Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Subcellulær avbildning av nevronal kalsiumhåndtering in vivo

Published: March 17, 2023 doi: 10.3791/64928
Automatic Translation
*1, *1,2, 1, 1
1Department of Biomedical Sciences, Colorado State University College of Veterinary Medicine and Biomedical Sciences, 2Cellular and Molecular Biology Graduate Program, Colorado State University College of Veterinary Medicine and Biomedical Sciences
* These authors contributed equally

Summary

De nåværende metodene beskriver en ikke-ratiometrisk tilnærming for høyoppløselig, subkompartmental kalsiumavbildning in vivo i Caenorhabditis elegans ved bruk av lett tilgjengelige genetisk kodede kalsiumindikatorer.

Abstract

Avbildning av kalsium (Ca 2+) har i stor grad blitt brukt til å undersøke nevronaktivitet, men det blir stadig tydeligere at subcellulær Ca2+-håndtering er en avgjørende komponent i intracellulær signalering. Visualiseringen av subcellulær Ca2+ dynamikk in vivo, hvor nevroner kan studeres i deres innfødte, intakte kretser, har vist seg teknisk utfordrende i komplekse nervesystemer. Gjennomsiktigheten og det relativt enkle nervesystemet til nematoden Caenorhabditis elegans muliggjør cellespesifikt uttrykk og in vivo visualisering av fluorescerende koder og indikatorer. Blant disse er fluorescerende indikatorer som er modifisert for bruk i cytoplasma, samt forskjellige subcellulære rom, som mitokondriene. Denne protokollen muliggjør ikke-ratiometrisk Ca 2+-avbildning in vivo med en subcellulær oppløsning som tillater analyse av Ca2+-dynamikk ned til nivået av individuelle dendrittiske pigger og mitokondrier. Her brukes to tilgjengelige genetisk kodede indikatorer med forskjellige Ca 2+ affiniteter for å demonstrere bruken av denne protokollen for å måle relative Ca2+ nivåer i cytoplasma eller mitokondriematrisen i et enkelt par eksitatoriske interneuroner (AVA). Sammen med de genetiske manipulasjonene og longitudinelle observasjonene som er mulige i C. elegans, kan denne bildeprotokollen være nyttig for å svare på spørsmål om hvordan Ca2+ -håndtering regulerer nevronfunksjon og plastisitet.

Introduction

Kalsiumioner (Ca2+) er svært allsidige bærere av informasjon i mange celletyper. I nevroner er Ca2+ ansvarlig for aktivitetsavhengig frigjøring av nevrotransmittere, regulering av cytoskeletal motilitet, finjustering av metabolske prosesser, samt mange andre mekanismer som kreves for riktig nevronvedlikehold og funksjon 1,2. For å sikre effektiv intracellulær signalering må nevroner opprettholde lave basale Ca2+ nivåer i deres cytoplasma3. Dette oppnås ved kooperative Ca 2+ håndteringsmekanismer, inkludert opptak av Ca2+ i organeller som endoplasmatisk retikulum (ER) og mitokondrier. Disse prosessene, i tillegg til arrangementet av Ca 2+-permeable ionekanaler i plasmamembranen, resulterer i heterogene nivåer av cytoplasmatisk Ca2+ gjennom nevronet.

Ca 2+ heterogenitet under hvile og nevronaktivering muliggjør mangfoldig, stedsspesifikk regulering av Ca2+-avhengige mekanismer1. Et eksempel på de konsentrasjonsspesifikke effektene av Ca 2 + er frigjøring av Ca2 + fra ER gjennom inositol 1,4,5-trisfosfat (InsP3) reseptorer. Lave Ca2+ nivåer i kombinasjon med InsP3 er nødvendig for åpning av reseptorens kalsiumgjennomtrengelige pore. Alternativt hemmer høye Ca2+ nivåer både direkte og indirekte reseptoren4. Betydningen av Ca 2+ homeostase for riktig nevronfunksjon støttes av bevis som tyder på at forstyrret intracellulær Ca2+ håndtering og signalering er et tidlig skritt i patogenesen av nevrodegenerative lidelser og naturlig aldring 5,6. Spesielt er unormalt Ca2+ opptak og frigjøring av ER og mitokondrier knyttet til utbruddet av nevronal dysfunksjon i Alzheimers sykdom, Parkinsons sykdom og Huntingtons sykdom 6,7.

