1 : Réactifs génétiques et souches utilisés dans cette étude. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

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Discussion

La première considération lors de la mise en œuvre de la méthode décrite implique la sélection d’un indicateur Ca2+ avec des caractéristiques idéales pour la question de recherche donnée. Les indicateurs cytoplasmiques Ca 2+ ont généralement une forte affinité pour Ca 2+, et la sensibilité de ces indicateurs au Ca2+ est inversement liée à la cinétique (taux marche/arrêt)16,17. Cela signifie que la sensibilité ou la cinétique du Ca2+ devra être priorisée en fonction du phénomène d’intérêt. Pour les compartiments subcellulaires avec des niveaux basaux relativement élevés de Ca 2+, tels que le RE, les indicateurs Ca 2+ avec une faible affinité Ca2+ devraient être considérés18. Pour générer de l’ADN recombinant pour l’expression spécifique à la cellule d’un indicateur Ca 2+, la technique de clonage préférée doit être utilisée pour insérer un promoteur spécifique à la cellule19,20 suivi de l’indicateur Ca 2+ de choix et d’un UTR de 3'. Des niveaux d’expression relativement élevés dans les neurones AVA peuvent être atteints en construisant un plasmide avec les promoteurs Pflp-18 ou Prig-3, un let-858 ou unc-54 3' UTR et en microinjectant ce plasmide à 15-25 ng / μL (voir le tableau supplémentaire 1).

La micro-injection réussie des plasmides contenant l’indicateur Ca 2+ et la lin-15+ dans la gonade des vers mutants lin-15(n765ts) donnera une descendance F1 qui exprime l’indicateur Ca 2+ et sera sauvée pour le phénotype multi-vulvaire. Seul un sous-ensemble (30%-80%) de la génération F1 transmettra l’ADN synthétique à la génération F2. L’expression de l’indicateur Ca2+ doit être évaluée dans la descendance F2 ou F3 sauvée sur des plaques avec transmission de <60% de l’ADN synthétique par montage et imagerie de la fluorescence chez les adultes âgés de 1 jour qui sont sauvés pour le phénotype multi-vulvaire. Le niveau d’expression idéal est déterminé en fonction des propriétés et de l’emplacement de l’indicateur Ca2+, ainsi que de la question biologique. Si une acquisition rapide de l’image est souhaitée, une expression relativement élevée est idéale. Cependant, une expression extrêmement élevée des indicateurs Ca2+ s’est avérée provoquer une mauvaise localisation subcellulaire, ainsi qu’une expression non spécifique dans d’autres cellules ou tissus.

Les indicateurs Ca 2+ codés génétiquement ont été largement utilisés pour les analyses in vivo de Ca2+ chez C. elegans, ainsi que dans d’autres organismes modèles. Certaines de ces études ont permis de surveiller la résolution unicellulaire des niveaux de Ca 2+ dans le corps cellulaire neuronal21,22,23,24. Des mesures de l’afflux de Ca 2+ dans les sous-compartiments neuronaux ont été réalisées in vivo chez C. elegans ainsi que dans des systèmes vertébrés, mais uniquement en enregistrant l’activité de l’indicateur Ca 2+ dans un neurite entier 25,26 ou des populations de dendrites 27. Bien que la mesure de l’activité du Ca 2+ dans les corps cellulaires neuronaux et les dendrites dans leur ensemble reflète l’activité de pointe de la cellule, elle ne permet pas d’observer la dynamique de l’afflux de Ca 2+ (c’est-à-dire la direction ou le taux de propagation) ou des transitoires Ca2+ inférieurs au seuil. Peu d’études in vivo ont été en mesure de discerner la manipulation du Ca2+ dans les neurones à la résolution spatiale et temporelle démontrée ici. Il convient de noter que la dynamique temporelle de l’afflux de Ca 2+ dans la plupart des neurones de C. elegans 28 semble être plus lente que dans les neurones des vertébrés29, il est donc probable que ce protocole d’imagerie rapide serait insuffisant pour capturer une dynamique temporelle similaire dans les systèmes vertébrés. Cependant, les progrès récents de la microscopie à deux photons permettent l’imagerie subcellulaire ultra-rapide (120 Hz) du calcium dans les dendrites individuelles de l’hippocampe chez des souris au comportement libre30, ce qui est prometteur pour obtenir une imagerie Ca2+ haute résolution similaire chez les vertébrés.

