Summary
I metodi attuali descrivono un approccio non raziometrico per l'imaging subcompartimentale del calcio ad alta risoluzione in vivo in Caenorhabditis elegans utilizzando indicatori di calcio geneticamente codificati prontamente disponibili.
Abstract
L'imaging del calcio (Ca 2+) è stato ampiamente utilizzato per esaminare l'attività neuronale, ma sta diventando sempre più chiaro che la manipolazione subcellulare di Ca2+ è una componente cruciale della segnalazione intracellulare. La visualizzazione della dinamica subcellulare di Ca2+ in vivo, dove i neuroni possono essere studiati nei loro circuiti nativi e intatti, si è dimostrata tecnicamente impegnativa nei sistemi nervosi complessi. La trasparenza e il sistema nervoso relativamente semplice del nematode Caenorhabditis elegans consentono l'espressione cellula-specifica e la visualizzazione in vivo di tag e indicatori fluorescenti. Tra questi ci sono indicatori fluorescenti che sono stati modificati per l'uso nel citoplasma e vari compartimenti subcellulari, come i mitocondri. Questo protocollo consente l'imaging non raziometrico di Ca 2+ in vivo con una risoluzione subcellulare che consente l'analisi della dinamica di Ca2+ fino al livello delle singole spine dendritiche e dei mitocondri. Qui, due indicatori geneticamente codificati disponibili con diverse affinità Ca 2+ sono utilizzati per dimostrare l'uso di questo protocollo per misurare i livelli relativi di Ca2+ all'interno del citoplasma o della matrice mitocondriale in una singola coppia di interneuroni eccitatori (AVA). Insieme alle manipolazioni genetiche e alle osservazioni longitudinali possibili in C. elegans, questo protocollo di imaging può essere utile per rispondere a domande su come la manipolazione di Ca2+ regola la funzione neuronale e la plasticità.
Introduction
Gli ioni calcio (Ca2+) sono vettori altamente versatili di informazioni in molti tipi di cellule. Nei neuroni, Ca2+ è responsabile del rilascio dipendente dall'attività dei neurotrasmettitori, della regolazione della motilità citoscheletrica, della messa a punto dei processi metabolici, nonché di molti altri meccanismi necessari per il corretto mantenimento e funzione neuronale 1,2. Per garantire un'efficace segnalazione intracellulare, i neuroni devono mantenere bassi i livelli basali di Ca2+ nel loro citoplasma3. Ciò è ottenuto da meccanismi di manipolazione cooperativa di Ca 2+, incluso l'assorbimento di Ca2+ in organelli come il reticolo endoplasmatico (ER) e i mitocondri. Questi processi, oltre alla disposizione dei canali ionici permeabili al Ca 2+ nella membrana plasmatica, determinano livelli eterogenei di Ca2+ citoplasmatico in tutto il neurone.
L'eterogeneità di Ca 2+ durante il riposo e l'attivazione neuronale consente la regolazione diversificata e specifica della posizione dei meccanismi dipendenti da Ca2+ 1. Un esempio degli effetti specifici della concentrazione di Ca 2+ è il rilascio di Ca2+ dall'ER attraverso i recettori dell'inositolo 1,4,5-trisfosfato (InsP3). Bassi livelli di Ca2+ in combinazione con InsP3 sono necessari per l'apertura del poro permeabile al calcio del recettore. In alternativa, alti livelli di Ca2+ inibiscono direttamente e indirettamente il recettore4. L'importanza dell'omeostasi del Ca 2+ per la corretta funzione neuronale è supportata da prove che suggeriscono che la manipolazione e la segnalazione intracellulare di Ca2+ è un passo iniziale nella patogenesi dei disturbi neurodegenerativi e dell'invecchiamento naturale 5,6. In particolare, l'assorbimento e il rilascio anormali di Ca2+ da parte dell'ER e dei mitocondri sono legati all'insorgenza di disfunzioni neuronali nella malattia di Alzheimer, nel morbo di Parkinson e nella malattia di Huntington 6,7.
Lo studio della disomeostasi di Ca 2+ durante l'invecchiamento naturale o la neurodegenerazione richiede l'osservazione longitudinale dei livelli di Ca2+ con risoluzione subcellulare in un organismo vivente e intatto in cui viene mantenuta l'architettura cellulare nativa (cioè la disposizione delle sinapsi e la distribuzione dei canali ionici). A tal fine, questo protocollo fornisce indicazioni sull'uso di due sensori Ca 2+ codificati geneticamente disponibili per la registrazione delle dinamiche Ca2+ in vivo con elevata risoluzione spaziale e temporale. I risultati rappresentativi acquisiti utilizzando il metodo descritto in C. elegans dimostrano come l'espressione di indicatori di Ca 2+ nel citoplasma o nella matrice mitocondriale di singoli neuroni possa consentire la rapida acquisizione di immagini fluorescenti (fino a 50 Hz) che illustrano la dinamica di Ca 2+ con la capacità aggiuntiva di discernere i livelli di Ca 2+ all'interno di singole strutture simili a spine e singoli mitocondri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Creazione di ceppi transgenici
- Utilizzando un metodo di clonazione a scelta8,9, clonare vettori di espressione per contenere il promotore Pflp-18 o Prig-3 (per il segnale specifico AVA nel cordone nervoso ventrale), seguito dall'indicatore di scelta Ca2+, e quindi un 3' UTR (vedere la discussione per maggiori informazioni)10. Un elenco dei plasmidi e delle loro fonti può essere trovato nella Tabella supplementare 1.
- Seguire il protocollo stabilito per la creazione di ceppi transgenici tramite microiniezione di un mix di DNA (<100 ng/μL; vedere la Tabella supplementare 1 per le concentrazioni di ciascun plasmide) contenente il transgene indicatore Ca2+ (~20 ng/μL) e il DNA di salvataggio lin-15+ (marcatore di selezione) nella gonade di un adulto di 1 giorno C. elegans10 (genotipo: LIN-15 (N765TS); fenotipo: multi-vulva)10,11.
NOTA. Mantenere i genitori lin-15 (n765ts) a 15 °C per sopprimere la mutazione sensibile alla temperatura. - Mantenere i genitori iniettati a 20 °C fino a quando la progenie F1 raggiunge l'età adulta per consentire la selezione transgenica utilizzando l'assenza del fenotipo multi-vulva.
- Passaggio clonale13 progenie adulta F1 che non ha il fenotipo multi-vulva in quanto ciò indica l'espressione dell'array extracromosomico contenente l'indicatore Ca2+ 11.
- Valutare l'espressione dell'indicatore Ca2+ nella progenie F2 o F3 che non ha il fenotipo multi-vulva montando e riprendendo gli adulti di 1 giorno come descritto più avanti nel paragrafo 3.
NOTA. Un'espressione relativamente alta dell'indicatore è necessaria per l'acquisizione rapida delle immagini come descritto qui (vedere la discussione per maggiori dettagli). - Eseguire esperimenti sulle generazioni successive dei ceppi transgenici con un'espressione ottimale dell'indicatore Ca 2+ (vedere la discussione per maggiori dettagli), mantenendo i ceppi in condizioni standard (20 °C su piastre NGM)12.
2. Configurazione ottica
- Utilizzare un microscopio in grado di imaging time-lapse a lungo termine.
NOTA. I dati rappresentativi sono stati acquisiti utilizzando un microscopio confocale a disco rotante invertito dotato di laser di eccitazione a 488 nm e 561 nm. - Utilizzare un obiettivo a basso ingrandimento (cioè 10x/0,40) per la localizzazione approssimativa del worm.
- Per ottenere la risoluzione subcellulare, passare e localizzare i neuroni utilizzando un obiettivo ad alto ingrandimento.
NOTA. Un obiettivo di olio 100x/1.40 NA è stato utilizzato per acquisire i dati rappresentativi in questo studio. - Acquisisci le immagini utilizzando una fotocamera ultrasensibile in grado di acquisire rapidamente le immagini (>50 fps).
- Utilizzare un filtro di emissione standard per l'indicatore di scelta Ca2+ (ad esempio, un filtro di emissione da 525 nm ± 50 nm per GCaMP6f e mitoGCaMP).
- Aggiungere un correttore Z-drift (ZDC) per l'acquisizione di flussi di immagini più lunghi di 10 s, poiché l'essiccazione del pad di agar durante la sessione di imaging fa sì che il neurite vada fuori fuoco in pochi secondi.
NOTA. Se una configurazione al microscopio non consente ZDC o se si desiderano lunghi periodi di imaging (>20 minuti), applicare un bordo di grasso al silicio o vaselina fusa attorno al tampone di agar per rallentare l'essiccazione.
3. Preparazione di vermi per l'imaging
- Preparazione dei cuscinetti di agar
- Produrre 3 ml di agar al 10% sciogliendo l'agar di grado molecolare in M912 in un tubo di coltura di vetro da 13 mm x 100 mm e cuocendo al microonde per diversi secondi (vedere Tabella dei materiali).
NOTA. L'agar fuso può essere conservato su un blocco termico per un massimo di 1 ora o può essere reso fresco ogni volta che sono necessari cuscinetti di agar. - Posizionare un vetrino da microscopio tra due vetrini aggiuntivi che hanno ciascuno due strati di nastro da laboratorio (vedere Figura 1A-i).
- Tagliare la punta di una punta di pipetta da 1.000 μL (senza filtro) e utilizzarla per pipettare una piccola goccia di agar sul coperchio centrale (Figura 1A-i).
- Appiattire l'agar premendo un altro scorrimento verso il basso sulla parte superiore dell'agar (Figura 1A-ii).
- Dopo il raffreddamento, tagliare l'agar in un piccolo disco usando l'apertura di un tubo di coltura di vetro di 13 mm x 100 mm (Figura 1A-iii), quindi rimuovere l'agar circostante.
- Produrre 3 ml di agar al 10% sciogliendo l'agar di grado molecolare in M912 in un tubo di coltura di vetro da 13 mm x 100 mm e cuocendo al microonde per diversi secondi (vedere Tabella dei materiali).
- Preparazione della soluzione di laminazione della vite senza fine
- Sciogliere la polvere di muscimolo in M9 per creare un brodo di 30 mM. Separare in aliquote da 50 μL e conservare a 4 °C.
- Scongelare una nuova aliquota di 30 mM di muscimolo ogni 3-5 giorni (e conservare a 20 °C durante l'uso).
- Diluire un brodo di muscimolo da 30 mM in rapporto 1:1 con perle di polistirolo per ottenere la soluzione di laminazione.
- Posizionamento di un worm per l'imaging
- Introdurre 1,6 μL della soluzione di laminazione al centro del tampone di agar.
NOTA: la quantità di liquido deve essere regolata per l'imaging degli animali più giovani (meno) o più anziani (più). - Utilizzando il plettro a vite senza fine preferito (cioè un plettro di filo di vetro o di platino)13, trasferire un verme dell'età desiderata senza il fenotipo multi-vulva11 nella soluzione di laminazione sul tampone di agar (Figura 1A-iv).
NOTA. I dati rappresentativi provengono da ermafroditi di 1 giorno (ceppo GCaMP6f = FJH185; ceppo mitoGCaMP; FJH597; cfr. tabella supplementare 1), che può essere identificata dalla presenza di una sola fila di uova. Vedere la discussione per maggiori dettagli su come lavorare con vermi di età diverse. - Attendere ~ 5 minuti affinché il muscimolo riduca il movimento del verme, quindi rilasciare una copertina di 22 mm x 22 mm sulla parte superiore del cuscinetto di agar, limitando fisicamente il movimento del verme.
- Per l'imaging dei neuriti nel cordone nervoso ventrale, far rotolare il verme nell'orientamento mostrato nella Figura 1B,C facendo scorrere leggermente il vetrino di copertura.
NOTA. Per visualizzare il cordone nervoso ventrale, posizionare il verme con la testa verso l'alto e far rotolare il verme fino a quando l'intestino si trova sul lato destro della porzione prossimale e a sinistra per la porzione distale del verme (dal punto di vista dello spettatore). Invertire questo orientamento (Figura 1C) per l'imaging dei neuriti nel cordone nervoso dorsale.
- Introdurre 1,6 μL della soluzione di laminazione al centro del tampone di agar.
- Montaggio del verme su un microscopio
- Posizionare una goccia di olio ad immersione sul vetrino prima di montarlo sul palco del microscopio.
- Trova il worm usando un obiettivo a basso ingrandimento (10x) in campo chiaro.
- Passa all'obiettivo 100x e regola la messa a fuoco.
- Localizzare il neurite AVA utilizzando l'illuminazione di GCaMP o mitoGCaMP con il laser di imaging a 488 nm.
NOTA: utilizzare piccole regolazioni per evitare di schiacciare il worm o di togliere il coperchio.
4. Acquisizione di flussi di immagini ad alta risoluzione
- In vivo Imaging GCaMP
- Impostare il tempo di esposizione su 20 ms.
- Regolare le impostazioni del laser di imaging e dell'acquisizione fino a quando la fluorescenza basale GCaMP è nella gamma media della gamma dinamica14 della termocamera. Fare riferimento alla discussione per suggerimenti sull'ottimizzazione dei parametri di imaging utilizzando altre configurazioni di microscopia.
NOTA. Per la configurazione ottica utilizzata in questo studio, impostare il laser di imaging a 488 nm sulle seguenti impostazioni di uscita: potenza laser = 50% e attenuazione = 1. Modificare le impostazioni di acquisizione aggiuntive come segue: guadagno EM = 200 e guadagno preamplificatore = 1. - Dopo aver localizzato il neurite AVA utilizzando la fluorescenza GCaMP con ingrandimento 100x, impostare lo ZDC (vedere Tabella dei materiali) su un intervallo di ±30 μm e avviare l'autofocus continuo. Correggere manualmente il piano focale in base alle esigenze prima di eseguire l'imaging.
- Acquisisci un flusso di immagini con un ingrandimento di 100x. Durate fino a 10 minuti possono essere raggiunte con la configurazione utilizzata in questo studio.
- Imaging mitoGCaMP in vivo
- Seguire i passaggi 4.1.1-4.1.2 secondo necessità per acquisire la fluorescenza basale mitoGCaMP nella gamma media per la gamma dinamica14 della telecamera.
NOTA. Per la configurazione ottica utilizzata in questo studio, impostare il laser di imaging a 488 nm sulle seguenti impostazioni di uscita: potenza laser = 20% e attenuazione = 10. Modificare le impostazioni di acquisizione come segue: guadagno EM = 100 e guadagno preamplificatore = 2. - Dopo che i mitocondri nel neurite AVA sono stati localizzati utilizzando la fluorescenza mitoGCaMP, impostare lo ZDC come descritto sopra nel passaggio 3.3.
- Acquisisci un flusso di immagini con un ingrandimento di 100x.
- Seguire i passaggi 4.1.1-4.1.2 secondo necessità per acquisire la fluorescenza basale mitoGCaMP nella gamma media per la gamma dinamica14 della telecamera.
5. Analisi del flusso di immagini
- Aprire il flusso di immagini in un software di immagine appropriato per analizzare i valori dei pixel in una serie di immagini (vedere Tabella dei materiali).
- Utilizzando lo strumento Selezione poligono , definire la regione subcellulare di interesse (ROI) contenente GCaMP o mitoGCaMP.
- Fai clic su Analizza > Tools > ROI Manager. In Gestione ROI, fai clic su Aggiungi e quindi su Altro > Multimisura. Nella finestra Multi misura, fate clic su OK per raccogliere automaticamente le intensità di pixel medie, minime e massime del ROI definito sopra per ogni fotogramma del flusso di immagini per ulteriori analisi.
NOTA. Si consiglia di normalizzare l'intensità media dei pixel (F avg) all'intensità minima (F min) per ciascun ROI utilizzando il rapporto Favg/Fmin per tenere conto delle differenze di fluorescenza dovute al posizionamento nel piano z. Scartare i flussi di immagini con il movimento del verme durante l'imaging poiché ciò influenzerebbe anche le misurazioni della fluorescenza.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Questi due protocolli consentono la rapida acquisizione di livelli differenziali di Ca2+ all'interno delle regioni subcellulari e degli organelli dei singoli neuriti in vivo con elevata risoluzione spaziale. Il primo protocollo consente la misurazione del Ca 2+ citoplasmatico con elevata risoluzione temporale e spaziale. Ciò è dimostrato qui utilizzando l'espressione cellula-specifica di GCaMP6f negli interneuroni15 del comando glutammatergico AVA, i cui neuriti percorrono l'intera lunghezza del cordone nervoso ventrale. La rapida acquisizione della fluorescenza GCaMP6f (50 Hz) ha permesso di rilevare la propagazione direzionale dell'afflusso di Ca 2+ (Figura 2A e Video Supplementare 1). La quantificazione subcellulare della fluorescenza GCaMP6f ha rivelato che l'insorgenza dell'afflusso di Ca 2+ è stata ritardata in una porzione del neurite a soli 10 μm di distanza (Figura 2B). Inoltre, questo protocollo ha permesso diverse osservazionidi eventi compartimentati di Ca 2+ e Ca2+ sottosoglia. Ad esempio, le strutture dendritiche simili a spine trovate lungo il neurite AVA sono state viste avere lampi nella fluorescenza GCaMP6f che si sono verificati indipendentemente dall'attivazione dei neuriti e non hanno portato a una propagazione dell'afflusso di Ca 2+ (Figura 2C, D e Video supplementare 2).
Il secondo protocollo mirava a misurare rapidamente i livelli relativi di Ca2+ nei singoli mitocondri in singoli neuriti. L'utilizzo di un ceppo di verme con espressione specifica AVA dell'indicatore Ca2+ localizzato della matrice mitoGCaMP ha permesso la rapida rilevazione di cambiamenti nella fluorescenza di mitoGCaMP a livello dei singoli mitocondri all'interno del neurite AVA. Questo protocollo di imaging ha rivelato diverse modalità di assorbimento di Ca2+ nei mitocondri, almeno in questo neurone. In primo luogo, i risultati mostrati nella Figura 3A forniscono un esempio dell'assorbimento sincrono di una quantità relativamente grande di Ca2+ in un sottogruppo di mitocondri. Più specificamente, questi dati hanno rivelato che l'assorbimento di Ca2+ in alcuni mitocondri era sincronizzato (Mito1 e Mito2; Figura 3A,B e Video supplementare 3), mentre i mitocondri vicini non sembrano assorbire Ca2+ (Mito3; Figura 3A,B). Allo stesso modo, sottogruppi di mitocondri sono stati visti assorbire rapidamente e rilasciare piccole quantità di Ca2+. Anche questo sembrava essere sincrono (Mito1 e Mito3, Figura 3C, D e Video supplementare 4), ma ancora una volta solo per un sottoinsieme di mitocondri (Mito 2, Figura 3C, D).
Figura 1: Montaggio e rotolamento di C. elegans per l'imaging del cordone nervoso ventrale. (A) Un'illustrazione delle fasi di preparazione delle pastiglie di agar e di raccolta di un singolo verme in una soluzione di laminazione. (B) Un esempio di posizione di un verme prima di essere riposizionato per l'imaging. La freccia rossa indica la necessità di un rotolo verso destra del verme, che può essere ottenuto facendo scorrere il coprislip verso destra (freccia blu). Barra di scala = 50 μm. (C) L'orientamento corretto necessario per visualizzare il cordone nervoso ventrale. Nota: l'intestino si trova sul lato destro dello spettatore (usando un microscopio verticale) nella metà prossimale ed è quindi sul lato sinistro nella metà distale. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Rapida acquisizione della fluorescenza GCaMP6f con risoluzione subcellulare nei neuriti AVA e nelle strutture simili alla colonna vertebrale. (A) Immagini rappresentative della fluorescenza GCaMP6f alla biforcazione dei neuriti AVAL e AVAR. Barra della scala = 5 μm. (B) Quantificazione della fluorescenza GCaMP6f normalizzata alla fluorescenza minima (F) per quella regione (Fmin) per le regioni prossimale (arancione) e distale (blu) definite nell'immagine in basso nel pannello A. (C) Immagini rappresentative della fluorescenza GCaMP6f a una proiezione simile a una colonna vertebrale nel neurite AVA. (D) Fluorescenza normalizzata GCaMP6f nel neurite (arancione) e proiezione simile alla colonna vertebrale (blu) dalle regioni corrispondenti nell'immagine in basso del pannello C. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Imaging rapido dell'assorbimento del calcio nei singoli mitocondri all'interno del neurite AVA. (A,C) Immagini rappresentative della fluorescenza di mitoGCaMP nel tempo. Barra di scala = 50 μm. (B) Tracce di fluorescenza GCaMP normalizzata (F/F min) per i mitocondri corrispondenti mostrati nell'immagine in basso del pannello A. (D) F/Fmin oltre 40 s di imaging nelle regioni evidenziate nell'immagine in basso nel pannello C. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Video supplementare 1: Fluorescenza GCaMP6f nella neurite AVA. Il video è stato renderizzato a velocità 2x. Barra della scala = 5 μm. Clicca qui per scaricare questo video.
Video supplementare 2: Fluorescenza GCaMP6f in una proiezione simile a una colonna vertebrale sul neurite AVA. Il video è stato renderizzato a velocità 2x. Barra della scala = 5 μm. Clicca qui per scaricare questo video.
Video supplementare 3: Fluorescenza di MitoGCaMP nell'assorbimento del calcio mitocondriale sincronizzato con i neuriti AVA. Il video è stato renderizzato a velocità 4x. Barra della scala = 5 μm. Clicca qui per scaricare questo video.
Video supplementare 4: Fluorescenza MitoGCaMP nel neurite AVA: rapido assorbimento e rilascio di calcio da parte dei mitocondri. Il video è stato renderizzato a velocità 4x. Barra della scala = 5 μm. Clicca qui per scaricare questo video.
Tabella supplementare 1: Reagenti genetici e ceppi utilizzati in questo studio. Clicca qui per scaricare questo file.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
La prima considerazione quando si implementa il metodo descritto comporta la selezione di un indicatore Ca2+ con caratteristiche ideali per la domanda di ricerca data. Gli indicatori citoplasmatici di Ca 2+ hanno tipicamente un'alta affinità per Ca 2+ e la sensibilità di questi indicatori a Ca 2+ è inversamente correlata alla cinetica (on/off rate)16,17. Ciò significa che la sensibilità o la cinetica di Ca2+ dovranno essere prioritarie in base al fenomeno di interesse. Per i compartimenti subcellulari con livelli basali diCa 2+ relativamente elevati, come l'ER, gli indicatori di Ca 2+ con bassa affinità di Ca2+ dovrebbero essere considerati18. Per generare DNA ricombinante per l'espressione cellulo-specifica di un indicatore Ca 2+, la tecnica di clonazione preferita dovrebbe essere utilizzata per inserire un promotore cellulo-specifico19,20 seguito dall'indicatore di scelta Ca 2+ e da un UTR 3'. Livelli di espressione relativamente elevati nei neuroni AVA possono essere raggiunti costruendo un plasmide con i promotori Pflp-18 o Prig-3, un let-858 o unc-54 3' UTR e microiniettando questo plasmide a 15-25 ng / μL (vedi Tabella supplementare 1).
La microiniezione riuscita dei plasmidi contenenti l'indicatore Ca 2+ e lin-15+ nella gonade dei vermi mutanti lin-15 (n765ts) produrrà una progenie F1 che esprime l'indicatore Ca 2+ e viene salvata per il fenotipo multi-vulva. Solo un sottoinsieme (30%-80%) della generazione F1 trasmetterà il DNA sintetico alla generazione F2. L'espressione dell'indicatore Ca2+ deve essere valutata nella progenie F2 o F3 salvata su piastre con trasmissione del <60% del DNA sintetico montando e visualizzando la fluorescenza in adulti di 1 giorno che vengono salvati per il fenotipo multi-vulva. Il livello di espressione ideale è determinato in base alle proprietà e alla posizione dell'indicatore Ca2+, nonché alla domanda biologica. Se si desidera un'acquisizione rapida dell'immagine, l'espressione relativamente alta è l'ideale. Tuttavia, è stato scoperto che un'espressione estremamente elevata di indicatori Ca2+ causa una cattiva localizzazione subcellulare, nonché un'espressione non specifica in altre cellule o tessuti.
Gli indicatori Ca 2+ geneticamente codificati sono stati ampiamente utilizzati per analisi in vivo di Ca2+ in C. elegans, così come in altri organismi modello. Alcuni di questi studi hanno raggiunto il monitoraggio della risoluzione di singole cellule dei livelli di Ca 2+ nel corpo delle cellule neuronali21,22,23,24. Le misurazioni dell'afflusso di Ca 2+ nei sottocompartimenti neuronali sono state ottenute in vivo in C. elegans e nei sistemi vertebrati, ma solo registrando l'attività dell'indicatore Ca 2+ in un intero neurite25,26 o popolazioni di dendriti 27. Sebbene la misurazione dell'attività di Ca 2+ nei corpi cellulari neuronali e nei dendriti nel loro complesso rifletta l'attività di spiking della cellula, non consente l'osservazione della dinamica dell'afflusso di Ca2+ (cioè la direzione o la velocità di propagazione) o dei transitori Ca2+ sotto soglia. Pochi studi in vivo sono stati in grado di discernere la manipolazione di Ca2+ nei neuroni per la risoluzione spaziale e temporale dimostrata qui. Va notato che la dinamica temporale dell'afflusso di Ca 2+ nella maggior parte dei neuroni C. elegans 28 sembra essere più lenta rispetto ai neuroni vertebrati29, quindi è probabile che questo protocollo di imaging rapido sarebbe insufficiente per catturare dinamiche temporali simili nei sistemi vertebrati. Tuttavia, i recenti progressi nella microscopia a due fotoni consentono l'imaging subcellulare ultraveloce (120 Hz) del calcio nei singoli dendriti ippocampali nei topi che si comportano liberamente30, che fornisce la promessa di ottenere un simile imaging Ca2+ ad alta risoluzione nei vertebrati.
È importante notare che questo approccio non raziometrico all'imaging in vivo di Ca2+ richiede l'uso di muscimol, che inibisce la contrazione dei muscoli della parete corporea, limitando così il movimento del verme durante l'imaging31. Se c'è un movimento eccessivo durante l'imaging (movimento costante in più di ~ 20% dei vermi), una nuova soluzione di laminazione dovrebbe essere fatta con un'aliquota appena scongelata di muscimolo, e il tempo per il quale un verme si bagna nella soluzione di laminazione prima di laminazione deve essere esteso. Muscimol è un agonista del recettore GABA, il che significa che inibisce i neuroni GABAergici, compresi quelli che forniscono input ai neuroni AVA. Inoltre, molti neuroni eccitatori, tra cui AVA, esprimono bassi livelli di recettori GABA, quindi è probabile che l'uso di muscimol in questo protocollo diminuisca l'attività neuronale. Tuttavia, utilizzando questo protocollo, l'attivazione spontanea complessiva di AVA è ridotta solo di ~ 29% in presenza di muscimolo (dati non pubblicati). L'attivazione di altri neuroni può essere più drasticamente diminuita dal muscimolo, e questo può essere testato sostituendo muscimolo per M9 nella soluzione di rotolamento e conducendo l'imaging nel corpo cellulare neuronale a basso ingrandimento32. Un'alternativa all'uso del muscimol sarebbe quella di utilizzare un indicatore raziometrico Ca2+ 33,34, che consentirebbe la correzione della fluorescenza dovuta al movimento del verme. Lo svantaggio di questo approccio è che richiede una configurazione ottica in grado di imaging a doppia lunghezza d'onda e limita la capacità di utilizzare un indicatore Ca2+ in combinazione con molti altri strumenti fluorescenti.
Uno dei principali limiti del sistema di microscopia descritto è la riduzione della luce emessa dal disco rotante, che si traduce in una perdita di informazioni. Questo sistema potrebbe essere modificato per consentire una maggiore cattura della luce emessa implementando un disco con fori di perno di diametro maggiore. Tuttavia, questa alterazione diminuirebbe la risoluzione assiale (piano z) e aumenterebbe la fluorescenza di fondo. Un'altra possibile configurazione della microscopia per questo scopo sarebbe il microscopio a foglio di luce a scansione rapida, che è stato migliorato negli ultimi anni per consentire immagini rapide (fino a 50 Hz) in situ e in vivo35.
La valutazione della dinamica spaziotemporale del Ca 2+ citoplasmatico e mitocondriale consentirà una migliore comprensione di come i transitori locali di Ca2+, e persino gli eventi sottosoglia, possano innescare la segnalazione calcio-dipendente o modulare la biologia mitocondriale. Questo imaging subcellulare in vivo di Ca2+ potrebbe essere particolarmente utile per lo studio della plasticità sinaptica, dei cambiamenti dipendenti dall'attività nel metabolismo neuronale e della modulazione omeostatica dell'eccitabilità neuronale. Ulteriori indagini su come gli ambienti subcellulari locali si adattano attorno a stati definiti di attività neuronale (cioè concentrazioni spazialmente specifiche e durata di vita di Ca 2+) fornirebbero informazioni su come la disomeostasi di Ca2+ porti a cambiamenti patogeni nella funzione neuronale. La capacità di studiare questo in un organismo vivente e intatto è particolarmente utile in quanto consente studi longitudinali che farebbero luce su come e perché l'omeostasi di Ca2+ cambia con l'invecchiamento naturale e la neurodegenerazione correlata alla malattia. L'applicazione di questo metodo per studiare l'invecchiamento e la neurodegenerazione è in qualche modo limitata alle prime età biologiche in C. elegans (<4 giorni dell'età adulta). In effetti, la manipolazione fisica durante il montaggio e il posizionamento dei vermi per l'imaging è difficile dopo circa 5 giorni di età adulta quando i vermi diventano flaccidi a causa della diminuzione del tono muscolare e dell'integrità della cuticola.
L'imaging rapido in vivo della dinamica e della manipolazione subcellulare di Ca2+ sarà determinante per comprendere come l'eccitabilità neuronale e la segnalazione intracellulare siano finemente regolate spazialmente e temporalmente. Questo protocollo potrebbe avvantaggiare una vasta gamma di ricercatori e ricercatori in molte aree a causa della diversità dei processi dipendenti da Ca2+ e del loro ruolo centrale nella funzione neuronale. Ad esempio, l'applicazione di questo metodo nei neuroni sani fornirebbe informazioni sul motivo per cui l'elevatoCa 2+ citoplasmatico durante l'invecchiamento si verifica in concomitanza con menomazioni nella plasticità sinaptica, respirazione mitocondriale inefficiente e altre disfunzioni36,37. Inoltre, questo metodo potrebbe essere utilizzato per studiare le cause della disomeostasi Ca2+ associata all'età38. Tuttavia, l'applicazione di questo metodo per le domande relative all'invecchiamento e alla neurodegenerazione è in qualche modo limitata alle prime fasi dell'invecchiamento (<5 giorni dell'età adulta)38. Come accennato in precedenza, l'imaging dei vermi adulti più anziani (>5 giorni di età adulta) è difficile usando il nostro metodo di rotolamento, ma i progressi nella microfluidica di C. elegans mostrano risultati promettenti per l'imaging con una risoluzione spaziale simile fino a 12 giorni di età adulta39,40.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non dichiarano interessi concorrenti.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health (NIH) (R01- NS115947 assegnato a F. Hoerndli). Vorremmo anche ringraziare il Dr. Attila Stetak per il plasmide pAS1.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100x/1.40 Oil objective | Olympus | UPlanSApo | |
| 10x/0.40 Objective | Olympus | UPlanSApo | |
| 22 mm x 22 mm Cover glass | VWR | 48366-227 | |
| Agarose SFR | VWR | J234-100G | |
| Beam homogenizer | Andor Technologies | Borealis upgrade to CSU-X1 | |
| CleanBench laboratory table | TMC | With vibration control | |
| Disposable culture tubes | VWR | 47729-572 | 13 mm x 100 mm |
| Environmental chamber | Thermo Scientific | 3940 | Set to 20 °C |
| Filter wheel or slider | ASI | For 25 mm diameter filters | |
| FJH 185 | Caenorhabditis Genetics Center | FJH 185 | Worm strain |
| FJH 597 | Caenorhabditis Genetics Center | FJH 597 | Worm strain |
| GFP bandpass emission filter | Chroma | 525 ± 50 nm (25 mm diameter) | |
| ILE laser combiner | Andor Technologies | 4 laser lines | |
| ILE solid state 488 nm laser | Andor Technologies | 50 mW | |
| ImageJ | National Institutes of Health | Version 1.52a | |
| IX83 Spinning disk confocal microscope | Olympus | With Yokogawa CSU-X1 spinning disc | |
| iXon Ultra EMCCD camera | Andor Technologies | ||
| Low auto-fluorescence immersion oil | Olympus | Z-81226 | |
| MetaMorph | Molecular Devices | Version 7.10.1 | |
| Microscope control box | Olympus | IX3-CBH | |
| Muscimol | MP Biomedical / Sigma | 02195336-CF | |
| pAS1 | AddGene | 194970 | Plasmid |
| pBSKS | Stratagene | ||
| pCT61 | Plasmid available from Hoerndli/Maricq lab upon request | ||
| pJM23 | Plasmid available from Hoerndli/Maricq lab upon request | ||
| pKK1 | AddGene | 194969 | Plasmid |
| Polybead microspheres | Polysciences Inc. | 00876-15 | 0.094 µm |
| Stability chamber | Norlake Scientific | NSRI241WSW/8H | Set to 15 °C |
| Stage controller | ASI | With filter wheel control | |
| Standard microscope slide | Premiere | 9108W-E | 75 mm x 25 mm x 1 mm |
| Touch panel controller | Olympus | I3-TPC | |
| Z-drift corrector | Olympus | IX3-ZDC2 |
References
- Berridge, M. J.
- Brini, M., Calì, T., Ottolini, D., Carafoli, E. Neuronal calcium signaling: Function and dysfunction. Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (15), 2787-2814 (2014).
- Brini, M., Calì, T., Ottolini, D., Carafoli, E. Intracellular calcium homeostasis and signaling. Metal Ions in Life Sciences. 12, 119-168 (2013).
- Berridge, M. J. The inositol trisphosphate/calcium signaling pathway in health and disease. Physiological Reviews. 96 (4), 1261-1296 (2016).
- Schrank, S., Barrington, N., Stutzmann, G. E. Calcium-handling defects and neurodegenerative disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 12 (7), 035212 (2020).
- Pchitskaya, E., Popugaeva, E., Bezprozvanny, I. Calcium signaling and molecular mechanisms underlying neurodegenerative diseases. Cell Calcium. 70, 87-94 (2018).
- Jadiya, P., et al. Impaired mitochondrial calcium efflux contributes to disease progression in models of Alzheimer's disease. Nature Communications. 10 (1), 3885 (2019).
- Zeiser, E., Frøkjær-Jensen, C., Jorgensen, E., Ahringer, J. MosSCI and gateway compatible plasmid toolkit for constitutive and inducible expression of transgenes in the C. elegans germline. PLoS One. 6 (5), 20082 (2011).
- Zhu, B., Cai, G., Hall, E. O., Freeman, G. J. In-FusionTM assembly: Seamless engineering of multidomain fusion proteins, modular vectors, and mutations. Biotechniques. 43 (3), 354-359 (2007).
- Evans, T. C.
- Giordano-Santini, R., Dupuy, D. Selectable genetic markers for nematode transgenesis. Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (11), 1917-1927 (2011).
- Stiernagle, T.
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans: Transferring worms grown on NGM plates. WormBook. , (2006).
- Ogama, T. A beginner's guide to improving image acquisition in fluorescence microscopy. The Biochemist. 42 (6), 22-27 (2020).
- Mellem, J. E., Brockie, P. J., Madsen, D. M., Maricq, A. v Action potentials contribute to neuronal signaling in C. elegans. Nature Neuroscience. 11 (8), 865-867 (2009).
- Zhang, Y., et al. Fast and sensitive GCaMP calcium indicators for imaging neural populations. bioRxiv. , (2021).
- Kerruth, S., Coates, C., Dürst, C. D., Oertner, T. G., Török, K. The kinetic mechanisms of fast-decay red-fluorescent genetically encoded calcium indicators. Journal of Biological Chemistry. 294 (11), 3934-3946 (2019).
- de Juan-Sanz, J., et al. Axonal endoplasmic reticulum Ca2+ content controls release probability in CNS nerve terminals. Neuron. 93 (4), 867-881 (2017).
- Bhatla, N. C. elegans neural network. , Available from: http://wormweb.org/neurainet#c=BAG&m=1 (2014).
- Fung, W., Wexler, L., Heiman, M. G. Cell-type-specific promoters for C. elegans glia. Journal of Neurogenetics. 34 (3-4), 335-346 (2020).
- Ali, F., Kwan, A. C. Interpreting in vivo calcium signals from neuronal cell bodies, axons, and dendrites: a review. Neurophotonics. 7 (1), 011402 (2019).
- Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
- Mank, M., et al. A genetically encoded calcium indicator for chronic in vivo two-photon imaging. Nature Methods. 5 (9), 805-811 (2008).
- Birkner, A., Tischbirek, C. H., Konnerth, A. Improved deep two-photon calcium imaging in vivo. Cell Calcium. 64, 29-35 (2017).
- Ryan, K. C., Laboy, J. T., Norman, K. R. Deregulation of mitochondrial calcium handling due to presenilin loss disrupts redox homeostasis and promotes neuronal dysfunction. Antioxidants. 11 (9), 1642 (2022).
- Yang, H. H., et al. Subcellular imaging of voltage and calcium signals reveals neural processing in vivo. Cell. 166 (1), 245-257 (2016).
- Takahashi, N., Oertner, T. G., Hegemann, P., Larkum, M. E. Active cortical dendrites modulate perception. Science. 354 (6319), 1587-1590 (2016).
- Nicoletti, M., et al. Biophysical modeling of C. elegans neurons: Single ion currents and whole-cell dynamics of AWCon and RMD. PLoS One. 14 (7), 0218738 (2019).
- Church, P. J., Stanley, E. F. Single L-type calcium channel conductance with physiological levels of calcium in chick ciliary ganglion neurons. The Journal of Physiology. 496, 59-68 (1996).
- O'Hare, J. K., et al. Compartment-specific tuning of dendritic feature selectivity by intracellular Ca 2+ release. Science. 375 (6586), (2022).
- Mclntire, S. L., Jorgensen, E., Horvitz, H. R. Genes required for GABA function in Caenorhabditis elegans. Nature. 364 (6435), 334-337 (1993).
- Doser, R. L., Amberg, G. C., Hoerndli, F. J. Reactive oxygen species modulate activity-dependent AMPA receptor transport in C. elegans. The Journal of Neuroscience. 40 (39), 7405-7420 (2020).
- Wu, J., et al. A long Stokes shift red fluorescent Ca2+ indicator protein for two-photon and ratiometric imaging. Nature Communications. 5, 5262 (2014).
- Cho, J. -H., et al. The GCaMP-R family of genetically encoded ratiometric calcium indicators. ACS Chemical Biology. 12 (4), 1066-1074 (2017).
- Smith, J. J., et al. A light sheet fluorescence microscopy protocol for Caenorhabditis elegans larvae and adults. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 1012820 (2022).
- Müller, M., et al. Mitochondria and calcium regulation as basis of neurodegeneration associated with aging. Frontiers in Neuroscience. 12, 470 (2018).
- Nikoletopoulou, V., Tavernarakis, N.
- Chen, C. -H., Chen, Y. -C., Jiang, H. -C., Chen, C. -K., Pan, C. -L. Neuronal aging: Learning from C. elegans. Journal of Molecular Signaling. 8 (1), 14 (2013).
- Saberi-Bosari, S., Huayta, J., San-Miguel, A. A microfluidic platform for lifelong high-resolution and high throughput imaging of subtle aging phenotypes in C. elegans. Lab on a Chip. 18 (20), 3090-3100 (2018).
- Sridhar, N., Fajrial, A. K., Doser, R. L., Hoerndli, F. J., Ding, X. Surface acoustic wave microfluidics for repetitive and reversible temporary immobilization of C. elegans. Lab on a Chip. 22 (24), 4882-4893 (2022).