Studien av Ca 2+ dyshomeostase under naturlig aldring eller nevrodegenerasjon krever langsgående observasjon av Ca2+ nivåer med subcellulær oppløsning i en levende, intakt organisme der den opprinnelige cellulære arkitekturen (dvs. arrangementet av synapser og distribusjon av ionkanaler) opprettholdes. For dette formål gir denne protokollen veiledning om bruk av to lett tilgjengelige, genetisk kodede Ca 2+ sensorer for registrering av Ca2+ dynamikk in vivo med høy romlig og tidsmessig oppløsning. De representative resultatene som er oppnådd ved hjelp av den beskrevne metoden i C. elegans, demonstrerer hvordan ekspresjonen av Ca2+ indikatorer i cytoplasma eller mitokondriell matrise av enkeltneuroner kan tillate rask oppkjøp av fluorescerende bilder (opptil 50 Hz) som illustrerer Ca 2 + dynamikken med den ekstra evnen til å skille Ca2 + nivåer innenfor enkelte ryggradslignende strukturer og individuelle mitokondrier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Opprette transgene stammer

  1. Ved hjelp av en valgfri metode 8,9, klon ekspresjonsvektorer for å inneholde Pflp-18 eller Prig-3 promotoren (for AVA-spesifikt signal i ventral nervestreng), etterfulgt av Ca2+ indikator for valg, og deretter en 3' UTR (se diskusjonen for mer informasjon)10. En liste over plasmider og deres kilder finnes i tilleggstabell 1.
  2. Følg den etablerte protokollen for opprettelse av transgene stammer via mikroinjeksjon av en DNA-blanding (<100 ng / μL; se tilleggstabell 1 for konsentrasjoner av hvert plasmid) som inneholder Ca 2+ indikatortransgenet (~20 ng / μL) og rednings-DNA lin-15 + (utvalgsmarkør) i gonaden til en 1 dag gammel voksen C. elegans10 (genotype: LIN-15(N765TS); fenotype: multi-vulva)10,11.
    NOTAT. Oppretthold lin-15 (n765ts) foreldre ved 15 °C for å undertrykke temperaturfølsom mutasjon.
  3. Hold de injiserte foreldrene ved 20 °C til F1-avkommet når voksen alder for å muliggjøre transgen seleksjon ved fravær av multivulva-fenotypen.
  4. Klonalt passasje13 voksne F1-avkom som ikke har multi-vulva-fenotypen, da dette indikerer uttrykket av den ekstrakromosomale matrisen som inneholder Ca2+ -indikatoren11.
  5. Vurder uttrykket av Ca2+ -indikatoren i F2- eller F3-avkommet som ikke har multivulva-fenotypen ved montering og avbildning av 1 dag gamle voksne som beskrevet senere i avsnitt 3.
    NOTAT. Et relativt høyt uttrykk for indikatoren er nødvendig for rask innsamling av bilder som beskrevet her (se diskusjonen for mer detaljer).
  6. Utfør eksperimenter på etterfølgende generasjoner av de transgene stammene med et optimalt uttrykk for Ca 2+-indikatoren (se diskusjonen for mer informasjon), opprettholde stammene under standardbetingelser (20 °C på NGM-plater)12.

2. Optisk oppsett

  1. Bruk et mikroskop som er i stand til langsiktig time-lapse-avbildning.
    NOTAT. De representative dataene ble samlet inn ved hjelp av et invertert spinndisk konfokalmikroskop utstyrt med 488 nm og 561 nm eksitasjonslasere.
  2. Bruk et mål med lav forstørrelse (dvs. 10x/0,40) for den grove lokaliseringen av ormen.
  3. For å oppnå subcellulær oppløsning, bytt til og lokaliser nevronene ved hjelp av et mål med høy forstørrelse.
    NOTAT. Et oljemål på 100x/1,40 NA ble brukt til å innhente representative data i denne studien.
  4. Skaff bildene ved hjelp av et ultrafølsomt kamera som er i stand til rask bildeopptak (>50 fps).
  5. Bruk et standard utslippsfilter for den valgte Ca2+ -indikatoren (dvs. et utslippsfilter på 525 nm ± 50 nm for GCaMP6f og mitoGCaMP).
  6. Legg til en Z-drift corrector (ZDC) for oppkjøp av bildestrømmer lengre enn 10 s, da uttørking av agarputen under avbildningsøkten får nevritten til å drive ut av fokus i løpet av flere sekunder.
    NOTAT. Hvis et mikroskopioppsett ikke tillater ZDC, eller hvis man ønsker lange (>20 minutter) avbildningsperioder, må du påføre en kant av silisiumfett eller smeltet vaselin rundt agarputen for å bremse uttørkingen.

