Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Subcellulär avbildning av neuronal kalciumhantering in vivo

Published: March 17, 2023 doi: 10.3791/64928
Automatic Translation
*1, *1,2, 1, 1
1Department of Biomedical Sciences, Colorado State University College of Veterinary Medicine and Biomedical Sciences, 2Cellular and Molecular Biology Graduate Program, Colorado State University College of Veterinary Medicine and Biomedical Sciences
* These authors contributed equally

Summary

De nuvarande metoderna beskriver en icke-ratiometrisk metod för högupplöst, subkompartmentell kalciumavbildning in vivo i Caenorhabditis elegans med hjälp av lättillgängliga genetiskt kodade kalciumindikatorer.

Abstract

Kalcium (Ca2+) avbildning har till stor del använts för att undersöka neuronal aktivitet, men det blir allt tydligare att subcellulär Ca2 + hantering är en avgörande komponent i intracellulär signalering. Visualiseringen av subcellulär Ca2+ dynamik in vivo, där neuroner kan studeras i sina infödda, intakta kretsar, har visat sig vara tekniskt utmanande i komplexa nervsystem. Transparensen och det relativt enkla nervsystemet hos nematoden Caenorhabditis elegans möjliggör cellspecifikt uttryck och in vivo-visualisering av fluorescerande taggar och indikatorer. Bland dessa är fluorescerande indikatorer som har modifierats för användning i cytoplasman såväl som olika subcellulära fack, såsom mitokondrier. Detta protokoll möjliggör icke-ratiometrisk Ca 2+ avbildning in vivo med en subcellulär upplösning som möjliggör analys av Ca2+ dynamik ner till nivån för enskilda dendritiska ryggar och mitokondrier. Här används två tillgängliga genetiskt kodade indikatorer med olika Ca 2+ affiniteter för att demonstrera användningen av detta protokoll för att mäta relativa Ca2+ nivåer inom cytoplasman eller mitokondriell matris i ett enda par excitatoriska interneuroner (AVA). Tillsammans med de genetiska manipulationer och longitudinella observationer som är möjliga i C. elegans kan detta avbildningsprotokoll vara användbart för att svara på frågor om hur Ca2+ hantering reglerar neuronal funktion och plasticitet.

Introduction

Kalciumjoner (Ca2+) är mycket mångsidiga bärare av information i många celltyper. I neuroner är Ca2+ ansvarig för den aktivitetsberoende frisättningen av neurotransmittorer, regleringen av cytoskeletal motilitet, finjustering av metaboliska processer, liksom många andra mekanismer som krävs för korrekt neuronalt underhåll och funktion 1,2. För att säkerställa effektiv intracellulär signalering måste neuroner upprätthålla låga basala Ca2+ nivåer i sin cytoplasma3. Detta uppnås genom kooperativa Ca 2+ hanteringsmekanismer, inklusive upptag av Ca2+ i organeller såsom endoplasmatisk retikulum (ER) och mitokondrier. Dessa processer, förutom arrangemanget av Ca2+-permeabla jonkanaler i plasmamembranet, resulterar i heterogena nivåer av cytoplasmatiskCa2+ i hela neuronen.

Ca 2+ heterogenitet under vila och neuronal aktivering möjliggör mångfaldig, platsspecifik reglering av Ca2+-beroende mekanismer 1. Ett exempel på de koncentrationsspecifika effekterna av Ca 2+ är frisättningen av Ca2+ från ER genom inositol 1,4,5-trisfosfat (InsP3) receptorer. Låga Ca2+ nivåer i kombination med InsP3 krävs för öppning av receptorns kalciumpermeabla porer. Alternativt hämmar höga Ca2+ nivåer både direkt och indirekt receptorn4. Betydelsen av Ca 2+ homeostas för korrekt neuronal funktion stöds av bevis som tyder på att störd intracellulär Ca2+ hantering och signalering är ett tidigt steg i patogenesen av neurodegenerativa störningar och naturligt åldrande 5,6. Specifikt är onormalt upptag och frisättning av Ca2+ av ER och mitokondrier kopplade till uppkomsten av neuronal dysfunktion vid Alzheimers sjukdom, Parkinsons sjukdom och Huntingtons sjukdom 6,7.

Studien av Ca 2+ dyshomeostas under naturligt åldrande eller neurodegeneration kräver longitudinell observation av Ca2+ nivåer med subcellulär upplösning i en levande, intakt organism där den ursprungliga cellulära arkitekturen (dvs arrangemanget av synapser och distribution av jonkanaler) upprätthålls. För detta ändamål ger detta protokoll vägledning om användningen av två lättillgängliga, genetiskt kodade Ca 2+ sensorer för inspelning av Ca2+ dynamik in vivo med hög rumslig och tidsmässig upplösning. De representativa resultaten som förvärvats med den beskrivna metoden i C. elegans visar hur uttrycket av Ca 2+ indikatorer i cytoplasman eller mitokondriell matris av enskilda neuroner kan möjliggöra snabb förvärv av fluorescerande bilder (upp till 50 Hz) som illustrerar Ca 2+ dynamiken med den ytterligare förmågan att urskilja Ca 2+ nivåer inom enskilda ryggradsliknande strukturer och individuella mitokondrier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Skapa transgena stammar

  1. Med hjälp av valfri kloningsmetod8,9 ska klonuttrycksvektorer innehålla promotorn Pflp-18 eller Prig-3 (för AVA-specifik signal i den ventrala nervkabeln), följt av valfri Ca2+-indikator, och sedan en 3' UTR (se diskussionen för mer information)10. En förteckning över plasmider och deras källor finns i kompletterande tabell 1.
  2. Följ det etablerade protokollet för skapande av transgena stammar via mikroinjektion av en DNA-blandning (<100 ng/μl; se kompletterande tabell 1 för koncentrationerna av varje plasmid) innehållande Ca2+ indikatortransgenen (~20 ng/μL) och räddnings-DNA lin-15+ (selektionsmarkören) i gonaden hos en 1 dag gammal vuxen C. elegans10 (genotyp: LIN-15 (N765TS); fenotyp: multi-vulva)10,11.
    NOT. Håll lin-15 (n765ts) föräldrar vid 15 ° C för att undertrycka temperaturkänslig mutation.
  3. Håll de injicerade föräldrarna vid 20 °C tills F1-avkomman når vuxen ålder för att möjliggöra transgent urval utan multivulvafenotyp.
  4. Klonalt passage13 vuxen F1-avkomma som inte har multi-vulva-fenotypen, eftersom detta indikerar uttrycket av den extrakromosomala matrisen som innehåller Ca2+ indikator11.
  5. Bedöm uttrycket av Ca2+ -indikatorn hos F2- eller F3-avkomman som inte har multivulvafenotypen genom att montera och avbilda 1 dag gamla vuxna enligt beskrivningen senare i avsnitt 3.
    NOT. Ett relativt högt uttryck för indikatorn krävs för snabb insamling av bilder som beskrivs här (se diskussionen för mer detaljer).
  6. Utföra experiment på efterföljande generationer av de transgena stammarna med ett optimalt uttryck av Ca 2+ indikatorn (se diskussionen för mer detaljer), bibehålla stammarna under standardförhållanden (20 °C på NGM-plattor)12.

2. Optisk inställning

  1. Använd ett mikroskop som kan avbildning av långvarig tidsfördröjning.
    NOT. De representativa data förvärvades med hjälp av ett inverterat spinnskivkonfokalmikroskop utrustat med 488 nm och 561 nm excitationslasrar.
  2. Använd ett mål med låg förstoring (dvs. 10x/0,40) för grov lokalisering av masken.
  3. För att uppnå subcellulär upplösning, växla till och lokalisera neuronerna med hjälp av ett mål med hög förstoring.
    NOT. Ett oljemål på 100x/1,40 NA användes för att erhålla representativa data i denna studie.
  4. Hämta bilderna med en ultrakänslig kamera som kan ta snabba bilder (>50 fps).
  5. Använd ett standardemissionsfilter för valfri Ca2+ -indikator (dvs. ett 525 nm ± 50 nm emissionsfilter för GCaMP6f och mitoGCaMP).
  6. Lägg till en Z-driftkorrigerare (ZDC) för förvärv av bildströmmar längre än 10 s, eftersom uttorkningen av agardynan under bildsessionen får neuriten att glida ur fokus inom några sekunder.
    NOT. Om en mikroskopiuppsättning inte tillåter ZDC, eller om långa (>20 min) avbildningsperioder önskas, applicera sedan en kant av kiselfett eller smält vaselin runt agardynan för att bromsa uttorkningen.

3. Förberedelse av maskar för avbildning

  1. Förbereda agarkuddarna
    1. Gör 3 ml 10 % agar genom att lösa upp agar av molekylär kvalitet i M912 i ett 13 mm x 100 mm glasodlingsrör och mikrovågsugn i flera sekunder (se materialtabell).
      NOT. Smält agar kan förvaras på ett värmeblock i upp till 1 timme eller kan göras färskt varje gång agarkuddar behövs.
    2. Placera ett mikroskopglas mellan ytterligare två objektglas som var och en har två lager laboratorietejp (se figur 1A-i).
    3. Skär spetsen på en 1 000 μL pipettspets (utan filter) och använd den för att pipettera en liten droppe agar på mitttäcket (figur 1A-i).
    4. Platta till agarn genom att trycka ner en annan bild ovanpå agaren (figur 1A-ii).
    5. Efter kylning skär agaren i en liten skiva med öppningen av ett 13 mm x 100 mm glasodlingsrör (figur 1A-iii) och avlägsna sedan den omgivande agaren.
  2. Förbereda maskrullningslösningen
    1. Lös upp muscimolpulvret i M9 för att skapa en 30 mM buljong. Separera i 50 μl alikvoter och förvara vid 4 °C.
    2. Tina en ny alikvot på 30 mM muscimol var 3-5 dag (och förvara vid 20 °C under användning).
    3. Späd en 30 mM muscimolfond i förhållandet 1: 1 med polystyrenpärlor för att göra rulllösningen.
  3. Placera en mask för avbildning
    1. Placera 1,6 μl av den rullande lösningen på mitten av agardynan.
      OBS: Mängden vätska bör justeras för avbildning av yngre (mindre) eller äldre djur (mer).
    2. Använd den föredragna maskplockningen (dvs. en glas- eller platinatrådplockning)13 och överför en mask av önskad ålder utan multivulvafenotyp11 till rulllösningen på agardynan (figur 1A–iv).
      NOT. Representativa data är från 1 dag gamla hermafroditer (GCaMP6f-stam = FJH185; mitoGCaMP-stam; FJH597; se kompletterande tabell 1), som kan identifieras genom närvaron av endast en rad ägg. Se diskussionen för mer information om att arbeta med maskar i olika åldrar.
    3. Vänta i ~ 5 minuter tills muscimolen minskar maskrörelsen och släpp sedan en 22 mm x 22 mm täckglasning ovanpå agardynan, vilket fysiskt begränsar maskrörelsen.
    4. För avbildning av neuriter i den ventrala nervkabeln, rulla masken till den riktning som visas i figur 1B,C genom att lätt skjuta täckglaset.
      NOT. För att visualisera den ventrala nervkabeln, placera masken med huvudet uppåt och rulla masken tills tarmen är på höger sida av den proximala delen och vänster för den distala delen av masken (ur betraktarens perspektiv). Invertera denna orientering (figur 1C) för avbildning av neuriter i dorsala nervkabeln.
  4. Montering av masken på ett mikroskop
    1. Lägg en droppe nedsänkningsolja på täckglaset innan du monterar det på mikroskopsteget.
    2. Hitta masken med hjälp av ett mål med låg förstoring (10x) i ljusfältet.
    3. Byt till 100x-målet och justera fokus.
    4. Lokalisera AVA-neuriten med hjälp av belysningen av GCaMP eller mitoGCaMP med 488 nm bildlaser.
      OBS: Använd små justeringar för att förhindra att masken kläms eller dras av täckglaset.

4. Förvärv av högupplösta bildströmmar

  1. In vivo GCaMP-avbildning
    1. Ställ in exponeringstiden på 20 ms.
    2. Justera bildlasern och upptagningsinställningarna tills den basala GCaMP-fluorescensen ligger i mittområdet för kamerans dynamiska område14. Se diskussionen för förslag på optimering av bildparametrarna med hjälp av andra mikroskopiinställningar.
      NOT. För den optiska installationen som används i denna studie, ställ in 488 nm bildlaser till följande utgångsinställningar: lasereffekt = 50% och dämpning = 1. Ändra de ytterligare förstärkningsinställningarna enligt följande: EM-förstärkning = 200 och förförstärkarens förstärkning = 1.
    3. När AVA-neuriten har lokaliserats med GCaMP-fluorescens vid 100x förstoring, ställ in ZDC (se Materialförteckning) på ett område på ±30 μm och initiera kontinuerlig autofokusering. Korrigera fokalplanet manuellt efter behov innan du avbildar det.
    4. Hämta en ström av bilder med 100x förstoring. Varaktigheter så långa som 10 minuter kan uppnås med den inställning som används i denna studie.
  2. In vivo mitoGCaMP-avbildning
    1. Följ steg 4.1.1-4.1.2 efter behov för att få den basala mitoGCaMP-fluorescensen i mellanregistret för kamerans dynamiska område14.
      NOT. För den optiska uppställningen som används i denna studie, ställ in 488 nm bildlaser på följande utgångsinställningar: lasereffekt = 20% och dämpning = 10. Ändra förvärvsinställningarna till följande: EM-förstärkning = 100 och förförstärkarens förstärkning = 2.
    2. När mitokondrierna i AVA-neuriten har lokaliserats med hjälp av mitoGCaMP-fluorescensen ställs ZDC in enligt beskrivningen ovan i steg 3.3.
    3. Hämta en ström av bilder med 100x förstoring.

5. Analys av bildström

  1. Öppna bildströmmen i ett lämpligt bildprogram för att analysera pixelvärdena i en bildserie (se Materialförteckning).
  2. Använd verktyget Polygon Selection och definiera den subcellulära regionen av intresse (ROI) som innehåller GCaMP eller mitoGCaMP.
  3. Klicka på Analysera > verktyg > ROI Manager. I ROI-hanteraren klickar du på Lägg till och sedan på Mer > Multi Measure. I fönstret Multimått klickar du på OK för att automatiskt samla in genomsnittliga, lägsta och högsta pixelintensiteter för ROI som definieras ovan för varje bildruta i bildströmmen för vidare analys.
    NOT. Det rekommenderas att den genomsnittliga pixelintensiteten (F avg) normaliseras till den lägsta intensiteten (F min) för varje ROI med hjälp av förhållandet Favg/Fmin för att ta hänsyn till fluorescensskillnader på grund av positionering i z-planet. Kassera bildströmmarna med maskrörelse under avbildning eftersom detta också skulle påverka fluorescensmätningarna.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Dessa två protokoll möjliggör snabb förvärv av differentiella Ca2+ nivåer inom de subcellulära regionerna och organellerna hos enskilda neuriter in vivo med hög rumslig upplösning. Det första protokollet möjliggör mätning av cytoplasmatisk Ca2+ med hög tidsmässig och rumslig upplösning. Detta demonstreras här med hjälp av det cellspecifika uttrycket av GCaMP6f i glutamaterga AVA-kommandointerneuroner15, vars neuriter löper hela längden av den ventrala nervkabeln. Den snabba insamlingen av GCaMP6f-fluorescens (50 Hz) möjliggjorde detektering av riktningsutbredningen av Ca2+ tillströmning (figur 2A och kompletterande video 1). Den subcellulära kvantifieringen av GCaMP6f-fluorescens avslöjade att uppkomsten av Ca 2+ -tillströmningen fördröjdes i en del av neuriten bara 10 μm bort (figur 2B). Dessutom tillät detta protokoll flera observationer av uppdelade Ca 2+ och subtröskel Ca2+ händelser. Till exempel sågs dendritiska ryggradsliknande strukturer som hittades längs AVA-neuriten ha blixtar i GCaMP6f-fluorescens som inträffade oberoende av neuritaktivering och inte ledde till en utbredning av Ca 2+ tillströmning (figur 2C, D och kompletterande video 2).

Det andra protokollet syftade till att snabbt mäta de relativaCa2+-nivåerna i de enskilda mitokondrierna hos enstaka neuriter. Genom att använda en maskstam med AVA-specifikt uttryck av den mitokondriella matrislokaliserade Ca2+-indikatorn möjliggjorde mitoGCaMP snabb detektion av förändringar i mitoGCaMP-fluorescens vid nivån av enskilda mitokondrier inom AVA-neuriten. Detta avbildningsprotokoll avslöjade olika lägen för Ca2+ upptag i mitokondrierna, åtminstone i denna neuron. För det första ger resultaten som visas i figur 3A ett exempel på det synkrona upptaget av en relativt stor mängdCa2+ i en delmängd av mitokondrierna. Mer specifikt avslöjade dessa data att Ca2+ upptag i vissa mitokondrier synkroniserades (Mito1 och Mito2; Figur 3A,B och kompletterande video 3), medan angränsande mitokondrier inte tycktes ta upp Ca2+ (Mito3; Figur 3A,B). På liknande sätt sågs undergrupper av mitokondrier snabbt ta upp och frigöra små mängder Ca2+. Detta verkade också vara synkront (Mito1 och Mito3, figur 3C, D och kompletterande video 4), men återigen endast för en delmängd av mitokondrier (Mito 2, figur 3C, D).

Figure 1
Figur 1: Montering och rullning av C. elegans för avbildning av den ventrala nervkabeln. (A) En illustration av stegen för att förbereda agarkuddarna och plocka en enda mask till en rulllösning. (B) Ett exempel på en maskposition innan den flyttas för avbildning. Den röda pilen indikerar behovet av en högerrulle av masken, vilket kan uppnås genom att skjuta täckglaset åt höger (blå pil). Skalstapel = 50 μm. (C) Den korrekta orientering som behövs för att visualisera den ventrala nervkabeln. Obs: Tarmen är på betraktarens högra sida (med hjälp av ett upprätt mikroskop) i den proximala halvan och är sedan på vänster sida i den distala halvan. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Snabb insamling av GCaMP6f-fluorescens med subcellulär upplösning i AVA-neurit och ryggradsliknande strukturer. (A) Representativa bilder av GCaMP6f-fluorescens vid AVAL- och AVAR-neuritförgreningen. Skalstång = 5 μm. (B) Kvantifiering av GCaMP6f-fluorescens normaliserad till minsta fluorescens (F) för det området (Fmin) för de proximala (orange) och distala (blå) regionerna som definieras i den nedre bilden i panel A. (C) Representativa bilder av GCaMP6f-fluorescens vid en ryggradsliknande projektion i AVA-neuriten. (D) Normaliserad GCaMP6f-fluorescens i neurit (orange) och den ryggradsliknande projektionen (blå) från motsvarande regioner i den nedre bilden av panel C. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3. Snabb avbildning av kalciumupptag i enskilda mitokondrier inom AVA-neuriten. (A, C) Representativa bilder av mitoGCaMP-fluorescens över tid. Skalstapel = 50 μm. (B) Spår av normaliserad GCaMP-fluorescens (F/F min) för motsvarande mitokondrier som visas i den nedre bilden av panel A. (D) F/Fmin över 40 s avbildning i de områden som markeras i den nedre bilden i panel C. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Kompletterande video 1: GCaMP6f-fluorescens i AVA-neuriten. Videon renderades med 2x hastighet. Skalstång = 5 μm. Klicka här för att ladda ner den här videon.

Kompletterande video 2: GCaMP6f-fluorescens i en ryggradsliknande projektion på AVA-neuriten. Videon renderades med 2x hastighet. Skalstång = 5 μm. Klicka här för att ladda ner den här videon.

Kompletterande video 3: MitoGCaMP-fluorescens i AVA-neuritsynkroniserat mitokondriellt kalciumupptag. Videon renderades med 4x hastighet. Skalstång = 5 μm. Klicka här för att ladda ner den här videon.

Kompletterande video 4: MitoGCaMP-fluorescens i AVA-neurit-snabbt upptag och frisättning av kalcium av mitokondrierna. Videon renderades med 4x hastighet. Skalstång = 5 μm. Klicka här för att ladda ner den här videon.

Kompletterande tabell 1: Genetiska reagenser och stammar som användes i denna studie. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Det första övervägandet vid implementering av den beskrivna metoden innefattar val av en Ca2+ indikator med ideala egenskaper för den givna forskningsfrågan. Cytoplasmatiska Ca 2+ indikatorer har vanligtvis en hög affinitet för Ca 2+, och känsligheten hos dessa indikatorer för Ca 2+ är omvänt relaterad till kinetiken (på / av-hastighet) 16,17. Detta innebär att antingen Ca2+ känslighet eller kinetik måste prioriteras baserat på fenomenet intresse. För subcellulära fack med relativt höga basala Ca 2+ nivåer, såsom ER, bör Ca 2+ indikatorer med låg Ca 2+ affinitet övervägas18. För att generera rekombinant DNA för det cellspecifika uttrycket av en Ca 2+ indikator bör den föredragna kloningstekniken användas för att infoga en cellspecifik promotor19,20 följt av den valda Ca 2+ indikatorn och en 3'-UTR. Relativt höga uttrycksnivåer i AVA-neuronerna kan uppnås genom att konstruera en plasmid med promotorerna Pflp-18 eller Prig-3, en let-858 eller unc-54 3' UTR och mikroinjicera denna plasmid vid 15-25 ng / μL (se kompletterande tabell 1).

Den framgångsrika mikroinjektionen av plasmiderna som innehåller Ca 2+ indikatorn och lin-15+ i gonaden av lin-15 (n765ts) mutanta maskar kommer att ge en F1-avkomma som uttrycker Ca 2+ -indikatorn och räddas för multi-vulva fenotypen. Endast en delmängd (30% -80%) av F1-generationen kommer att överföra det syntetiska DNA: t till F2-generationen. Uttrycket av Ca2+ indikatorn bör bedömas i den räddade F2- eller F3-avkomman på plattor med <60% överföring av syntetiskt DNA genom montering och avbildning av fluorescensen hos 1 dag gamla vuxna som räddas för multi-vulva fenotypen. Den ideala uttrycksnivån bestäms utifrån egenskaperna och placeringen av Ca2+ -indikatorn, liksom den biologiska frågan. Om snabb bildförvärv önskas är relativt högt uttryck idealiskt. Ett extremt högt uttryck av Ca2+ indikatorer har dock visat sig orsaka subcellulär fellokalisering, såväl som icke-specifikt uttryck i andra celler eller vävnader.

Genetiskt kodade Ca 2+ indikatorer har använts i stor utsträckning för in vivo-analyser av Ca2+ i C. elegans, liksom i andra modellorganismer. Några av dessa studier har uppnått encellsupplösningsövervakning av Ca 2+ nivåer i den neuronala cellkroppen21,22,23,24. Mätningar av Ca 2+ tillströmning i neuronala underavdelningar har uppnåtts in vivo i C. elegans såväl som ryggradsdjur, men endast genom att registrera Ca 2+ indikatoraktivitet i en hel neurite 25,26 eller populationer av dendriter 27. Även om mätning av Ca 2+ -aktivitet i neuronala cellkroppar och dendriter som helhet återspeglar cellens spikningsaktivitet, tillåter det inte observation av dynamiken i Ca 2+ -tillströmningen (dvs utbredningsriktningen eller utbredningshastigheten) eller subtröskel Ca 2+ transienter. Få in vivo-studier har kunnat urskilja Ca2+ hantering i neuroner till den rumsliga och tidsmässiga upplösningen som demonstreras här. Det bör noteras att den tidsmässiga dynamiken för Ca 2+ tillströmning i de flesta C. elegans-neuroner 28 verkar vara långsammare än hos ryggradsdjurneuroner 29, så det är troligt att detta snabba avbildningsprotokoll skulle vara otillräckligt för att fånga liknande tidsdynamik i ryggradsdjursystem. De senaste framstegen inom tvåfotonmikroskopi möjliggör emellertid ultrasnabb (120 Hz), subcellulär avbildning av kalcium i enskilda hippocampus dendriter i fritt betande möss30, vilket ger löfte om att uppnå liknande högupplöst Ca2 + -avbildning hos ryggradsdjur.

Det är viktigt att notera att detta icke-ratiometriska tillvägagångssätt för in vivo Ca2+ -avbildning kräver användning av muscimol, vilket hämmar sammandragningen av kroppsväggsmusklerna, vilket begränsar maskrörelsen under avbildning31. Om det finns överdriven rörelse under avbildning (konsekvent rörelse i mer än ~ 20% av maskarna), bör en ny rulllösning göras med en nytinad alikvot av muscimol, och den tid som en mask badar i rulllösningen före rullning bör förlängas. Muscimol är en GABA-receptoragonist, vilket betyder att den hämmar GABAerga nervceller, inklusive de som ger input till AVA-neuronerna. Dessutom uttrycker många excitatoriska neuroner, inklusive AVA, låga nivåer av GABA-receptorer, så det är troligt att användningen av muscimol i detta protokoll minskar neuronaktiviteten. Med hjälp av detta protokoll reduceras dock den totala spontana aktiveringen av AVA med endast ~29% i närvaro av muscimol (opublicerade data). Aktiveringen av andra nervceller kan minskas mer drastiskt av muscimol, och detta kan testas genom att ersätta M9 med muscimol i den rullande lösningen och genomföra avbildning i den neuronala cellkroppen vid låg förstoring32. Ett alternativ till att använda muscimol skulle vara att använda en ratiometrisk Ca2+ indikator33,34, vilket skulle möjliggöra fluorescenskorrigering på grund av maskrörelse. Nackdelen med detta tillvägagångssätt är att det kräver en optisk inställning som kan avbilda dubbla våglängder och begränsar möjligheten att använda en Ca2 + -indikator i kombination med många andra fluorescerande verktyg.

En stor begränsning av mikroskopisystemet som beskrivs är minskningen av det utsända ljuset från den snurrande skivan, vilket resulterar i förlust av information. Detta system kan modifieras för att möjliggöra ökad infångning av utsänt ljus genom att implementera en skiva med stifthål med större diameter. Denna förändring skulle emellertid minska den axiella (z-plan) upplösningen och öka bakgrundsfluorescensen. En annan möjlig mikroskopiinställning för detta ändamål skulle vara det snabba skanningsljusarkmikroskopet, som har förbättrats de senaste åren för att möjliggöra snabb (upp till 50 Hz) avbildning in situ och in vivo35.

Att bedöma den spatiotemporala dynamiken hos cytoplasmatisk och mitokondriell Ca 2+ kommer att möjliggöra en bättre förståelse för hur lokala Ca2+ transienter, och till och med subtröskelhändelser, kan utlösa kalciumberoende signalering eller modulera mitokondriell biologi. Denna subcellulära, in vivo Ca2+ -avbildning kan vara särskilt användbar för studier av synaptisk plasticitet, aktivitetsberoende förändringar i neuronal metabolism och homeostatisk modulering av neuronal excitabilitet. Ytterligare undersökning av hur lokala, subcellulära miljöer anpassar sig kring definierade tillstånd av neuronal aktivitet (dvs rumsligt specifika koncentrationer och livslängd av Ca2 +) skulle ge insikt i hur Ca2+ dyshomeostas leder till patogena förändringar i neuronal funktion. Möjligheten att studera detta i en levande, intakt organism är särskilt användbar eftersom den möjliggör longitudinella studier som skulle belysa hur och varför Ca2+ homeostas förändras med naturligt åldrande och sjukdomsrelaterad neurodegeneration. Att tillämpa denna metod för att studera åldrande och neurodegeneration är något begränsad till de tidiga biologiska åldrarna i C. elegans (<4 dagar av vuxen ålder). Faktum är att den fysiska manipulationen under montering och positionering av maskarna för avbildning är svår efter cirka 5 dagars vuxen ålder när maskarna blir slappa på grund av minskad muskelton och nagelbandsintegritet.

Snabb in vivo-avbildning av dynamiken och subcellulär hantering av Ca2+ kommer att vara avgörande för vår förståelse av hur neuronal excitabilitet och intracellulär signalering regleras fint rumsligt och tidsmässigt. Detta protokoll kan gynna ett brett spektrum av forskning och forskare inom många områden på grund av mångfalden av Ca2 + -beroende processer och deras centrala roll i neuronal funktion. Till exempel skulle tillämpningen av denna metod i friska neuroner ge insikt i varför förhöjd cytoplasmatisk Ca2+ under åldrande sker i samband med försämringar i synaptisk plasticitet, ineffektiv mitokondriell andning, liksom andra dysfunktioner36,37. Dessutom kan denna metod användas för att undersöka orsakerna till åldersassocierad Ca2+ dyshomeostas38. Tillämpningen av denna metod på frågor som rör åldrande och neurodegeneration är dock något begränsad till de tidiga stadierna av åldrande (<5 dagar av vuxen ålder)38. Som nämnts ovan är avbildning av äldre vuxna maskar (>5 dagar av vuxen ålder) svårt med vår rullande metod, men framsteg inom C. elegans mikrofluidik visar löfte för avbildning med en liknande rumslig upplösning i upp till 12 dagar av vuxen ålder39,40.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar inte några konkurrerande intressen.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av National Institutes of Health (NIH) (R01- NS115947 tilldelad F. Hoerndli). Vi vill också tacka Dr. Attila Stetak för plasmiden pAS1.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100x/1.40 Oil objective   Olympus   UPlanSApo
10x/0.40 Objective  Olympus   UPlanSApo
22 mm x 22 mm Cover glass  VWR  48366-227 
Agarose SFR  VWR  J234-100G 
Beam homogenizer Andor Technologies Borealis upgrade to CSU-X1
CleanBench laboratory table  TMC  With vibration control
Disposable culture tubes VWR  47729-572  13 mm x 100 mm
Environmental chamber Thermo Scientific 3940 Set to 20 °C
Filter wheel or slider ASI For 25 mm diameter filters
FJH 185 Caenorhabditis Genetics Center  FJH 185 Worm strain
FJH 597 Caenorhabditis Genetics Center FJH 597 Worm strain
GFP bandpass emission filter  Chroma  525 ± 50 nm (25 mm diameter)
ILE laser combiner  Andor Technologies  4 laser lines 
ILE solid state 488 nm laser Andor Technologies  50 mW
ImageJ National Institutes of Health Version 1.52a
IX83 Spinning disk confocal microscope  Olympus  With Yokogawa CSU-X1 spinning disc
iXon Ultra EMCCD camera  Andor Technologies 
Low auto-fluorescence immersion oil  Olympus  Z-81226
MetaMorph  Molecular Devices  Version 7.10.1 
Microscope control box Olympus IX3-CBH
Muscimol  MP Biomedical / Sigma 02195336-CF 
pAS1 AddGene 194970 Plasmid
pBSKS Stratagene
pCT61 Plasmid available from Hoerndli/Maricq lab upon request
pJM23 Plasmid available from Hoerndli/Maricq lab upon request
pKK1  AddGene  194969 Plasmid
Polybead microspheres  Polysciences Inc.  00876-15  0.094 µm
Stability chamber Norlake Scientific NSRI241WSW/8H Set to 15 °C
Stage controller ASI With filter wheel control
Standard microscope slide Premiere 9108W-E 75 mm x 25 mm x 1 mm
Touch panel controller Olympus I3-TPC
Z-drift corrector  Olympus  IX3-ZDC2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Berridge, M. J. Neuronal calcium signaling. Neuron. 21 (1), 13-26 (1998).
  2. Brini, M., Calì, T., Ottolini, D., Carafoli, E. Neuronal calcium signaling: Function and dysfunction. Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (15), 2787-2814 (2014).
  3. Brini, M., Calì, T., Ottolini, D., Carafoli, E. Intracellular calcium homeostasis and signaling. Metal Ions in Life Sciences. 12, 119-168 (2013).
  4. Berridge, M. J. The inositol trisphosphate/calcium signaling pathway in health and disease. Physiological Reviews. 96 (4), 1261-1296 (2016).
  5. Schrank, S., Barrington, N., Stutzmann, G. E. Calcium-handling defects and neurodegenerative disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 12 (7), 035212 (2020).
  6. Pchitskaya, E., Popugaeva, E., Bezprozvanny, I. Calcium signaling and molecular mechanisms underlying neurodegenerative diseases. Cell Calcium. 70, 87-94 (2018).
  7. Jadiya, P., et al. Impaired mitochondrial calcium efflux contributes to disease progression in models of Alzheimer's disease. Nature Communications. 10 (1), 3885 (2019).
  8. Zeiser, E., Frøkjær-Jensen, C., Jorgensen, E., Ahringer, J. MosSCI and gateway compatible plasmid toolkit for constitutive and inducible expression of transgenes in the C. elegans germline. PLoS One. 6 (5), 20082 (2011).
  9. Zhu, B., Cai, G., Hall, E. O., Freeman, G. J. In-FusionTM assembly: Seamless engineering of multidomain fusion proteins, modular vectors, and mutations. Biotechniques. 43 (3), 354-359 (2007).
  10. Evans, T. C. Transformation and Microinjection. WormBook. , (2006).
  11. Giordano-Santini, R., Dupuy, D. Selectable genetic markers for nematode transgenesis. Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (11), 1917-1927 (2011).
  12. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , (2006).
  13. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans: Transferring worms grown on NGM plates. WormBook. , (2006).
  14. Ogama, T. A beginner's guide to improving image acquisition in fluorescence microscopy. The Biochemist. 42 (6), 22-27 (2020).
  15. Mellem, J. E., Brockie, P. J., Madsen, D. M., Maricq, A. v Action potentials contribute to neuronal signaling in C. elegans. Nature Neuroscience. 11 (8), 865-867 (2009).
  16. Zhang, Y., et al. Fast and sensitive GCaMP calcium indicators for imaging neural populations. bioRxiv. , (2021).
  17. Kerruth, S., Coates, C., Dürst, C. D., Oertner, T. G., Török, K. The kinetic mechanisms of fast-decay red-fluorescent genetically encoded calcium indicators. Journal of Biological Chemistry. 294 (11), 3934-3946 (2019).
  18. de Juan-Sanz, J., et al. Axonal endoplasmic reticulum Ca2+ content controls release probability in CNS nerve terminals. Neuron. 93 (4), 867-881 (2017).
  19. Bhatla, N. C. elegans neural network. , Available from: http://wormweb.org/neurainet#c=BAG&m=1 (2014).
  20. Fung, W., Wexler, L., Heiman, M. G. Cell-type-specific promoters for C. elegans glia. Journal of Neurogenetics. 34 (3-4), 335-346 (2020).
  21. Ali, F., Kwan, A. C. Interpreting in vivo calcium signals from neuronal cell bodies, axons, and dendrites: a review. Neurophotonics. 7 (1), 011402 (2019).
  22. Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
  23. Mank, M., et al. A genetically encoded calcium indicator for chronic in vivo two-photon imaging. Nature Methods. 5 (9), 805-811 (2008).
  24. Birkner, A., Tischbirek, C. H., Konnerth, A. Improved deep two-photon calcium imaging in vivo. Cell Calcium. 64, 29-35 (2017).
  25. Ryan, K. C., Laboy, J. T., Norman, K. R. Deregulation of mitochondrial calcium handling due to presenilin loss disrupts redox homeostasis and promotes neuronal dysfunction. Antioxidants. 11 (9), 1642 (2022).
  26. Yang, H. H., et al. Subcellular imaging of voltage and calcium signals reveals neural processing in vivo. Cell. 166 (1), 245-257 (2016).
  27. Takahashi, N., Oertner, T. G., Hegemann, P., Larkum, M. E. Active cortical dendrites modulate perception. Science. 354 (6319), 1587-1590 (2016).
  28. Nicoletti, M., et al. Biophysical modeling of C. elegans neurons: Single ion currents and whole-cell dynamics of AWCon and RMD. PLoS One. 14 (7), 0218738 (2019).
  29. Church, P. J., Stanley, E. F. Single L-type calcium channel conductance with physiological levels of calcium in chick ciliary ganglion neurons. The Journal of Physiology. 496, 59-68 (1996).
  30. O'Hare, J. K., et al. Compartment-specific tuning of dendritic feature selectivity by intracellular Ca 2+ release. Science. 375 (6586), (2022).
  31. Mclntire, S. L., Jorgensen, E., Horvitz, H. R. Genes required for GABA function in Caenorhabditis elegans. Nature. 364 (6435), 334-337 (1993).
  32. Doser, R. L., Amberg, G. C., Hoerndli, F. J. Reactive oxygen species modulate activity-dependent AMPA receptor transport in C. elegans. The Journal of Neuroscience. 40 (39), 7405-7420 (2020).
  33. Wu, J., et al. A long Stokes shift red fluorescent Ca2+ indicator protein for two-photon and ratiometric imaging. Nature Communications. 5, 5262 (2014).
  34. Cho, J. -H., et al. The GCaMP-R family of genetically encoded ratiometric calcium indicators. ACS Chemical Biology. 12 (4), 1066-1074 (2017).
  35. Smith, J. J., et al. A light sheet fluorescence microscopy protocol for Caenorhabditis elegans larvae and adults. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 1012820 (2022).
  36. Müller, M., et al. Mitochondria and calcium regulation as basis of neurodegeneration associated with aging. Frontiers in Neuroscience. 12, 470 (2018).
  37. Nikoletopoulou, V., Tavernarakis, N. Calcium homeostasis in aging neurons. Frontiers in Genetics. 3, 200 (2012).
  38. Chen, C. -H., Chen, Y. -C., Jiang, H. -C., Chen, C. -K., Pan, C. -L. Neuronal aging: Learning from C. elegans. Journal of Molecular Signaling. 8 (1), 14 (2013).
  39. Saberi-Bosari, S., Huayta, J., San-Miguel, A. A microfluidic platform for lifelong high-resolution and high throughput imaging of subtle aging phenotypes in C. elegans. Lab on a Chip. 18 (20), 3090-3100 (2018).
  40. Sridhar, N., Fajrial, A. K., Doser, R. L., Hoerndli, F. J., Ding, X. Surface acoustic wave microfluidics for repetitive and reversible temporary immobilization of C. elegans. Lab on a Chip. 22 (24), 4882-4893 (2022).

Tags

Neurovetenskap nummer 193
Subcellulär avbildning av neuronal kalciumhantering <em>in vivo</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Doser, R., Knight, K. M., Deihl, E., … More

Doser, R., Knight, K. M., Deihl, E., Hoerndli, F. Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo. J. Vis. Exp. (193), e64928, doi:10.3791/64928 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter