Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

הדמיה תת-תאית של טיפול בסידן עצבי ב-Vivo

Published: March 17, 2023 doi: 10.3791/64928
Automatic Translation
*1, *1,2, 1, 1
1Department of Biomedical Sciences, Colorado State University College of Veterinary Medicine and Biomedical Sciences, 2Cellular and Molecular Biology Graduate Program, Colorado State University College of Veterinary Medicine and Biomedical Sciences
* These authors contributed equally

Summary

השיטות הנוכחיות מתארות גישה לא רציומטרית להדמיית סידן ברזולוציה גבוהה, תת-מדורית in vivo ב- Caenorhabditis elegans באמצעות מדדי סידן מקודדים גנטית זמינים.

Abstract

הדמיית סידן (Ca 2+) שימשה בעיקר לבחינת הפעילות העצבית, אך מתברר יותר ויותר כי טיפול תת-תאי ב- Ca2+ הוא מרכיב חיוני באיתות תוך תאי. ההדמיה של דינמיקת Ca2+ in vivo תת-תאית, שבה ניתן לחקור נוירונים במעגלים הטבעיים והשלמים שלהם, הוכחה כמאתגרת מבחינה טכנית במערכות עצבים מורכבות. השקיפות ומערכת העצבים הפשוטה יחסית של הנמטודה Caenorhabditis elegans מאפשרות ביטוי ספציפי לתא והדמיה in vivo של תגים ואינדיקטורים פלואורסצנטיים. בין אלה הם אינדיקטורים פלואורסצנטיים שהותאמו לשימוש בציטופלסמה, כמו גם תאים תת-תאיים שונים, כגון המיטוכונדריה. פרוטוקול זה מאפשר הדמיה לא רציומטרית של Ca 2+ in vivo עם רזולוציה תת-תאית המאפשרת ניתוח של דינמיקת Ca2+ עד לרמת עמוד השדרה הדנדריטי והמיטוכונדריה הבודדים. כאן, שני אינדיקטורים מקודדים גנטית זמינים עם זיקות Ca 2+ שונות משמשים כדי להדגים את השימוש בפרוטוקול זה למדידת רמות Ca2+ יחסיות בתוך הציטופלסמה או המטריצה המיטוכונדריאלית בזוג יחיד של נוירונים מעוררים (AVA). יחד עם המניפולציות הגנטיות ותצפיות האורך האפשריות ב- C. elegans, פרוטוקול הדמיה זה עשוי להיות שימושי לענות על שאלות לגבי האופן שבו טיפול Ca2+ מווסת את התפקוד העצבי ואת הפלסטיות.

Introduction

יוני סידן (Ca2+) הם נשאים רב-תכליתיים ביותר של מידע בסוגי תאים רבים. בנוירונים, Ca2+ אחראי על שחרור תלוי פעילות של מוליכים עצביים, ויסות תנועתיות השלד הציטו-שלד, כוונון עדין של תהליכים מטבוליים, כמו גם מנגנונים רבים אחרים הדרושים לתחזוקה עצבית נאותה ותפקוד 1,2. כדי להבטיח איתות תוך-תאי יעיל, תאי עצב חייבים לשמור על רמות נמוכות של Ca2+ בסיסי בציטופלסמה3 שלהם. זה מושג על ידי מנגנוני טיפול Ca 2+ שיתופיים, כולל ספיגה של Ca2+ לתוך אברונים כגון הרשתית האנדופלסמית (ER) והמיטוכונדריה. תהליכים אלה, בנוסף לסידור של תעלות יונים חדירות Ca 2+ בקרום הפלזמה, גורמים לרמות הטרוגניות של Ca2+ ציטופלזמי בכל תא העצב.

הטרוגניות Ca 2+ במהלך מנוחה והפעלה עצבית מאפשרת ויסות מגוון וספציפי למיקום של מנגנונים תלויי Ca2+ 1. דוגמה אחת להשפעות הספציפיות לריכוז של Ca 2+ היא שחרור Ca2+ מהמיון דרך קולטני אינוסיטול 1,4,5-trisphosphate (InsP3). רמות נמוכות של Ca2+ בשילוב עם InsP3 נדרשות לפתיחת נקבובית הסידן החדירה של הקולטן. לחלופין, רמות גבוהות של Ca2+ מעכבות באופן ישיר ועקיף את הקולטן4. החשיבות של Ca 2+ הומאוסטזיס לתפקוד עצבי תקין נתמכת על ידי ראיות המצביעות על כך שטיפול ואיתות תוך תאי Ca2+ משובש הוא צעד מוקדם בפתוגנזה של הפרעות נוירודגנרטיביות והזדקנות טבעית 5,6. באופן ספציפי, ספיגה חריגה של Ca2+ ושחרור על ידי המיון והמיטוכונדריה קשורים להופעת תפקוד עצבי לקוי במחלת אלצהיימר, מחלת פרקינסון ומחלת הנטינגטון 6,7.

המחקר של Ca 2+ dyshomeostasis במהלך הזדקנות טבעית או ניוון עצבי דורש תצפית אורכית של רמות Ca2+ עם רזולוציה תת-תאית באורגניזם חי ושלם שבו נשמרת הארכיטקטורה התאית הטבעית (כלומר, סידור הסינפסות ופיזור תעלות היונים). לשם כך, פרוטוקול זה מספק הנחיות לשימוש בשני חיישני Ca 2+ זמינים ומקודדים גנטית להקלטת דינמיקת Ca2+ in vivo ברזולוציה מרחבית וזמנית גבוהה. התוצאות המייצגות שהתקבלו בשיטה המתוארת ב- C. elegans מדגימות כיצד ביטוי של אינדיקטורים Ca 2+ בציטופלסמה או במטריצה המיטוכונדריאלית של נוירונים בודדים יכול לאפשר רכישה מהירה של תמונות פלואורסצנטיות (עד 50 הרץ) הממחישות את הדינמיקה של Ca 2+ עם יכולת נוספת להבחין ברמות Ca 2+ בתוך מבנים דמויי עמוד שדרה יחיד ומיטוכונדריה בודדת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. יצירת זנים טרנסגניים

  1. באמצעות שיטת שיבוט של בחירה8,9, וקטורי ביטוי שיבוט כדי להכיל את מקדם Pflp-18 או Prig-3 (עבור אות ספציפי AVA בחוט העצב הגחוני), ואחריו מחוון Ca2+ של בחירה, ולאחר מכן 3' UTR (ראה דיון למידע נוסף)10. רשימה של פלסמידים ומקורותיהם ניתן למצוא בטבלה משלימה 1.
  2. עקוב אחר הפרוטוקול שנקבע ליצירת זנים טרנסגניים באמצעות מיקרו-הזרקה של תערובת DNA (<100 ng/μL; ראה טבלה משלימה 1 לריכוזים של כל פלסמיד) המכילה את טרנסגן האינדיקטור Ca 2+ (~20 ng/μL) ואת DNA ההצלה lin-15+ (סמן בחירה) לגונד של בוגר בן יום אחד C. elegans10 (גנוטיפ: לין-15(N765TS); פנוטיפ: רב פות)10,11.
    הערה. שמור על הורים lin-15(n765ts) ב 15 ° C כדי לדכא מוטציה רגישה לטמפרטורה.
  3. שמרו על ההורים המוזרקים בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס עד שצאצאי F1 יגיעו לבגרות כדי לאפשר ברירה מהונדסת תוך היעדר פנוטיפ רב פות.
  4. מעבר קלונלי13 צאצאי F1 בוגרים שאין להם את הפנוטיפ הרב-פותי מכיוון שהדבר מציין את הביטוי של המערך החוץ-כרומוזומלי המכיל את מחוון Ca2+ 11.
  5. הערך את הביטוי של מחוון Ca2+ בצאצאי F2 או F3 שאין להם את הפנוטיפ הרב-פות על ידי הרכבה והדמיה של מבוגרים בני יום אחד כמתואר בהמשך סעיף 3.
    הערה. נדרש ביטוי גבוה יחסית של המחוון לרכישה מהירה של תמונות כמתואר כאן (ראו בהרחבה בדיון).
  6. לבצע ניסויים בדורות הבאים של הזנים הטרנסגניים עם ביטוי אופטימלי של מחוון Ca 2+ (ראה דיון לפרטים נוספים), שמירה על הזנים בתנאים סטנדרטיים (20 ° C על לוחות NGM)12.

2. הגדרה אופטית

  1. השתמש במיקרוסקופ המסוגל לבצע הדמיה בהילוך מהיר לטווח ארוך.
    הערה. הנתונים המייצגים נרכשו באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי דיסק מסתובב הפוך המצויד בלייזר עירור 488 ננומטר ו 561 ננומטר.
  2. השתמש ביעד הגדלה נמוכה (כלומר, 10x/0.40) עבור לוקליזציה גסה של התולעת.
  3. כדי להשיג רזולוציה תת-תאית, עברו לתאי העצב ומקמו אותם באמצעות מטרת הגדלה גבוהה.
    הערה. מטרת שמן 100x/1.40 NA שימשה להשגת הנתונים המייצגים במחקר זה.
  4. השג את התמונות באמצעות מצלמה רגישה במיוחד המסוגלת לקלוט תמונה במהירות (>50 fps).
  5. השתמש במסנן פליטה סטנדרטי עבור מחוון Ca2+ לפי בחירתו (כלומר, מסנן פליטה של 525 ננומטר ± 50 ננומטר עבור GCaMP6f ו- mitoGCaMP).
  6. הוסף מתקן Z-drift (ZDC) לרכישת זרמי תמונה ארוכים מ- 10 שניות, מכיוון שהתייבשות כרית האגר במהלך סשן ההדמיה גורמת לנוריט לצאת מהמיקוד תוך מספר שניות.
    הערה. אם הגדרת מיקרוסקופ אינה מאפשרת ZDC, או אם יש צורך בפרקי הדמיה ארוכים (>20 דקות), יש למרוח גבול של שומן סיליקון או ג'ל פטרולאום מומס סביב כרית האגר כדי להאט את הייבוש.