3. Forberedelse av ormer for avbildning

  1. Klargjøre agarputene
    1. Lag 3 ml 10 % agar ved å oppløse molekylær agar i M912 i et 13 mm x 100 mm glasskulturrør og mikrobølgeovn i flere sekunder (se materialfortegnelse).
      NOTAT. Smeltet agar kan holdes på en varmeblokk i opptil 1 time eller kan gjøres frisk hver gang agar pads er nødvendig.
    2. Plasser et lysbilde i mikroskop mellom to ekstra lysbilder som hver har to lag laboratorietape (se figur 1A-i).
    3. Klipp spissen på en 1000 μL pipettespiss (uten filter), og bruk den til å pipette en liten dråpe agar på midtdekselet (figur 1A-i).
    4. Flat agaren ved å trykke en annen lysbilde ned på toppen av agar (figur 1A-ii).
    5. Etter avkjøling, kutt agar i en liten plate ved hjelp av åpningen av et 13 mm x 100 mm glasskulturrør (figur 1A-iii), og fjern deretter den omkringliggende agar.
  2. Klargjøre ormrullingsløsningen
    1. Løs opp muscimolpulver i M9 for å lage en 30 mM lager. Separeres i 50 μL alikoter, og oppbevares ved 4 °C.
    2. Tin en ny alikot med 30 mM muscimol hver 3-5 dag (og oppbevares ved 20 °C mens den er i bruk).
    3. Fortynn en 30 mM muscimolbestand i forholdet 1: 1 med polystyrenperler for å lage rulleløsningen.
  3. Plassere en orm for avbildning
    1. Plasser 1,6 μL av rulleløsningen på midten av agarputen.
      MERK: Mengden væske bør justeres for avbildning av yngre (mindre) eller eldre dyr (mer).
    2. Bruk den foretrukne ormehakken (dvs. en glass- eller platinatrådplukk)13, overfør en orm av ønsket alder uten multivulva-fenotype11 til rulleløsningen på agarputen (figur 1A-iv).
      NOTAT. De representative dataene er fra 1 dag gamle hermafroditter (GCaMP6f stamme = FJH185; mitoGCaMP stamme; FJH597; se tilleggstabell 1), som kan identifiseres ved tilstedeværelse av bare én rad egg. Se diskusjonen for mer detaljert informasjon om arbeid med ormer i ulike aldre.
    3. Vent i ~ 5 min for muscimol å redusere ormen bevegelse, og deretter slippe en 22 mm x 22 mm coverslip på toppen av agar pad, fysisk begrense ormen bevegelse.
    4. For avbildning av nevritter i den ventrale nervestrengen, rull ormen inn i retningen vist i figur 1B,C ved å skyve dekselet lett.
      NOTAT. For å visualisere den ventrale nervestrengen, plasser ormen med hodet oppover, og rull ormen til tarmen er på høyre side av den proksimale delen og venstre for den distale delen av ormen (fra betrakterens perspektiv). Inverter denne orienteringen (figur 1C) for avbildning av nevritter i dorsalnervestrengen.
  4. Montering av ormen på et mikroskop
    1. Plasser en dråpe nedsenkningsolje på dekselet før du monterer den på mikroskoptrinnet.
    2. Finn ormen ved hjelp av et mål med lav forstørrelse (10x) i Brightfield.
    3. Bytt til 100x-målet, og juster fokus.
    4. Finn AVA-nevitten ved hjelp av belysningen av GCaMP eller mitoGCaMP med 488 nm bildelaser.
      MERK: Bruk små justeringer for å forhindre klemming av ormen eller trekk av dekselet.

4. Anskaffelse av høyoppløselige bildestrømmer

  1. In vivo GCaMP-avbildning
    1. Sett eksponeringstiden til 20 ms.
    2. Juster innstillingene for bildelaseren og innsamlingen til den basale GCaMP-fluorescensen er i mellomområdet av kameraets dynamiske område14. Se diskusjonen for forslag til optimalisering av avbildningsparametrene ved hjelp av andre mikroskopioppsett.
      NOTAT. For det optiske oppsettet som brukes i denne studien, still inn 488 nm bildelaseren til følgende utgangsinnstillinger: lasereffekt = 50 % og demping = 1. Endre de ekstra anskaffelsesinnstillingene på følgende måte: EM-forsterkning = 200 og forforsterkerforsterkning = 1.
    3. Etter at AVA-nevitten er lokalisert ved hjelp av GCaMP-fluorescensen ved 100x forstørrelse, sett ZDC (se materialtabellen) til et område på ±30 μm, og start kontinuerlig autofokusering. Korriger fokalplanet manuelt etter behov før avbildning.
    4. Skaff deg en strøm av bilder ved 100x forstørrelse. Varighet så lenge som 10 min kan oppnås med oppsettet som brukes i denne studien.
  2. MitoGCaMP-avbildning in vivo
    1. Følg trinn 4.1.1-4.1.2 etter behov for å få den basale mitoGCaMP-fluorescensen i mellomområdet for kameraets dynamiske område14.
      NOTAT. For det optiske oppsettet som ble brukt i denne studien, still inn 488 nm bildelaseren til følgende utgangsinnstillinger: lasereffekt = 20 % og demping = 10. Endre anskaffelsesinnstillingene til følgende: EM-forsterkning = 100 og forforsterkerforsterkning = 2.
    2. Etter at mitokondriene i AVA-nevritten er lokalisert ved hjelp av mitoGCaMP-fluorescensen, sett ZDC som beskrevet ovenfor i trinn 3.3.
    3. Skaff deg en strøm av bilder ved 100x forstørrelse.

5. Analyse av bildestrøm

  1. Åpne bildestrømmen i et passende bildeprogram for å analysere bildepunktverdiene i en bildeserie (se Materialfortegnelse).
  2. Bruk polygonmarkeringsverktøyet til å definere det subcellulære interesseområdet (ROI) som inneholder GCaMP eller mitoGCaMP.
  3. Klikk på Analyser > verktøy > ROI Manager. I ROI Manager klikker du på Legg til og deretter Mer > Multimål. I Multi Measure-vinduet klikker du på OK for automatisk å samle inn gjennomsnittlig, minimum og maksimum pikselintensitet for avkastningen som er definert ovenfor for hvert bilde i bildestrømmen for videre analyse.
    NOTAT. Det anbefales at den gjennomsnittlige pikselintensiteten (Fgjennomsnitt) normaliseres til minimumsintensiteten (F min) for hver avkastning ved å bruke forholdet Fgjennomsnitt/Fmin for å ta hensyn til fluorescensforskjeller på grunn av plassering i z-planet. Kast bildestrømmene med ormebevegelser under avbildning, da dette også vil påvirke fluorescensmålingene.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Disse to protokollene muliggjør rask oppkjøp av differensial Ca2+ nivåer innenfor de subcellulære områdene og organeller av individuelle neuritter in vivo med høy romlig oppløsning. Den første protokollen tillater måling av cytoplasmatisk Ca2+ med høy temporal og romlig oppløsning. Dette demonstreres her ved å bruke det cellespesifikke uttrykket av GCaMP6f i de glutamatergiske AVA-kommandointernevronene15, hvis nevritter løper hele lengden av den ventrale nervestrengen. Den raske anskaffelsen av GCaMP6f-fluorescens (50 Hz) gjorde det mulig å oppdage retningsforplantningen av Ca2+-tilstrømning (figur 2A og tilleggsvideo 1). Den subcellulære kvantifiseringen av GCaMP6f-fluorescens viste at utbruddet av Ca 2+ tilstrømning ble forsinket i en del av nevritten bare 10 μm unna (figur 2B). I tillegg tillot denne protokollen flere observasjoner av compartmentalized Ca 2+ og subthreshold Ca2+ hendelser. For eksempel ble dendritiske ryggradslignende strukturer funnet langs AVA-nevritten sett å ha blink i GCaMP6f-fluorescens som oppstod uavhengig av nevrittaktivering og ikke førte til forplantning av Ca 2+ tilstrømning (figur 2C, D og tilleggsvideo 2).

Den andre protokollen tok sikte på raskt å måle de relative Ca2+ nivåene i de enkelte mitokondriene i enkeltnevritter. Ved å bruke en ormstamme med AVA-spesifikt uttrykk for den mitokondrielle matrise-lokaliserte Ca2+-indikatoren, muliggjorde mitoGCaMP rask påvisning av endringer i mitoGCaMP-fluorescens på nivået av individuelle mitokondrier i AVA-nevrittet. Denne avbildningsprotokollen avslørte forskjellige moduser av Ca2+ opptak i mitokondriene, i hvert fall i dette nevronet. For det første gir resultatene vist i figur 3A et eksempel på synkront opptak av en relativt stor mengde Ca2+ i en delmengde av mitokondrier. Mer spesifikt viste disse dataene at Ca2+ opptak i noen mitokondrier var synkronisert (Mito1 og Mito2; figur 3A,B og tilleggsvideo 3), mens nabomitokondriene ikke så ut til å ta opp Ca2+ (Mito3; Figur 3A,B). Tilsvarende ble undergrupper av mitokondrier sett å raskt ta opp og frigjøre små mengder Ca2+. Dette syntes også å være synkront (Mito1 og Mito3, figur 3C,D og tilleggsvideo 4), men igjen bare for en undergruppe av mitokondrier (Mito 2, figur 3C,D).

Figure 1
Figur 1 Montering og rulling av C. elegans for avbildning av ventralnervestrengen. (A) En illustrasjon av trinnene for å klargjøre agarputene og plukke en enkelt orm til en rullende løsning. (B) Et eksempel på en ormposisjon før den flyttes for avbildning. Den røde pilen indikerer behovet for en høyrerulling av ormen, noe som kan oppnås ved å skyve dekselet til høyre (blå pil). Skala bar = 50 μm. (C) Den riktige orienteringen som trengs for å visualisere den ventrale nervestrengen. Merk: Tarmen er på betrakterens høyre side (ved hjelp av et oppreist mikroskop) i den proksimale halvdelen og er deretter på venstre side i den distale halvdelen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Rask oppkjøp av GCaMP6f fluorescens med subcellulær oppløsning i AVA nevritt og ryggradslignende strukturer. (A) Representative bilder av GCaMP6f fluorescens ved AVAL og AVAR nevrittbifurkasjon. Skala bar = 5 μm. (B) Kvantifisering av GCaMP6f fluorescens normalisert til minimum fluorescens (F) for den regionen (Fmin) for de proksimale (oransje) og distale (blå) regionene definert i det nederste bildet i panel A. (C) Representative bilder av GCaMP6f fluorescens ved en ryggradslignende projeksjon i AVA-nevrittet. (D) Normalisert GCaMP6f fluorescens i nevritt (oransje) og ryggradslignende projeksjon (blå) fra de tilsvarende områdene i det nederste bildet av panel C. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3. Rask avbildning av kalsiumopptak i individuelle mitokondrier i AVA-nevritten. (A,C) Representative bilder av mitoGCaMP-fluorescens over tid. Skala bar = 50 μm. (B) Spor av normalisert GCaMP-fluorescens (F/F min) for de tilsvarende mitokondriene vist på det nederste bildet av panel A. (D) F/Fmin over 40 s avbildning i områdene uthevet i det nederste bildet i panel C. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tilleggsvideo 1: GCaMP6f fluorescens i AVA-nevritt. Videoen ble gjengitt med 2x hastighet. Skala bar = 5 μm. Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.

Supplerende video 2: GCaMP6f fluorescens i en ryggradslignende projeksjon på AVA-nevritten. Videoen ble gjengitt med 2x hastighet. Skala bar = 5 μm. Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.

Tilleggsvideo 3: MitoGCaMP-fluorescens i AVA-nevrittsynkronisert mitokondrielt kalsiumopptak. Videoen ble gjengitt med 4x hastighet. Skala bar = 5 μm. Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.

Tilleggsvideo 4: MitoGCaMP-fluorescens i AVA-nevritt-raskt opptak og frigjøring av kalsium i mitokondriene. Videoen ble gjengitt med 4x hastighet. Skala bar = 5 μm. Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.

Tilleggstabell 1: Genetiske reagenser og stammer brukt i denne studien. Klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den første vurderingen ved implementering av metoden som er beskrevet, innebærer valg av en Ca2+ indikator med ideelle egenskaper for det gitte forskningsspørsmålet. Cytoplasmatiske Ca 2+-indikatorer har vanligvis høy affinitet for Ca 2+, og sensitiviteten til disse indikatorene til Ca 2+ er omvendt relatert til kinetikken (på/av-hastighet)16,17. Dette betyr at enten Ca2+ følsomhet eller kinetikk må prioriteres basert på fenomenet av interesse. For subcellulære rom med relativt høye basale Ca 2+ nivåer, som ER, bør Ca 2+ indikatorer med lav Ca 2+ affinitet vurderes18. For å generere rekombinant DNA for det cellespesifikke uttrykket av en Ca 2+ indikator, bør den foretrukne kloningsteknikken brukes til å sette inn en cellespesifikk promotor19,20 etterfulgt av Ca 2+ indikatoren for valg og en 3' UTR. Relativt høye ekspresjonsnivåer i AVA-nevronene kan oppnås ved å konstruere et plasmid med promotorene Pflp-18 eller Prig-3, en let-858 eller unc-54 3' UTR og mikroinjisere dette plasmidet ved 15-25 ng / μL (se tilleggstabell 1).

Den vellykkede mikroinjeksjonen av plasmidene som inneholder Ca 2+-indikatoren og lin-15+ i gonaden til lin-15(n765ts) mutante ormer, vil gi et F1-avkom som uttrykker Ca 2+-indikatoren og reddes for multi-vulva-fenotypen. Bare en undergruppe (30% -80%) av F1-generasjonen vil overføre det syntetiske DNA til F2-generasjonen. Ekspresjonen av Ca2+-indikatoren bør vurderes i det reddede F2- eller F3-avkommet på plater med <60% overføring av syntetisk DNA ved montering og avbildning av fluorescensen hos 1 dag gamle voksne som reddes for multivulva-fenotypen. Det ideelle uttrykksnivået bestemmes ut fra egenskapene og plasseringen av Ca2+ indikatoren, samt det biologiske spørsmålet. Hvis rask bildeoppkjøp er ønsket, er relativt høyt uttrykk ideelt. Imidlertid har et ekstremt høyt uttrykk av Ca2+ indikatorer vist seg å forårsake subcellulær feillokalisering, så vel som ikke-spesifikt uttrykk i andre celler eller vev.

Genetisk kodede Ca 2+ indikatorer har vært mye brukt for in vivo analyser av Ca2+ i C. elegans, så vel som i andre modellorganismer. Noen av disse studiene har oppnådd overvåking av enkeltcelleoppløsning av Ca 2+ nivåer i nevroncellekroppen21,22,23,24. Målinger av Ca 2+ tilstrømning i nevrale underrom er oppnådd in vivo i C. elegans så vel som virveldyrsystemer, men bare ved å registrere Ca 2+ indikatoraktiviteten i en hel nevritt 25,26 eller populasjoner av dendritter 27. Selv om måling av Ca2+ aktivitet i nevrale cellelegemer og dendritter som helhet reflekterer cellens spiking aktivitet, tillater det ikke observasjon av dynamikken i Ca 2 + tilstrømning (dvs. retning eller forplantningshastighet) eller sub-terskel Ca2 + transienter. Få in vivo-studier har vært i stand til å skjelne Ca2+-håndtering i nevroner til den romlige og tidsmessige oppløsningen som er demonstrert her. Det skal bemerkes at den tidsmessige dynamikken til Ca 2+ tilstrømning i de fleste C. elegans nevroner28 ser ut til å være langsommere enn i virveldyrneuroner29, så det er sannsynlig at denne raske avbildningsprotokollen ville være utilstrekkelig for å fange lignende tidsdynamikk i virveldyrsystemer. Nylige fremskritt i to-foton mikroskopi tillater imidlertid ultra-rask (120 Hz), subcellulær avbildning av kalsium i individuelle hippocampus-dendritter i fritt oppførende mus30, noe som gir løfte om å oppnå lignende høyoppløselig Ca2 + -avbildning hos vertebrater.

Det er viktig å merke seg at denne ikke-ratiometriske tilnærmingen til in vivo Ca2+ avbildning krever bruk av muscimol, som hemmer sammentrekningen av kroppsveggmusklene, og dermed begrenser ormebevegelsen under avbildning31. Hvis det er overdreven bevegelse under avbildning (konsekvent bevegelse i mer enn ~ 20% av ormer), bør en ny rulleløsning gjøres med en nylig tint alikot av muscimol, og tiden som en orm bader i rulleløsningen før rulling bør forlenges. Muscimol er en GABA-reseptoragonist, noe som betyr at den hemmer GABAergiske nevroner, inkludert de som gir innspill til AVA-nevronene. I tillegg uttrykker mange eksitatoriske nevroner, inkludert AVA, lave nivåer av GABA-reseptorer, så det er sannsynlig at bruken av muscimol i denne protokollen reduserer nevronaktiviteten. Ved bruk av denne protokollen reduseres imidlertid den totale spontane aktiveringen av AVA med bare ~ 29% i nærvær av muscimol (upubliserte data). Aktiveringen av andre nevroner kan bli mer drastisk redusert av muscimol, og dette kan testes ved å erstatte muscimol for M9 i rulleløsningen og gjennomføre avbildning i nevroncellelegemet ved lav forstørrelse32. Et alternativ til å bruke muscimol ville være å bruke en ratiometrisk Ca2+ indikator33,34, som ville tillate fluorescenskorreksjon på grunn av ormbevegelse. Ulempen med denne tilnærmingen er at den krever et optisk oppsett som er i stand til å avbildning med dobbel bølgelengde og begrenser muligheten til å bruke en Ca2+ -indikator i kombinasjon med mange andre fluorescerende verktøy.

En stor begrensning av det beskrevne mikroskopisystemet er reduksjonen av utsendt lys fra spinnskiven, noe som resulterer i tap av informasjon. Dette systemet kan modifiseres for å tillate økt fangst av utsendt lys ved å implementere en plate med pinnehull med større diameter. Imidlertid vil denne endringen redusere den aksiale (z-plan) oppløsningen og øke bakgrunnsfluorescensen. Et annet mulig mikroskopioppsett for dette formålet vil være det hurtigsøkende lysarkmikroskopet, som har blitt forbedret de siste årene for å muliggjøre rask (opptil 50 Hz) avbildning in situ og in vivo35.

Å vurdere den spatiotemporale dynamikken til cytoplasmatisk og mitokondriell Ca 2+ vil gi en bedre forståelse av hvordan lokale Ca2+ transienter, og til og med subterskelhendelser, kan utløse kalsiumavhengig signalering eller modulere mitokondriebiologi. Denne subcellulære, in vivo Ca2+-avbildningen kan være spesielt nyttig for studiet av synaptisk plastisitet, aktivitetsavhengige endringer i nevronmetabolismen og den homeostatiske moduleringen av nevronal eksitabilitet. Videre undersøkelse av hvordan lokale, subcellulære miljøer tilpasser seg definerte tilstander av nevronaktivitet (dvs. romlig spesifikke konsentrasjoner og levetid på Ca 2+) vil gi innsikt i hvordan Ca2+ dyshomeostase fører til patogene endringer i nevronfunksjon. Evnen til å studere dette i en levende, intakt organisme er spesielt nyttig da det muliggjør langsgående studier som vil kaste lys over hvordan og hvorfor Ca2+ homeostase endres med naturlig aldring og sykdomsrelatert nevrodegenerasjon. Bruk av denne metoden for å studere aldring og neurodegenerasjon er noe begrenset til de tidlige biologiske aldre i C. elegans (<4 dager i voksen alder). Faktisk er den fysiske manipulasjonen under montering og posisjonering av ormene for avbildning vanskelig etter ca 5 dager i voksen alder når ormene blir slappe på grunn av redusert muskelton og neglebåndsintegritet.

Rask in vivo avbildning av dynamikken og subcellulær håndtering av Ca2+ vil være medvirkende til vår forståelse av hvordan neuronal excitability og intracellulær signalering er fint regulert romlig og temporalt. Denne protokollen kan være til nytte for et bredt spekter av forskning og forskere på mange områder på grunn av mangfoldet av Ca2+-avhengige prosesser og deres sentrale rolle i nevronfunksjonen. For eksempel vil anvendelsen av denne metoden i friske nevroner gi innsikt i hvorfor forhøyet cytoplasmatisk Ca2+ under aldring oppstår i forbindelse med nedsatt synaptisk plastisitet, ineffektiv mitokondriell respirasjon, samt andre dysfunksjoner36,37. I tillegg kan denne metoden brukes til å undersøke årsakene til aldersassosiert Ca2+ dyshomeostase38. Anvendelsen av denne metoden for spørsmål knyttet til aldring og nevrodegenerasjon er imidlertid noe begrenset til de tidlige stadiene av aldring (<5 dager i voksen alder)38. Som nevnt ovenfor er avbildning av eldre voksne ormer (>5 dager i voksen alder) vanskelig ved hjelp av vår rullemetode, men fremskritt i C. elegans mikrofluidikk viser løfte om avbildning med en lignende romlig oppløsning i opptil 12 dager i voksen alder39,40.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne oppgir ingen konkurrerende interesser.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health (NIH) (R01- NS115947 tildelt F. Hoerndli). Vi vil også takke Dr. Attila Stetak for pAS1-plasmidet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100x/1.40 Oil objective   Olympus   UPlanSApo
10x/0.40 Objective  Olympus   UPlanSApo
22 mm x 22 mm Cover glass  VWR  48366-227 
Agarose SFR  VWR  J234-100G 
Beam homogenizer Andor Technologies Borealis upgrade to CSU-X1
CleanBench laboratory table  TMC  With vibration control
Disposable culture tubes VWR  47729-572  13 mm x 100 mm
Environmental chamber Thermo Scientific 3940 Set to 20 °C
Filter wheel or slider ASI For 25 mm diameter filters
FJH 185 Caenorhabditis Genetics Center  FJH 185 Worm strain
FJH 597 Caenorhabditis Genetics Center FJH 597 Worm strain
GFP bandpass emission filter  Chroma  525 ± 50 nm (25 mm diameter)
ILE laser combiner  Andor Technologies  4 laser lines 
ILE solid state 488 nm laser Andor Technologies  50 mW
ImageJ National Institutes of Health Version 1.52a
IX83 Spinning disk confocal microscope  Olympus  With Yokogawa CSU-X1 spinning disc
iXon Ultra EMCCD camera  Andor Technologies 
Low auto-fluorescence immersion oil  Olympus  Z-81226
MetaMorph  Molecular Devices  Version 7.10.1 
Microscope control box Olympus IX3-CBH
Muscimol  MP Biomedical / Sigma 02195336-CF 
pAS1 AddGene 194970 Plasmid
pBSKS Stratagene
pCT61 Plasmid available from Hoerndli/Maricq lab upon request
pJM23 Plasmid available from Hoerndli/Maricq lab upon request
pKK1  AddGene  194969 Plasmid
Polybead microspheres  Polysciences Inc.  00876-15  0.094 µm
Stability chamber Norlake Scientific NSRI241WSW/8H Set to 15 °C
Stage controller ASI With filter wheel control
Standard microscope slide Premiere 9108W-E 75 mm x 25 mm x 1 mm
Touch panel controller Olympus I3-TPC
Z-drift corrector  Olympus  IX3-ZDC2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Berridge, M. J. Neuronal calcium signaling. Neuron. 21 (1), 13-26 (1998).
  2. Brini, M., Calì, T., Ottolini, D., Carafoli, E. Neuronal calcium signaling: Function and dysfunction. Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (15), 2787-2814 (2014).
  3. Brini, M., Calì, T., Ottolini, D., Carafoli, E. Intracellular calcium homeostasis and signaling. Metal Ions in Life Sciences. 12, 119-168 (2013).
  4. Berridge, M. J. The inositol trisphosphate/calcium signaling pathway in health and disease. Physiological Reviews. 96 (4), 1261-1296 (2016).
  5. Schrank, S., Barrington, N., Stutzmann, G. E. Calcium-handling defects and neurodegenerative disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 12 (7), 035212 (2020).
  6. Pchitskaya, E., Popugaeva, E., Bezprozvanny, I. Calcium signaling and molecular mechanisms underlying neurodegenerative diseases. Cell Calcium. 70, 87-94 (2018).
  7. Jadiya, P., et al. Impaired mitochondrial calcium efflux contributes to disease progression in models of Alzheimer's disease. Nature Communications. 10 (1), 3885 (2019).
  8. Zeiser, E., Frøkjær-Jensen, C., Jorgensen, E., Ahringer, J. MosSCI and gateway compatible plasmid toolkit for constitutive and inducible expression of transgenes in the C. elegans germline. PLoS One. 6 (5), 20082 (2011).
  9. Zhu, B., Cai, G., Hall, E. O., Freeman, G. J. In-FusionTM assembly: Seamless engineering of multidomain fusion proteins, modular vectors, and mutations. Biotechniques. 43 (3), 354-359 (2007).
  10. Evans, T. C. Transformation and Microinjection. WormBook. , (2006).
  11. Giordano-Santini, R., Dupuy, D. Selectable genetic markers for nematode transgenesis. Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (11), 1917-1927 (2011).
  12. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , (2006).
  13. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans: Transferring worms grown on NGM plates. WormBook. , (2006).
  14. Ogama, T. A beginner's guide to improving image acquisition in fluorescence microscopy. The Biochemist. 42 (6), 22-27 (2020).
  15. Mellem, J. E., Brockie, P. J., Madsen, D. M., Maricq, A. v Action potentials contribute to neuronal signaling in C. elegans. Nature Neuroscience. 11 (8), 865-867 (2009).
  16. Zhang, Y., et al. Fast and sensitive GCaMP calcium indicators for imaging neural populations. bioRxiv. , (2021).
  17. Kerruth, S., Coates, C., Dürst, C. D., Oertner, T. G., Török, K. The kinetic mechanisms of fast-decay red-fluorescent genetically encoded calcium indicators. Journal of Biological Chemistry. 294 (11), 3934-3946 (2019).
  18. de Juan-Sanz, J., et al. Axonal endoplasmic reticulum Ca2+ content controls release probability in CNS nerve terminals. Neuron. 93 (4), 867-881 (2017).
  19. Bhatla, N. C. elegans neural network. , Available from: http://wormweb.org/neurainet#c=BAG&m=1 (2014).
  20. Fung, W., Wexler, L., Heiman, M. G. Cell-type-specific promoters for C. elegans glia. Journal of Neurogenetics. 34 (3-4), 335-346 (2020).
  21. Ali, F., Kwan, A. C. Interpreting in vivo calcium signals from neuronal cell bodies, axons, and dendrites: a review. Neurophotonics. 7 (1), 011402 (2019).
  22. Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
  23. Mank, M., et al. A genetically encoded calcium indicator for chronic in vivo two-photon imaging. Nature Methods. 5 (9), 805-811 (2008).
  24. Birkner, A., Tischbirek, C. H., Konnerth, A. Improved deep two-photon calcium imaging in vivo. Cell Calcium. 64, 29-35 (2017).
  25. Ryan, K. C., Laboy, J. T., Norman, K. R. Deregulation of mitochondrial calcium handling due to presenilin loss disrupts redox homeostasis and promotes neuronal dysfunction. Antioxidants. 11 (9), 1642 (2022).
  26. Yang, H. H., et al. Subcellular imaging of voltage and calcium signals reveals neural processing in vivo. Cell. 166 (1), 245-257 (2016).
  27. Takahashi, N., Oertner, T. G., Hegemann, P., Larkum, M. E. Active cortical dendrites modulate perception. Science. 354 (6319), 1587-1590 (2016).
  28. Nicoletti, M., et al. Biophysical modeling of C. elegans neurons: Single ion currents and whole-cell dynamics of AWCon and RMD. PLoS One. 14 (7), 0218738 (2019).
  29. Church, P. J., Stanley, E. F. Single L-type calcium channel conductance with physiological levels of calcium in chick ciliary ganglion neurons. The Journal of Physiology. 496, 59-68 (1996).
  30. O'Hare, J. K., et al. Compartment-specific tuning of dendritic feature selectivity by intracellular Ca 2+ release. Science. 375 (6586), (2022).
  31. Mclntire, S. L., Jorgensen, E., Horvitz, H. R. Genes required for GABA function in Caenorhabditis elegans. Nature. 364 (6435), 334-337 (1993).
  32. Doser, R. L., Amberg, G. C., Hoerndli, F. J. Reactive oxygen species modulate activity-dependent AMPA receptor transport in C. elegans. The Journal of Neuroscience. 40 (39), 7405-7420 (2020).
  33. Wu, J., et al. A long Stokes shift red fluorescent Ca2+ indicator protein for two-photon and ratiometric imaging. Nature Communications. 5, 5262 (2014).
  34. Cho, J. -H., et al. The GCaMP-R family of genetically encoded ratiometric calcium indicators. ACS Chemical Biology. 12 (4), 1066-1074 (2017).
  35. Smith, J. J., et al. A light sheet fluorescence microscopy protocol for Caenorhabditis elegans larvae and adults. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 1012820 (2022).
  36. Müller, M., et al. Mitochondria and calcium regulation as basis of neurodegeneration associated with aging. Frontiers in Neuroscience. 12, 470 (2018).
  37. Nikoletopoulou, V., Tavernarakis, N. Calcium homeostasis in aging neurons. Frontiers in Genetics. 3, 200 (2012).
  38. Chen, C. -H., Chen, Y. -C., Jiang, H. -C., Chen, C. -K., Pan, C. -L. Neuronal aging: Learning from C. elegans. Journal of Molecular Signaling. 8 (1), 14 (2013).
  39. Saberi-Bosari, S., Huayta, J., San-Miguel, A. A microfluidic platform for lifelong high-resolution and high throughput imaging of subtle aging phenotypes in C. elegans. Lab on a Chip. 18 (20), 3090-3100 (2018).
  40. Sridhar, N., Fajrial, A. K., Doser, R. L., Hoerndli, F. J., Ding, X. Surface acoustic wave microfluidics for repetitive and reversible temporary immobilization of C. elegans. Lab on a Chip. 22 (24), 4882-4893 (2022).

Tags

Nevrovitenskap utgave 193
Subcellulær avbildning av nevronal kalsiumhåndtering <em>in vivo</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Doser, R., Knight, K. M., Deihl, E., … More

Doser, R., Knight, K. M., Deihl, E., Hoerndli, F. Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo. J. Vis. Exp. (193), e64928, doi:10.3791/64928 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter