Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Nöronal Kalsiyum Kullanımının In Vivo Subsellüler Görüntülemesi

Published: March 17, 2023 doi: 10.3791/64928
Automatic Translation
*1, *1,2, 1, 1
1Department of Biomedical Sciences, Colorado State University College of Veterinary Medicine and Biomedical Sciences, 2Cellular and Molecular Biology Graduate Program, Colorado State University College of Veterinary Medicine and Biomedical Sciences
* These authors contributed equally

Summary

Mevcut yöntemler, kolayca bulunabilen genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergelerini kullanarak Caenorhabditis elegans'ta in vivo olarak yüksek çözünürlüklü, sub-kompartmanlı kalsiyum görüntüleme için orantılı olmayan bir yaklaşımı tanımlamaktadır.

Abstract

Kalsiyum (Ca 2 +) görüntüleme, nöronal aktiviteyi incelemek için büyük ölçüde kullanılmıştır, ancak hücre altı Ca2 + kullanımının hücre içi sinyallemenin çok önemli bir bileşeni olduğu giderek daha açık hale gelmektedir. Nöronların yerli, bozulmamış devrelerinde incelenebildiği hücre altıCa2 + dinamiklerinin in vivo olarak görselleştirilmesi, karmaşık sinir sistemlerinde teknik olarak zor olduğunu kanıtlamıştır. Nematodun Caenorhabditis elegans'ın saydamlığı ve nispeten basit sinir sistemi, floresan etiketlerinin ve göstergelerinin hücreye özgü ekspresyonunu ve in vivo görselleştirilmesini sağlar. Bunlar arasında, sitoplazmada ve mitokondri gibi çeşitli hücre altı bölmelerde kullanılmak üzere modifiye edilmiş floresan göstergeler bulunmaktadır. Bu protokol, Ca 2+ dinamiklerinin bireysel dendritik dikenler ve mitokondri seviyesine kadar analizine izin veren bir hücre altı çözünürlükle in vivo olarak orantısız Ca2 + görüntülemeyi mümkün kılar. Burada, farklı Ca 2 + afinitelerine sahip iki mevcut genetik olarak kodlanmış gösterge, bu protokolün tek bir uyarıcı internöron çiftinde (AVA) sitoplazma veya mitokondriyal matris içindeki göreceli Ca2 + seviyelerini ölçmek için kullanımını göstermek için kullanılır. C. elegans'ta mümkün olan genetik manipülasyonlar ve uzunlamasına gözlemlerle birlikte, bu görüntüleme protokolü, Ca2+ kullanımının nöronal fonksiyonu ve plastisiteyi nasıl düzenlediğine ilişkin soruları cevaplamak için yararlı olabilir.

Introduction

Kalsiyum iyonları (Ca2+), birçok hücre tipinde çok yönlü bilgi taşıyıcılarıdır. Nöronlarda, Ca2+, nörotransmitterlerin aktiviteye bağlı salınımından, sitoiskelet motilitesinin düzenlenmesinden, metabolik süreçlerin ince ayarından ve ayrıca uygun nöronal bakım ve fonksiyon 1,2 için gerekli diğer birçok mekanizmadan sorumludur. Etkili hücre içi sinyalleşmeyi sağlamak için, nöronlar sitoplazma3'lerinde düşük bazal Ca2 + seviyelerini korumalıdır. Bu, Ca2 + 'nın endoplazmik retikulum (ER) ve mitokondri gibi organellere alımı da dahil olmak üzere işbirlikçi Ca2 + taşıma mekanizmaları ile gerçekleştirilir. Bu işlemler, plazma zarındakiCa2 + geçirgen iyon kanallarının düzenlenmesine ek olarak, nöron boyunca heterojen sitoplazmik Ca2 + seviyelerine neden olur.

Dinlenme ve nöronal aktivasyon sırasında Ca 2 + heterojenliği, Ca2 + bağımlı mekanizmaların çeşitli, yere özgü düzenlenmesine izin verir1. Ca 2 + 'nın konsantrasyona özgü etkilerinin bir örneği, Ca2 + 'nın ER'den inositol 1,4,5-trisfosfat (InsP3) reseptörleri yoluyla salınmasıdır. Reseptörün kalsiyum geçirgen gözeneklerinin açılması için InsP3 ile kombinasyon halinde düşük Ca2 + seviyeleri gereklidir. Alternatif olarak, yüksek Ca2 + seviyeleri hem doğrudan hem de dolaylı olarak reseptör4'ü inhibe eder. Ca2+ homeostazının uygun nöronal fonksiyon için önemi, bozulmuş hücre içi Ca2+ kullanımı ve sinyalizasyonunun nörodejeneratif bozuklukların ve doğal yaşlanmanın patogenezinde erken bir adım olduğunu gösteren kanıtlarla desteklenmektedir 5,6. Spesifik olarak, ER ve mitokondri tarafından anormal Ca2 + alımı ve salınımı Alzheimer hastalığı, Parkinson hastalığı ve Huntington hastalığı 6,7'de nöronal disfonksiyonun başlangıcı ile bağlantılıdır.

Doğal yaşlanma veya nörodejenerasyon sırasında Ca 2+ dishomeostazının incelenmesi, doğal hücresel mimarinin (yani, sinapsların düzenlenmesi ve iyon kanallarının dağılımı) korunduğu canlı, sağlam bir organizmada hücre altı çözünürlükle Ca2 + seviyelerinin uzunlamasına gözlemlenmesini gerektirir. Bu amaçla, bu protokol, Ca 2+ dinamiklerini yüksek uzamsal ve zamansal çözünürlükle in vivo olarak kaydetmek için kolayca bulunabilen, genetik olarak kodlanmış iki Ca2+ sensörünün kullanımı konusunda rehberlik sağlar. C. elegans'ta tarif edilen yöntem kullanılarak elde edilen temsili sonuçlar, tek nöronların sitoplazmasında veya mitokondriyal matrisindeCa2+ göstergelerinin ekspresyonunun, tek omurga benzeri yapılar ve bireysel mitokondri içindeki Ca2+ seviyelerini ayırt etme yeteneği ile Ca2 + dinamiklerini gösteren floresan görüntülerin (50 Hz'e kadar) hızlı bir şekilde elde edilmesine nasıl izin verebileceğini göstermektedir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Transgenik suşların oluşturulması

  1. Tercih edilen 8,9 klonlama yöntemini kullanarak, Pflp-18 veya Prig-3 promotörünü (ventral sinir kordonundaki AVA'ya özgü sinyal için), ardından tercih edilen Ca2+ göstergesini ve ardından 3' UTR'yi (daha fazla bilgi için tartışmaya bakın) içerecek şekilde ekspresyon vektörlerini klonlayın10. Plazmidlerin ve kaynaklarının bir listesi Ek Tablo 1'de bulunabilir.
  2. Ca 2+ indikatör transgeni (~20 ng / μL) ve kurtarma DNA lin-15 + (seçim belirteci) içeren bir DNA karışımının (<100 ng / μL; her plazmidin konsantrasyonları için Ek Tablo 1'e bakınız) 1 günlük yetişkin C. elegans10'un gonadına mikroenjeksiyonu yoluyla transgenik suşların oluşturulması için belirlenmiş protokolü izleyin (genotip: Lin-15 (N765TS); Fenotip: Multi-vulva)10,11.
    NOT. Sıcaklığa duyarlı mutasyonu bastırmak için lin-15 (n765ts) ebeveynlerini 15 ° C'de tutun.
  3. Enjekte edilen ebeveynleri, çoklu vulva fenotipinin yokluğunu kullanarak transgenik seçime izin vermek için F1 soyu yetişkinliğe ulaşana kadar 20 ° C'de tutun.
  4. Klonal olarak geçiş: Çok vulva fenotipine sahip olmayan13 yetişkin F1 soyundan, Ca2 + göstergesi11'i içeren ekstrakromozomal dizinin ekspresyonunu gösterir.
  5. Çoklu-vulva fenotipine sahip olmayan F2 veya F3 döllerindeki Ca2+ göstergesinin ekspresyonunu, bölüm 3'te daha sonra açıklandığı gibi 1 günlük yetişkinleri monte ederek ve görüntüleyerek değerlendirin.
    NOT. Burada açıklandığı gibi görüntülerin hızlı bir şekilde elde edilmesi için göstergenin nispeten yüksek bir ifadesi gereklidir (daha fazla ayrıntı için tartışmaya bakın).
  6. Ca 2+ göstergesinin optimal bir ifadesiyle transgenik suşların sonraki nesilleri üzerinde deneyler yapın (daha fazla ayrıntı için tartışmaya bakın), suşları standart koşullar altında (NGM plakalarında20 °C) koruyun12.

2. Optik kurulum

  1. Uzun süreli hızlandırılmış görüntüleme yapabilen bir mikroskop kullanın.
    NOT. Temsili veriler, 488 nm ve 561 nm uyarma lazerleri ile donatılmış ters eğirme diskli konfokal mikroskop kullanılarak elde edildi.
  2. Solucanın ham lokalizasyonu için düşük büyütme hedefi (yani, 10x/0,40) kullanın.
  3. Hücre altı çözünürlük elde etmek için, yüksek büyütmeli bir hedef kullanarak nöronlara geçin ve onları lokalize edin.
    NOT. Bu çalışmada temsili verileri elde etmek için 100x/1.40 NA petrol hedefi kullanılmıştır.
  4. Hızlı görüntü yakalama (>50 fps) özelliğine sahip ultra hassas bir kamera kullanarak görüntüleri elde edin.
  5. Tercih edilen Ca2+ göstergesi için standart bir emisyon filtresi kullanın (yani, GCaMP6f ± mitoGCaMP için 525 nm 50 nm emisyon filtresi).
  6. Görüntüleme seansı sırasında agar pedinin kuruması nöritin birkaç saniye içinde odak dışına kaymasına neden olduğundan, 10 saniyeden daha uzun görüntü akışlarının elde edilmesi için bir Z-sürüklenme düzelticisi (ZDC) ekleyin.
    NOT. Bir mikroskopi kurulumu ZDC'ye izin vermiyorsa veya uzun (>20 dakika) görüntüleme periyotları isteniyorsa, kurutmayı yavaşlatmak için agar pedinin etrafına bir silikon yağ veya erimiş petrol jölesi sınırı uygulayın.

3. Görüntüleme için solucanların hazırlanması

  1. Agar pedlerinin hazırlanması
    1. M912'deki moleküler dereceli agar'ı 13 mm x 100 mm'lik bir cam kültür tüpünde çözerek ve birkaç saniye boyunca mikrodalgada pişirerek 3 mL% 10 agar yapın (bkz.
      NOT. Erimiş agar, 1 saate kadar bir ısı bloğunda tutulabilir veya agar pedlerine her ihtiyaç duyulduğunda taze hale getirilebilir.
    2. Her biri iki laboratuvar bandı katmanına sahip iki ek slaytın arasına bir mikroskop slaydı yerleştirin (bkz. Şekil 1A-i).
    3. 1.000 μL'lik pipet ucunun ucunu kesin (filtresiz) ve orta kapak kaymasına küçük bir damla agar damlası damlatmak için kullanın (Şekil 1A-i).
    4. Agarın üstüne başka bir sürgü bastırarak agar'ı düzleştirin (Şekil 1A-ii).
    5. Soğuduktan sonra, 13 mm x 100 mm'lik bir cam kültür tüpünün açıklığını kullanarak agar'ı küçük bir disk halinde kesin (Şekil 1A-iii) ve ardından çevreleyen agar'ı çıkarın.
  2. Sonsuz haddeleme çözeltisinin hazırlanması
    1. 30 mM'lik bir stok oluşturmak için mussimol tozunu M9'da çözün. 50 μL aliquots'a ayırın ve 4 °C'de saklayın.
    2. Her 3-5 günde bir 30 mM mussimol'lük yeni bir alikotu çözün (ve kullanımdayken 20 ° C'de saklayın).
    3. Haddeleme çözeltisini yapmak için 30 mM'lik bir mussimol stoğunu polistiren boncuklarla 1: 1 oranında seyreltin.
  3. Solucanı görüntüleme için konumlandırma
    1. Haddeleme çözeltisinin 1,6 μL'sini agar pedinin ortasına yerleştirin.
      NOT: Genç (daha az) veya daha yaşlı (daha fazla) hayvanların görüntülenmesi için sıvı miktarı ayarlanmalıdır.
    2. Tercih edilen solucan toplama (yani bir cam veya platin tel toplama)13 kullanarak, multi-vulva fenotip11 olmadan istenen yaştaki bir solucanı agar pedi üzerindeki yuvarlanma çözeltisine aktarın (Şekil 1A-iv).
      NOT. Temsili veriler 1 günlük hermafroditlerden (GCaMP6f suşu = FJH185; mitoGCaMP suşu; FJH597; Ek Tablo 1'e bakınız), sadece bir sıra yumurtanın varlığı ile tanımlanabilir. Farklı yaşlardaki solucanlarla çalışma hakkında daha fazla ayrıntı için tartışmaya bakın.
    3. Mussimolün solucan hareketini azaltması için ~ 5 dakika bekleyin ve ardından solucan hareketini fiziksel olarak kısıtlayan agar pedinin üzerine 22 mm x 22 mm'lik bir örtü kayması bırakın.
    4. Ventral sinir kordonundaki nöritleri görüntülemek için, solucanı Şekil 1B, C'de gösterilen yöne doğru yuvarlayın.
      NOT. Ventral sinir kordonunu görselleştirmek için, solucanı baş yukarı doğru olacak şekilde konumlandırın ve solucanı bağırsak proksimal kısmın sağ tarafında ve solucanın distal kısmı için solda olana kadar yuvarlayın (izleyicinin bakış açısından). Dorsal sinir kordonundaki nöritleri görüntülemek için bu oryantasyonu tersine çevirin (Şekil 1C).
  4. Solucanı mikroskop üzerine monte etme
    1. Mikroskop aşamasına monte etmeden önce kapak kapağına bir damla daldırma yağı koyun.
    2. Parlak alanda düşük büyütme hedefi (10x) hedefini kullanarak solucanı bulun.
    3. 100x reklam verme amacına geçin ve odağı ayarlayın.
    4. 488 nm görüntüleme lazeri ile GCaMP veya mitoGCaMP'nin aydınlatmasını kullanarak AVA nöritini bulun.
      NOT: Solucanın ezilmesini veya kapak kaymasının çekilmesini önlemek için küçük ayarlamalar kullanın.

4. Yüksek çözünürlüklü görüntü akışlarının elde edilmesi

  1. İn vivo GCaMP görüntüleme
    1. Maruz kalma süresini 20 ms olarak ayarlayın.
    2. Bazal GCaMP floresan kameranın dinamik aralığının orta aralığında olana kadar görüntüleme lazeri ve alma ayarlarını yapın14. Diğer mikroskopi kurulumlarını kullanarak görüntüleme parametrelerini optimize etme önerileri için tartışmaya bakın.
      NOT. Bu çalışmada kullanılan optik kurulum için, 488 nm görüntüleme lazerini aşağıdaki çıkış ayarlarına ayarlayın: lazer gücü =% 50 ve zayıflama = 1. Ek alım ayarlarını şu şekilde değiştirin: EM kazancı = 200 ve ön amplifikatör kazancı = 1.
    3. AVA nöriti GCaMP floresan kullanılarak 100x büyütmede konumlandırıldıktan sonra, ZDC'yi ( bkz. Malzeme Tablosu) ±30 μm aralığına ayarlayın ve sürekli otomatik netlemeyi başlatın. Görüntülemeden önce odak düzlemini gerektiği gibi manuel olarak düzeltin.
    4. 100x büyütmede bir görüntü akışı elde edin. Bu çalışmada kullanılan kurulum ile 10 dakikaya varan süreler elde edilebilmektedir.
  2. İn vivo mitoGCaMP görüntüleme
    1. Kameranın dinamik aralığı14 için orta aralıkta bazal mitoGCaMP floresansını elde etmek üzere gerektiği gibi 4.1.1-4.1.2 adımlarını izleyin.
      NOT. Bu çalışmada kullanılan optik kurulum için, 488 nm görüntüleme lazerini aşağıdaki çıkış ayarlarına ayarlayın: lazer gücü =% 20 ve zayıflama = 10. Alma ayarlarını şu şekilde değiştirin: EM kazancı = 100 ve ön amplifikatör kazancı = 2.
    2. AVA nöritindeki mitokondri mitoGCaMP floresan kullanılarak yerleştirildikten sonra, ZDC'yi yukarıda adım 3.3'te açıklandığı gibi ayarlayın.
    3. 100x büyütmede bir görüntü akışı elde edin.

5. Görüntü akışı analizi

  1. Bir görüntü serisindeki piksel değerlerini analiz etmek için görüntü akışını uygun bir görüntü yazılımında açın (bkz.
  2. Poligon Seçim aracını kullanarak, GCaMP veya mitoGCaMP içeren hücre altı ilgi alanını (ROI) tanımlayın.
  3. ROI Manager'> > Araçlarını Analiz Et'e tıklayın. ROI Yöneticisi'nde, Ekle'ye ve ardından Çoklu Ölçüm > Fazlası'na tıklayın. Çoklu Ölçüm penceresinde, daha fazla analiz için görüntü akışının her karesi için yukarıda tanımlanan YG'nin ortalama, minimum ve maksimum piksel yoğunluklarını otomatik olarak toplamak üzere Tamam'ı tıklatın.
    NOT. Ortalama piksel yoğunluğunun (Fort), z düzlemindeki konumlandırmadan kaynaklanan floresan farklılıklarını hesaba katmak için Favg/F dak oranı kullanılarak her ROI için minimum yoğunluğa (Fdak) normalleştirilmesi önerilir. Görüntüleme sırasında solucan hareketi olan görüntü akışlarını atın, çünkü bu floresan ölçümlerini de etkileyecektir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bu iki protokol, hücre altı bölgelerde ve bireysel nöritlerin organellerinde diferansiyelCa2 + seviyelerinin in vivo olarak yüksek uzamsal çözünürlükle hızlı bir şekilde elde edilmesini sağlar. İlk protokol, yüksek zamansal ve uzamsal çözünürlükte sitoplazmik Ca2 + 'nın ölçülmesine izin verir. Bu, burada, nöritleri ventral sinir kordonunun tüm uzunluğunu çalıştıran glutamaterjik AVA komutu internöronlar15'teki GCaMP6f'nin hücreye özgü ekspresyonu kullanılarak gösterilmiştir. GCaMP6f floresansının (50 Hz) hızlı bir şekilde elde edilmesi, Ca2 + akışının yönlü yayılımının tespit edilmesini sağlamıştır (Şekil 2A ve Ek Video 1). GCaMP6f floresansının hücre altı nicelleştirilmesi, Ca2 + akışının başlangıcının, sadece 10 μm uzaklıktaki nöritin bir kısmında geciktiğini ortaya koymuştur (Şekil 2B). Ek olarak, bu protokol bölümlere ayrılmış Ca2 + ve eşik altı Ca2 + olaylarının birkaç gözlemine izin verdi. Örneğin, AVA nöriti boyunca bulunan dendritik omurga benzeri yapıların, nörit aktivasyonundan bağımsız olarak meydana gelen veCa2 + akışının yayılmasına yol açmayan GCaMP6f floresansında yanıp sönmelere sahip olduğu görülmüştür (Şekil 2C, D ve Ek Video 2).

İkinci protokol, tek nöritlerdeki bireysel mitokondrideki göreceli Ca2 + seviyelerini hızlı bir şekilde ölçmeyi amaçladı. Mitokondriyal matris lokalize Ca2+ göstergesi mitoGCaMP'nin AVA'ya özgü ekspresyonuna sahip bir solucan suşu kullanmak, AVA nöriti içindeki bireysel mitokondri seviyesinde mitoGCaMP floresansındaki değişikliklerin hızlı bir şekilde tespit edilmesini sağlamıştır. Bu görüntüleme protokolü, en azından bu nöronda, mitokondriye farklı Ca2 + alım modlarını ortaya çıkardı. İlk olarak, Şekil 3A'da gösterilen sonuçlar, nispeten büyük miktarda Ca2 + 'nın mitokondrinin bir alt kümesine senkron alımının bir örneğini sunmaktadır. Daha spesifik olarak, bu veriler bazı mitokondrilere Ca2 + alımının senkronize olduğunu ortaya koymuştur (Mito1 ve Mito2; Şekil 3A, B ve Ek Video 3), komşu mitokondri ise Ca2+ (Mito3; Şekil 3A,B). Benzer şekilde, mitokondri alt kümelerinin hızlı bir şekilde az miktarda Ca2 + 'yı aldığı ve serbest bıraktığı görülmüştür. Bu aynı zamanda senkron (Mito1 ve Mito3, Şekil 3C, D ve Ek Video 4), ancak yine sadece mitokondrinin bir alt kümesi için (Mito 2, Şekil 3C, D) ortaya çıktı.

Figure 1
Resim 1: Ventral sinir kordonunu görüntülemek için C. elegans'ın montajı ve yuvarlanması. (A) Agar pedlerinin hazırlanması ve tek bir solucanın yuvarlanma çözeltisine toplanması için gereken adımların bir örneği. (B) Görüntüleme için yeniden konumlandırılmadan önce solucan pozisyonuna bir örnek. Kırmızı ok, solucanın sağa doğru yuvarlanması gerektiğini gösterir, bu da kapak kaymasını sağa kaydırarak elde edilebilir (mavi ok). Ölçek çubuğu = 50 μm. (C) Ventral sinir kordonunu görselleştirmek için gereken doğru oryantasyon. Not: Bağırsak, proksimal yarıda izleyicinin sağ tarafındadır (dik bir mikroskop kullanarak) ve daha sonra distal yarıda sol taraftadır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: AVA nörit ve omurga benzeri yapılarda hücre altı çözünürlük ile GCaMP6f floresansının hızlı bir şekilde elde edilmesi. (A) AVAL ve AVAR nörit bifurkasyonunda GCaMP6f floresansının temsili görüntüleri. Ölçek çubuğu = 5 μm. (B) GCaMP6f floresansının miktarı, panel A'daki alt görüntüde tanımlanan proksimal (turuncu) ve distal (mavi) bölgeler için o bölge (Fdak) için minimum floresana (F) normalleştirildi. (C) AVA nöritindeki omurga benzeri bir projeksiyonda GCaMP6f floresansının temsili görüntüleri. (D) Nöritte (turuncu) normalleştirilmiş GCaMP6f floresan ve C panelinin alt görüntüsündeki ilgili bölgelerden omurga benzeri projeksiyon (mavi). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3. AVA nöriti içindeki bireysel mitokondriye kalsiyum alımının hızlı görüntülenmesi. (A,C) Zaman içinde mitoGCaMP floresansının temsili görüntüleri. Ölçek çubuğu = 50 μm. (B) Panel A'nın alt görüntüsünde gösterilen karşılık gelen mitokondri için normalleştirilmiş GCaMP floresan izleri (F / Fdak. (D) C panelindeki alt resimde vurgulanan bölgelerde 40 saniyenin üzerinde F / Fdakika. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Video 1: AVA nöritinde GCaMP6f floresansı. Video 2x hızında oluşturuldu. Ölçek çubuğu = 5 μm. Bu Videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Video 2: AVA nöriti üzerinde omurga benzeri bir projeksiyonda GCaMP6f floresansı. Video 2x hızında oluşturuldu. Ölçek çubuğu = 5 μm. Bu Videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Video 3: AVA nörit senkronize mitokondriyal kalsiyum alımında MitoGCaMP floresansı. Video 4x hızında oluşturuldu. Ölçek çubuğu = 5 μm. Bu Videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Video 4: AVA nöritinde MitoGCaMP floresansı mitokondri tarafından kalsiyumun hızlı alımı ve salınması. Video 4x hızında oluşturuldu. Ölçek çubuğu = 5 μm. Bu Videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Tablo 1: Bu çalışmada kullanılan genetik reaktifler ve suşlar. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Açıklanan yöntemi uygularken göz önünde bulundurulması gereken ilk husus, verilen araştırma sorusu için ideal özelliklere sahip bir Ca2+ göstergesinin seçilmesini içerir. Sitoplazmik Ca 2+ göstergeleri tipik olarak Ca2+ için yüksek bir afiniteye sahiptir ve bu göstergelerin Ca2 + 'ya duyarlılığı kinetik (açma / kapama oranı) ile ters orantılıdır 16,17. Bu, Ca2+ duyarlılığının veya kinetiğin ilgi olgusuna göre önceliklendirilmesi gerekeceği anlamına gelir. ER gibi nispeten yüksek bazal Ca2+ seviyelerine sahip hücre altı bölmeler için, düşük Ca 2+ afinitesine sahip Ca2+ göstergeleri18 olarak düşünülmelidir. Bir Ca 2 + göstergesinin hücreye özgü ekspresyonu için rekombinant DNA üretmek için, tercih edilen klonlama tekniği, hücreye özgü bir promotör19,20 ve ardından tercih edilen Ca2 + göstergesi ve 3' UTR eklemek için kullanılmalıdır. AVA nöronlarındaki nispeten yüksek ekspresyon seviyeleri, Pflp-18 veya Prig-3, bir let-858 veya unc-54 3' UTR promotörleri ile bir plazmid oluşturarak ve bu plazmidi 15-25 ng / μL'de mikroenjekte ederek elde edilebilir (bakınız Ek Tablo 1).

Ca2+ göstergesini ve lin-15 + içeren plazmidlerin lin-15 (n765ts) mutant solucanlarının gonadına başarılı bir şekilde mikroenjeksiyonu, Ca 2 + göstergesini ifade eden ve çoklu vulva fenotipi için kurtarılan bir F1 soyu verecektir. F1 neslinin sadece bir alt kümesi (%30-%80) sentetik DNA'yı F2 nesline iletecektir. Ca2+ göstergesinin ekspresyonu, multi-vulva fenotipi için kurtarılan 1 günlük yetişkinlerde floresansı monte ederek ve görüntüleyerek sentetik DNA'nın% <60'ının iletildiği plakalar üzerinde kurtarılan F2 veya F3 döllerinde değerlendirilmelidir. İdeal ifade seviyesi, Ca2+ göstergesinin özelliklerine ve konumuna ve biyolojik soruya göre belirlenir. Hızlı görüntü elde etmek isteniyorsa, nispeten yüksek ifade idealdir. Bununla birlikte,Ca2 + göstergelerinin son derece yüksek bir ekspresyonunun, hücre altı yanlış lokalizasyonun yanı sıra diğer hücrelerde veya dokularda spesifik olmayan ekspresyona neden olduğu bulunmuştur.

Genetik olarak kodlanmış Ca 2 + göstergeleri, C. elegans'ta ve diğer model organizmalarda Ca2 + 'nın in vivo analizleri için yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu çalışmalardan bazıları, nöronal hücre gövdesindeki Ca2 + seviyelerinin tek hücreli çözünürlük izlemesini sağlamıştır 21,22,23,24. Nöronal alt kompartmanlardaki Ca 2 + akışının ölçümleri, omurgalı sistemlerin yanı sıra C. elegans'ta in vivo olarak elde edilmiştir, ancak yalnızca tüm nörit25,26'daki Ca2 + gösterge aktivitesini veya dendritpopülasyonlarını 27 kaydederek elde edilmiştir. Nöronal hücre gövdelerinde ve dendritlerde bir bütün olarak Ca2+ aktivitesinin ölçülmesi, hücrenin ani yükselme aktivitesini yansıtmasına rağmen, Ca2 + akışının dinamiklerinin (yani, yayılma yönü veya hızı) veya eşik altı Ca2 + geçicilerinin gözlemlenmesine izin vermez. Çok az sayıda in vivo çalışma, nöronlardaki Ca2 + 'nın kullanımını, burada gösterilen mekansal ve zamansal çözünürlüğe ayırt edebilmiştir. Çoğu C. elegans nöronu28'deki Ca2 + akışının zamansal dinamiklerinin omurgalı nöronları29'dan daha yavaş göründüğü belirtilmelidir, bu nedenle bu hızlı görüntüleme protokolünün omurgalı sistemlerinde benzer zamansal dinamikleri yakalamak için yetersiz olması muhtemeldir. Bununla birlikte, iki foton mikroskobundaki son gelişmeler, serbest davranan farelerde bireysel hipokampal dendritlerde kalsiyumun ultra hızlı (120 Hz), hücre altı görüntülemesine izin verir30, bu da omurgalılarda benzer yüksek çözünürlüklü Ca2 + görüntüleme elde etmek için umut vaat eder.

İn vivo Ca2 + görüntülemeye yönelik bu oransal olmayan yaklaşımın, vücut duvarı kaslarının kasılmasını engelleyen ve böylece görüntüleme sırasında solucan hareketini sınırlayan mussimol kullanımını gerektirdiğini belirtmek önemlidir31. Görüntüleme sırasında aşırı hareket varsa (solucanların ~% 20'sinden fazlasında tutarlı hareket), yeni çözülmüş bir mussimol aliquot ile yeni bir yuvarlanma çözeltisi yapılmalı ve bir solucanın yuvarlanmadan önce yuvarlanma çözeltisinde yıkandığı süre uzatılmalıdır. Muscimol bir GABA reseptör agonistidir, yani AVA nöronlarına girdi sağlayanlar da dahil olmak üzere GABAerjik nöronları inhibe eder. Ek olarak, AVA da dahil olmak üzere birçok uyarıcı nöron, düşük seviyelerde GABA reseptörlerini eksprese eder, bu nedenle bu protokolde mussimol kullanımının nöronal aktiviteyi azaltması muhtemeldir. Bununla birlikte, bu protokolü kullanarak, AVA'nın genel spontan aktivasyonu, mussimol varlığında (yayınlanmamış veriler) sadece ~% 29 oranında azalır. Diğer nöronların aktivasyonu mussimol tarafından daha büyük ölçüde azaltılabilir ve bu, yuvarlanma çözeltisinde M9 için mussimol ikame edilerek ve nöronal hücre gövdesinde düşük büyütme32'de görüntüleme yapılarak test edilebilir. Mussimol kullanmaya bir alternatif, solucan hareketi nedeniyle floresan düzeltmesine izin verecek bir oranmetrik Ca2 + göstergesi33,34 kullanmak olacaktır. Bu yaklaşımın dezavantajı, çift dalga boylu görüntüleme yeteneğine sahip optik bir kurulum gerektirmesi ve diğer birçok floresan aracıyla birlikte bir Ca2+ göstergesi kullanma yeteneğini sınırlamasıdır.

Tarif edilen mikroskopi sisteminin önemli bir sınırlaması, yayılan ışığın dönen disk tarafından azaltılmasıdır ve bu da bilgi kaybına neden olur. Bu sistem, daha büyük çaplı pim deliklerine sahip bir disk uygulanarak yayılan ışığın daha fazla yakalanmasına izin verecek şekilde değiştirilebilir. Bununla birlikte, bu değişiklik eksenel (z-düzlemi) çözünürlüğü azaltacak ve arka plan floresansını artıracaktır. Bu amaçla bir başka olası mikroskopi kurulumu, son yıllarda yerinde ve in vivo35'te hızlı (50 Hz'e kadar) görüntülemeye izin verecek şekilde geliştirilmiş olan hızlı taramalı ışık tabakası mikroskobu olacaktır.

Sitoplazmik ve mitokondriyal Ca 2 + 'nın mekansal zamansal dinamiklerini değerlendirmek, yerel Ca2 + geçişlerinin ve hatta eşik altı olayların kalsiyuma bağımlı sinyallemeyi nasıl tetikleyebileceğinin veya mitokondriyal biyolojiyi nasıl modüle edebileceğinin daha iyi anlaşılmasını sağlayacaktır. Bu subsellüler, in vivo Ca2+ görüntüleme, sinaptik plastisite, nöronal metabolizmadaki aktiviteye bağlı değişiklikler ve nöronal uyarılabilirliğin homeostatik modülasyonu için özellikle yararlı olabilir. Yerel, hücre altı ortamların tanımlanmış nöronal aktivite durumları (yani, mekansal olarak spesifik konsantrasyonlar ve Ca2 + 'nın ömrü) etrafında nasıl adapte olduğuna dair daha fazla araştırma,Ca2 + dishomeostazının nöronal fonksiyonda patojenik değişikliklere nasıl yol açtığına dair fikir verecektir. Bunu canlı, bozulmamış bir organizmada inceleme yeteneği, Ca2 + homeostazının doğal yaşlanma ve hastalığa bağlı nörodejenerasyon ile nasıl ve neden değiştiğine ışık tutacak uzunlamasına çalışmalara olanak tanıdığı için özellikle yararlıdır. Bu yöntemin yaşlanma ve nörodejenerasyonu incelemek için uygulanması, C. elegans'taki (yetişkinliğin 4 günü <) erken biyolojik yaşlarla sınırlıdır. Gerçekten de, solucanların görüntüleme için monte edilmesi ve konumlandırılması sırasındaki fiziksel manipülasyon, solucanların kas tonusu ve kütikül bütünlüğünün azalması nedeniyle sarkık hale geldiği yaklaşık 5 günlük yetişkinlikten sonra zordur.

Ca2 + 'nın dinamiklerinin ve hücre altı kullanımının hızlı in vivo görüntülemesi, nöronal uyarılabilirliğin ve hücre içi sinyallemenin mekansal ve zamansal olarak nasıl iyi düzenlendiğini anlamamızda etkili olacaktır. Bu protokol, Ca2 + bağımlı süreçlerin çeşitliliği ve nöronal fonksiyondaki merkezi rolleri nedeniyle birçok alanda geniş bir araştırma ve araştırmacı yelpazesine fayda sağlayabilir. Örneğin, bu yöntemin sağlıklı nöronlara uygulanması, yaşlanma sırasında yüksek sitoplazmik Ca2 + 'nın neden sinaptik plastisitedeki bozulmalar, verimsiz mitokondriyal solunum ve diğer işlev bozuklukları ile birlikte ortaya çıktığı hakkında fikir verecektir36,37. Ek olarak, bu yöntem yaşa bağlı Ca2 + dishomeostaz38'in nedenlerini araştırmak için kullanılabilir. Bununla birlikte, bu yöntemin yaşlanma ve nörodejenerasyon ile ilgili sorular için uygulanması, yaşlanmanın erken evreleriyle (yetişkinliğin <5 günü) biraz sınırlıdır38. Yukarıda belirtildiği gibi, yaşlı yetişkin solucanların (yetişkinliğin >5 günü) görüntülenmesi haddeleme yöntemimizi kullanarak zordur, ancak C. elegans mikroakışkanlarındaki ilerlemeler, 12 günlük yetişkinlik 39,40'a kadar benzer bir uzamsal çözünürlükle görüntüleme için umut vaat etmektedir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar birbiriyle çelişen çıkarlar olmadığını beyan ederler.

Acknowledgments

Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) tarafından desteklenmiştir (R01- NS115947, F. Hoerndli'ye verilmiştir). Ayrıca pAS1 plazmidi için Dr. Attila Stetak'a teşekkür ederiz.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100x/1.40 Oil objective   Olympus   UPlanSApo
10x/0.40 Objective  Olympus   UPlanSApo
22 mm x 22 mm Cover glass  VWR  48366-227 
Agarose SFR  VWR  J234-100G 
Beam homogenizer Andor Technologies Borealis upgrade to CSU-X1
CleanBench laboratory table  TMC  With vibration control
Disposable culture tubes VWR  47729-572  13 mm x 100 mm
Environmental chamber Thermo Scientific 3940 Set to 20 °C
Filter wheel or slider ASI For 25 mm diameter filters
FJH 185 Caenorhabditis Genetics Center  FJH 185 Worm strain
FJH 597 Caenorhabditis Genetics Center FJH 597 Worm strain
GFP bandpass emission filter  Chroma  525 ± 50 nm (25 mm diameter)
ILE laser combiner  Andor Technologies  4 laser lines 
ILE solid state 488 nm laser Andor Technologies  50 mW
ImageJ National Institutes of Health Version 1.52a
IX83 Spinning disk confocal microscope  Olympus  With Yokogawa CSU-X1 spinning disc
iXon Ultra EMCCD camera  Andor Technologies 
Low auto-fluorescence immersion oil  Olympus  Z-81226
MetaMorph  Molecular Devices  Version 7.10.1 
Microscope control box Olympus IX3-CBH
Muscimol  MP Biomedical / Sigma 02195336-CF 
pAS1 AddGene 194970 Plasmid
pBSKS Stratagene
pCT61 Plasmid available from Hoerndli/Maricq lab upon request
pJM23 Plasmid available from Hoerndli/Maricq lab upon request
pKK1  AddGene  194969 Plasmid
Polybead microspheres  Polysciences Inc.  00876-15  0.094 µm
Stability chamber Norlake Scientific NSRI241WSW/8H Set to 15 °C
Stage controller ASI With filter wheel control
Standard microscope slide Premiere 9108W-E 75 mm x 25 mm x 1 mm
Touch panel controller Olympus I3-TPC
Z-drift corrector  Olympus  IX3-ZDC2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Berridge, M. J. Neuronal calcium signaling. Neuron. 21 (1), 13-26 (1998).
  2. Brini, M., Calì, T., Ottolini, D., Carafoli, E. Neuronal calcium signaling: Function and dysfunction. Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (15), 2787-2814 (2014).
  3. Brini, M., Calì, T., Ottolini, D., Carafoli, E. Intracellular calcium homeostasis and signaling. Metal Ions in Life Sciences. 12, 119-168 (2013).
  4. Berridge, M. J. The inositol trisphosphate/calcium signaling pathway in health and disease. Physiological Reviews. 96 (4), 1261-1296 (2016).
  5. Schrank, S., Barrington, N., Stutzmann, G. E. Calcium-handling defects and neurodegenerative disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 12 (7), 035212 (2020).
  6. Pchitskaya, E., Popugaeva, E., Bezprozvanny, I. Calcium signaling and molecular mechanisms underlying neurodegenerative diseases. Cell Calcium. 70, 87-94 (2018).
  7. Jadiya, P., et al. Impaired mitochondrial calcium efflux contributes to disease progression in models of Alzheimer's disease. Nature Communications. 10 (1), 3885 (2019).
  8. Zeiser, E., Frøkjær-Jensen, C., Jorgensen, E., Ahringer, J. MosSCI and gateway compatible plasmid toolkit for constitutive and inducible expression of transgenes in the C. elegans germline. PLoS One. 6 (5), 20082 (2011).
  9. Zhu, B., Cai, G., Hall, E. O., Freeman, G. J. In-FusionTM assembly: Seamless engineering of multidomain fusion proteins, modular vectors, and mutations. Biotechniques. 43 (3), 354-359 (2007).
  10. Evans, T. C. Transformation and Microinjection. WormBook. , (2006).
  11. Giordano-Santini, R., Dupuy, D. Selectable genetic markers for nematode transgenesis. Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (11), 1917-1927 (2011).
  12. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , (2006).
  13. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans: Transferring worms grown on NGM plates. WormBook. , (2006).
  14. Ogama, T. A beginner's guide to improving image acquisition in fluorescence microscopy. The Biochemist. 42 (6), 22-27 (2020).
  15. Mellem, J. E., Brockie, P. J., Madsen, D. M., Maricq, A. v Action potentials contribute to neuronal signaling in C. elegans. Nature Neuroscience. 11 (8), 865-867 (2009).
  16. Zhang, Y., et al. Fast and sensitive GCaMP calcium indicators for imaging neural populations. bioRxiv. , (2021).
  17. Kerruth, S., Coates, C., Dürst, C. D., Oertner, T. G., Török, K. The kinetic mechanisms of fast-decay red-fluorescent genetically encoded calcium indicators. Journal of Biological Chemistry. 294 (11), 3934-3946 (2019).
  18. de Juan-Sanz, J., et al. Axonal endoplasmic reticulum Ca2+ content controls release probability in CNS nerve terminals. Neuron. 93 (4), 867-881 (2017).
  19. Bhatla, N. C. elegans neural network. , Available from: http://wormweb.org/neurainet#c=BAG&m=1 (2014).
  20. Fung, W., Wexler, L., Heiman, M. G. Cell-type-specific promoters for C. elegans glia. Journal of Neurogenetics. 34 (3-4), 335-346 (2020).
  21. Ali, F., Kwan, A. C. Interpreting in vivo calcium signals from neuronal cell bodies, axons, and dendrites: a review. Neurophotonics. 7 (1), 011402 (2019).
  22. Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
  23. Mank, M., et al. A genetically encoded calcium indicator for chronic in vivo two-photon imaging. Nature Methods. 5 (9), 805-811 (2008).
  24. Birkner, A., Tischbirek, C. H., Konnerth, A. Improved deep two-photon calcium imaging in vivo. Cell Calcium. 64, 29-35 (2017).
  25. Ryan, K. C., Laboy, J. T., Norman, K. R. Deregulation of mitochondrial calcium handling due to presenilin loss disrupts redox homeostasis and promotes neuronal dysfunction. Antioxidants. 11 (9), 1642 (2022).
  26. Yang, H. H., et al. Subcellular imaging of voltage and calcium signals reveals neural processing in vivo. Cell. 166 (1), 245-257 (2016).
  27. Takahashi, N., Oertner, T. G., Hegemann, P., Larkum, M. E. Active cortical dendrites modulate perception. Science. 354 (6319), 1587-1590 (2016).
  28. Nicoletti, M., et al. Biophysical modeling of C. elegans neurons: Single ion currents and whole-cell dynamics of AWCon and RMD. PLoS One. 14 (7), 0218738 (2019).
  29. Church, P. J., Stanley, E. F. Single L-type calcium channel conductance with physiological levels of calcium in chick ciliary ganglion neurons. The Journal of Physiology. 496, 59-68 (1996).
  30. O'Hare, J. K., et al. Compartment-specific tuning of dendritic feature selectivity by intracellular Ca 2+ release. Science. 375 (6586), (2022).
  31. Mclntire, S. L., Jorgensen, E., Horvitz, H. R. Genes required for GABA function in Caenorhabditis elegans. Nature. 364 (6435), 334-337 (1993).
  32. Doser, R. L., Amberg, G. C., Hoerndli, F. J. Reactive oxygen species modulate activity-dependent AMPA receptor transport in C. elegans. The Journal of Neuroscience. 40 (39), 7405-7420 (2020).
  33. Wu, J., et al. A long Stokes shift red fluorescent Ca2+ indicator protein for two-photon and ratiometric imaging. Nature Communications. 5, 5262 (2014).
  34. Cho, J. -H., et al. The GCaMP-R family of genetically encoded ratiometric calcium indicators. ACS Chemical Biology. 12 (4), 1066-1074 (2017).
  35. Smith, J. J., et al. A light sheet fluorescence microscopy protocol for Caenorhabditis elegans larvae and adults. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 1012820 (2022).
  36. Müller, M., et al. Mitochondria and calcium regulation as basis of neurodegeneration associated with aging. Frontiers in Neuroscience. 12, 470 (2018).
  37. Nikoletopoulou, V., Tavernarakis, N. Calcium homeostasis in aging neurons. Frontiers in Genetics. 3, 200 (2012).
  38. Chen, C. -H., Chen, Y. -C., Jiang, H. -C., Chen, C. -K., Pan, C. -L. Neuronal aging: Learning from C. elegans. Journal of Molecular Signaling. 8 (1), 14 (2013).
  39. Saberi-Bosari, S., Huayta, J., San-Miguel, A. A microfluidic platform for lifelong high-resolution and high throughput imaging of subtle aging phenotypes in C. elegans. Lab on a Chip. 18 (20), 3090-3100 (2018).
  40. Sridhar, N., Fajrial, A. K., Doser, R. L., Hoerndli, F. J., Ding, X. Surface acoustic wave microfluidics for repetitive and reversible temporary immobilization of C. elegans. Lab on a Chip. 22 (24), 4882-4893 (2022).

Tags

Nörobilim Sayı 193
<em>Nöronal Kalsiyum Kullanımının In Vivo</em> Subsellüler Görüntülemesi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Doser, R., Knight, K. M., Deihl, E., … More

Doser, R., Knight, K. M., Deihl, E., Hoerndli, F. Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo. J. Vis. Exp. (193), e64928, doi:10.3791/64928 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter