Summary
Los métodos actuales describen un enfoque no ratiométrico para imágenes de calcio subcompartimentales de alta resolución in vivo en Caenorhabditis elegans utilizando indicadores de calcio codificados genéticamente fácilmente disponibles.
Abstract
Las imágenes de calcio (Ca 2+) se han utilizado en gran medida para examinar la actividad neuronal, pero cada vez está más claro que el manejo subcelular de Ca2+ es un componente crucial de la señalización intracelular. La visualización de la dinámica subcelular de Ca2+ in vivo, donde las neuronas pueden estudiarse en sus circuitos nativos e intactos, ha demostrado ser técnicamente desafiante en sistemas nerviosos complejos. La transparencia y el sistema nervioso relativamente simple del nematodo Caenorhabditis elegans permiten la expresión específica de la célula y la visualización in vivo de etiquetas e indicadores fluorescentes. Entre estos se encuentran indicadores fluorescentes que han sido modificados para su uso en el citoplasma, así como varios compartimentos subcelulares, como las mitocondrias. Este protocolo permite obtener imágenes no ratiométricas de Ca 2+ in vivo con una resolución subcelular que permite el análisis de la dinámica de Ca2+ hasta el nivel de las espinas dendríticas individuales y las mitocondrias. Aquí, se utilizan dos indicadores codificados genéticamente disponibles con diferentes afinidades de Ca 2+ para demostrar el uso de este protocolo para medir los niveles relativos de Ca2+ dentro del citoplasma o la matriz mitocondrial en un solo par de interneuronas excitatorias (AVA). Junto con las manipulaciones genéticas y las observaciones longitudinales posibles en C. elegans, este protocolo de imagen puede ser útil para responder preguntas sobre cómo el manejo de Ca2+ regula la función neuronal y la plasticidad.
Introduction
Los iones de calcio (Ca2+) son portadores altamente versátiles de información en muchos tipos de células. En las neuronas, el Ca2+ es responsable de la liberación dependiente de la actividad de los neurotransmisores, la regulación de la motilidad del citoesqueleto, el ajuste fino de los procesos metabólicos, así como muchos otros mecanismos necesarios para el mantenimiento y la función neuronal adecuados 1,2. Para garantizar una señalización intracelular efectiva, las neuronas deben mantener bajos los niveles basales de Ca2+ en su citoplasma3. Esto se logra mediante mecanismos cooperativos de manejo de Ca 2+, incluida la absorción de Ca2+ en orgánulos como el retículo endoplásmico (RE) y las mitocondrias. Estos procesos, además de la disposición de los canales iónicos permeables al Ca 2+ en la membrana plasmática, dan como resultado niveles heterogéneos de Ca2+ citoplasmático en toda la neurona.
La heterogeneidad de Ca 2+ durante el reposo y la activación neuronal permite la regulación diversa y específica de la ubicación de los mecanismos dependientes de Ca 2+ 1. Un ejemplo de los efectos específicos de la concentración de Ca 2+ es la liberación de Ca2+ del RE a través de los receptores de inositol 1,4,5-trifosfato (InsP 3). Se requieren niveles bajos de Ca2+ en combinación con InsP3 para la apertura del poro permeable al calcio del receptor. Alternativamente, los niveles altos de Ca2+ inhiben directa e indirectamente el receptor4. La importancia de la homeostasis del Ca 2+ para la función neuronal adecuada está respaldada por la evidencia que sugiere que la manipulación y señalización intracelular del Ca2+ interrumpido es un paso temprano en la patogénesis de los trastornos neurodegenerativos y el envejecimiento natural 5,6. Específicamente, la absorción y liberación anormal de Ca2+ por el RE y las mitocondrias están relacionadas con la aparición de disfunción neuronal en la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson y la enfermedad de Huntington 6,7.
El estudio de la dishomeostasis de Ca 2+ durante el envejecimiento natural o la neurodegeneración requiere la observación longitudinal de los niveles de Ca2+ con resolución subcelular en un organismo vivo e intacto en el que se mantiene la arquitectura celular nativa (es decir, la disposición de las sinapsis y la distribución de los canales iónicos). Con este fin, este protocolo proporciona orientación sobre el uso de dos sensores de Ca 2+ codificados genéticamente fácilmente disponibles para registrar la dinámica de Ca2+ in vivo con alta resolución espacial y temporal. Los resultados representativos adquiridos utilizando el método descrito en C. elegans demuestran cómo la expresión de indicadores de Ca 2+ en el citoplasma o matriz mitocondrial de neuronas individuales puede permitir la adquisición rápida de imágenes fluorescentes (hasta 50 Hz) que ilustran la dinámica de Ca 2+ con la capacidad adicional de discernir los niveles de Ca 2+ dentro de estructuras individuales similares a espinas y mitocondrias individuales.
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Protocol
1. Creación de cepas transgénicas
- Utilizando un método de clonación de la elección8,9, clonar vectores de expresión para contener el promotor Pflp-18 o Prig-3 (para señal específica de AVA en el cordón nervioso ventral), seguido del indicador de elección Ca2+, y luego un UTR 3' (ver la discusión para más información)10. Una lista de plásmidos y sus fuentes se puede encontrar en la Tabla Suplementaria 1.
- Seguir el protocolo establecido para la creación de cepas transgénicas mediante la microinyección de una mezcla de ADN (<100 ng/μL; ver Tabla Suplementaria 1 para las concentraciones de cada plásmido) que contiene el transgén indicador Ca2+ (~20 ng/μL) y el ADN de rescate lin-15+ (marcador de selección) en la gónada de un adulto de 1 día de edad C. elegans10 (genotipo: LIN-15 (N765TS); Fenotipo: Multivulva)10,11.
NOTA. Mantener los padres lin-15(n765ts) a 15 °C para suprimir la mutación sensible a la temperatura. - Mantener los padres inyectados a 20 °C hasta que la progenie F1 alcance la edad adulta para permitir la selección transgénica utilizando la ausencia del fenotipo multivulva.
- Clonalmente pasaje13 adultos F1 progenie que no tienen el fenotipo multivulva ya que esto indica la expresión de la matriz extracromosómica que contiene el indicador Ca2+ 11.
- Evaluar la expresión del indicador Ca2+ en la progenie F2 o F3 que no tienen el fenotipo multivulva mediante el montaje y la obtención de imágenes de adultos de 1 día de edad, como se describe más adelante en la sección 3.
NOTA. Se requiere una expresión relativamente alta del indicador para la adquisición rápida de imágenes como se describe aquí (ver la discusión para más detalles). - Realizar experimentos en generaciones posteriores de las cepas transgénicas con una expresión óptima del indicador Ca 2+ (ver la discusión para más detalles), manteniendo las cepas en condiciones estándar (20 °C en placas NGM)12.
2. Configuración óptica
- Use un microscopio capaz de obtener imágenes de lapso de tiempo a largo plazo.
NOTA. Los datos representativos se adquirieron utilizando un microscopio confocal de disco giratorio invertido equipado con láseres de excitación de 488 nm y 561 nm. - Utilice un objetivo de bajo aumento (es decir, 10x/0,40) para la localización cruda del gusano.
- Para lograr la resolución subcelular, cambie y localice las neuronas utilizando un objetivo de gran aumento.
NOTA. Se utilizó un objetivo de aceite 100x/1.40 NA para adquirir los datos representativos en este estudio. - Adquiera las imágenes utilizando una cámara ultrasensible capaz de adquirir imágenes rápidamente (>50 fps).
- Utilice un filtro de emisión estándar para el indicador de Ca2+ de elección (es decir, un filtro de emisión de 525 nm ± 50 nm para GCaMP6f y mitoGCaMP).
- Agregue un corrector de deriva Z (ZDC) para la adquisición de flujos de imágenes de más de 10 s, ya que la desecación de la almohadilla de agar durante la sesión de imágenes hace que la neurita se desenfoque en varios segundos.
NOTA. Si una configuración de microscopía no permite ZDC, o si se desean períodos de imagen largos (>20 minutos), aplique un borde de grasa de silicona o vaselina derretida alrededor de la almohadilla de agar para disminuir la desecación.
3. Preparación de gusanos para imágenes
- Preparación de las almohadillas de agar
- Hacer 3 ml de agar al 10% disolviendo agar de grado molecular en M912 en un tubo de cultivo de vidrio de 13 mm x 100 mm y calentar en el microondas durante varios segundos (ver Tabla de materiales).
NOTA. El agar fundido se puede mantener en un bloque de calor hasta 1 h o se puede hacer fresco cada vez que se necesitan almohadillas de agar. - Coloque un portaobjetos de microscopio entre dos portaobjetos adicionales que tengan dos capas de cinta de laboratorio (véase la figura 1A-i).
- Corte la punta de una punta de pipeta de 1.000 μL (sin filtro) y utilícela para pipetear una pequeña gota de agar sobre el cubreobjetos central (Figura 1A-i).
- Aplanar el agar presionando otro deslizamiento hacia abajo en la parte superior del agar (Figura 1A-ii).
- Después del enfriamiento, corte el agar en un disco pequeño usando la abertura de un tubo de cultivo de vidrio de 13 mm x 100 mm (Figura 1A-iii), y luego retire el agar circundante.
- Hacer 3 ml de agar al 10% disolviendo agar de grado molecular en M912 en un tubo de cultivo de vidrio de 13 mm x 100 mm y calentar en el microondas durante varios segundos (ver Tabla de materiales).
- Preparación de la solución de laminación de gusanos
- Disuelva el polvo de muscimol en M9 para crear un stock de 30 mM. Separar en alícuotas de 50 μL y conservar a 4 °C.
- Descongelar una nueva alícuota de muscimol de 30 mM cada 3-5 días (y conservar a 20 °C durante el uso).
- Diluir una culata de muscimol de 30 mM en una proporción de 1:1 con perlas de poliestireno para hacer la solución de laminación.
- Posicionamiento de un gusano para obtener imágenes
- Coloque 1,6 μL de la solución laminada en el centro de la almohadilla de agar.
NOTA: La cantidad de líquido debe ajustarse para obtener imágenes de animales más jóvenes (menos) o más viejos (más). - Usando el tornillo sin fin preferido (es decir, un pico de alambre de vidrio o platino)13, transfiera un gusano de la edad deseada sin el fenotipo11 de la vulva múltiple a la solución de laminación en la almohadilla de agar (Figura 1A-iv).
NOTA. Los datos representativos son de hermafroditas de 1 día de edad (cepa GCaMP6f = FJH185; cepa mitoGCaMP; FJH597; véase la Tabla suplementaria 1), que puede identificarse por la presencia de una sola fila de huevos. Consulte la discusión para obtener más detalles sobre cómo trabajar con gusanos de diferentes edades. - Espere ~ 5 minutos para que el muscimol reduzca el movimiento del gusano, y luego deje caer un cubreobjetos de 22 mm x 22 mm sobre la almohadilla de agar, restringiendo físicamente el movimiento del gusano.
- Para obtener imágenes de neuritas en el cordón nervioso ventral, haga rodar el gusano en la orientación que se muestra en la Figura 1B,C deslizando ligeramente el cubreobjetos.
NOTA. Para visualizar el cordón nervioso ventral, coloque el gusano con la cabeza hacia arriba y haga rodar el gusano hasta que el intestino esté en el lado derecho de la porción proximal y a la izquierda para la porción distal del gusano (desde la perspectiva del espectador). Invierta esta orientación (Figura 1C) para obtener imágenes de neuritas en el cordón nervioso dorsal.
- Coloque 1,6 μL de la solución laminada en el centro de la almohadilla de agar.
- Montaje del gusano en un microscopio
- Coloque una gota de aceite de inmersión en el cubreobjetos antes de montarlo en la plataforma del microscopio.
- Encuentre el gusano utilizando un objetivo de bajo aumento (10x) en campo claro.
- Cambia al objetivo 100x y ajusta el enfoque.
- Localice la neurita AVA utilizando la iluminación del GCaMP o mitoGCaMP con el láser de imágenes de 488 nm.
NOTA: Utilice pequeños ajustes para evitar aplastar el gusano o arrancar el cubreobjetos.
4. Adquisición de flujos de imágenes de alta resolución
- In vivo Imágenes GCaMP
- Ajuste el tiempo de exposición a 20 ms.
- Ajuste el láser de imágenes y los ajustes de adquisición hasta que la fluorescencia GCaMP basal esté en el rango medio del rango dinámico14 de la cámara. Consulte la discusión para obtener sugerencias sobre cómo optimizar los parámetros de imagen utilizando otras configuraciones de microscopía.
NOTA. Para la configuración óptica utilizada en este estudio, ajuste el láser de imágenes de 488 nm en los siguientes ajustes de salida: potencia del láser = 50% y atenuación = 1. Modifique los ajustes de adquisición adicionales de la siguiente manera: ganancia EM = 200 y ganancia del preamplificador = 1. - Después de localizar la neurita AVA utilizando la fluorescencia GCaMP con un aumento de 100x, ajuste el ZDC (consulte la Tabla de materiales) a un rango de ±30 μm e inicie el enfoque automático continuo. Corrija manualmente el plano focal según sea necesario antes de obtener imágenes.
- Adquiera un flujo de imágenes con un aumento de 100x. Se pueden lograr duraciones de hasta 10 minutos con la configuración utilizada en este estudio.
- Imágenes mitoGCaMP in vivo
- Siga los pasos 4.1.1-4.1.2 según sea necesario para adquirir la fluorescencia mitoGCaMP basal en el rango medio para el rango dinámico14 de la cámara.
NOTA. Para la configuración óptica utilizada en este estudio, ajuste el láser de imágenes de 488 nm a los siguientes ajustes de salida: potencia del láser = 20% y atenuación = 10. Modifique la configuración de adquisición a lo siguiente: ganancia EM = 100 y ganancia del preamplificador = 2. - Después de localizar las mitocondrias en la neurita AVA utilizando la fluorescencia mitoGCaMP, configure el ZDC como se describe anteriormente en el paso 3.3.
- Adquiera un flujo de imágenes con un aumento de 100x.
- Siga los pasos 4.1.1-4.1.2 según sea necesario para adquirir la fluorescencia mitoGCaMP basal en el rango medio para el rango dinámico14 de la cámara.
5. Análisis del flujo de imágenes
- Abra la secuencia de imágenes en un software de imagen adecuado para analizar los valores de píxeles en una serie de imágenes (consulte Tabla de materiales).
- Con la herramienta Selección de polígonos, defina la región de interés subcelular (ROI) que contiene GCaMP o mitoGCaMP.
- Haga clic en Analizar herramientas > > ROI Manager. En el Administrador de ROI, haga clic en Agregar y, a continuación, en Más > Multimedida. En la ventana Multimedida, haga clic en Aceptar para recopilar automáticamente las intensidades de píxeles promedio, mínimo y máximo del ROI definido anteriormente para cada fotograma de la secuencia de imágenes para su posterior análisis.
NOTA. Se recomienda que la intensidad media de píxeles (Fpromedio) se normalice a la intensidad mínima (F min) para cada ROI utilizando la relación Favg/Fmin para tener en cuenta las diferencias de fluorescencia debidas al posicionamiento en el plano z. Descarte los flujos de imágenes con el movimiento del gusano durante la obtención de imágenes, ya que esto también afectaría las mediciones de fluorescencia.
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Representative Results
Estos dos protocolos permiten la adquisición rápida de niveles diferenciales de Ca2+ dentro de las regiones subcelulares y orgánulos de neuritas individuales in vivo con alta resolución espacial. El primer protocolo permite la medición de Ca2+ citoplasmático con alta resolución temporal y espacial. Esto se demuestra aquí utilizando la expresión celular específica de GCaMP6f en las interneuronas15 del comando AVA glutamatérgico, cuyas neuritas recorren toda la longitud del cordón nervioso ventral. La rápida adquisición de fluorescencia GCaMP6f (50 Hz) permitió la detección de la propagación direccional de la afluencia de Ca2+ (Figura 2A y Video Suplementario 1). La cuantificación subcelular de la fluorescencia GCaMP6f reveló que el inicio de la afluencia de Ca 2+ se retrasó en una porción de la neurita a solo 10 μm de distancia (Figura 2B). Además, este protocolo permitió varias observaciones de eventos compartimentados de Ca 2+ y Ca2+ subumbral. Por ejemplo, se observó que las estructuras dendríticas similares a la columna vertebral encontradas a lo largo de la neurita AVA tenían destellos en la fluorescencia GCaMP6f que ocurrieron independientemente de la activación de la neurita y no condujeron a una propagación de la afluencia de Ca 2+ (Figura 2C, D y Video Suplementario 2).
El segundo protocolo tenía como objetivo medir rápidamente los niveles relativos de Ca2+ en las mitocondrias individuales en neuritas individuales. El uso de una cepa de gusano con expresión específica de AVA del indicador de Ca2+ mitoGCaMP localizado en la matriz mitocondrial permitió la detección rápida de cambios en la fluorescencia de mitoGCaMP a nivel de mitocondrias individuales dentro de la neurita AVA. Este protocolo de imagen reveló diferentes modos de captación de Ca2+ en las mitocondrias, al menos en esta neurona. En primer lugar, los resultados mostrados en la Figura 3A proporcionan un ejemplo de la captación sincrónica de una cantidad relativamente grande de Ca2+ en un subconjunto de mitocondrias. Más específicamente, estos datos revelaron que la captación de Ca2+ en algunas mitocondrias estaba sincronizada (Mito1 y Mito2; Figura 3A, B y Video Suplementario 3), mientras que las mitocondrias vecinas no parecían ocupar Ca2+ (Mito3; Figura 3A,B). Del mismo modo, se observó que los subconjuntos de mitocondrias absorben y liberan rápidamente pequeñas cantidades de Ca2+. Esto también parecía ser sincrónico (Mito1 y Mito3, Figura 3C, D y Video Suplementario 4), pero nuevamente solo para un subconjunto de mitocondrias (Mito 2, Figura 3C, D).
Figura 1: Montaje y rodamiento de C. elegans para obtener imágenes del cordón nervioso ventral. (A) Una ilustración de los pasos para preparar las almohadillas de agar y recoger un solo gusano en una solución laminada. (B) Un ejemplo de una posición de gusano antes de ser reposicionada para la obtención de imágenes. La flecha roja indica la necesidad de un giro hacia la derecha del gusano, que se puede lograr deslizando el cubreobjetos hacia la derecha (flecha azul). Barra de escala = 50 μm. (C) La orientación correcta necesaria para visualizar el cordón nervioso ventral. Nota: El intestino está en el lado derecho del espectador (usando un microscopio vertical) en la mitad proximal y luego está en el lado izquierdo en la mitad distal. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Adquisición rápida de fluorescencia GCaMP6f con resolución subcelular en neuritas AVA y estructuras similares a la columna vertebral. (A) Imágenes representativas de la fluorescencia GCaMP6f en la bifurcación de neuritas AVAL y AVAR. Barra de escala = 5 μm. (B) Cuantificación de la fluorescencia GCaMP6f normalizada a la fluorescencia mínima (F) para esa región (Fmin) para las regiones proximal (naranja) y distal (azul) definidas en la imagen inferior en el panel A. (C) Imágenes representativas de fluorescencia GCaMP6f en una proyección similar a una columna vertebral en la neurita AVA. (D) Fluorescencia GCaMP6f normalizada en la neurita (naranja) y la proyección en forma de columna vertebral (azul) de las regiones correspondientes en la imagen inferior del panel C. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Imágenes rápidas de la absorción de calcio en mitocondrias individuales dentro de la neurita AVA. (A,C) Imágenes representativas de la fluorescencia de mitoGCaMP a lo largo del tiempo. Barra de escala = 50 μm. (B) Trazas de fluorescencia GCaMP normalizada (F/F min) para las mitocondrias correspondientes que se muestran en la imagen inferior del panel A. (D) F/Fmin más de 40 s de imágenes en las regiones resaltadas en la imagen inferior del panel C. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Video suplementario 1: Fluorescencia GCaMP6f en la neurita AVA. El video fue renderizado a una velocidad 2x. Barra de escala = 5 μm. Haga clic aquí para descargar este video.
Video suplementario 2: Fluorescencia GCaMP6f en una proyección similar a una columna vertebral en la neurita AVA. El video fue renderizado a una velocidad 2x. Barra de escala = 5 μm. Haga clic aquí para descargar este video.
Video complementario 3: Fluorescencia de MitoGCaMP en la captación de calcio mitocondrial sincronizada con neuritas AVA. El video fue renderizado a una velocidad 4x. Barra de escala = 5 μm. Haga clic aquí para descargar este video.
Video suplementario 4: Fluorescencia de MitoGCaMP en la neurita AVA: rápida captación y liberación de calcio por las mitocondrias. El video fue renderizado a una velocidad 4x. Barra de escala = 5 μm. Haga clic aquí para descargar este video.
Tabla suplementaria 1: Reactivos genéticos y cepas utilizadas en este estudio. Haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
La primera consideración al implementar el método descrito implica la selección de un indicador Ca2+ con características ideales para la pregunta de investigación dada. Los indicadores citoplasmáticos de Ca 2+ suelen tener una alta afinidad por el Ca 2+, y la sensibilidad de estos indicadores al Ca2+ está inversamente relacionada con la cinética (tasa de encendido/apagado)16,17. Esto significa que la sensibilidad o la cinética de Ca2+ deberán priorizarse en función del fenómeno de interés. Para compartimentos subcelulares con niveles basales relativamente altos de Ca 2+, como el RE, los indicadores de Ca 2+ con baja afinidad de Ca2+ deben considerarse18. Para generar ADN recombinante para la expresión celular específica de un indicador de Ca 2+, se debe utilizar la técnica de clonación preferida para insertar un promotor específico de células19,20 seguido del indicador de elección Ca 2+ y un UTR 3'. Se pueden lograr niveles de expresión relativamente altos en las neuronas AVA construyendo un plásmido con los promotores Pflp-18 o Prig-3, un let-858 o unc-54 3' UTR y microinyectando este plásmido a 15-25 ng/μL (ver Tabla suplementaria 1).
La microinyección exitosa de los plásmidos que contienen el indicador Ca 2+ y lin-15+ en la gónada de los gusanos mutantes lin-15 (n765ts) producirá una progenie F1 que expresa el indicador Ca2+ y se rescata para el fenotipo multivulva. Solo un subconjunto (30%-80%) de la generación F1 transmitirá el ADN sintético a la generación F2. La expresión del indicador Ca2+ debe evaluarse en la progenie F2 o F3 rescatada en placas con <60% de transmisión del ADN sintético mediante el montaje y la obtención de imágenes de la fluorescencia en adultos de 1 día de edad que son rescatados para el fenotipo multivulva. El nivel de expresión ideal se determina en función de las propiedades y la ubicación del indicador Ca2+, así como de la pregunta biológica. Si se desea una adquisición rápida de imágenes, entonces la expresión relativamente alta es ideal. Sin embargo, se ha encontrado que una expresión extremadamente alta de indicadores de Ca2+ causa una mala localización subcelular, así como una expresión no específica en otras células o tejidos.
Los indicadores de Ca 2+ codificados genéticamente se han empleado ampliamente para análisis in vivo de Ca2+ en C. elegans, así como en otros organismos modelo. Algunos de estos estudios han logrado un monitoreo de resolución unicelular de los niveles de Ca 2+ en el cuerpo celular neuronal21,22,23,24. Las mediciones de la afluencia de Ca 2+ en subcompartimentos neuronales se han logrado in vivo en C. elegans, así como en sistemas de vertebrados, pero solo registrando la actividad del indicador de Ca 2+ en una neurita completa25,26 o poblaciones de dendritas 27. Aunque medir la actividad de Ca 2+ en cuerpos celulares neuronales y dendritas en su conjunto refleja la actividad de aumento de la célula, no permite la observación de la dinámica de la afluencia de Ca 2+ (es decir, la dirección o velocidad de propagación) o transitorios de Ca2+ por debajo del umbral. Pocos estudios in vivo han sido capaces de discernir el manejo de Ca2+ en las neuronas a la resolución espacial y temporal demostrada aquí. Cabe señalar que la dinámica temporal de la afluencia de Ca 2+ en la mayoría de las neuronas de C. elegans 28 parece ser más lenta que en las neuronas de vertebrados29, por lo que es probable que este protocolo de imagen rápida sea insuficiente para capturar dinámicas temporales similares en sistemas de vertebrados. Sin embargo, los avances recientes en microscopía de dos fotones permiten la imagen subcelular ultrarrápida (120 Hz) del calcio en dendritas individuales del hipocampo en ratones que se comportan libremente30, lo que proporciona la promesa de lograr imágenes similares de alta resolución de Ca2+ en vertebrados.
Es importante señalar que este enfoque no ratiométrico para la imagen in vivo de Ca2+ requiere el uso de muscimol, que inhibe la contracción de los músculos de la pared del cuerpo, limitando así el movimiento del gusano durante la imagen31. Si hay un movimiento excesivo durante la obtención de imágenes (movimiento constante en más de ~ 20% de los gusanos), se debe hacer una nueva solución de laminación con una alícuota de muscimol recién descongelada, y se debe extender el tiempo durante el cual un gusano se baña en la solución de laminación antes de enrollar. Muscimol es un agonista del receptor GABA, lo que significa que inhibe las neuronas GABAérgicas, incluidas las que proporcionan información a las neuronas AVA. Además, muchas neuronas excitadoras, incluyendo AVA, expresan bajos niveles de receptores GABA, por lo que es probable que el uso de muscimol en este protocolo disminuya la actividad neuronal. Sin embargo, utilizando este protocolo, la activación espontánea general de AVA se reduce en solo ~ 29% en presencia de muscimol (datos no publicados). La activación de otras neuronas puede ser disminuida más drásticamente por muscimol, y esto puede probarse sustituyendo muscimol por M9 en la solución rodante y realizando imágenes en el cuerpo celular neuronal a bajo aumento32. Una alternativa al uso de muscimol sería utilizar un indicador ratiométrico de Ca2+ 33,34, que permitiría la corrección de fluorescencia debido al movimiento del gusano. La desventaja de este enfoque es que requiere una configuración óptica capaz de obtener imágenes de doble longitud de onda y limita la capacidad de usar un indicador Ca2+ en combinación con muchas otras herramientas fluorescentes.
Una limitación importante del sistema de microscopía descrito es la reducción de la luz emitida por el disco giratorio, lo que resulta en una pérdida de información. Este sistema podría modificarse para permitir una mayor captura de la luz emitida mediante la implementación de un disco con orificios de pasador de mayor diámetro. Sin embargo, esta alteración disminuiría la resolución axial (plano z) y aumentaría la fluorescencia de fondo. Otra posible configuración de microscopía para este propósito sería el microscopio de hoja de luz de escaneo rápido, que se ha mejorado en los últimos años para permitir imágenes rápidas (hasta 50 Hz) in situ e in vivo35.
La evaluación de la dinámica espaciotemporal del Ca 2+ citoplasmático y mitocondrial permitirá una mejor comprensión de cómo los transitorios locales de Ca2+, e incluso los eventos subumbrales, pueden desencadenar la señalización dependiente del calcio o modular la biología mitocondrial. Esta imagen subcelular, in vivo de Ca2+ podría ser particularmente útil para el estudio de la plasticidad sináptica, los cambios dependientes de la actividad en el metabolismo neuronal y la modulación homeostática de la excitabilidad neuronal. La investigación adicional de cómo los entornos subcelulares locales se adaptan en torno a estados definidos de actividad neuronal (es decir, concentraciones espacialmente específicas y vida útil de Ca 2+) proporcionaría información sobre cómo la dishomeostasis de Ca2+ conduce a cambios patogénicos en la función neuronal. La capacidad de estudiar esto en un organismo vivo e intacto es especialmente útil, ya que permite estudios longitudinales que arrojarían luz sobre cómo y por qué la homeostasis de Ca2+ cambia con el envejecimiento natural y la neurodegeneración relacionada con la enfermedad. La aplicación de este método para estudiar el envejecimiento y la neurodegeneración se limita en cierta medida a las edades biológicas tempranas en C. elegans (<4 días de la edad adulta). De hecho, la manipulación física durante el montaje y posicionamiento de los gusanos para obtener imágenes es difícil después de aproximadamente 5 días de edad adulta cuando los gusanos se vuelven flácidos debido a la disminución del tono muscular y la integridad de la cutícula.
Las imágenes rápidas in vivo de la dinámica y el manejo subcelular de Ca2+ serán fundamentales para comprender cómo la excitabilidad neuronal y la señalización intracelular están finamente reguladas espacial y temporalmente. Este protocolo podría beneficiar a una amplia gama de investigadores e investigadores en muchas áreas debido a la diversidad de procesos dependientes de Ca2+ y su papel central en la función neuronal. Por ejemplo, la aplicación de este método en neuronas sanas proporcionaría información sobre por qué el Ca2+ citoplasmático elevado durante el envejecimiento ocurre junto con alteraciones en la plasticidad sináptica, respiración mitocondrial ineficiente, así como otras disfunciones36,37. Además, este método podría ser utilizado para investigar las causas de la dishomeostasis Ca2+ asociada a la edad38. Sin embargo, la aplicación de este método para preguntas relacionadas con el envejecimiento y la neurodegeneración se limita un poco a las primeras etapas del envejecimiento (<5 días de la edad adulta)38. Como se mencionó anteriormente, la obtención de imágenes de gusanos adultos mayores (>5 días de la edad adulta) es difícil utilizando nuestro método de laminación, pero los avances en microfluídica de C. elegans son prometedores para obtener imágenes con una resolución espacial similar hasta 12 días de edad adulta39,40.
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Disclosures
Los autores declaran que no hay intereses contrapuestos.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud (NIH) (R01- NS115947 otorgado a F. Hoerndli). También nos gustaría agradecer al Dr. Attila Stetak por el plásmido pAS1.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100x/1.40 Oil objective | Olympus | UPlanSApo | |
| 10x/0.40 Objective | Olympus | UPlanSApo | |
| 22 mm x 22 mm Cover glass | VWR | 48366-227 | |
| Agarose SFR | VWR | J234-100G | |
| Beam homogenizer | Andor Technologies | Borealis upgrade to CSU-X1 | |
| CleanBench laboratory table | TMC | With vibration control | |
| Disposable culture tubes | VWR | 47729-572 | 13 mm x 100 mm |
| Environmental chamber | Thermo Scientific | 3940 | Set to 20 °C |
| Filter wheel or slider | ASI | For 25 mm diameter filters | |
| FJH 185 | Caenorhabditis Genetics Center | FJH 185 | Worm strain |
| FJH 597 | Caenorhabditis Genetics Center | FJH 597 | Worm strain |
| GFP bandpass emission filter | Chroma | 525 ± 50 nm (25 mm diameter) | |
| ILE laser combiner | Andor Technologies | 4 laser lines | |
| ILE solid state 488 nm laser | Andor Technologies | 50 mW | |
| ImageJ | National Institutes of Health | Version 1.52a | |
| IX83 Spinning disk confocal microscope | Olympus | With Yokogawa CSU-X1 spinning disc | |
| iXon Ultra EMCCD camera | Andor Technologies | ||
| Low auto-fluorescence immersion oil | Olympus | Z-81226 | |
| MetaMorph | Molecular Devices | Version 7.10.1 | |
| Microscope control box | Olympus | IX3-CBH | |
| Muscimol | MP Biomedical / Sigma | 02195336-CF | |
| pAS1 | AddGene | 194970 | Plasmid |
| pBSKS | Stratagene | ||
| pCT61 | Plasmid available from Hoerndli/Maricq lab upon request | ||
| pJM23 | Plasmid available from Hoerndli/Maricq lab upon request | ||
| pKK1 | AddGene | 194969 | Plasmid |
| Polybead microspheres | Polysciences Inc. | 00876-15 | 0.094 µm |
| Stability chamber | Norlake Scientific | NSRI241WSW/8H | Set to 15 °C |
| Stage controller | ASI | With filter wheel control | |
| Standard microscope slide | Premiere | 9108W-E | 75 mm x 25 mm x 1 mm |
| Touch panel controller | Olympus | I3-TPC | |
| Z-drift corrector | Olympus | IX3-ZDC2 |
References
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