3. הכנת תולעים להדמיה

  1. הכנת רפידות האגר
    1. הכינו 3 מ"ל של 10% אגר על ידי המסת אגר כיתה מולקולרית ב-M912 בשפופרת תרבית זכוכית בגודל 13 מ"מ x 100 מ"מ וגלי מיקרו למשך מספר שניות (ראו טבלת חומרים).
      הערה. אגר מותך יכול להישמר על בלוק חום עד שעה או יכול להיות טרי בכל פעם שיש צורך ברפידות אגר.
    2. מקמו שקופית מיקרוסקופ בין שתי שקופיות נוספות שבכל אחת מהן יש שתי שכבות של סרט מעבדה (ראו איור 1A-i).
    3. חתכו קצה של קצה פיפטה בנפח 1,000 מיקרוליטר (ללא מסנן), והשתמשו בו כדי לקלוט טיפה קטנה של אגר על הכיסוי המרכזי (איור 1A-i).
    4. שטחו את האגר על-ידי לחיצה על שקופית נוספת כלפי מטה על גבי האגר (איור 1A-ii).
    5. לאחר הקירור, חתכו את האגר לדיסקית קטנה באמצעות פתח של צינור תרבית זכוכית בגודל 13 מ"מ x 100 מ"מ (איור 1A-iii), ולאחר מכן הסירו את האגר שמסביב.
  2. הכנת תמיסת גלגול התולעים
    1. יש להמיס אבקת מוסצימול ב-M9 ליצירת ציר של 30 מילימול. יש להפריד לתוך 50 μL aliquots, ולאחסן ב 4 ° C.
    2. הפשיר aliquot חדש של 30 mM muscimol כל 3-5 ימים (ולאחסן ב 20 ° C בזמן השימוש).
    3. לדלל ציר muscimol 30 mM ביחס של 1:1 עם חרוזי פוליסטירן כדי ליצור את הפתרון מתגלגל.
  3. מיקום תולעת לצורך הדמיה
    1. מניחים 1.6 μL של תמיסת הגלגול במרכז כרית האגר.
      הערה: יש להתאים את כמות הנוזלים להדמיה של בעלי חיים צעירים יותר (פחות) או מבוגרים יותר (יותר).
    2. באמצעות פיק התולעת המועדף (כלומר, פיק חוטי זכוכית או פלטינה)13, העבירו תולעת בגיל הרצוי ללא פנוטיפ רב-פות11 לתמיסה המתגלגלת על כרית האגר (איור 1A-iv).
      הערה. הנתונים המייצגים הם מהרמפרודיטים בני יום אחד (זן GCaMP6f = FJH185; זן mitoGCaMP; FJH597; ראו טבלה משלימה 1), שניתן לזהותה על ידי הימצאות שורה אחת בלבד של ביצים. ראה את הדיון לפרטים נוספים על עבודה עם תולעים בגילאים שונים.
    3. המתן ~ 5 דקות עד שהמוסצימול יפחית את תנועת התולעת, ולאחר מכן שחרר כיסוי בגודל 22 מ"מ x 22 מ"מ על גבי כרית האגר, המגביל פיזית את תנועת התולעת.
    4. לצורך הדמיה של תאי עצב בחוט העצב הגחוני, גלגלו את התולעת לכיוון שמוצג באיור 1B,C על-ידי החלקה קלה של הכיסוי.
      הערה. כדי לדמיין את חוט העצב הגחוני, מקם את התולעת עם הראש כלפי מעלה, וגלגל את התולעת עד שהמעי נמצא בצד ימין של החלק הפרוקסימלי ובצד שמאל של החלק הדיסטלי של התולעת (מנקודת מבטו של הצופה). הפוך את הכיוון הזה (איור 1C) עבור תאי עצב לדימות בחוט העצב הגבי.
  4. הרכבת התולעת על מיקרוסקופ
    1. הניחו טיפת שמן טבילה על הכיסוי לפני הרכבתו על במת המיקרוסקופ.
    2. מצא את התולעת באמצעות יעד הגדלה נמוכה (פי 10) ב- brightfield.
    3. עבור למטרה של 100x וכוונן את המיקוד.
    4. אתר את נוירוט AVA באמצעות הארה של GCaMP או mitoGCaMP עם לייזר הדמיה 488 ננומטר.
      הערה: השתמש בהתאמות קטנות כדי למנוע מעיכת התולעת או משיכת הכיסוי.

4. רכישת זרמי תמונה ברזולוציה גבוהה

  1. In vivo הדמיית GCaMP
    1. הגדר את זמן החשיפה ל- 20 אלפיות השנייה.
    2. כוונן את הגדרות ההדמיה והרכישה של לייזר עד שהפלואורסצנטיות הבסיסית של GCaMP תגיע למרכז הטווח הדינמי של המצלמה14. עיין בדיון לקבלת הצעות לאופטימיזציה של פרמטרי ההדמיה באמצעות הגדרות מיקרוסקופיה אחרות.
      הערה. עבור ההגדרה האופטית המשמשת במחקר זה, הגדר את לייזר ההדמיה 488 ננומטר להגדרות הפלט הבאות: עוצמת לייזר = 50% והנחתה = 1. שנה את הגדרות הרכישה הנוספות באופן הבא: רווח EM = 200 ורווח טרום מגבר = 1.
    3. לאחר איתור הנוירוט AVA באמצעות פלואורסצנטיות GCaMP בהגדלה של 100x, הגדר את ZDC (ראה טבלת חומרים) לטווח של ±30 מיקרומטר, והתחל מיקוד אוטומטי רציף. תקן ידנית את מישור המוקד לפי הצורך לפני ההדמיה.
    4. קבל זרם של תמונות בהגדלה של 100x. משכי זמן ארוכים עד 10 דקות ניתן להשיג עם ההתקנה המשמשת במחקר זה.
  2. הדמיית מיטוGCaMP In vivo
    1. בצע את השלבים 4.1.1-4.1.2 לפי הצורך כדי להשיג את הפלואורסצנטיות הבסיסית של המיטוג-GCaMP בטווח הביניים עבור הטווח הדינמי של המצלמה14.
      הערה. עבור ההגדרה האופטית ששימשה במחקר זה, הגדר את לייזר ההדמיה של 488 ננומטר להגדרות הפלט הבאות: עוצמת לייזר = 20% והנחתה = 10. שנה את הגדרות הרכישה באופן הבא: רווח EM = 100 ורווח טרום מגבר = 2.
    2. לאחר שהמיטוכונדריה בנוירוט AVA ממוקמים באמצעות הפלואורסצנטיות של המיטוג'יMP, הגדר את ZDC כמתואר לעיל בשלב 3.3.
    3. קבל זרם של תמונות בהגדלה של 100x.

5. ניתוח זרם תמונות

  1. פתחו את זרם התמונות בתוכנת תמונה מתאימה לניתוח ערכי הפיקסלים בסדרת תמונות (ראו טבלת חומרים).
  2. בעזרת הכלי בחירת מצולע , הגדירו את אזור העניין התת-תאי (ROI) המכיל GCaMP או mitoGCaMP.
  3. לחץ על ניתוח כלי > >- ROI Manager. במנהל החזר ההשקעה, לחץ על הוסף ולאחר מכן על עוד > מידה מרובה. בחלון Multi Measure, לחץ על OK כדי לאסוף באופן אוטומטי את עוצמות הפיקסלים הממוצעות, המינימליות והמרביות של החזר ההשקעה שהוגדר לעיל עבור כל מסגרת של זרם התמונה לצורך ניתוח נוסף.
    הערה. מומלץ לנרמל את עוצמת הפיקסלים הממוצעת (Favg) לעוצמה המינימלית (F min) עבור כל החזר השקעה באמצעות היחס Fממוצע / Fmin כדי לקחת בחשבון הבדלים פלואורסצנטיים עקב מיקום במישור z. השליכו את זרמי התמונה עם תנועת תולעת במהלך ההדמיה מכיוון שהדבר ישפיע גם על מדידות הפלואורסצנטיות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

שני פרוטוקולים אלה מאפשרים רכישה מהירה של רמות Ca2+ דיפרנציאליות בתוך האזורים התת-תאיים והאברונים של נוירוטים בודדים in vivo עם רזולוציה מרחבית גבוהה. הפרוטוקול הראשון מאפשר מדידה של Ca2+ ציטופלזמי ברזולוציה טמפורלית ומרחבית גבוהה. זה מודגם כאן באמצעות ביטוי ספציפי לתא של GCaMP6f באינטרנוירונים15 של פקודת AVA גלוטמטרגית, שתאי העצב שלהם רצים לכל אורכו של חוט העצב הגחוני. הרכישה המהירה של פלואורסצנטיות GCaMP6f (50 הרץ) אפשרה לזהות את ההתפשטות הכיוונית של זרם Ca 2+ (איור 2A ווידאו משלים 1). הכימות התת-תאי של פלואורסצנטיות GCaMP6f גילה שתחילת זרם Ca 2+ התעכבה בחלק של הנוריט במרחק של 10 מיקרומטר בלבד (איור 2B). בנוסף, פרוטוקול זה איפשר מספר תצפיות של אירועי Ca 2+ ממודרים ותת-סף Ca2+. לדוגמה, מבנים דמויי עמוד שדרה דנדריטי שנמצאו לאורך הנוירוט AVA נראו עם הבזקים בפלואורסצנטיות GCaMP6f שהתרחשו ללא תלות בהפעלת הנוריט ולא הובילו להתפשטות של זרם Ca 2+ (איור 2C,D ווידאו משלים 2).

הפרוטוקול השני נועד למדוד במהירות את רמות Ca2+ היחסיות במיטוכונדריה הבודדת בעצבים בודדים. שימוש בזן תולעת עם ביטוי ספציפי ל-AVA של המטריצה המיטוכונדריאלית המקומית Ca2+ אינדיקטור mitoGCaMP איפשר זיהוי מהיר של שינויים בפלואורסצנטיות של מיטוכונדריה ברמת מיטוכונדריה בודדת בתוך AVA neurite. פרוטוקול הדמיה זה חשף מצבים שונים של ספיגת Ca2+ לתוך המיטוכונדריה, לפחות בתא עצב זה. ראשית, התוצאות שמוצגות באיור 3A מספקות דוגמה לספיגה סינכרונית של כמות גדולה יחסית של Ca2+ לתוך תת-קבוצה של מיטוכונדריה. באופן ספציפי יותר, נתונים אלה גילו כי ספיגת Ca2+ לחלק מהמיטוכונדריה הייתה מסונכרנת (Mito1 ו- Mito2; איור 3A,B ווידאו משלים 3), בעוד שבמיטוכונדריה שכנים לא נראה שהם תופסים Ca2+ (מיטו3; איור 3A,B). באופן דומה, תת-קבוצות של מיטוכונדריה נראו סופגות ומשחררות במהירות כמויות קטנות של Ca2+. גם זה נראה סינכרוני (מיטו1 ומיטו3, איור 3C,D ווידאו משלים 4), אבל שוב רק עבור תת-קבוצה של מיטוכונדריה (מיטו 2, איור 3C,D).

Figure 1
איור 1: הרכבה וגלגול של C. elegans לצורך הדמיה של חוט העצב הגחוני. (A) איור של השלבים להכנת רפידות האגר ובחירת תולעת בודדת לתמיסה מתגלגלת. (B) דוגמה למיקום תולעת לפני מיקומה מחדש לצורך הדמיה. החץ האדום מציין את הצורך בגלגול ימינה של התולעת, אשר ניתן להשיג על ידי החלקת הכיסוי ימינה (חץ כחול). סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. (C) הכיוון הנכון הדרוש להדמיית חוט העצב הגחוני. הערה: המעי נמצא בצד ימין של הצופה (באמצעות מיקרוסקופ זקוף) בחצי הפרוקסימלי ולאחר מכן נמצא בצד שמאל בחצי הדיסטלי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: רכישה מהירה של פלואורסצנטיות GCaMP6f עם רזולוציה תת-תאית ב-AVA neurite ובמבנים דמויי עמוד שדרה. (A) תמונות מייצגות של פלואורסצנטיות GCaMP6f בביפורקציה של AVAL ו-AVAR neurit. סרגל קנה מידה = 5 מיקרומטר. (B) כימות פלואורסצנטיות GCaMP6f מנורמל לפלואורסצנטיות המינימלית (F) עבור אזור זה (Fmin) עבור האזורים הפרוקסימליים (כתום) והדיסטליים (כחולים) שהוגדרו בתמונה התחתונה בלוח A. (C) תמונות מייצגות של פלואורסצנטיות GCaMP6f בהיטל דמוי עמוד שדרה בנוריט AVA. (D) פלואורסצנטיות GCaMP6f מנורמלת בנוריט (כתום) והקרנה דמוית עמוד שדרה (כחול) מהאזורים המתאימים בתמונה התחתונה של לוח C. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3. הדמיה מהירה של ספיגת סידן לתוך מיטוכונדריה בודדים בתוך AVA neurite. (א,ג) תמונות מייצגות של פלואורסצנטיות מיטוג'י-ג'יMP לאורך זמן. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. (B) עקבות של פלואורסצנטיות GCaMP מנורמלת (F/F min) עבור המיטוכונדריה המתאימה המוצגות בתמונה התחתונה של לוח A. (D) F/Fmin מעל 40 שניות של הדמיה באזורים המודגשים בתמונה התחתונה בלוח C. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

וידאו משלים 1: פלואורסצנטיות GCaMP6f בנוריט AVA. הסרטון עובד במהירות של פי 2. סרגל קנה מידה = 5 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להוריד סרטון זה.

וידאו משלים 2: פלואורסצנטיות GCaMP6f בהקרנה דמוית עמוד שדרה על AVA neurite. הסרטון עובד במהירות של פי 2. סרגל קנה מידה = 5 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להוריד סרטון זה.

סרטון משלים 3: פלואורסצנטיות של מיטוג'י בספיגת הסידן המיטוכונדריאלי המסונכרן עם AVA neurite. הסרטון עובד במהירות פי 4. סרגל קנה מידה = 5 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להוריד סרטון זה.

סרטון משלים 4: פלואורסצנטיות של MitoGCaMP בספיגה מהירה של AVA neurite ושחרור סידן על ידי המיטוכונדריה. הסרטון עובד במהירות פי 4. סרגל קנה מידה = 5 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להוריד סרטון זה.

טבלה משלימה 1: ריאגנטים וזנים גנטיים ששימשו במחקר זה. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

השיקול הראשון ביישום השיטה המתוארת כרוך בבחירת אינדיקטור Ca2+ עם מאפיינים אידיאליים לשאלת המחקר הנתונה. לאינדיקטורים ציטופלזמיים Ca 2+ יש בדרך כלל זיקה גבוהה ל- Ca 2+, והרגישות של אינדיקטורים אלה ל- Ca 2+ קשורה ביחס הפוך לקינטיקה (קצב הפעלה/כיבוי)16,17. משמעות הדבר היא כי רגישות Ca2+ או קינטיקה יהיה צורך לתעדף על בסיס התופעה של עניין. עבור תאים תת-תאיים עם רמות Ca 2+ בסיסיות גבוהות יחסית, כגון ER, יש לשקול אינדיקטורים Ca 2+ עם זיקה נמוכה של Ca 2+ 18. כדי ליצור DNA רקומביננטי עבור ביטוי ספציפי לתא של מחוון Ca 2+, יש להשתמש בטכניקת השיבוט המועדפת כדי להכניס מקדם ספציפי לתא19,20 ואחריו מחוון Ca 2+ לבחירה ו- UTR 3'. רמות ביטוי גבוהות יחסית בנוירוני AVA יכולות להיות מושגות על ידי בניית פלסמיד עם המקדמים Pflp-18 או Prig-3, a let-858, או unc-54 3' UTR והזרקה מיקרו של פלסמיד זה ב 15-25 ng/μL (ראה טבלה משלימה 1).

המיקרו-הזרקה המוצלחת של הפלסמידים המכילים את מחוון Ca 2+ ו-lin-15+ לתוך הגונד של תולעים מוטנטיות lin-15(n765ts) תניב צאצא F1 המבטא את מחוון Ca 2+ וניצלים עבור הפנוטיפ הרב-פותי. רק תת-קבוצה (30%-80%) מדור ה-F1 תעביר את הדנ"א הסינתטי לדור ה-F2. יש להעריך את הביטוי של מחוון Ca2+ בצאצאי F2 או F3 שניצלו על לוחות עם שידור של <60% של הדנ"א הסינתטי על ידי הרכבה והדמיה של הפלואורסצנטיות במבוגרים בני יום אחד שניצלו עבור הפנוטיפ הרב-פותי. רמת הביטוי האידיאלית נקבעת על סמך המאפיינים והמיקום של מחוון Ca2+, כמו גם השאלה הביולוגית. אם רכישת תמונה מהירה רצויה, אז ביטוי גבוה יחסית הוא אידיאלי. עם זאת, ביטוי גבוה מאוד של אינדיקטורים Ca2+ נמצא כגורם לחוסר לוקליזציה תת-תאית, כמו גם ביטוי לא ספציפי בתאים או רקמות אחרים.

אינדיקטורים מקודדים גנטית Ca 2+ שימשו באופן נרחב עבור ניתוחי in vivo של Ca2+ ב- C. elegans, כמו גם באורגניזמים מודל אחרים. חלק מהמחקרים הללו השיגו ניטור ברזולוציה של תא בודד של רמות Ca 2+ בגוף התא העצבי21,22,23,24. מדידות של זרם Ca 2+ בתת-תאים עצביים הושגו in vivo ב- C. elegans כמו גם במערכות חולייתנים, אך רק על ידי רישום פעילות מחוון Ca 2+ בנוריט שלם 25,26 או אוכלוסיות של דנדריטים 27. למרות שמדידת פעילות Ca 2+ בגופי תאים עצביים ובדנדריטים בכללותם משקפת את פעילות הספייקינג של התא, היא אינה מאפשרת תצפית על הדינמיקה של זרם Ca 2+ (כלומר, כיוון או קצב ההתפשטות) או תת-סף Ca 2+ transients. מחקרים מעטים in vivo הצליחו להבחין בטיפול Ca2+ בתאי עצב ברזולוציה המרחבית והזמנית שהודגמה כאן. יש לציין כי הדינמיקה הטמפורלית של זרם Ca 2+ ברוב תאי העצב C. elegans 28 נראית איטית יותר מאשר בנוירונים בעלי חוליות29, כך שסביר להניח שפרוטוקול הדמיה מהיר זה לא יספיק ללכידת דינמיקה טמפורלית דומה במערכות חולייתנים. עם זאת, ההתקדמות האחרונה במיקרוסקופ דו-פוטוני מאפשרת הדמיה תת-תאית מהירה במיוחד (120 הרץ) של סידן בדנדריטים בודדים בהיפוקמפוס בעכברים30 המתנהגים בחופשיות, מה שמספק הבטחה להשגת דימות דומה ברזולוציה גבוהה Ca2+ בבעלי חוליות.

חשוב לציין כי גישה לא רציומטרית זו להדמיית in vivo Ca2+ דורשת שימוש במוצימול, המעכב את התכווצות שרירי דופן הגוף, ובכך מגביל את תנועת התולעת במהלך הדמיה31. אם יש תנועה מוגזמת במהלך ההדמיה (תנועה עקבית ביותר מ~20% מהתולעים), יש לבצע תמיסת גלגול חדשה עם אליקוט חדש מופשר של מוסצימול, ולהאריך את הזמן שבו תולעת רוחצת בתמיסת הגלגול לפני הגלגול. Muscimol הוא אגוניסט לקולטן GABA, כלומר הוא מעכב נוירונים GABAergic, כולל אלה המספקים קלט לנוירוני AVA. בנוסף, נוירונים מעוררים רבים, כולל AVA, מבטאים רמות נמוכות של קולטני GABA, כך שסביר להניח שהשימוש במוצימול בפרוטוקול זה מקטין את הפעילות העצבית. עם זאת, באמצעות פרוטוקול זה, ההפעלה הספונטנית הכוללת של AVA מופחתת רק ~ 29% בנוכחות muscimol (נתונים שלא פורסמו). ההפעלה של נוירונים אחרים עשויה להיות מופחתת באופן דרסטי יותר על ידי muscimol, וזה יכול להיבדק על ידי החלפת muscimol עבור M9 בתמיסה מתגלגלת וביצוע הדמיה בגוף התא העצבי בהגדלה נמוכה32. חלופה לשימוש muscimol יהיה להשתמש יחס Ca2+ מחוון33,34, אשר יאפשר תיקון פלואורסצנטי עקב תנועת תולעת. החיסרון בגישה זו הוא שהיא דורשת מערך אופטי המסוגל להדמיה באורך גל כפול ומגבילה את היכולת להשתמש במחוון Ca2+ בשילוב עם כלים פלואורסצנטיים רבים אחרים.

מגבלה עיקרית אחת של מערכת המיקרוסקופ המתוארת היא הפחתת האור הנפלט על ידי הדיסק המסתובב, מה שגורם לאובדן מידע. ניתן לשנות מערכת זו כדי לאפשר לכידה מוגברת של האור הנפלט על ידי יישום דיסק עם חורי פינים בקוטר גדול יותר. עם זאת, שינוי זה יקטין את הרזולוציה הצירית (מישור z) ויגדיל את פלואורסצנטיות הרקע. מערך מיקרוסקופיה אפשרי נוסף למטרה זו יהיה מיקרוסקופ יריעות אור בסריקה מהירה, אשר שופר בשנים האחרונות כדי לאפשר הדמיה מהירה (עד 50 הרץ) באתרו ו-in vivo35.

הערכת הדינמיקה המרחבית-טמפורלית של Ca 2+ ציטופלזמי ומיטוכונדריאלי תאפשר הבנה טובה יותר של האופן שבו מעברי Ca2+ מקומיים, ואפילו אירועי תת-סף, עשויים לעורר איתות תלוי סידן או לווסת את הביולוגיה המיטוכונדריאלית. הדמיה תת-תאית זו, in vivo Ca2+ יכולה להיות שימושית במיוחד לחקר גמישות סינפטית, שינויים תלויי פעילות במטבוליזם עצבי, ומודולציה הומיאוסטטית של עוררות עצבית. חקירה נוספת של האופן שבו סביבות מקומיות תת-תאיות מסתגלות סביב מצבים מוגדרים של פעילות עצבית (כלומר, ריכוזים ספציפיים מרחבית ומשך חיים של Ca 2+) תספק תובנה כיצד דיסהומאוסטזיס Ca2+ מוביל לשינויים פתוגניים בתפקוד העצבי. היכולת לחקור זאת באורגניזם חי ושלם שימושית במיוחד מכיוון שהיא מאפשרת מחקרי אורך שישפכו אור על איך ומדוע הומאוסטזיס Ca2+ משתנה עם הזדקנות טבעית וניוון עצבי הקשור למחלות. יישום שיטה זו לחקר הזדקנות וניוון עצבי מוגבל במידת מה לגילאים הביולוגיים המוקדמים ב- C. elegans (<4 ימים של בגרות). ואכן, המניפולציה הפיזית במהלך הרכבה ומיקום התולעים להדמיה קשה לאחר כ -5 ימים של בגרות כאשר התולעים הופכות רפויות בגלל ירידה בטונוס השרירים ושלמות הקוטיקולה.

הדמיה מהירה in vivo של הדינמיקה והטיפול התת-תאי של Ca2+ תהיה חיונית להבנתנו כיצד עוררות עצבית ואיתות תוך-תאי מווסתים היטב מרחבית וזמנית. פרוטוקול זה יכול להועיל למגוון רחב של מחקרים וחוקרים בתחומים רבים בשל מגוון התהליכים התלויים ב- Ca2+ ותפקידם המרכזי בתפקוד העצבי. לדוגמה, היישום של שיטה זו בנוירונים בריאים יספק תובנה מדוע Ca2+ ציטופלזמי מוגבר במהלך ההזדקנות מתרחש בשילוב עם ליקויים בפלסטיות סינפטית, נשימה מיטוכונדריאלית לא יעילה, כמו גם תפקוד לקוי אחר36,37. בנוסף, שיטה זו יכולה לשמש כדי לחקור את הגורמים הקשורים לגיל Ca2+ dyshomeostasis38. עם זאת, היישום של שיטה זו עבור שאלות הקשורות הזדקנות ניוון עצבי מוגבל במידת מה לשלבים המוקדמים של ההזדקנות (<5 ימים של בגרות)38. כפי שהוזכר לעיל, הדמיה של תולעים מבוגרות (>5 ימים של בגרות) קשה באמצעות שיטת הגלגול שלנו, אבל ההתקדמות במיקרופלואידיקה של C. elegans מראה הבטחה לדימות ברזולוציה מרחבית דומה עד 12 ימים של בגרות39,40.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין אינטרסים מתחרים.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) (R01- NS115947 הוענק F. Hoerndli). ברצוננו להודות גם לד"ר אטילה סטק על פלסמיד pAS1.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100x/1.40 Oil objective   Olympus   UPlanSApo
10x/0.40 Objective  Olympus   UPlanSApo
22 mm x 22 mm Cover glass  VWR  48366-227 
Agarose SFR  VWR  J234-100G 
Beam homogenizer Andor Technologies Borealis upgrade to CSU-X1
CleanBench laboratory table  TMC  With vibration control
Disposable culture tubes VWR  47729-572  13 mm x 100 mm
Environmental chamber Thermo Scientific 3940 Set to 20 °C
Filter wheel or slider ASI For 25 mm diameter filters
FJH 185 Caenorhabditis Genetics Center  FJH 185 Worm strain
FJH 597 Caenorhabditis Genetics Center FJH 597 Worm strain
GFP bandpass emission filter  Chroma  525 ± 50 nm (25 mm diameter)
ILE laser combiner  Andor Technologies  4 laser lines 
ILE solid state 488 nm laser Andor Technologies  50 mW
ImageJ National Institutes of Health Version 1.52a
IX83 Spinning disk confocal microscope  Olympus  With Yokogawa CSU-X1 spinning disc
iXon Ultra EMCCD camera  Andor Technologies 
Low auto-fluorescence immersion oil  Olympus  Z-81226
MetaMorph  Molecular Devices  Version 7.10.1 
Microscope control box Olympus IX3-CBH
Muscimol  MP Biomedical / Sigma 02195336-CF 
pAS1 AddGene 194970 Plasmid
pBSKS Stratagene
pCT61 Plasmid available from Hoerndli/Maricq lab upon request
pJM23 Plasmid available from Hoerndli/Maricq lab upon request
pKK1  AddGene  194969 Plasmid
Polybead microspheres  Polysciences Inc.  00876-15  0.094 µm
Stability chamber Norlake Scientific NSRI241WSW/8H Set to 15 °C
Stage controller ASI With filter wheel control
Standard microscope slide Premiere 9108W-E 75 mm x 25 mm x 1 mm
Touch panel controller Olympus I3-TPC
Z-drift corrector  Olympus  IX3-ZDC2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Berridge, M. J. Neuronal calcium signaling. Neuron. 21 (1), 13-26 (1998).
  2. Brini, M., Calì, T., Ottolini, D., Carafoli, E. Neuronal calcium signaling: Function and dysfunction. Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (15), 2787-2814 (2014).
  3. Brini, M., Calì, T., Ottolini, D., Carafoli, E. Intracellular calcium homeostasis and signaling. Metal Ions in Life Sciences. 12, 119-168 (2013).
  4. Berridge, M. J. The inositol trisphosphate/calcium signaling pathway in health and disease. Physiological Reviews. 96 (4), 1261-1296 (2016).
  5. Schrank, S., Barrington, N., Stutzmann, G. E. Calcium-handling defects and neurodegenerative disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 12 (7), 035212 (2020).
  6. Pchitskaya, E., Popugaeva, E., Bezprozvanny, I. Calcium signaling and molecular mechanisms underlying neurodegenerative diseases. Cell Calcium. 70, 87-94 (2018).
  7. Jadiya, P., et al. Impaired mitochondrial calcium efflux contributes to disease progression in models of Alzheimer's disease. Nature Communications. 10 (1), 3885 (2019).
  8. Zeiser, E., Frøkjær-Jensen, C., Jorgensen, E., Ahringer, J. MosSCI and gateway compatible plasmid toolkit for constitutive and inducible expression of transgenes in the C. elegans germline. PLoS One. 6 (5), 20082 (2011).
  9. Zhu, B., Cai, G., Hall, E. O., Freeman, G. J. In-FusionTM assembly: Seamless engineering of multidomain fusion proteins, modular vectors, and mutations. Biotechniques. 43 (3), 354-359 (2007).
  10. Evans, T. C. Transformation and Microinjection. WormBook. , (2006).
  11. Giordano-Santini, R., Dupuy, D. Selectable genetic markers for nematode transgenesis. Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (11), 1917-1927 (2011).
  12. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , (2006).
  13. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans: Transferring worms grown on NGM plates. WormBook. , (2006).
  14. Ogama, T. A beginner's guide to improving image acquisition in fluorescence microscopy. The Biochemist. 42 (6), 22-27 (2020).
  15. Mellem, J. E., Brockie, P. J., Madsen, D. M., Maricq, A. v Action potentials contribute to neuronal signaling in C. elegans. Nature Neuroscience. 11 (8), 865-867 (2009).
  16. Zhang, Y., et al. Fast and sensitive GCaMP calcium indicators for imaging neural populations. bioRxiv. , (2021).
  17. Kerruth, S., Coates, C., Dürst, C. D., Oertner, T. G., Török, K. The kinetic mechanisms of fast-decay red-fluorescent genetically encoded calcium indicators. Journal of Biological Chemistry. 294 (11), 3934-3946 (2019).
  18. de Juan-Sanz, J., et al. Axonal endoplasmic reticulum Ca2+ content controls release probability in CNS nerve terminals. Neuron. 93 (4), 867-881 (2017).
  19. Bhatla, N. C. elegans neural network. , Available from: http://wormweb.org/neurainet#c=BAG&m=1 (2014).
  20. Fung, W., Wexler, L., Heiman, M. G. Cell-type-specific promoters for C. elegans glia. Journal of Neurogenetics. 34 (3-4), 335-346 (2020).
  21. Ali, F., Kwan, A. C. Interpreting in vivo calcium signals from neuronal cell bodies, axons, and dendrites: a review. Neurophotonics. 7 (1), 011402 (2019).
  22. Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
  23. Mank, M., et al. A genetically encoded calcium indicator for chronic in vivo two-photon imaging. Nature Methods. 5 (9), 805-811 (2008).
  24. Birkner, A., Tischbirek, C. H., Konnerth, A. Improved deep two-photon calcium imaging in vivo. Cell Calcium. 64, 29-35 (2017).
  25. Ryan, K. C., Laboy, J. T., Norman, K. R. Deregulation of mitochondrial calcium handling due to presenilin loss disrupts redox homeostasis and promotes neuronal dysfunction. Antioxidants. 11 (9), 1642 (2022).
  26. Yang, H. H., et al. Subcellular imaging of voltage and calcium signals reveals neural processing in vivo. Cell. 166 (1), 245-257 (2016).
  27. Takahashi, N., Oertner, T. G., Hegemann, P., Larkum, M. E. Active cortical dendrites modulate perception. Science. 354 (6319), 1587-1590 (2016).
  28. Nicoletti, M., et al. Biophysical modeling of C. elegans neurons: Single ion currents and whole-cell dynamics of AWCon and RMD. PLoS One. 14 (7), 0218738 (2019).
  29. Church, P. J., Stanley, E. F. Single L-type calcium channel conductance with physiological levels of calcium in chick ciliary ganglion neurons. The Journal of Physiology. 496, 59-68 (1996).
  30. O'Hare, J. K., et al. Compartment-specific tuning of dendritic feature selectivity by intracellular Ca 2+ release. Science. 375 (6586), (2022).
  31. Mclntire, S. L., Jorgensen, E., Horvitz, H. R. Genes required for GABA function in Caenorhabditis elegans. Nature. 364 (6435), 334-337 (1993).
  32. Doser, R. L., Amberg, G. C., Hoerndli, F. J. Reactive oxygen species modulate activity-dependent AMPA receptor transport in C. elegans. The Journal of Neuroscience. 40 (39), 7405-7420 (2020).
  33. Wu, J., et al. A long Stokes shift red fluorescent Ca2+ indicator protein for two-photon and ratiometric imaging. Nature Communications. 5, 5262 (2014).
  34. Cho, J. -H., et al. The GCaMP-R family of genetically encoded ratiometric calcium indicators. ACS Chemical Biology. 12 (4), 1066-1074 (2017).
  35. Smith, J. J., et al. A light sheet fluorescence microscopy protocol for Caenorhabditis elegans larvae and adults. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 1012820 (2022).
  36. Müller, M., et al. Mitochondria and calcium regulation as basis of neurodegeneration associated with aging. Frontiers in Neuroscience. 12, 470 (2018).
  37. Nikoletopoulou, V., Tavernarakis, N. Calcium homeostasis in aging neurons. Frontiers in Genetics. 3, 200 (2012).
  38. Chen, C. -H., Chen, Y. -C., Jiang, H. -C., Chen, C. -K., Pan, C. -L. Neuronal aging: Learning from C. elegans. Journal of Molecular Signaling. 8 (1), 14 (2013).
  39. Saberi-Bosari, S., Huayta, J., San-Miguel, A. A microfluidic platform for lifelong high-resolution and high throughput imaging of subtle aging phenotypes in C. elegans. Lab on a Chip. 18 (20), 3090-3100 (2018).
  40. Sridhar, N., Fajrial, A. K., Doser, R. L., Hoerndli, F. J., Ding, X. Surface acoustic wave microfluidics for repetitive and reversible temporary immobilization of C. elegans. Lab on a Chip. 22 (24), 4882-4893 (2022).

Tags

מדעי המוח גיליון 193
הדמיה תת-תאית של טיפול <em>בסידן עצבי ב-Vivo</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Doser, R., Knight, K. M., Deihl, E., … More

Doser, R., Knight, K. M., Deihl, E., Hoerndli, F. Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo. J. Vis. Exp. (193), e64928, doi:10.3791/64928 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter