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Neuroscience

Imagem Subcelular da Manipulação Neuronal de Cálcio In Vivo

Published: March 17, 2023 doi: 10.3791/64928
Automatic Translation
*1, *1,2, 1, 1
1Department of Biomedical Sciences, Colorado State University College of Veterinary Medicine and Biomedical Sciences, 2Cellular and Molecular Biology Graduate Program, Colorado State University College of Veterinary Medicine and Biomedical Sciences
* These authors contributed equally

Summary

Os métodos atuais descrevem uma abordagem não-ratiométrica para imagens subcompartimentais de cálcio de alta resolução in vivo em Caenorhabditis elegans usando indicadores de cálcio codificados geneticamente prontamente disponíveis.

Abstract

A imagem com cálcio (Ca 2+) tem sido amplamente utilizada para examinar a atividade neuronal, mas está ficando cada vez mais claro que a manipulação subcelular de Ca2+ é um componente crucial da sinalização intracelular. A visualização da dinâmica subcelular de Ca2+ in vivo, onde os neurônios podem ser estudados em seus circuitos nativos e intactos, tem se mostrado tecnicamente desafiadora em sistemas nervosos complexos. A transparência e o sistema nervoso relativamente simples do nematoide Caenorhabditis elegans permitem a expressão célula-específica e a visualização in vivo de marcadores e marcadores fluorescentes. Entre eles estão indicadores fluorescentes que foram modificados para uso no citoplasma, bem como em vários compartimentos subcelulares, como as mitocôndrias. Este protocolo permite a obtenção de imagens não ratiométricas de Ca 2+ in vivo com uma resolução subcelular que permite a análise da dinâmica de Ca2+ até o nível de espinhas dendríticas individuais e mitocôndrias. Aqui, dois indicadores geneticamente codificados disponíveis com diferentes afinidades de Ca 2+ são usados para demonstrar o uso deste protocolo para medir os níveis relativos de Ca2+ dentro do citoplasma ou matriz mitocondrial em um único par de interneurônios excitatórios (AVA). Juntamente com as manipulações genéticas e observações longitudinais possíveis em C. elegans, este protocolo de imagem pode ser útil para responder a perguntas sobre como o manuseio de Ca2+ regula a função neuronal e a plasticidade.

Introduction

Os íons cálcio (Ca2+) são carreadores de informação altamente versáteis em muitos tipos celulares. Nos neurônios, o Ca2+ é responsável pela liberação de neurotransmissores atividade-dependente, pela regulação da motilidade citoesquelética, pelo ajuste fino dos processos metabólicos, bem como por muitos outros mecanismos necessários para a adequada manutenção e função neuronal 1,2. Para garantir uma sinalização intracelular eficaz, os neurônios devem manter baixos níveis basais de Ca2+ em seu citoplasma3. Isso é realizado por mecanismos cooperativos de manipulação de Ca 2+, incluindo a captação de Ca2+ em organelas como o retículo endoplasmático (RE) e mitocôndrias. Esses processos, além do arranjo de canais iônicos permeáveis ao Ca 2+ na membrana plasmática, resultam em níveis heterogêneos de Ca2+ citoplasmático em todo o neurônio.

A heterogeneidade do Ca 2+ durante o repouso e a ativação neuronal permitem a regulação diversa e local-específica dos mecanismos dependentes do Ca 2+ 1. Um exemplo dos efeitos concentração-específicos do Ca 2+ é a liberação de Ca 2+ do RE através dos receptores inositol 1,4,5-trisfosfato (InsP 3). Baixos níveis de Ca2+ em combinação com InsP3 são necessários para a abertura do poro permeável ao cálcio do receptor. Alternativamente, altos níveis de Ca2+ inibem direta e indiretamente o receptor4. A importância da homeostase do Ca 2+ para a função neuronal adequada é apoiada por evidências que sugerem que a interrupção da manipulação e sinalização intracelular do Ca2+ é um passo precoce na patogênese de doenças neurodegenerativas e envelhecimento natural 5,6. Especificamente, a captação e liberação anormais de Ca2+ pelo PS e mitocôndrias estão ligadas ao aparecimento de disfunção neuronal na doença de Alzheimer, doença de Parkinson e doença de Huntington 6,7.

O estudo da dishomeostase de Ca 2+ durante o envelhecimento natural ou neurodegeneração requer a observação longitudinal dos níveis de Ca2+ com resolução subcelular em um organismo vivo e intacto, no qual a arquitetura celular nativa (isto é, o arranjo de sinapses e distribuição de canais iônicos) é mantida. Para este fim, este protocolo fornece orientação sobre o uso de dois sensores Ca2+ codificados geneticamente prontamente disponíveis para registro da dinâmica de Ca2+ in vivo com alta resolução espacial e temporal. Os resultados representativos obtidos usando o método descrito em C. elegans demonstram como a expressão de indicadores de Ca 2+ no citoplasma ou na matriz mitocondrial de neurônios individuais pode permitir a aquisição rápida de imagens fluorescentes (até 50 Hz) que ilustram a dinâmica do Ca 2+ com a capacidade adicional de discernir os níveis de Ca 2+ dentro de estruturas semelhantes à coluna vertebral e mitocôndrias individuais.

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Protocol

1. Criação de cepas transgênicas

  1. Usando um método de clonagem de escolha8,9, clone vetores de expressão para conter o promotor Pflp-18 ou Prig-3 (para sinal AVA-específico no cordão nervoso ventral), seguido pelo indicador de escolha Ca2+ e, em seguida, um UTR 3' (veja a discussão para obter mais informações)10. Uma lista de plasmídeos e suas fontes pode ser encontrada na Tabela Suplementar 1.
  2. Seguir o protocolo estabelecido para a criação de cepas transgênicas através da microinjeção de uma mistura de DNA (<100 ng/μL; ver Tabela Suplementar 1 para as concentrações de cada plasmídeo) contendo o transgene indicador Ca2+ (~20 ng/μL) e o DNA de resgate lin-15+ (marcador de seleção) na gônada de um adulto de 1 dia de idade C. elegans10 (genótipo: LIN-15 (N765TS); fenótipo: multivulva)10,11.
    NOTA. Manter os pais lin-15(n765ts) a 15 °C para suprimir a mutação sensível à temperatura.
  3. Manter os pais injetados a 20 °C até que a progênie F1 atinja a idade adulta para permitir a seleção transgênica usando a ausência do fenótipo multivulva.
  4. Clonalmente passam13 progênies F1 adultas que não possuem o fenótipo multivulva, pois indica a expressão do arranjo extracromossômico contendo o indicador Ca2+ 11.
  5. Avaliar a expressão do indicador Ca2+ na progênie F2 ou F3 que não têm o fenótipo multivulva montando e imageando adultos com 1 dia de idade, conforme descrito posteriormente na seção 3.
    NOTA. Uma expressão relativamente alta do indicador é necessária para a rápida aquisição de imagens, como descrito aqui (veja a discussão para mais detalhes).
  6. Realizar experimentos em gerações subsequentes das cepas transgênicas com uma expressão ótima do indicador Ca 2+ (ver a discussão para mais detalhes), mantendo as cepas em condições padrão (20 °C em placas NGM)12.

2. Configuração óptica

  1. Use um microscópio capaz de imagens de lapso de tempo de longo prazo.
    NOTA. Os dados representativos foram adquiridos utilizando-se microscópio confocal de disco giratório invertido equipado com lasers de excitação de 488 nm e 561 nm.
  2. Use uma objetiva de baixa ampliação (ou seja, 10x/0,40) para a localização bruta do worm.
  3. Para alcançar a resolução subcelular, alterne e localize os neurônios usando uma objetiva de alta magnificação.
    NOTA. Uma objetiva de óleo de 100x/1,40 NA foi utilizada para obter os dados representativos neste estudo.
  4. Adquira as imagens usando uma câmera ultrassensível capaz de aquisição rápida de imagens (>50 fps).
  5. Use um filtro de emissão padrão para o indicador Ca2+ de escolha (ou seja, um filtro de emissão de 525 nm ± 50 nm para GCaMP6f e mitoGCaMP).
  6. Adicione um corretor Z-drift (ZDC) para a aquisição de fluxos de imagem com mais de 10 s, pois a dessecação da almofada de ágar durante a sessão de imagem faz com que o neurito saia do foco em alguns segundos.
    NOTA. Se uma configuração de microscopia não permitir ZDC, ou se longos períodos de imagem (>20 min) forem desejados, aplique uma borda de graxa de silício ou vaselina derretida ao redor da almofada de ágar para retardar a dessecação.

3. Preparação de vermes para aquisição de imagens

  1. Preparação das almofadas de ágar
    1. Completar 3 ml de ágar a 10% dissolvendo ágar de grau molecular em M912 num tubo de cultura de vidro de 13 mm x 100 mm e micro-ondas durante vários segundos (ver Tabela de Materiais).
      NOTA. O ágar fundido pode ser mantido em um bloco de calor por até 1 h ou pode ser feito fresco cada vez que as almofadas de ágar são necessárias.
    2. Coloque uma lâmina de microscópio entre duas lâminas adicionais, cada uma com duas camadas de fita adesiva de laboratório (ver Figura 1A-i).
    3. Corte a ponta de uma ponta de pipeta de 1.000 μL (sem filtro) e use-a para pipetar uma pequena gota de ágar na tampa central (Figura 1A-i).
    4. Achate o ágar pressionando outra lâmina para baixo em cima do ágar (Figura 1A-ii).
    5. Após o resfriamento, corte o ágar em um pequeno disco usando a abertura de um tubo de cultura de vidro de 13 mm x 100 mm (Figura 1A-iii) e, em seguida, remova o ágar circundante.
  2. Preparando a solução de laminação de worms
    1. Dissolva o pó de muscimol em M9 para criar um estoque de 30 mM. Separar em alíquotas de 50 μL e conservar a 4 °C.
    2. Descongele uma nova alíquota de 30 mM de muscimol a cada 3-5 dias (e armazene a 20 °C enquanto estiver em uso).
    3. Diluir um estoque de muscimol de 30 mM na proporção de 1:1 com esferas de poliestireno para fazer a solução de laminação.
  3. Posicionando um worm para geração de imagens
    1. Colocar 1,6 μL da solução de laminação no centro da almofada de ágar.
      NOTA: A quantidade de líquido deve ser ajustada para imagens de animais mais jovens (menos) ou mais velhos (mais).
    2. Usando o worm pick preferido (isto é, um coletor de fio de vidro ou platina)13, transfira um verme da idade desejada sem o fenótipomultivulva 11 para a solução de rolamento na almofada de ágar (Figura 1A-iv).
      NOTA. Os dados representativos são de hermafroditas com 1 dia de idade (cepa GCaMP6f = FJH185; cepa mitoGCaMP; FJH597; ver Tabela Suplementar 1), que pode ser identificada pela presença de apenas uma fileira de ovos. Veja a discussão para obter mais detalhes sobre como trabalhar com vermes de diferentes idades.
    3. Aguarde ~5 min para que o muscimol reduza o movimento do verme e, em seguida, solte uma lamínula de 22 mm x 22 mm em cima da almofada de ágar, restringindo fisicamente o movimento do verme.
    4. Para obter imagens de neuritos no cordão nervoso ventral, enrole o verme na orientação mostrada na Figura 1B,C deslizando levemente a lamínula.
      NOTA. Para visualizar o cordão nervoso ventral, posicione o verme com a cabeça para cima e role o verme até que o intestino fique do lado direito da porção proximal e o esquerdo para a porção distal do verme (da perspectiva do observador). Inverter essa orientação (Figura 1C) para obtenção de imagens de neuritos no cordão nervoso dorsal.
  4. Montagem do verme em um microscópio
    1. Coloque uma gota de óleo de imersão na tampa antes de montá-la no palco do microscópio.
    2. Encontre o worm usando uma objetiva de baixa ampliação (10x) no campo brilhante.
    3. Mude para a objetiva de 100x e ajuste o foco.
    4. Localize o neurito AVA usando a iluminação do GCaMP ou mitoGCaMP com o laser de imagem de 488 nm.
      NOTA: Use pequenos ajustes para evitar esmagar o verme ou puxar a tampa.

4. Aquisição de fluxos de imagens de alta resolução

  1. In vivo Imagem do GCaMP
    1. Defina o tempo de exposição para 20 ms.
    2. Ajuste as configurações de aquisição e laser de imagem até que a fluorescência basal do GCaMP esteja na faixa intermediária da faixa dinâmica da câmera14. Consulte a discussão para obter sugestões sobre como otimizar os parâmetros de imagem usando outras configurações de microscopia.
      NOTA. Para o arranjo óptico utilizado neste estudo, ajuste o laser de imagem de 488 nm para as seguintes configurações de saída: potência do laser = 50% e atenuação = 1. Modifique as configurações de aquisição adicionais da seguinte forma: ganho de EM = 200 e ganho pré-amplificador = 1.
    3. Depois que o neurito AVA for localizado usando a fluorescência GCaMP em aumento de 100x, ajuste o ZDC (consulte Tabela de Materiais) para uma faixa de ±30 μm e inicie o foco automático contínuo. Corrija manualmente o plano focal conforme necessário antes da geração de imagens.
    4. Adquira um fluxo de imagens com ampliação de 100x. Durações de até 10 min podem ser alcançadas com o setup utilizado neste estudo.
  2. Imagem in vivo do mitoGCaMP
    1. Siga as etapas 4.1.1-4.1.2 conforme necessário para adquirir a fluorescência mitoGCaMP basal na faixa intermediária para a faixa dinâmica da câmera14.
      NOTA. Para o set-up óptico utilizado neste estudo, ajuste o laser de imagem de 488 nm para as seguintes configurações de saída: potência do laser = 20% e atenuação = 10. Modifique as configurações de aquisição para o seguinte: ganho de EM = 100 e ganho pré-amplificador = 2.
    2. Depois que as mitocôndrias no neurito AVA forem localizadas usando a fluorescência mitoGCaMP, defina o ZDC como descrito acima na etapa 3.3.
    3. Adquira um fluxo de imagens com ampliação de 100x.

5. Análise do fluxo de imagens

  1. Abra o fluxo de imagens em um software de imagem apropriado para analisar os valores de pixel em uma série de imagens (consulte Tabela de materiais).
  2. Usando a ferramenta Polygon Selection , defina a região subcelular de interesse (ROI) contendo GCaMP ou mitoGCaMP.
  3. Clique em Analisar > Ferramentas > ROI Manager. No Gerenciador de ROI, clique em Adicionar e, em seguida, em Mais > Multimedida. Na janela Multimedida, clique em OK para coletar automaticamente as intensidades média, mínima e máxima de pixels do ROI definido acima para cada quadro do fluxo de imagem para análise adicional.
    NOTA. Recomenda-se que a intensidade média dos pixels (F méd) seja normalizada para a intensidade mínima (F min) para cada ROI usando a razão Fméd/Fmin para explicar as diferenças de fluorescência devido ao posicionamento no plano z. Descarte os fluxos de imagem com movimento de verme durante a imagem, pois isso também afetaria as medições de fluorescência.

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Representative Results

Estes dois protocolos permitem a rápida aquisição de níveis diferenciais de Ca2+ dentro das regiões subcelulares e organelas de neuritos individuais in vivo com alta resolução espacial. O primeiro protocolo permite a dosagem citoplasmática de Ca2+ com alta resolução temporal e espacial. Isso é demonstrado aqui usando a expressão célula-específica de GCaMP6f nos interneurônios de comando glutamatérgico AVA15, cujos neuritos percorrem toda a extensão do cordão nervoso ventral. A rápida aquisição da fluorescência GCaMP6f (50 Hz) permitiu a detecção da propagação direcional do influxo de Ca 2+ (Figura 2A e Vídeo Suplementar 1). A quantificação subcelular da fluorescência GCaMP6f revelou que o início do influxo de Ca 2+ foi retardado em uma porção do neurito a apenas 10 μm de distância (Figura 2B). Além disso, este protocolo permitiu várias observações de eventos compartimentados de Ca2+ e Ca2+ sublimiares. Por exemplo, estruturas dendríticas semelhantes à coluna vertebral encontradas ao longo do neurito AVA apresentaram flashes na fluorescência GCaMP6f que ocorreram independentemente da ativação do neurito e não levaram à propagação do influxo de Ca 2+ (Figura 2C,D e Vídeo Suplementar 2).

O segundo protocolo teve como objetivo medir rapidamente os níveis relativos de Ca2+ nas mitocôndrias individuais em neuritos únicos. O uso de uma cepa de verme com expressão específica de AVA do indicador de Ca2+ localizado na matriz mitocondrial mitoGCaMP permitiu a detecção rápida de alterações na fluorescência de mitoGCaMP no nível de mitocôndrias individuais dentro do neurito AVA. Este protocolo de imagem revelou diferentes modos de captação de Ca2+ para as mitocôndrias, pelo menos neste neurônio. Primeiro, os resultados mostrados na Figura 3A fornecem um exemplo da captação síncrona de uma quantidade relativamente grande de Ca2+ em um subconjunto de mitocôndrias. Mais especificamente, esses dados revelaram que a captação de Ca2+ em algumas mitocôndrias estava sincronizada (Mito1 e Mito2; Figura 3A,B e Vídeo Suplementar 3), enquanto as mitocôndrias vizinhas não parecem absorver Ca2+ (Mito3; Figura 3A,B). Da mesma forma, subconjuntos de mitocôndrias foram vistos para absorver rapidamente e liberar pequenas quantidades de Ca2+. Isso também pareceu ser sincrônico (Mito1 e Mito3, Figura 3C,D e Vídeo Suplementar 4), mas novamente apenas para um subconjunto de mitocôndrias (Mito 2, Figura 3C,D).

Figure 1
Figura 1: Montagem e rolamento de C. elegans para obtenção de imagens do cordão nervoso ventral. (A) Uma ilustração das etapas para preparar as almofadas de ágar e escolher um único verme em uma solução de rolamento. (B) Um exemplo de posição de um verme antes de ser reposicionado para aquisição de imagens. A seta vermelha indica a necessidade de um rolo para a direita do verme, o que pode ser conseguido deslizando a lamínula para a direita (seta azul). Barra de escala = 50 μm. (C) A orientação correta necessária para a visualização do cordão nervoso ventral. Nota: O intestino está no lado direito do observador (usando um microscópio vertical) na metade proximal e é então no lado esquerdo na metade distal. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Aquisição rápida da fluorescência GCaMP6f com resolução subcelular em neuritos AVA e estruturas semelhantes à coluna vertebral. (A) Imagens representativas da fluorescência GCaMP6f na bifurcação de neuritos AVAL e AVAR. Barra de escala = 5 μm. (B) Quantificação da fluorescência GCaMP6f normalizada para a fluorescência mínima (F) para essa região (Fmin) para as regiões proximal (laranja) e distal (azul) definidas na imagem inferior do painel A. (C) Imagens representativas da fluorescência GCaMP6f em uma projeção semelhante à coluna vertebral no neurito AVA. (D) Fluorescência GCaMP6f normalizada no neurito (laranja) e na projeção em forma de coluna (azul) das regiões correspondentes na imagem inferior do painel C. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Gráfico 3. Imagem rápida da captação de cálcio em mitocôndrias individuais dentro do neurito AVA. (A,C) Imagens representativas da fluorescência do mitoGCaMP ao longo do tempo. Barra de escala = 50 μm. (B) Traços de fluorescência normalizada do GCaMP (F/F min) para as mitocôndrias correspondentes mostradas na imagem inferior do painel A. (D) F/Fmin mais de 40 s de imagem nas regiões destacadas na imagem inferior no painel C. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Vídeo suplementar 1: Fluorescência GCaMP6f no neurito AVA. O vídeo foi renderizado em velocidade 2x. Barra de escala = 5 μm. Clique aqui para baixar este vídeo.

Vídeo suplementar 2: Fluorescência GCaMP6f em uma projeção semelhante à coluna vertebral no neurito AVA. O vídeo foi renderizado em velocidade 2x. Barra de escala = 5 μm. Clique aqui para baixar este vídeo.

Vídeo Suplementar 3: Fluorescência do MitoGCaMP na captação de cálcio mitocondrial sincronizada com neuritos AVA. O vídeo foi renderizado em velocidade 4x. Barra de escala = 5 μm. Clique aqui para baixar este vídeo.

Vídeo Suplementar 4: Fluorescência do MitoGCaMP na captação rápida de neuritos AVA e liberação de cálcio pelas mitocôndrias. O vídeo foi renderizado em velocidade 4x. Barra de escala = 5 μm. Clique aqui para baixar este vídeo.

Tabela suplementar 1: Reagentes genéticos e cepas utilizadas neste estudo. Clique aqui para baixar este arquivo.

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Discussion

A primeira consideração ao implementar o método descrito envolve a seleção de um indicador Ca2+ com características ideais para a pergunta de pesquisa dada. Os indicadores citoplasmáticos de Ca 2+ tipicamente têm alta afinidade por Ca 2+, e a sensibilidade desses indicadores ao Ca2+ está inversamente relacionada à cinética (taxa liga/desliga)16,17. Isso significa que a sensibilidade ou a cinética do Ca2+ precisarão ser priorizadas com base no fenômeno de interesse. Para compartimentos subcelulares com níveis basais relativamente altos de Ca 2+, como o RE, indicadores de Ca 2+ com baixa afinidade por Ca2+ devem ser considerados18. Para gerar DNA recombinante para a expressão célula-específica de um indicador Ca 2+, a técnica de clonagem preferida deve ser usada para inserir um promotor específico para célula19,20 seguido pelo indicador Ca 2+ de escolha e um UTR 3'. Níveis de expressão relativamente altos nos neurônios AVA podem ser alcançados construindo um plasmídeo com os promotores Pflp-18 ou Prig-3, um let-858, ou unc-54 3' UTR e microinjetando este plasmídeo em 15-25 ng/μL (ver Tabela Suplementar 1).

A microinjeção bem sucedida dos plasmídeos contendo o indicador Ca 2+ e lin-15+ na gônada de vermes mutantes lin-15(n765ts) produzirá uma progênie F1 que expressa o indicador Ca2+ e são resgatados para o fenótipo multivulva. Apenas um subconjunto (30%-80%) da geração F1 transmitirá o DNA sintético para a geração F2. A expressão do indicador Ca2+ deve ser avaliada na progênie F2 ou F3 resgatada em placas com <60% de transmissão do DNA sintético por meio da montagem e imageamento da fluorescência em adultos de 1 dia de idade resgatados para o fenótipo multivulva. O nível ideal de expressão é determinado com base nas propriedades e localização do indicador Ca2+, bem como na questão biológica. Se a aquisição rápida da imagem é desejada, então uma expressão relativamente alta é ideal. No entanto, uma expressão extremamente alta de indicadores de Ca2+ causou má localização subcelular, bem como expressão inespecífica em outras células ou tecidos.

Indicadores de Ca 2+ codificados geneticamente têm sido amplamente empregados para análises in vivo de Ca2+ em C. elegans, bem como em outros organismos modelo. Alguns desses estudos têm conseguido monitorar a resolução unicelular dos níveis de Ca 2+ no corpo celular neuronal21,22,23,24. Medidas do influxo de Ca 2+ em subcompartimentos neuronais têm sido obtidas in vivo em C. elegans, bem como em sistemas vertebrados, mas apenas registrando a atividade do indicador de Ca 2+ em um neurito inteiro 25,26 ou populações de dendritos 27. Embora a medição da atividade de Ca 2+ em corpos celulares neuronais e dendritos como um todo seja reflexo da atividade de pico da célula, ela não permite a observação da dinâmica do influxo de Ca 2+ (isto é, a direção ou taxa de propagação) ou transientes sub-limiar de Ca2+. Poucos estudos in vivo foram capazes de discernir o manuseio de Ca2+ em neurônios para a resolução espacial e temporal aqui demonstrada. Deve-se notar que a dinâmica temporal do influxo de Ca 2+ na maioria dos neurônios de C. elegans 28 parece ser mais lenta do que nos neurônios vertebrados29, então é provável que esse protocolo de imagem rápida seja insuficiente para capturar dinâmica temporal semelhante em sistemas vertebrados. No entanto, avanços recentes na microscopia de dois fótons permitem a obtenção de imagens subcelulares ultrarrápidas (120 Hz) de cálcio em dendritos hipocampais individuais em camundongos de comportamento livre30, o que fornece promessa para a obtenção de imagens semelhantes de alta resolução de Ca2+ em vertebrados.

É importante ressaltar que essa abordagem não ratiométrica para a imagem in vivo de Ca2+ requer o uso de muscimol, que inibe a contração dos músculos da parede corporal, limitando o movimento do verme durante a aquisição de imagens31. Se houver movimento excessivo durante a imagem (movimento consistente em mais de ~20% dos vermes), uma nova solução de rolamento deve ser feita com uma alíquota de muscimol recém-descongelada, e o tempo durante o qual um verme se banha na solução de rolamento antes de rolar deve ser estendido. Muscimol é um agonista do receptor GABA, o que significa que inibe os neurônios GABAérgicos, incluindo aqueles que fornecem entrada para os neurônios AVA. Além disso, muitos neurônios excitatórios, incluindo AVA, expressam baixos níveis de receptores GABA, então é provável que o uso de muscimol neste protocolo diminua a atividade neuronal. No entanto, usando este protocolo, a ativação espontânea global da AVA é reduzida em apenas ~29% na presença de muscimol (dados não publicados). A ativação de outros neurônios pode ser mais drasticamente diminuída pelo muscimol, e isso pode ser testado substituindo muscimol por M9 na solução de rolamento e conduzindo imagens no corpo celular neuronal em baixa magnificação32. Uma alternativa ao uso do muscimol seria o uso de um indicador ratiométrico Ca2+ 33,34, que permitiria a correção da fluorescência devido ao movimento do verme. A desvantagem dessa abordagem é que ela requer uma configuração óptica capaz de gerar imagens de comprimento de onda duplo e limita a capacidade de usar um indicador Ca2+ em combinação com muitas outras ferramentas fluorescentes.

Uma das principais limitações do sistema de microscopia descrito é a redução da luz emitida pelo disco giratório, o que resulta em perda de informação. Este sistema poderia ser modificado para permitir uma maior captação da luz emitida através da implementação de um disco com orifícios de pinos de maior diâmetro. No entanto, essa alteração diminuiria a resolução axial (plano z) e aumentaria a fluorescência de fundo. Outra configuração de microscopia possível para esse fim seria o microscópio de folha de luz de varredura rápida, que foi aprimorado nos últimos anos para permitir imagens rápidas (até 50 Hz) in situ e in vivo35.

A avaliação da dinâmica espaço-temporal do Ca 2+ citoplasmático e mitocondrial permitirá uma melhor compreensão de como os transitórios locais de Ca2+, e mesmo eventos sublimiares, podem desencadear sinalização dependente de cálcio ou modular a biologia mitocondrial. Esta imagem subcelular, in vivo, de Ca2+ poderia ser particularmente útil para o estudo da plasticidade sináptica, das alterações dependentes da atividade no metabolismo neuronal e da modulação homeostática da excitabilidade neuronal. Uma investigação mais aprofundada de como os ambientes subcelulares locais se adaptam em torno de estados definidos de atividade neuronal (ou seja, concentrações espacialmente específicas e tempo de vida de Ca 2+) forneceria informações sobre como a dishomeostase de Ca2+ leva a alterações patogênicas na função neuronal. A capacidade de estudar isso em um organismo vivo e intacto é especialmente útil, pois permite estudos longitudinais que lançariam luz sobre como e por que a homeostase do Ca2+ muda com o envelhecimento natural e a neurodegeneração relacionada à doença. A aplicação deste método para estudar o envelhecimento e a neurodegeneração é um pouco limitada às idades biológicas precoces em C. elegans (<4 dias da idade adulta). De fato, a manipulação física durante a montagem e posicionamento dos vermes para obtenção de imagens é difícil após cerca de 5 dias da idade adulta, quando os vermes ficam flácidos devido à diminuição do tônus muscular e integridade da cutícula.

Imagens rápidas in vivo da dinâmica e manipulação subcelular do Ca2+ serão fundamentais em nossa compreensão de como a excitabilidade neuronal e a sinalização intracelular são finamente reguladas espacial e temporalmente. Este protocolo poderia beneficiar uma ampla gama de pesquisas e pesquisadores em muitas áreas devido à diversidade de processos dependentes de Ca2+ e seu papel central na função neuronal. Por exemplo, a aplicação desse método em neurônios saudáveis forneceria informações sobre por que Ca2+ citoplasmático elevado durante o envelhecimento ocorre em conjunto com prejuízos na plasticidade sináptica, respiração mitocondrial ineficiente, bem como outras disfunções36,37. Além disso, esse método poderia ser usado para investigar as causas da dishomeostase Ca2+ associada à idade38. No entanto, a aplicação desse método para questões relacionadas ao envelhecimento e à neurodegeneração é um pouco limitada aos estágios iniciais do envelhecimento (<5 dias da vida adulta)38. Como mencionado acima, a obtenção de imagens de vermes adultos mais velhos (>5 dias da idade adulta) é difícil usando nosso método de rolamento, mas os avanços na microfluídica de C. elegans são promissores para imagens com resolução espacial semelhante para até 12 dias da idade adulta39,40.

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Disclosures

Os autores declaram não haver interesses concorrentes.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado pelo National Institutes of Health (NIH) (R01- NS115947 concedido a F. Hoerndli). Agradecemos também ao Dr. Attila Stetak pelo plasmídeo pAS1.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100x/1.40 Oil objective   Olympus   UPlanSApo
10x/0.40 Objective  Olympus   UPlanSApo
22 mm x 22 mm Cover glass  VWR  48366-227 
Agarose SFR  VWR  J234-100G 
Beam homogenizer Andor Technologies Borealis upgrade to CSU-X1
CleanBench laboratory table  TMC  With vibration control
Disposable culture tubes VWR  47729-572  13 mm x 100 mm
Environmental chamber Thermo Scientific 3940 Set to 20 °C
Filter wheel or slider ASI For 25 mm diameter filters
FJH 185 Caenorhabditis Genetics Center  FJH 185 Worm strain
FJH 597 Caenorhabditis Genetics Center FJH 597 Worm strain
GFP bandpass emission filter  Chroma  525 ± 50 nm (25 mm diameter)
ILE laser combiner  Andor Technologies  4 laser lines 
ILE solid state 488 nm laser Andor Technologies  50 mW
ImageJ National Institutes of Health Version 1.52a
IX83 Spinning disk confocal microscope  Olympus  With Yokogawa CSU-X1 spinning disc
iXon Ultra EMCCD camera  Andor Technologies 
Low auto-fluorescence immersion oil  Olympus  Z-81226
MetaMorph  Molecular Devices  Version 7.10.1 
Microscope control box Olympus IX3-CBH
Muscimol  MP Biomedical / Sigma 02195336-CF 
pAS1 AddGene 194970 Plasmid
pBSKS Stratagene
pCT61 Plasmid available from Hoerndli/Maricq lab upon request
pJM23 Plasmid available from Hoerndli/Maricq lab upon request
pKK1  AddGene  194969 Plasmid
Polybead microspheres  Polysciences Inc.  00876-15  0.094 µm
Stability chamber Norlake Scientific NSRI241WSW/8H Set to 15 °C
Stage controller ASI With filter wheel control
Standard microscope slide Premiere 9108W-E 75 mm x 25 mm x 1 mm
Touch panel controller Olympus I3-TPC
Z-drift corrector  Olympus  IX3-ZDC2

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References

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Neurociência Edição 193
Imagem Subcelular da Manipulação Neuronal de Cálcio <em>In Vivo</em>
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Doser, R., Knight, K. M., Deihl, E., … More

Doser, R., Knight, K. M., Deihl, E., Hoerndli, F. Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo. J. Vis. Exp. (193), e64928, doi:10.3791/64928 (2023).

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