Summary
現在の方法は、容易に入手可能な遺伝的にコードされたカルシウム指標を使用して、カエノラブディティスエレガンスのin vivoで高解像度のサブコンパートメントカルシウムイメージングのための非レシオメトリックアプローチを説明しています。
Abstract
カルシウム(Ca2+)イメージングは、主に神経活動を調べるために使用されてきましたが、細胞内Ca2+の取り扱いが細胞内シグナル伝達の重要な要素であることがますます明らかになっています。ニューロンを本来の無傷の回路で研究できるin vivoでの細胞内Ca2+ダイナミクスの視覚化は、複雑な神経系では技術的に困難であることが証明されています。線虫Caenorhabditis elegansの透明性と比較的単純な神経系は、蛍光タグとインジケーターの細胞特異的発現とin vivo視覚化を可能にします。これらの中には、細胞質ならびにミトコンドリアなどの様々な細胞内区画で使用するために改変された蛍光指示薬がある。このプロトコルは、個々の樹状突起スパインおよびミトコンドリアのレベルまでのCa2+動態の分析を可能にする細胞内分解能でin vivoでの非レシオメトリックCa2+イメージングを可能にします。ここでは、異なるCa2+親和性を有する2つの利用可能な遺伝的にコードされた指標を使用して、単一の興奮性介在ニューロン(AVA)の細胞質またはミトコンドリアマトリックス内の相対的なCa2+レベルを測定するためのこのプロトコルの使用を実証する。C. elegansで可能な遺伝子操作と縦断的観察とともに、このイメージングプロトコルは、Ca 2+の取り扱いがニューロン機能と可塑性をどのように調節するかに関する質問に答えるのに役立つ可能性があります。
Introduction
カルシウムイオン(Ca2+)は、多くの細胞型において非常に汎用性の高い情報担体です。ニューロンにおいて、Ca2+は、神経伝達物質の活動依存的放出、細胞骨格運動性の調節、代謝過程の微調整、ならびに適切なニューロンの維持および機能に必要な他の多くのメカニズムに関与している1,2。効果的な細胞内シグナル伝達を確実にするために、ニューロンは細胞質3において低い基底Ca2+レベルを維持しなければならない。これは、小胞体(ER)やミトコンドリアなどの細胞小器官へのCa2+の取り込みを含む、協調的なCa2+処理メカニズムによって達成されます。これらのプロセスは、原形質膜におけるCa2+透過性イオンチャネルの配置に加えて、ニューロン全体にわたって不均一なレベルの細胞質Ca2+をもたらす。
安静時およびニューロン活性化中のCa2+不均一性は、Ca2+依存性メカニズムの多様で場所特異的な調節を可能にします1。Ca2+の濃度特異的効果の一例は、イノシトール1,4,5-三リン酸(InsP3)受容体を介したERからのCa2+の放出である。InsP3と組み合わせた低Ca2+レベルは、受容体のカルシウム透過性細孔の開口に必要とされる。あるいは、高いCa2+レベルは、受容体4を直接的および間接的に阻害する。適切な神経機能のためのCa2+恒常性の重要性は、細胞内Ca2+の取り扱いおよびシグナル伝達の破壊が神経変性障害および自然老化の病因の初期段階であることを示唆する証拠によって裏付けられている5,6。具体的には、ERおよびミトコンドリアによる異常なCa2+の取り込みおよび放出は、アルツハイマー病、パーキンソン病、およびハンチントン病における神経機能障害の発症に関連している6,7。
自然老化または神経変性中のCa2+異相変の研究には、天然の細胞構造(すなわち、シナプスの配置およびイオンチャネルの分布)が維持されている生きている無傷の生物における細胞内分解能でのCa2+レベルの縦断的観察が必要である。この目的のために、このプロトコルは、高い空間的および時間的分解能でin vivoでCa2+ダイナミクスを記録するために、容易に入手可能で遺伝的にコード化された2つのCa2+センサーの使用に関するガイダンスを提供します。C. elegansに記載の方法を用いて得られた代表的な結果は、単一ニューロンの細胞質またはミトコンドリアマトリックスにおけるCa2+指示薬の発現が、単一のスパイン様構造および個々のミトコンドリア内のCa2+レベルを識別する追加能力を有するCa2+動態を示す蛍光画像(最大50Hz)の迅速な取得をどのように可能にするかを示している。
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Protocol
1. トランスジェニック株の作製
- 選択したクローニング法8,9を用いて、Pflp-18またはPrig-3プロモーター(腹側神経索におけるAVA特異的シグナル用)を含む発現ベクターをクローニングし、続いて選択したCa2+指標、次いで3' UTR(詳細についてはディスカッションを参照)10を含む。プラスミドとそのソースのリストは、補足表1に記載されています。
- Ca2+指示薬導入遺伝子(~20 ng/μL)とレスキューDNA lin-15+(選択マーカー)を含むDNAミックス(<100 ng/μL;各プラスミドの濃度については補足表1を参照)を1日齢の成人C.エレガンス10(遺伝子型: リン-15 (N765TS);表現型:多外陰部)10,11。
手記。 lin-15(n765ts) の親を15°Cに維持して、温度感受性変異を抑制します。 - F1子孫が成人期に達するまで注射した両親を20°Cに維持し、多外陰部の表現型がないことを使用してトランスジェニック選択を可能にします。
- クローン継代13 は多外陰部表現型を有していない成体F1子孫、Ca2+ 指示薬11を含む染色体外配列の発現を示す。
- セクション3で後述するように、1日齢の成人をマウントしてイメージングすることにより、多外陰部表現型を持たないF2またはF3子孫におけるCa2+ インジケーターの発現を評価します。
手記。ここで説明するように、画像を迅速に取得するには、指標の比較的高い表現が必要です(詳細については、説明を参照してください)。 - Ca2+指示薬を最適発現させてトランスジェニック株のその後の世代で実験を行い(詳細は説明を参照)、標準条件(NGMプレート上で20°C)12で菌株を維持します。
2.光学セットアップ
- 長期間のタイムラプスイメージングが可能な顕微鏡を使用してください。
手記。代表的なデータは、488nmおよび561nm励起レーザーを備えた倒立スピニングディスク共焦点顕微鏡を使用して取得されました。 - ワームの大まかな局在化のために、低倍率の対物レンズ(つまり、10x / 0.40)を使用します。
- 細胞内分解能を達成するには、高倍率対物レンズを使用してニューロンに切り替えて局在化します。
手記。100x/1.40 NAのオイル対物レンズを使用して、この研究の代表的なデータを取得しました。 - 高速画像取得(>50fps)が可能な超高感度カメラを使用して画像を取得します。
- 選択したCa2+インジケーターには標準の発光フィルターを使用してください(GCaMP6fおよびmitoGCaMPには525nm ±50nmの発光フィルター)。
- イメージングセッション中に寒天パッドが乾燥すると、神経突起が数秒以内に焦点が合っなくなるため、10秒を超える画像ストリームを取得するためのZドリフト補正器(ZDC)を追加します。
手記。顕微鏡のセットアップでZDCができない場合、または長い(>20分)イメージング期間が必要な場合は、寒天パッドの周りにシリコングリースまたは溶けたワセリンの境界を塗布して、乾燥を遅らせます。
3.イメージング用のワームの準備
- 寒天パッドの準備
- 分子グレード寒天をM9 12に溶解し、13 mm x 100 mmのガラス培養チューブに溶解し、数秒間電子レンジで数秒間電子レンジで、3 mLの10%寒天を作ります(材料の表を参照)。
手記。溶融寒天は、最大1時間ヒートブロックに保持することも、寒天パッドが必要になるたびに新鮮にすることもできます。 - それぞれに2層の実験用テープがある2つの追加のスライドの間に顕微鏡スライドを配置します(図1A-iを参照)。
- 1,000 μLのピペットチップ(フィルターなし)の先端を切り取り、それを使用して寒天の小滴を中央のカバースリップにピペットで移します(図1A-i)。
- 寒天の上部にある別のスライドを押して寒天を平らにします(図1A-ii)。
- 冷却後、13mm×100mmのガラス培養管(図1A-iii)の開口部を用いて寒天を小さな円盤状に切断し、周囲の寒天を取り除きます。
- 分子グレード寒天をM9 12に溶解し、13 mm x 100 mmのガラス培養チューブに溶解し、数秒間電子レンジで数秒間電子レンジで、3 mLの10%寒天を作ります(材料の表を参照)。
- ワームローリングソリューションの準備
- ムシモール粉末をM9に溶解して、30 mMのストックを作成します。50 μLのアリコートに分離し、4°Cで保存します。
- 3〜5日ごとに30 mMムシモールの新しいアリコートを解凍します(使用中は20°Cで保管してください)。
- 30 mMのムシモールストックをポリスチレンビーズで1:1の比率で希釈して、圧延溶液を作ります。
- イメージング用のワームの配置
- 1.6 μLのローリング溶液を寒天パッドの中央に置きます。
注意: 液体の量は、若い(少ない)または年配の動物(多い)を画像化するために調整する必要があります。 - 好ましいワームピック(すなわち、ガラスまたはプラチナワイヤーピック)13を使用して、多外陰部表現型11 のない所望の年齢のワームを寒天パッド上のローリング溶液に移す(図1A-iv)。
手記。代表的なデータは、1日齢の雌雄同体(GCaMP6f株= FJH185;mitoGCaMP株;FJH597; 補足表1を参照)、これは1列の卵のみの存在によって識別できます。さまざまな年齢のワームの操作の詳細については、ディスカッションを参照してください。 - ムシモールがワームの動きを減らすまで~5分待ってから、寒天パッドの上に22 mm x 22 mmのカバーガラスを落とし、ワームの動きを物理的に制限します。
- 腹側神経索の神経突起を画像化するには、カバーガラスを軽くスライドさせて、ワームを 図1B、C に示す方向に転がします。
手記。腹側神経索を視覚化するには、頭を上にしてワームを配置し、腸が近位部の右側とワームの遠位部分の左側になるまで(視聴者の視点から)ワームを転がします。背側神経索の神経突起を画像化するために、この向きを反転させます(図1C)。
- 1.6 μLのローリング溶液を寒天パッドの中央に置きます。
- ワームを顕微鏡に取り付ける
- 顕微鏡ステージに取り付ける前に、カバーガラスに液浸オイルを一滴置きます。
- 明視野で低倍率対物レンズ(10倍)対物レンズを使用してワームを見つけます。
- 100倍の対物レンズに切り替えて、フォーカスを調整します。
- GCaMPまたはmitoGCaMPと488nmイメージングレーザーの照明を使用して、AVA神経突起を見つけます。
注意: ワームを押しつぶしたり、カバーガラスを引っ張ったりしないように、微調整を使用してください。
4. 高解像度画像ストリームの取得
- 生体内 GCaMP イメージング
- 露光時間を 20 ms に設定します。
- 基礎GCaMP蛍光がカメラのダイナミックレンジ14のミッドレンジになるまで、イメージングレーザーと取得の設定を調整します。他の顕微鏡設定を使用したイメージングパラメータの最適化に関する提案については、ディスカッションを参照してください。
手記。この研究で使用する光学セットアップでは、488 nmイメージングレーザーを次の出力設定に設定します:レーザー出力= 50%、減衰= 1。追加のアクイジション設定を次のように変更します:EMゲイン= 200およびプリアンプゲイン= 1。 - GCaMP蛍光を100倍の倍率で使用してAVA神経突起を見つけたら、ZDC( 材料表を参照)を±30 μmの範囲に設定し、連続オートフォーカスを開始します。イメージングする前に、必要に応じて焦点面を手動で修正します。
- 100倍の倍率で画像のストリームを取得します。この調査で使用したセットアップでは、10分という期間を達成できます。
- 生体内 マイトGCaMPイメージング
- 必要に応じて手順4.1.1〜4.1.2に従って、カメラのダイナミックレンジ14のミッドレンジで基礎mitoGCaMP蛍光を取得します。
手記。この研究で使用する光学セットアップでは、488 nmイメージングレーザーを次の出力設定に設定します:レーザー出力= 20%、減衰= 10。集録設定を次のように変更します:EMゲイン= 100およびプリアンプゲイン= 2。 - mitoGCaMP蛍光を用いてAVA神経突起中のミトコンドリアが位置特定された後、ステップ3.3で上述したようにZDCを設定する。
- 100倍の倍率で画像のストリームを取得します。
- 必要に応じて手順4.1.1〜4.1.2に従って、カメラのダイナミックレンジ14のミッドレンジで基礎mitoGCaMP蛍光を取得します。
5. 画像ストリーム解析
- 画像シリーズのピクセル値を分析するための適切な画像ソフトウェアで画像ストリームを開きます(「 材料表」を参照)。
- ポリゴン選択ツールを使用して、GCaMP または mitoGCaMP を含む細胞内関心領域 (ROI) を定義します。
- ROIマネージャー>>ツールの分析をクリックします。ROI マネージャーで、[追加]、[その他] > [マルチメジャー] の順にクリックします。[Multi Measure] ウィンドウで [OK] をクリックすると、画像ストリームの各フレームについて上記で定義した ROI の平均、最小、および最大のピクセル強度が自動的に収集され、さらに分析されます。
手記。平均ピクセル強度(Favg)は、z 平面内の位置による蛍光の差を考慮して、Favg/F min の比率を使用して各 ROI の最小強度 (Fmin) に正規化することをお勧めします。イメージング中にワームの動きを伴う画像ストリームは、蛍光測定にも影響するため、破棄します。
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Representative Results
これら2つのプロトコルにより、in vivoで個々の神経突起の細胞内領域および細胞小器官内の異なるCa2+レベルを高い空間分解能で迅速に取得できます。最初のプロトコルは、高い時間的および空間的分解能で細胞質Ca2+の測定を可能にします。これは、神経突起が腹側神経索の全長を走るグルタミン酸作動性AVAコマンド介在ニューロン15におけるGCaMP6fの細胞特異的発現を用いてここで実証される。GCaMP6f蛍光(50 Hz)を迅速に取得することで、Ca2+流入の方向性伝播を検出することができました(図2Aおよび補足ビデオ1)。GCaMP6f蛍光の細胞内定量により、Ca2+流入の開始がわずか10μm離れた神経突起の一部で遅れることが明らかになりました(図2B)。さらに、このプロトコルは、区画化されたCa2+およびサブスレッショルドCa 2+イベントのいくつかの観察を可能にした。例えば、AVA神経突起に沿って見られる樹状突起スパイン様構造は、神経突起の活性化とは無関係に起こり、Ca2+流入の伝播をもたらさないGCaMP6f蛍光の閃光を有することが見られた(図2C、Dおよび補足ビデオ2)。
第2のプロトコルは、単一神経突起における個々のミトコンドリアにおける相対的なCa2+レベルを迅速に測定することを目的としていた。ミトコンドリアマトリックスに局在するCa2+指示薬mitoGCaMPのAVA特異的発現を有する線虫株を用いることで、AVA神経突起内の個々のミトコンドリアレベルでmitoGCaMP蛍光の変化を迅速に検出することができました。このイメージングプロトコルは、少なくともこのニューロンにおいて、ミトコンドリアへのCa2+取り込みの異なるモードを明らかにした。第1に、図3Aに示す結果は、ミトコンドリアのサブセットへの比較的大量のCa2+の同期取り込みの例を提供する。より具体的には、これらのデータから、一部のミトコンドリアへのCa2+取り込みが同期していることが明らかになりました(Mito1とMito2;図3A,Bおよび補足ビデオ3)に対して、隣接するミトコンドリアはCa2+(Mito3;図3A,B)。同様に、ミトコンドリアのサブセットは、少量のCa2+を急速に取り込み、放出することが見られました。これも同期しているように見えましたが(Mito1とMito3、図3C、D、補足ビデオ4)、やはりミトコンドリアのサブセット(Mito 2、図3C、D)についてのみです。
図1:腹側神経索を画像化するための C.エレガンスの 取り付けとローリング。 (A)寒天パッドを準備し、単一のワームをローリング溶液にピッキングする手順の図。(B)イメージングのために再配置される前のワームの位置の例。赤い矢印は、カバーガラスを右にスライドさせることで達成できるワームの右向きのロールの必要性を示しています(青い矢印)。スケールバー= 50μm。(C)腹側神経索を視覚化するために必要な正しい向き。注:腸は、近位半分の視聴者の右側(正立顕微鏡を使用)にあり、遠位半分の左側にあります。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:AVA神経突起およびスパイン様構造における細胞内分解能によるGCaMP6f蛍光の迅速な取得 。 (A)AVALおよびAVAR神経突起分岐部におけるGCaMP6f蛍光の代表的な画像。スケールバー= 5μm。(B)パネルAの下部画像で定義された近位(オレンジ)および遠位(青)領域について、その領域(Fmin)の最小蛍光(F)に正規化されたGCaMP6f蛍光の定量化。 (C)AVA神経突起の脊椎状突起におけるGCaMP6f蛍光の代表的な画像。(D)パネルCの下部画像の対応する領域からの神経突起(オレンジ色)および脊椎状突起(青色)における正規化されたGCaMP6f蛍光。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図 3.AVA神経突起内の個々のミトコンドリアへのカルシウム取り込みの迅速なイメージング。(A,C)時間の経過に伴うmitoGCaMP蛍光の代表的な画像。スケールバー= 50μm。(B)パネルAの下部画像に示されている対応するミトコンドリアの正規化GCaMP蛍光の痕跡(F / Fmin)。 (D)パネルCの下部画像で強調表示されている領域での40秒間のF / F分。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
補足ビデオ1:AVA神経突起におけるGCaMP6f蛍光。 ビデオは2倍速でレンダリングされました。スケールバー= 5μm。 このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ビデオ2:AVA神経突起上のスパイン様突起におけるGCaMP6f蛍光。 ビデオは2倍速でレンダリングされました。スケールバー= 5μm。 このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ビデオ3:AVA神経突起に同期したミトコンドリアカルシウム取り込みにおけるMitoGCaMP蛍光。 ビデオは4倍速でレンダリングされました。スケールバー= 5μm。 このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ビデオ4:AVA神経突起におけるMitoGCaMP蛍光-ミトコンドリアによるカルシウムの急速な取り込みと放出。 ビデオは4倍速でレンダリングされました。スケールバー= 5μm。 このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足表1:本研究で用いた遺伝子試薬および菌株。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
記載された方法を実施する際の最初の考慮事項は、所与の研究課題に対して理想的な特性を有するCa2+指標の選択を含む。細胞質Ca2+指示薬は典型的にはCa2+に対して高い親和性を有し、Ca2+に対するこれらの指示薬の感受性は動態(オン/オフ率)に反比例する16,17。これは、Ca2+感度または動力学のいずれかを関心のある現象に基づいて優先順位を付ける必要があることを意味します。ERのような比較的高い基礎Ca2+レベルを有する細胞内区画の場合、低いCa2+親和性を有するCa2+指標は18と考えられるべきである。Ca2+指示薬の細胞特異的発現のための組換えDNAを生成するために、好ましいクローニング技術は、細胞特異的プロモーター19、20を挿入し、続いて選択したCa2+指示薬および3' UTRを挿入すべきである。AVAニューロンにおける比較的高い発現レベルは、プロモーターPflp-18またはPrig-3、let-858、またはunc-54 3' UTRを用いてプラスミドを構築し、このプラスミドを15-25 ng/μLでマイクロインジェクションすることによって達成できます(補足表1を参照)。
Ca2+指示薬とlin-15+を含むプラスミドをlin-15(n765ts)変異線虫の生殖巣にマイクロインジェクションすることで、Ca2+指示薬を発現するF1子孫が得られ、多外陰部の表現型が救出されます。F1世代のサブセット(30%〜80%)のみが合成DNAをF2世代に伝達します。Ca2+インジケーターの発現は、多外陰部表現型のために救助された1日齢の成人の蛍光をマウントしてイメージングすることにより、合成DNAの<60%の伝達を有するプレート上の救助されたF2またはF3子孫で評価する必要があります。理想的な発現レベルは、Ca2+指示薬の性質および位置、ならびに生物学的問題に基づいて決定される。迅速な画像取得が必要な場合は、比較的高い表現が理想的です。しかしながら、Ca2+指示薬の極めて高い発現は、細胞内ミスローカリゼーション、ならびに他の細胞または組織における非特異的発現を引き起こすことが見出されている。
遺伝的にコードされたCa2+指示薬は、C. elegansおよび他のモデル生物におけるCa 2+のin vivo分析に広く採用されています。これらの研究のいくつかは、ニューロン細胞体におけるCa2+レベルの単一細胞分解能モニタリングを達成した21、22、23、24。ニューロンサブコンパートメントにおけるCa2+流入の測定は、C.エレガンスおよび脊椎動物系においてin vivoで達成されているが、神経突起全体25,26または樹状突起27の集団におけるCa2+指示活性を記録することによってのみ達成されている。ニューロン細胞体および樹状突起全体におけるCa2+活性の測定は、細胞のスパイク活性を反映するが、Ca2+流入のダイナミクス(すなわち、伝播の方向または速度)または閾値以下のCa2+過渡現象の観察はできない。ニューロンにおけるCa2+の取り扱いを、ここで実証された空間的および時間的分解能で識別できたin vivo研究はほとんどありません。ほとんどのC.エレガンスニューロン28におけるCa2+流入の時間ダイナミクスは、脊椎動物ニューロン29よりも遅いように見えるため、この迅速なイメージングプロトコルは、脊椎動物システムにおける同様の時間的ダイナミクスをキャプチャするには不十分である可能性が高いことに注意してください。しかし、2光子顕微鏡法における最近の進歩は、自由に行動するマウス30における個々の海馬樹状突起におけるカルシウムの超高速(120Hz)細胞内イメージングを可能にし、脊椎動物において同様の高解像度Ca2+イメージングを達成することが期待されている。
インビボCa2+画像化へのこの非レシオメトリックアプローチは、ムシモールの使用を必要とし、これは体壁筋肉の収縮を阻害し、したがって画像化中の虫の動きを制限することに留意することが重要である31。イメージング中に過度の動き(ワームの~20%以上で一貫した動き)がある場合は、新たに解凍したムシモールのアリコートを使用して新しいローリング溶液を作成し、ロール前にワームがローリング溶液に浸る時間を延長する必要があります。ムシモールはGABA受容体アゴニストであり、AVAニューロンに入力を提供するものを含むGABA作動性ニューロンを阻害することを意味します。さらに、AVAを含む多くの興奮性ニューロンは低レベルのGABA受容体を発現するため、このプロトコルでのムシモールの使用はニューロン活動を低下させる可能性があります。しかし、このプロトコルを使用すると、AVAの全体的な自発的活性化は、ムシモールの存在下で~29%しか減少しません(未発表データ)。他のニューロンの活性化はムシモールによってより劇的に減少することがあり、これはローリング溶液中のM9をムシモールに置換し、低倍率でニューロン細胞本体でイメージングを行うことによってテストできます32。ムシモールを使用する代わりに、レシオメトリックCa2+指示薬33,34を使用することであり、これは虫の動きによる蛍光補正を可能にするであろう。このアプローチの欠点は、2波長イメージングが可能な光学セットアップが必要であり、他の多くの蛍光ツールと組み合わせてCa2+インジケーターを使用する能力が制限されることです。
記載された顕微鏡システムの1つの主要な制限は、スピニングディスクによる放出光の減少であり、これは情報の損失をもたらす。このシステムは、より大きな直径のピンホールを備えたディスクを実装することにより、放出された光のキャプチャを増やすことができるように変更できます。ただし、この変更により、軸方向(z面)の分解能が低下し、バックグラウンド蛍光が増加します。この目的のための別の可能な顕微鏡セットアップは、近年改良された高速走査型ライトシート顕微鏡であり、これはin situおよびin vivoでの迅速な(最大50Hz)イメージングを可能にするために改良されています35。
細胞質およびミトコンドリアCa2+の時空間ダイナミクスを評価することで、局所的なCa2+過渡現象、さらには閾値以下のイベントがカルシウム依存性シグナル伝達を引き起こしたり、ミトコンドリア生物学を調節したりする方法についての理解を深めることができます。この細胞内、in vivo Ca2+イメージングは、シナプス可塑性、ニューロン代謝における活動依存性変化、およびニューロン興奮性の恒常性調節の研究に特に有用である可能性がある。局所的な細胞内環境がニューロン活動の定義された状態(すなわち、空間的に特異的な濃度とCa2+の寿命)にどのように適応するかをさらに調査することで、Ca2+のホメオスタシスがニューロン機能の病原性変化にどのようにつながるかについての洞察が得られます。生きている無傷の生物でこれを研究する能力は、Ca2+恒常性が自然な老化と疾患関連の神経変性とともにどのようにそしてなぜ変化するかを明らかにする縦断的研究を可能にするので特に有用です。老化と神経変性を研究するためにこの方法を適用することは、C.エレガンスの初期の生物学的年齢(成人期の<4日)にいくらか制限されています。実際、イメージングのためのワームの取り付けと位置決め中の物理的操作は、筋肉の緊張とキューティクルの完全性の低下のためにワームが弛緩する成人期の約5日後に困難になります。
Ca2+の動態と細胞内ハンドリングの迅速なin vivoイメージングは、神経細胞の興奮性と細胞内シグナル伝達が空間的および時間的にどのように細かく制御されているかを理解するのに役立ちます。このプロトコルは、Ca2+依存プロセスの多様性と神経機能におけるそれらの中心的な役割により、多くの分野の幅広い研究および研究者に利益をもたらす可能性があります。例えば、健康なニューロンにこの方法を適用すると、老化中の細胞質Ca2+の上昇が、シナプス可塑性の障害、非効率的なミトコンドリア呼吸、およびその他の機能障害と関連して発生する理由についての洞察が得られます36,37。さらに、この方法は、加齢に伴うCa2+異相変の原因を調査するために使用できます38。しかし、老化と神経変性に関連する質問に対するこの方法の適用は、老化の初期段階(成人期の<5日)にいくらか限定されています38。上記のように、高齢の成虫のイメージング(成人期の>5日)は、私たちのローリング法では困難ですが、C.エレガンスマイクロフルイディクスの進歩は、成人期の最大12日間、同様の空間分解能でのイメージングが期待されています39,40。
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Disclosures
著者は競合する利益を宣言しません。
Acknowledgments
この研究は、国立衛生研究所(NIH)(R01-NS115947がF. Hoerndliに授与)によってサポートされました。また、pAS1プラスミドを提供してくれたAttila Stetak博士にも感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100x/1.40 Oil objective | Olympus | UPlanSApo | |
| 10x/0.40 Objective | Olympus | UPlanSApo | |
| 22 mm x 22 mm Cover glass | VWR | 48366-227 | |
| Agarose SFR | VWR | J234-100G | |
| Beam homogenizer | Andor Technologies | Borealis upgrade to CSU-X1 | |
| CleanBench laboratory table | TMC | With vibration control | |
| Disposable culture tubes | VWR | 47729-572 | 13 mm x 100 mm |
| Environmental chamber | Thermo Scientific | 3940 | Set to 20 °C |
| Filter wheel or slider | ASI | For 25 mm diameter filters | |
| FJH 185 | Caenorhabditis Genetics Center | FJH 185 | Worm strain |
| FJH 597 | Caenorhabditis Genetics Center | FJH 597 | Worm strain |
| GFP bandpass emission filter | Chroma | 525 ± 50 nm (25 mm diameter) | |
| ILE laser combiner | Andor Technologies | 4 laser lines | |
| ILE solid state 488 nm laser | Andor Technologies | 50 mW | |
| ImageJ | National Institutes of Health | Version 1.52a | |
| IX83 Spinning disk confocal microscope | Olympus | With Yokogawa CSU-X1 spinning disc | |
| iXon Ultra EMCCD camera | Andor Technologies | ||
| Low auto-fluorescence immersion oil | Olympus | Z-81226 | |
| MetaMorph | Molecular Devices | Version 7.10.1 | |
| Microscope control box | Olympus | IX3-CBH | |
| Muscimol | MP Biomedical / Sigma | 02195336-CF | |
| pAS1 | AddGene | 194970 | Plasmid |
| pBSKS | Stratagene | ||
| pCT61 | Plasmid available from Hoerndli/Maricq lab upon request | ||
| pJM23 | Plasmid available from Hoerndli/Maricq lab upon request | ||
| pKK1 | AddGene | 194969 | Plasmid |
| Polybead microspheres | Polysciences Inc. | 00876-15 | 0.094 µm |
| Stability chamber | Norlake Scientific | NSRI241WSW/8H | Set to 15 °C |
| Stage controller | ASI | With filter wheel control | |
| Standard microscope slide | Premiere | 9108W-E | 75 mm x 25 mm x 1 mm |
| Touch panel controller | Olympus | I3-TPC | |
| Z-drift corrector | Olympus | IX3-ZDC2 |
References
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