Summary
该协议通过结合大体积显微 CT 扫描、定制的压缩载物台和先进的图像处理工具，能够测量整个人类股骨近端骨微结构的变形及其韧性。
Abstract
在逐渐增加的负荷下对骨骼微观结构进行成像可以观察骨骼的微观结构失效行为。在这里，我们描述了一种方案，用于在逐渐增加的变形下获得整个股骨近端的三维微观结构图像序列，导致股骨颈的临床相关骨折。该方案使用来自人群中骨密度较低端的 66-80 岁女性供体的四个股骨来证明（T 分数范围 = -2.09 至 -4.75）。设计了一个无线电透明的压缩载物台，用于加载复制单腿姿势的标本，同时记录显微计算机断层扫描 （micro-CT） 成像期间施加的载荷。视场宽 146 mm，高 132 mm，各向同性像素尺寸为 0.03 mm。力增量基于断裂载荷的有限元预测。压缩台用于将位移施加到试样上并制定规定的力增量。股骨颈张开和剪切导致的股骨头下骨折发生在四到五次负荷增加后。对显微CT图像和反作用力测量值进行处理，研究骨应变和能量吸收能力。皮层的不稳定性出现在早期的加载步骤中。股骨头软骨下骨在骨折前出现大变形，达到16%，支撑能力逐渐增加直至骨折。变形能随位移直至断裂呈线性增加，而刚度在断裂前降至接近零的值。在最后 25% 的力增量中，试样吸收了四分之三的断裂能量。总之，开发的方案揭示了显着的能量吸收能力或损伤耐受性，以及高龄供体皮质骨和小梁骨之间的协同相互作用。
Introduction
股骨颈骨折是老龄化人口的主要负担。显微计算机断层扫描 （micro-CT） 成像和伴随的机械测试可以观察骨微观结构并研究其与骨强度的关系、与年龄相关的变化以及负荷下的位移 1,2。然而，直到最近，负重骨骼的显微 CT 研究仅限于切除的骨芯3、小动物4 和人类脊柱单元5。本方案可以量化整个近端人股骨微观结构在负荷下和骨折后的位移。
已经进行了几项研究来调查人类股骨的衰竭，有时，这些研究得出了截然不同的结论。例如，与年龄相关的皮质和小梁结构变薄被认为通过引起骨骼的弹性不稳定性来决定与年龄相关的骨折易感性6,7，这与假设没有弹性不稳定性的皮质应变和股骨力量预测的高确定系数形成鲜明对比 （R2 = 0.80-0.97）8,9.然而，这些研究系统地低估了股骨强度（21%-29%），从而对模型 8,10 中实施的脆性和准脆性骨反应提出了质疑。对于这些明显相反的发现，一种可能的解释可能是与孤立的骨芯相比，整个骨骼的骨折行为不同。因此，观察整个股骨近端骨微结构的变形和骨折反应可能会增进对髋部骨折力学和相关应用的了解。
目前以微米分辨率对整个人体骨骼进行成像的方法有限。龙门架和探测器尺寸必须提供合适的工作体积来容纳人体近端股骨（约 13 cm x 10 cm，宽 x 长），并且可能提供 0.02-0.03 mm 量级的像素尺寸，以确保可以捕获相关的微观结构特征11。目前，一些同步加速器设施1和一些市售的大体积显微CT扫描仪12,13可以满足这些规格。压缩阶段必须是无线电透明的，以尽量减少 X 射线衰减，同时产生足以导致人体股骨骨折的力（例如，老年白人女性在 0.9 kN 到 14.3 kN 之间）14。这种较大的断裂荷载变化使断裂荷载步数、总实验时间和相应产生的数据量的规划变得复杂。为了解决这个问题，可以使用临床计算机断层扫描 （CT） 图像1,2 中标本的骨密度分布，通过有限元建模来估计骨折载荷和位置。最后，在实验结束后，需要对产生的大量数据进行处理，以研究整个人体股骨的失效机理和耗能能力。
在这里，我们描述了一种协议，用于在逐渐增加的变形下获得整个股骨近端的三维微观结构图像序列，这导致股骨颈的临床相关骨折2。该协议包括规划标本压缩的逐步增量，通过定制的无线电透明压缩台加载，通过大体积显微CT扫描仪成像，以及处理图像和负载曲线。
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Protocol
该协议是用从遗体捐赠计划中收到的 12 个股骨标本开发和测试的。将标本新鲜获得并储存在-20°C的弗林德斯大学生物力学和植入物实验室（澳大利亚南澳大利亚州Tonsley）。在整个实验过程中保持骨骼水分。捐赠者是白人妇女（66-80岁）。从弗林德斯大学社会和行为研究伦理委员会（SBREC）获得伦理许可（项目#6380）。
1. 规划特定于试样的载荷阶跃增量
- 使用临床 CT 扫描仪扫描股骨标本，目标是切片厚度和大约 0.5-0.7 毫米的平面内像素尺寸。此步骤可由任何公共成像机构的专业放射技师使用标准的预先录制的骨骼可视化成像协议完成。
- 与标本一起，用五种已知浓度的磷酸氢二钾（K2HPO4，当量密度范围大约在 59 mg∙cm-3 和 375 mg∙cm-3 之间）扫描 CT 密度校准模型。
- 从临床 CT 图像15 中分割骨几何形状，对骨骼的分割几何形状进行网格划分，并使用 Schileo 等人报告的密度-弹性模量关系将各向同性材料属性逐个元素映射到校准的骨密度值8。保存网格，以便在有限元软件中进一步分析。按照分割和有限元软件提供的相关指南完成每个步骤。
- 将网格导入有限元软件。完全约束模型的 3-6 mm 远端。施加 1,000 N 的标称力，从冠状面的股骨干轴线内收 8° 并穿过股骨头中心。此负载条件模拟静态单腿站立任务 （orthoload.com）。
- 使用内置的 PCG 求解器求解有限元模型（收敛容差：1 x 10−7）。
注：这里使用的是有限元软件ANSYS。- 通过执行以下命令，生成包含单元质心处的第一和第三个主应变分量的单元表：
/POST1
可ETABLE，， EPTO1,1
可ETABLE，， EPTO3,3 - 通过执行以下命令，计算模型中第一和第三主应变分量与拉伸（0.73%应变）和压缩（1.04%应变）8 （图1）下的骨屈服应变之间的应变比：
SMULT，RFT，EPTO1， ，1/0.0074,1，
SMULT， RFT，EPTO3， ，1/0.0104,1，
- 通过执行以下命令，生成包含单元质心处的第一和第三个主应变分量的单元表：
- 将标称力按拉伸和压缩的峰值应变比进行缩放，并丢弃两者中最大的应变比，以获得断裂载荷的估计值。将荷载增量确定为计算出的断裂荷载 1 的1/4。
图 1：断裂载荷的计算。 有限元应变图、用于将标称力转换为断裂载荷的方程（左）以及显示股骨（右中）、远端铝杯（右上）和聚乙烯压力套筒（右下）的荷载方案。 请点击这里查看此图的较大版本.
2. 股骨试样组件的制备（图2）
- 从冰箱（-20°C）中取出标本。
- 在室温（RT）下解冻24小时，同时将标本保存在防水塑料袋中，该塑料袋包裹在浸泡在生理溶液中的吸收材料中，以保持骨骼水分。
- 在距股骨头近端 180 毫米处切开股骨干。
- 通过将凹形聚乙烯压力插座（图2D）和股骨头对齐，将股骨头居中在对准装置的垂直轴上。
- 将包含股骨颈和骨干轴的平面与额平面对齐（图2）。
- 将骨干轴旋转至8°内收，使垂直轴代表静态单腿站立期间髋关节反作用力的方向（图2）。
- 按照制造商的说明准备牙科粘结剂。
- 将试样的远端放入 55 毫米深的铝制灌封杯中，用牙科水泥填充铝杯。水泥完成固化的时间不少于30分钟。
- 将试样组件储存在-20°C。
图 2：对准装置。 对准装置的正面（左）和侧面（右）照片，显示 （A） 框架，（B） 铝灌封杯，（C） 合成股骨模型，以及 （D） 球形压力插座。 请点击这里查看此图的较大版本.
3.压缩级组装
注意：压缩台的外部尺寸为直径 245 mm、高度 576 mm、重量 14 kg，不包括样品。压缩级由压缩室和执行器两大部分组成，其组装如下：
- 压缩室
- 将聚乙烯压力插座（直径 104 mm，高 60 mm）安装在铝筒（直径 203 mm，壁厚 3 mm）的底部，该圆柱体的一端（底部）由焊接铝板封闭。
- 驱动器
- 使用圆盘、三根杆、三角形板和垂直导轨组装顶部结构（图 3）。
- 将螺旋千斤顶机构（行程：150 mm，最大负载：10,000 N，齿轮比：27：1，每转位移：0.148 mm）安装在三角板上。
- 将角度适配器安装到线性导轨上。
- 将低摩擦 x-y 工作台安装到角度适配器上。
- 通过将称重传感器的x-z平面对准顶部结构的正面平面，将六自由度称重传感器（最大测量误差：0.005%;最大力：10,000N/最大扭矩：500Nm）安装到低摩擦工作台上。
- 将执行器螺钉连接到角适配器。
图 3：定制的透射线压缩级组件。 压缩阶段的照片（左）和模型（右）。（A） 压缩室，即底部封闭的 3 mm 厚铝制圆柱体;（二）执行机构总成采用顶部结构;（三）螺旋千斤顶机构;（四）低摩擦x-y工作台;（E）在模型上显示和指示六轴称重传感器。 请点击这里查看此图的较大版本.
4. 设置实验
- 在室温下解冻标本24小时，同时将其保存在浸泡在生理溶液中的吸收性材料包裹的防水塑料袋中以保持骨水分。
- 通过将试样组件的正面平面与执行器的正面平面对齐，将铝杯试样组件安装到称重传感器上。
- 将顶部结构（包括试样）组装到压缩室中。注意将股骨头与聚乙烯压力插座上的球形凹面对齐。确保股骨头啮合但在压力窝的球形腔内松弛。
- 将压缩载物台放在成像和医学光束线（IMBL）处的显微CT扫描仪的旋转载物台上。
- 将称重传感器（误差<0.005%;最大力：10,000N;最大扭矩：500Nm）连接到应变放大器。
- 通过USB将应变放大器连接到配备称重传感器随附应用软件的笔记本电脑。
- 在压缩阶段，通过将试样向下移动到压力插座来启动螺杆机构，同时监测笔记本电脑中称重传感器测量的反作用力。一旦达到等于 100 N 的压缩力，就停止螺杆机构。将试样卸载至 50 N 预紧力。
- 选择单个 pco.edge 传感器透镜耦合闪烁体“Ruby”（http://archive.synchrotron.org.au/31-australian-synchrotron/imbl/811-preparation-for-imaging-experiments）。
- 将视场设置为 76.31 mm x 64.39 mm，对于 2,560 像素 x 2,160 像素的阵列大小，提供 29.81 μm 的像素大小。
- 将旋转载物台的轴线设置为距视场轴线 8 mm（水平）（偏移扫描模式），以将视场扩展到 145.71 mm x 64.39 mm，像素尺寸为 29.81 μm。
- 将扫描参数设置为光束能量为 60 keV、旋转增量为 0.1°、两批 180° 旋转（偏移扫描）、曝光时间为 50 μs，每个旋转位置的帧平均为 2 个。
- 将扫描设置为连续采集 5 个垂直堆叠扫描，每个扫描的垂直偏移 26 mm，因此扫描体积的总高度为 132.2 mm，总扫描时间为 30 分钟。
5. 机械测试与伴随的微观结构成像
- 在参考条件（作为零应变条件）下进行两次显微CT（像素尺寸：0.03mm）成像。
- 通过以每轮约 1 秒 （0.1-0.2 mm/s） 的恒定速率手动启动螺旋千斤顶机构来施加力增量。
- 进行显微 CT 成像。
- 重复步骤5.2和步骤5.3，直至引起试样断裂，如反作用力突然下降所示。
- 对骨折标本进行显微 CT 成像。
- 拼接 1,800 个投影图像（尺寸为 2,560 像素 x 896 像素，尺寸为 76.8 mm x 26.88 mm，宽 x 高，32 位浮点图像）。该过程将两张投影图像（在水平偏移扫描模式下拍摄）和五张垂直移动的图像拼接在一起，从而产生单个投影图像。
- 重建横截面图像的体积（4,407 张图像，每张图像的大小为 4,888 x 4,888 像素），并将其另存为 32 位浮点文件。TIFF 格式（占用 392 GB 磁盘空间）。
- 应用 3 x 3 高斯滤波器以降低噪声。将图像转换为 8 位（256 个灰度图像，以位图格式保存，每个卷占用大约 100 GB）。
注意：在这项工作中，图像的处理是在IMBL操作员的指导下使用澳大利亚同步加速器提供的软件进行的。
6.位移和应变场的计算
- 对横截面图像进行四次（120 μm/像素）的子采样，以减少计算时间。
- 在空间中严格地将载荷下的试样的图像与卸载参考条件下的试样的图像共配准。使用远端骨干作为共同注册的对象（补充文件 1 和 补充文件 2）。
- 创建曲面三维模型 （.STL 文件）用于对显微 CT 图像进行二值化后的可视化11.
- 使用等于 50 像素的网格大小（SDER = 0.076% 应变误差、BoneDVC https://bonedvc.insigneo.org/dvc/）将图像体积弹性地注册到参考体积，以确定网格节点处的位移。
- 将网格转换为有限元模型。将 BoneDVC 计算的节点位移应用于模型。求解模型以确定整个骨体积的应变张量。
- 使用全分辨率图像在显示最高应变水平的区域中重复分析。
- 使用带有 interp3 函数 （Matlab）2 的三次插值将 DVC 应变图映射到全分辨率图像。
- 可视化位移、应变和微观结构图像，以实现大体积可视化和动画 （Matlab）2。
第7章 分析
- 通过叠加在空载条件下和骨折后获得的图像来显示骨骼的永久变形（损伤）2.
- 通过在空载条件下、增加的载荷水平和骨折后2 下叠加三维模型来显示骨骼的渐进性微观结构变形。
- 显示骨折位置2 处的骨应变。
- 使用描述性统计和回归方法分析变形能量、刚度和位移2.
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Representative Results
这些图像显示了整个股骨近端、压力窝、牙科水泥、铝杯和包裹组织。随着骨折前和骨折后负荷的增加，可以看到骨微结构逐渐变形（图 4）。
图 4：连接到笔记本电脑的 压缩阶段。 （A） 压缩阶段，（B） 笔记本电脑，（C） 数据采集设备。试样组件以透明方式覆盖在压缩室上（右）。 请点击这里查看此图的较大版本.
股骨头向内侧旋转，并逐渐向上旋转直至骨折。骨折不完全，在颈上皮质开口或显示首都下剪切失败（视频 1 和图 5）。头部曲率在与窝接触的区域变平，可以观察到皮质壳的局部弹性不稳定性。然而，没有观察到小梁体积上的弹性不稳定性。
视频1：整个股骨变形和断裂的动画。 整个股骨变形和骨折时的动画（显微 CT 图像 4 倍子采样，三维渲染）。 请按此下载此影片。
图 5：经过时间的微观结构图像和相应的载荷。 一个代表性标本的冠状显微 CT 横截面图像序列（左上）、施加的力和力矩轮廓（左下）。叠加显示施加负荷前、负荷下和骨折发生后 1 mm 厚股骨切片的显微 CT 图像的三维渲染。 请点击这里查看此图的较大版本.
骨致密化发生在受压高峰区域（例如，股骨头上部），骨折后变形持续存在。骨折发生于曲率增加的区域，表明上皮质壳因张开和剪切而弯曲。皮质开口以正常角度通过主拉伸小梁组和颈上皮质，沿主受压小梁组的方向向远端移动，终点于臼区。剪切断裂沿剪切面引起小梁破坏，距主压缩小梁轴线约45°。骨折后，微结构恢复了大部分位移，在峰值压缩下，除了靠近接触区域的头部区域外，其他任何地方的骨骼都显示出主要的弹性恢复。数字体积相关分析的节点间距为50像素，在零应变测试中显示0.1%的应变误差。一旦受力超过FE预测试样强度的50%，应变就超过了股骨头上部和股骨头的屈服应变，在全分辨率图像中达到8-16%的压缩（视频2 和 图6）。
视频2：全分辨率。 小梁网络逐渐变形和破裂的动画（全分辨率显微CT图像，三维渲染）。 请按此下载此影片。
图6：股骨头的变形。 在施加负荷之前和负荷下股骨近端的叠加（左列）;加载前和骨折后股骨头上表面（第二和第三列）;不同负荷阶段股骨头上微结构的叠加（第四列）;以及股骨头上皮层不稳定的细节（右）。 请点击这里查看此图的较大版本.
失效发生在复杂应变状态下，表现出压缩（8%-12%）、拉伸（4%-8%）和剪切（3%-10%）应变。变形能量是位移的线性函数（R2 = 0.97-0.99，p < 0.01），直至断裂，显示出稳定的断裂行为（图7）。
图 7：骨折前的应变场和股骨的能量吸收能力。 剪切和拉伸应变图以及断裂模式（上图）。由断裂能量 Emax 归一化的变形能量与死亡时 66 至 80 岁的四名供体的位移与断裂位移 Dmax 之间的比率作图。 请点击这里查看此图的较大版本.
补充文件1：显示标本显微CT图像共同配准的屏幕截图。请点击这里下载此文件。
补充文件2：共同配准的冠状显微CT横截面图像的动画，显示了在增加载荷直至断裂时变形的微观结构。请按此下载此影片。
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Discussion
本方案允许在 离体的三维空间中研究髋部骨折的时间经过的微观力学。一种能够对人体股骨近端施加渐进变形并测量反作用力的透射线透明（铝）压缩台已经过定制设计、制造和测试。该协议中采用大体积显微CT扫描仪来提供图像体积的时间序列，以微观分辨率显示整个股骨近端，并逐渐加载。在这项工作中，利用图像的弹性共配准计算了位移场和应变场。该协议能够显示股骨近端微观结构的变形，并提供试样的变形能量和刚度，以响应规定的增量载荷直至骨折点。
该协议的关键方面包括 a） 确定每个标本中的负载步骤以控制实验时间，b） 在整个实验过程中保持骨骼水分，c） 在负载下实现骨骼的显微 CT 成像直至骨折点，d） 确保成像时骨骼的最小移动，以及 e） 存储和处理大量图像。虽然最初设计和用于在特定的同步加速器设施（成像和医学光束线，澳大利亚同步加速器，克莱顿维多利亚州，澳大利亚）测试股骨近端，但该协议最近已与市售的大体积显微 CT 扫描仪一起使用，并用于不同的解剖区域12,13，这提供了其更广泛适用性的证据。然而，根据预期的实验，不同的扫描仪可能需要与此处报告的成像设置不同的成像设置，并且通常提供与此处报告的不同的成像重建和分析软件。在使用低预加载或最小预加载获得的 3/40 扫描体积中观察到明显的图像伪影，这降低了这些数据的实用性。这可能是由于在成像过程中标本在最小载荷下移动。可以优化股骨头和压力窝之间的几何一致性、施加的负荷以及施加负荷和成像之间的时间，以降低成像时显着移动的风险。此外，试样与铝制圆柱壁之间约20 mm的距离似乎足以避免明显的边界伪影。最后，处理大量图像给数据存储和处理带来了挑战。开发的自定义代码和在不同空间分辨率下对不同感兴趣区域的多次分析（首先从下采样图像开始，然后进展到全分辨率图像）能够成功处理每像素 30 μm 的人类股骨近端半部的图像体积。然而，该过程需要配备 128 GB RAM 的高端工作站。
本方案的主要局限性是准静态载荷，因为高动态载荷，例如跌落引起的载荷，可能会引起不稳定的弹性响应，否则在本方案中是不可复制的。然而，这里观察到的弹性稳定的断裂行为似乎与之前在准静态载荷下在孤立的骨芯中观察到的不稳定响应形成鲜明对比，这激发了大量关于断裂预测的研究6,7。与在孤立的骨芯中观察到的骨折相比，本方案观察到的大骨变形 （8%-16%）、皮质壳的局部不稳定性以及骨折前变形能量的线性增加代表了不同的骨折行为，这可能强调了皮质壳在负荷下对内部小梁骨的约束的重要性。
总之，该协议能够研究整个人股骨近端的微观结构失效机制及其能量吸收能力或韧性。该协议可以帮助提高目前对髋部骨折机制的理解，并通过分析更多标本和不同的解剖区域来支持脆性预测、预防和治疗方法的进步。
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Disclosures
所有作者均声明没有利益冲突。
Acknowledgments
澳大利亚研究委员会（FT180100338;IC190100020） 表示感谢。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Absorbent tissue | N/A | Maintain the bone moisture throughout the experiment | |
| Alignment rig | Custom-made | Rig for positioning the specimen in the potting cup | |
| Aluminium potting cup | Custom-made | Potting cup | |
| Bone saw | N/A | Cut the specimen to size | |
| Calibration phantom QCT Pro | Mindways Software, Inc., Austin, USA | CT Calibration 13002 | Calibrate grey levels in the images into equivalent bone mineral (ash) density levels |
| Clinical Computed-Tmography scanner | General Electric Medical Systems Co., Wisconsin, USA | Optima CT660 | Preliminary imaging for the prediction of the load step to fracture |
| Compressive stage | Custom-made | A 10 kg, radiotransparent compressive stage for applying and maintaining throught imaging a prescribed deformation to the specimen. | |
| Dental cement | Soesterberg, The Netherlands | Vertex RS | |
| Femur specimen | Science Care, Phoenix, USA | ||
| Finite-element analysis software | ANSYS Inc., Canonsburg, USA | ANSYS Mechanical APDL | Finite-element software package |
| Freezer | N/A | Store specimens at -20 °C | |
| Hard Drive | Dell | Disk space: 500 GB per volume | |
| Image bnarization and segmentation software | Skyscan-Bruker, Kontich, Belgium | CT analyzer | Image processing software |
| Image elastic segmentation | The University of Sheffield | Bone DVC | https://bonedvc.insigneo.org/dvc/ |
| Image processing and automation software | The MathWork Inc. | Matlab | Image processing software |
| Image registration software | Skyscan-Bruker, Kontich, Belgium | DataViewer | Image processing software |
| Image segmentation and FE modelling software | Simpleware, Exeter, UK | Scan IP | Bone egmentation software |
| Image stiching script | Australian syncrotron, Clayton, VIC, AU | The script is available at IMBL | |
| Image visualization | Kitware, Clifton Park, NY, USA | Paraview | Image visualization |
| Image visualization | Australian National University | Dristhi | Image visualization: doi:10.1117/12.935640 |
| Imaging and Medical beamline | Australian syncrotron, Clayton, VIC, AU | Large object micro-CT beamline at the Australian Synchrotron | |
| Laptop | Dell Inc., USA | ||
| Low-friction x-y table | THK Co., Tokyo, Japan | ||
| NI signal acquisition software | National Instruments, Austin, TX | NI-DAQmx | |
| Phosphate-buffered saline solution | Custom-made | Maintain the bone moisture throughout the experiment | |
| Plastic bag | N/A | Maintain the bone moisture throughout the experiment | |
| Rail | SKF Inc., Lansdale, PA, USA | ||
| Screw-jack mechanism | Benzlers, Örebro, Sweden | Serie BD (warm gear unit) | stroke: 150 mm, maximal load: 10,000 N, gear ratio: 27:1, a displacement per revolution: 0.148 mm |
| Single pco.edge sensor, lens coupled scintillator | Australian syncrotron, Clayton, VIC, AU | Detector Ruby FOV: 141 x 119 mm; 2560 x 2160 px; 55 µm/px; 50 fps | |
| Six axis load cell | ME-Meßsysteme GmbH, Hennigsdorf, GE | K6D6 | Maximal measurement error: 0.005%; maximal force: 10000 N; maximal torque: 500 Nm |
| Strain amplifier | ME-Meßsysteme GmbH, Hennigsdorf, GE | GSV-1A8USB K6D/M16 |
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