Il est important de noter que cette approche non ratiométrique de l’imagerie in vivo Ca2+ nécessite l’utilisation de muscimol, qui inhibe la contraction des muscles de la paroi corporelle, limitant ainsi le mouvement du ver pendant l’imagerie31. S’il y a un mouvement excessif pendant l’imagerie (mouvement constant dans plus de ~20% des vers), une nouvelle solution de laminage doit être faite avec une partie aliquote de muscimol nouvellement décongelée, et le temps pendant lequel un vis sans fin baigne dans la solution de laminage avant le laminage doit être prolongé. Muscimol est un agoniste des récepteurs GABA, ce qui signifie qu’il inhibe les neurones GABAergiques, y compris ceux qui fournissent des informations aux neurones AVA. De plus, de nombreux neurones excitateurs, y compris AVA, expriment de faibles niveaux de récepteurs GABA, il est donc probable que l’utilisation de muscimol dans ce protocole diminue l’activité neuronale. Cependant, en utilisant ce protocole, l’activation spontanée globale de l’AVA n’est réduite que de ~29% en présence de muscimol (données non publiées). L’activation d’autres neurones peut être diminuée plus drastiquement par le muscimol, ce qui peut être testé en substituant le muscimol à M9 dans la solution roulante et en effectuant une imagerie dans le corps cellulaire neuronal à faible grossissement32. Une alternative à l’utilisation du muscimol serait d’utiliser un indicateur ratiométrique Ca2+ 33,34, ce qui permettrait une correction de fluorescence due au mouvement du ver. L’inconvénient de cette approche est qu’elle nécessite une configuration optique capable d’imagerie à double longueur d’onde et limite la possibilité d’utiliser un indicateur Ca2+ en combinaison avec de nombreux autres outils fluorescents.

Une limitation majeure du système de microscopie décrit est la réduction de la lumière émise par le disque en rotation, ce qui entraîne une perte d’information. Ce système pourrait être modifié pour permettre une capture accrue de la lumière émise en mettant en œuvre un disque avec des trous d’épingle de plus grand diamètre. Cependant, cette altération diminuerait la résolution axiale (plan z) et augmenterait la fluorescence de fond. Une autre configuration de microscopie possible à cette fin serait le microscope à feuille de lumière à balayage rapide, qui a été amélioré ces dernières années pour permettre une imagerie rapide (jusqu’à 50 Hz) in situ et in vivo35.

L’évaluation de la dynamique spatio-temporelle du Ca 2+ cytoplasmique et mitochondrial permettra de mieux comprendre comment les transitoires Ca2+ locaux, et même les événements sous-seuils, peuvent déclencher une signalisation dépendante du calcium ou moduler la biologie mitochondriale. Cette imagerie sous-cellulaire in vivo Ca2+ pourrait être particulièrement utile pour l’étude de la plasticité synaptique, des changements dépendants de l’activité du métabolisme neuronal et de la modulation homéostatique de l’excitabilité neuronale. Une étude plus approfondie de la façon dont les environnements subcellulaires locaux s’adaptent autour d’états définis d’activité neuronale (c.-à-d. concentrations spatialement spécifiques et durée de vie de Ca 2+) permettrait de mieux comprendre comment la dyshoméostasie Ca2+ entraîne des changements pathogènes dans la fonction neuronale. La capacité d’étudier cela dans un organisme vivant et intact est particulièrement utile car elle permet des études longitudinales qui feraient la lumière sur comment et pourquoi l’homéostasie Ca2+ change avec le vieillissement naturel et la neurodégénérescence liée à la maladie. L’application de cette méthode pour étudier le vieillissement et la neurodégénérescence est quelque peu limitée aux premiers âges biologiques chez C. elegans (<4 jours de l’âge adulte). En effet, la manipulation physique lors du montage et du positionnement des vers pour l’imagerie est difficile après environ 5 jours d’âge adulte lorsque les vers deviennent flasques en raison de la diminution du tonus musculaire et de l’intégrité des cuticules.

L’imagerie in vivo rapide de la dynamique et de la manipulation subcellulaire du Ca2+ sera déterminante dans notre compréhension de la façon dont l’excitabilité neuronale et la signalisation intracellulaire sont finement régulées spatialement et temporellement. Ce protocole pourrait bénéficier à un large éventail de chercheurs et de chercheurs dans de nombreux domaines en raison de la diversité des processus dépendants de Ca2+ et de leur rôle central dans la fonction neuronale. Par exemple, l’application de cette méthode dans des neurones sains permettrait de comprendre pourquoi un Ca2+ cytoplasmique élevé au cours du vieillissement se produit en conjonction avec des altérations de la plasticité synaptique, une respiration mitochondriale inefficace, ainsi que d’autres dysfonctionnements36,37. De plus, cette méthode pourrait être utilisée pour étudier les causes de la dyshoméostasie Ca2+ associée à l’âge38. Cependant, l’application de cette méthode aux questions liées au vieillissement et à la neurodégénérescence est quelque peu limitée aux premiers stades du vieillissement (<5 jours de l’âge adulte)38. Comme mentionné ci-dessus, l’imagerie des vers adultes âgés (>5 jours de l’âge adulte) est difficile en utilisant notre méthode de laminage, mais les progrès de la microfluidique de C. elegans sont prometteurs pour l’imagerie avec une résolution spatiale similaire jusqu’à 12 jours de l’âge adulte39,40.

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Disclosures

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par les National Institutes of Health (NIH) (R01- NS115947 attribué à F. Hoerndli). Nous tenons également à remercier le Dr Attila Stetak pour le plasmide pAS1.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100x/1.40 Oil objective   Olympus   UPlanSApo
10x/0.40 Objective  Olympus   UPlanSApo
22 mm x 22 mm Cover glass  VWR  48366-227 
Agarose SFR  VWR  J234-100G 
Beam homogenizer Andor Technologies Borealis upgrade to CSU-X1
CleanBench laboratory table  TMC  With vibration control
Disposable culture tubes VWR  47729-572  13 mm x 100 mm
Environmental chamber Thermo Scientific 3940 Set to 20 °C
Filter wheel or slider ASI For 25 mm diameter filters
FJH 185 Caenorhabditis Genetics Center  FJH 185 Worm strain
FJH 597 Caenorhabditis Genetics Center FJH 597 Worm strain
GFP bandpass emission filter  Chroma  525 ± 50 nm (25 mm diameter)
ILE laser combiner  Andor Technologies  4 laser lines 
ILE solid state 488 nm laser Andor Technologies  50 mW
ImageJ National Institutes of Health Version 1.52a
IX83 Spinning disk confocal microscope  Olympus  With Yokogawa CSU-X1 spinning disc
iXon Ultra EMCCD camera  Andor Technologies 
Low auto-fluorescence immersion oil  Olympus  Z-81226
MetaMorph  Molecular Devices  Version 7.10.1 
Microscope control box Olympus IX3-CBH
Muscimol  MP Biomedical / Sigma 02195336-CF 
pAS1 AddGene 194970 Plasmid
pBSKS Stratagene
pCT61 Plasmid available from Hoerndli/Maricq lab upon request
pJM23 Plasmid available from Hoerndli/Maricq lab upon request
pKK1  AddGene  194969 Plasmid
Polybead microspheres  Polysciences Inc.  00876-15  0.094 µm
Stability chamber Norlake Scientific NSRI241WSW/8H Set to 15 °C
Stage controller ASI With filter wheel control
Standard microscope slide Premiere 9108W-E 75 mm x 25 mm x 1 mm
Touch panel controller Olympus I3-TPC
Z-drift corrector  Olympus  IX3-ZDC2

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References

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Neurosciences numéro 193
Imagerie subcellulaire de la manipulation neuronale du calcium <em>in vivo</em>
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Doser, R., Knight, K. M., Deihl, E., Hoerndli, F. Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo. J. Vis. Exp. (193), e64928, doi:10.3791/64928 (2023).

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