Summary
Protokollen muliggør måling af deformationen af knoglemikrostrukturen i hele den proksimale humane lårben og dens sejhed ved at kombinere mikro-CT-scanning med stort volumen, et specialfremstillet komprimeringstrin og avancerede billedbehandlingsværktøjer.
Abstract
Billeddannelse af knoglemikrostrukturen under gradvist stigende belastninger gør det muligt at observere knoglens mikrostrukturelle svigtadfærd. Her beskriver vi en protokol til opnåelse af en sekvens af tredimensionelle mikrostrukturelle billeder af hele den proksimale lårben under gradvist stigende deformation, hvilket forårsager klinisk relevante brud på lårhalsen. Protokollen er demonstreret ved hjælp af fire femora fra kvindelige donorer i alderen 66-80 år i den nedre ende af knoglemineraltætheden i befolkningen (T-score interval = -2,09 til -4,75). Et radiogennemsigtigt tryktrin blev designet til at indlæse prøverne, der replikerer en etbensholdning, mens den påførte belastning registreres under mikrocomputertomografi (mikro-CT) billeddannelse. Synsfeltet var 146 mm bredt og 132 mm højt, og den isotropiske pixelstørrelse var 0, 03 mm. Kraftforøgelsen var baseret på endelige elementforudsigelser af brudbelastningen. Kompressionstrinnet blev brugt til at påføre forskydningen på prøven og vedtage de foreskrevne kraftforøgelser. Subkapitalfrakturer på grund af åbning og forskydning af lårbenshalsen opstod efter fire til fem belastningstrin. Mikro-CT-billederne og reaktionskraftmålingerne blev behandlet for at studere knoglestammen og energiabsorptionskapaciteten. Ustabilitet af cortex optrådte ved de tidlige indlæsningstrin. Den subchondrale knogle i lårbenshovedet viste store deformationer, der nåede 16% før brud, og en progressiv stigning i støttekapaciteten op til brud. Deformationsenergien steg lineært med forskydningen op til brud, mens stivheden faldt til næsten nulværdier umiddelbart før brud. Tre fjerdedele af brudenergien blev taget af prøven under den sidste 25% kraftforøgelse. Afslutningsvis afslørede den udviklede protokol en bemærkelsesværdig energiabsorptionskapacitet eller skadetolerance og en synergisk interaktion mellem den kortikale og trabekulære knogle i en avanceret donoralder.
Introduction
Frakturer i lårbenshalsen er en stor byrde for den aldrende befolkning. Mikrocomputertomografi (mikro-CT) billeddannelse og samtidig mekanisk test gør det muligt at observere knoglemikrostrukturen og studere dens forhold til knoglestyrke, dens aldersrelaterede ændringer og forskydninger under belastning 1,2. Indtil for nylig var mikro-CT-undersøgelser af knogle under belastning imidlertid begrænset til udskårne knoglekerner3, små dyr4 og humane rygsøjleenheder5. Denne protokol kan kvantificere forskydningen af mikrostrukturen af hele den proksimale humane lårben under belastning og efter et brud.
Flere undersøgelser er blevet udført for at undersøge svigt i den menneskelige lårben, og til tider har disse nået kontrasterende konklusioner. For eksempel menes den aldersrelaterede udtynding af de kortikale og trabekulære strukturer at bestemme den aldersrelaterede modtagelighed for brud ved at forårsage elastisk ustabilitet afknoglen 6,7, hvilket er i åbenbar kontrast til den høje bestemmelseskoefficient for kortikal belastning og forudsigelser af lårbensstyrke, forudsat at der ikke er nogen elastisk ustabilitet (R2 = 0,80-0,97)8,9. Ikke desto mindre har sådanne undersøgelser systematisk undervurderet lårbensstyrken (med 21% -29%), hvilket sætter spørgsmålstegn ved de skøre og kvasi-sprøde knogleresponser, der er implementeret i modellerne 8,10. En mulig forklaring på disse tilsyneladende kontrasterende fund kan ligge i en anden brudadfærd af hele knogler sammenlignet med isolerede knoglekerner. Derfor kan observation af deformations- og brudresponserne i knoglemikrostrukturen i hele proksimale lårben fremme viden om hoftefrakturmekanik og relaterede applikationer.
Nuværende metoder til billeddannelse af hele menneskelige knogler med mikrometrisk opløsning er begrænsede. Portalen og detektorstørrelsen skal give et passende arbejdsvolumen til at være vært for den menneskelige proksimale lårben (ca. 13 cm x 10 cm, bredde x længde) og muligvis en pixelstørrelse i størrelsesordenen 0,02-0,03 mm for at sikre, at relevante mikroarkitektoniske træk kan fanges11. Disse specifikationer kan i øjeblikket opfyldes af nogle synkrotronfaciliteter1 og nogle kommercielt tilgængelige mikro-CT-scannere med stort volumen12,13. Tryktrinnet skal være radiogennemsigtigt for at minimere røntgendæmpning og samtidig generere en kraft, der er tilstrækkelig til at forårsage brud på det menneskelige lårben (f.eks. mellem 0,9 kN og 14,3 kN for ældre hvide kvinder)14. Denne store frakturbelastningsvariation komplicerer planlægningen af antallet af belastningstrin til brud, den samlede eksperimenttid og den tilsvarende mængde producerede data. For at løse dette problem kan brudbelastningen og placeringen estimeres via finite-element modellering ved hjælp af knogletæthedsfordelingen af prøven fra klinisk computertomografi (CT) billeder 1,2. Endelig, efter eksperimentet, skal den store mængde data, der genereres, behandles for at studere fejlmekanismerne og energiafledningskapaciteten i hele den menneskelige lårben.
Her beskriver vi en protokol til opnåelse af en sekvens af tredimensionelle mikrostrukturelle billeder af hele den proksimale lårben under gradvist stigende deformation, hvilket forårsager klinisk relevante brud på lårbenshalsen2. Protokollen omfatter planlægning af den trinvise forøgelse af prøvekomprimeringen, indlæsning via et brugerdefineret radiogennemsigtigt komprimeringstrin, billeddannelse via en mikro-CT-scanner med stort volumen og behandling af billederne og belastningsprofilerne.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollen blev udviklet og testet med 12 lårbensprøver modtaget fra et kropsdonationsprogram. Prøverne blev opnået friske og opbevaret ved -20 °C på Biomechanics and Implants Laboratory ved Flinders University (Tonsley, South Australia, Australien). Knoglefugtighed blev opretholdt under hele eksperimentet. Donorerne var kaukasiske kvinder (66-80 år). Etisk godkendelse blev opnået fra Social and Behavioural Research Ethics Committee (SBREC) ved Flinders University (Projekt # 6380).
1. Planlægning af et prøvespecifikt belastningstrintrin
- Scan lårbensprøven ved hjælp af en klinisk CT-scanner, der sigter mod en skivetykkelse og en in-plane pixelstørrelse på ca. 0,5-0,7 mm. Dette trin kan udføres af en ekspert radiograf på enhver offentlig billedbehandlingsfacilitet ved hjælp af standard forudindspillede billeddannelsesprotokoller til knoglevisualisering.
- Sammen med prøven scannes et CT-densitometrikalibreringsfantomom med fem kendte koncentrationer af dikaliumhydrogenphosphat (K2HPO4, ækvivalent densitetsområde ca. mellem 59 mg∙cm−3 og 375 mg∙cm−3).
- Segmenter knoglegeometrien fra de kliniske CT-billeder15, mesh knoglens segmenterede geometri og kortlæg de isotrope materialeegenskaber element for element til de kalibrerede knogletæthedsværdier ved hjælp af densitet-til-elastisk modulforhold rapporteret af Schileo et al.8. Gem masken til yderligere analyse i softwaren med endelige elementer. Fuldfør hvert trin ved at følge de relevante retningslinjer, der følger med segmenterings- og finite-element-softwaren.
- Importer masken til softwaren med endelige elementer. Begræns den 3-6 mm distale ende af modellen helt. Påfør en nominel kraft på 1.000 N, addukteret med 8 ° fra lårbensaksen i koronalplanet og passerer gennem midten af lårbenshovedet. Denne belastningstilstand efterligner en statisk etbenet holdningsopgave (orthoload.com).
- Løs finite-element-modellen ved hjælp af den indbyggede PCG-solver (konvergenstolerance: 1 x 10-7).
BEMÆRK: Her blev finite element-softwaren ANSYS brugt.- Generer en elementtabel, der indeholder de første og tredje hovedstammekomponenter ved elementcentroiden ved at udføre følgende kommandoer:
/INDLÆG1
TABEL,, EPTO1,1
TABEL,, EPTO3,3 - Beregn belastningsforholdet mellem den første og tredje hovedstammekomponent i modellen og knogleudbyttebelastningen i spænding (0,73% belastning) og kompression (1,04% belastning)8 (figur 1) ved at udføre følgende kommandoer:
SMULT,RFT,EPTO1,,1/0.0074,1,
SMULT, RFT,EPTO3, ,1/0.0104,1,
- Generer en elementtabel, der indeholder de første og tredje hovedstammekomponenter ved elementcentroiden ved at udføre følgende kommandoer:
- Den nominelle kraft skaleres ud fra det maksimale belastningsforhold i både spænding og kompression, og den største af de to kasseres for at få et skøn over brudbelastningen. Bestem belastningsforøgelsen som 1/4 af den beregnede brudbelastning1.
Figur 1: Beregning af brudbelastningen. Stamkortet for det endelige element, ligningerne, der bruges til at konvertere den nominelle kraft til brudbelastningen (venstre), og belastningsskemaet, der viser lårbenet (midten til højre), den distale aluminium (øverst til højre) kop og polyethylentrykstikket (nederst til højre). Klik her for at se en større version af denne figur.
2. Forberedelse af lårbensprøvesamlingen (figur 2)
- Prøven tages ud af fryseren (-20 °C).
- Optø ved stuetemperatur (RT) i 24 timer, mens prøven opbevares i en vandtæt plastpose indpakket i absorberende materiale gennemblødt i en fysiologisk opløsning for at opretholde knoglefugtigheden.
- Skær lårbensdiafysen 180 mm fra det proksimale lårbenshoved.
- Centrer lårbenshovedet på justeringsriggens lodrette akse ved at justere den konkave polyethylentryksknap (figur 2D) og lårbenshovedet.
- Juster planet indeholdende lårbenshalsen og diafyseaksen med frontplanet (figur 2).
- Drej diafyseaksen til 8° adduktion, så den lodrette akse repræsenterer orienteringen af hoftereaktionskraften under en statisk enkeltbensstilling (figur 2).
- Klargør tandcementen ved at følge producentens anvisninger.
- Pot den distale ende af prøven i en aluminiumspottekop, der er 55 mm dyb, og fyld aluminiumskoppen med tandcement. Tillad ikke mindre end 30 minutter for cementen at fuldføre hærdningen.
- Prøveenheden opbevares ved -20 °C.
Figur 2: Justeringsriggen. Et frontalt (venstre) og lateralt (højre) foto af justeringsriggen, der viser (A) rammen, (B) aluminiumspottekoppen, (C) en syntetisk lårbensmodel og (D) den sfærisk formede tryksokkel. Klik her for at se en større version af denne figur.
3. Kompression fase samling
BEMÆRK: Kompressionstrinnets udvendige dimensioner er 245 mm diameter, 576 mm højde og 14 kg vægt, eksklusive prøven. Kompressionstrinnet består af to hoveddele: kompressionskammeret og aktuatoren, der samles som følger:
- Kompressionskammer
- Monter polyethylentrykstikket (104 mm diameter, 60 mm højde) i bunden af aluminiumscylinderen (203 mm diameter, 3 mm vægtykkelse), som lukkes af en svejset aluminiumsplade i den ene ende (bund).
- Aktuator
- Saml den øverste struktur ved hjælp af disken, de tre stænger, den trekantede plade og den lodrette skinne (figur 3).
- Monter skrue-donkraftmekanismen (slaglængde: 150 mm, maksimal belastning: 10.000 N, udvekslingsforhold: 27:1, forskydning pr. omdrejning: 0,148 mm) på den trekantede plade.
- Monter vinkeladapteren på den lineære skinne.
- Monter x-y-bordet med lav friktion på vinkeladapteren.
- Monter vejecellen med seks frihedsgrader (maksimal målefejl: 0,005 %; maksimal kraft: 10.000 N; maksimalt drejningsmoment: 500 Nm) på lavfriktionsbordet ved at justere vejecellens x-z-plan til topstrukturens frontplan.
- Tilslut aktuatorskruen til vinkeladapteren.
Figur 3: Den specialfremstillede radiotransparente kompressionstrinsenhed. Et foto (venstre) og en model (højre) af komprimeringsfasen. A) Kompressionskammeret, som er en 3 mm tyk aluminiumscylinder lukket i bunden. B) aktuatorenheden med overbygning C) skruedonkraftmekanismen D) x-Y-tabellen med lav friktion og (E) den seksaksede vejecelle vises og angives på modellen. Klik her for at se en større version af denne figur.
4. Opsætning af eksperimentet
- Optø prøven ved RT i 24 timer, mens den opbevares i en vandtæt plastpose indpakket i absorberende materiale gennemblødt i en fysiologisk opløsning for at opretholde knoglefugtigheden.
- Monter aluminiumskopprøveenheden på vejecellen ved at justere prøveenhedens frontplan med aktuatorens.
- Saml topstrukturen, inklusive prøven, i kompressionskammeret. Pas på at justere lårbenshovedet med den sfæriske konkavitet på polyethylentrykstikket. Sørg for, at lårbenshovedet er i indgreb, men slap inden for trykstikkets sfæriske hulrum.
- Placer kompressionstrinnet på mikro-CT-scannerens rotationstrin ved IMBL (Imaging and Medical Beamline).
- Tilslut vejecellen (fejl < 0,005 %; maksimal kraft: 10.000 N; maksimalt drejningsmoment: 500 Nm) til belastningsforstærkeren.
- Tilslut belastningsforstærkeren via USB til en bærbar computer, der er udstyret med den applikationssoftware, der følger med vejecellen.
- Aktivér skruemekanismen i kompressionstrinnet ved at flytte prøven nedad mod trykslukket, mens du overvåger reaktionskraften målt af vejecellen i den bærbare computer. Stop skruemekanismen, når der er opnået en kompressionskraft svarende til 100 N. Prøven aflæses til 50 N forspænding.
- Vælg den enkelte pco.edge-sensorlinsekoblede scintillator "Ruby" (http://archive.synchrotron.org.au/31-australian-synchrotron/imbl/811-preparation-for-imaging-experiments).
- Indstil synsfeltet til 76,31 mm x 64,39 mm, hvilket for matrixstørrelsen på 2.560 pixel x 2.160 pixel giver en pixelstørrelse på 29,81 μm.
- Indstil rotationstrinnets akse til 8 mm (vandret) fra synsfeltets akse (off-set scanningstilstand) for at udvide synsfeltet til 145,71 mm x 64,39 mm ved en pixelstørrelse på 29,81 μm.
- Indstil scanningsparametrene til en stråleenergi på 60 keV, en rotationsforøgelse på 0,1°, to batcher med 180° rotation (off-set scanning), en eksponeringstid på 50 μs og et rammegennemsnit på to pr. rotationsposition.
- Indstil scanningen til at hente fem fortløbende, lodret stablede scanninger med en lodret forskydning på 26 mm hver, så den samlede højde på den scannede diskenhed er 132,2 mm for en samlet scanningstid på 30 minutter.
5. Mekanisk test med samtidig mikrostrukturel billeddannelse
- Udfør mikro-CT-billeddannelse (pixelstørrelse: 0,03 mm) to gange i referencetilstanden (taget som en belastningsfri tilstand).
- Kraftforøgelsen påføres ved manuelt at aktivere skruedonkraftmekanismen med en konstant hastighed på ca. 1 s pr. runde (0,1-0,2 mm/s).
- Udfør mikro-CT-billeddannelse.
- Trin 5.2 og trin 5.3 gentages indtil prøvebruddet, som indikeret ved et pludseligt fald i reaktionskraften.
- Udfør mikro-CT-billeddannelse af den brudte prøve.
- Sy 1.800-projektionsbillederne (2.560 pixel x 896 pixel i størrelse, 76,8 mm x 26,88 mm, bredde x højde, 32-bit floating point-billeder). Processen syr to projektionsbilleder (taget i vandret off-set scanningstilstand) og de fem lodret forskudte billeder, hvilket giver et enkelt projektionsbillede.
- Rekonstruer lydstyrken på tværsnitsbillederne (4.407 billeder, hvert billede 4.888 x 4.888 pixel i størrelse), og gem dem som 32-bit flydende punktfiler i . TIFF-format (optager 392 GB diskplads).
- Anvend et 3 x 3 Gaussisk filter for at reducere støj. Konverter billederne til 8-bit (256 gråtonebilleder, gemt i bitmapformat, optager ca. 100 GB pr. diskenhed).
BEMÆRK: I dette arbejde blev behandlingen af billederne udført ved hjælp af software, der var tilgængelig på den australske synkrotron under vejledning af operatøren af IMBL.
6. Beregning af forskydnings- og belastningsfeltet
- Undersample tværsnitsbillederne med fire (120 μm/pixel) for at reducere beregningstiden.
- Registrer i øjeblikket billederne af den belastede prøve i rummet til billederne af prøven i den ubelastede referencetilstand. Brug den distale diafyse som mål for den fælles registrering (supplerende fil 1 og supplerende fil 2).
- Oprette tredimensionelle overflademodeller (. STL-filer) til visualisering efter binarisering af mikro-CT-billeder11.
- Registrer billedvolumen elastisk til referencediskenheden ved hjælp af en gitterstørrelse svarende til 50 pixels (SDER = 0,076% belastningsfejl, BoneDVC https://bonedvc.insigneo.org/dvc/) for at bestemme forskydningerne ved gitterets knudepunkter.
- Konverter gitteret til en model med begrænsede elementer. Anvend nodalforskydningen beregnet af BoneDVC på modellen. Løs modellen for at bestemme stammetensoren over hele knoglevolumenet.
- Gentag analysen i det område, der viser de højeste belastningsniveauer, ved hjælp af billederne i fuld opløsning.
- Knyt DVC-stammekortene til billederne i fuld opløsning ved hjælp af kubisk interpolation med interp3-funktionen (Matlab)2.
- Visualiser forskydninger, belastning og mikrostrukturelle billeder til visualisering og animation i store mængder (Matlab)2.
7. Bedømmelse
- Vis den permanente deformation af knoglen (skade) ved at overlejre de billeder, der er opnået under ubelastede forhold og efter bruddet2.
- Vis den progressive mikrostrukturelle deformation af knoglen ved at overlejre de tredimensionelle modeller under ubelastede forhold, ved stigende belastningsniveauer og efter brud2.
- Vis knoglens stamme på brudstedet2.
- Analyser deformationsenergi, stivhed og forskydning ved hjælp af beskrivende statistik og regressionsmetoder2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Billederne viser hele den proksimale lårben, trykstikket, tandcementen, aluminiumskoppen og indpakningsvævet. Knoglemikroarkitekturen kan ses gradvist deformeres, efterhånden som belastningen øges før brud og efter brud (figur 4).
Figur 4: Det komprimeringstrin, der er tilsluttet den bærbare computer. (A) Komprimeringsfasen, (B) den bærbare computer og (C) dataindsamlingsenheden. Prøveenheden er overlejret med gennemsigtighed på kompressionskammeret (højre). Klik her for at se en større version af denne figur.
Lårbenshovedet roterede medialt og gradvist op til brud. Frakturerne var ufuldstændige, åbnede i den overlegne halscortex eller viste forskydningssvigt under kapitalen (video 1 og figur 5). Hovedkrumningen er fladt i kontaktområdet med stikkontakten, hvor lokal elastisk ustabilitet af den kortikale skal kan observeres. Der er imidlertid ikke observeret nogen elastisk ustabilitet over det trabekulære volumen.
Video 1: Animation af hele lårbenet deformering og brud. Animation af hele lårbenet, når det deformeres og frakturer (mikro-CT-billeder subsamplet 4x, tredimensionel gengivelse). Klik her for at downloade denne video.
Figur 5: Tidsforløbne mikrostrukturelle billeder og de tilsvarende belastninger. Sekvensen af koronale mikro-CT-tværsnitsbilleder (øverst til venstre), den anvendte kraft og momentprofilerne (nederst til venstre) for en repræsentativ prøve. Tredimensionel gengivelse af mikro-CT-billeder af en 1 mm tyk skive af lårbenet før belastningen blev påført, under belastning og efter bruddet opstod vises overlejret. Klik her for at se en større version af denne figur.
Knoglefortætning forekom i områder med maksimal kompression (for eksempel i det overlegne lårbenshoved), hvor deformation fortsatte efter en brud. Frakturdebut forekom i områder med øget krumning, hvilket indikerer bøjning af den overlegne kortikale skal ved åbning og forskydning. Kortikal åbning udviklede sig i normale vinkler gennem hovedtræktrabekulær gruppe og den overlegne halscortex, bevægede sig distalt efter retningen af den vigtigste kompressionstrabekulære gruppe og sluttede i calcar-regionen. Forskydningsbrud forårsagede trabekulært svigt langs forskydningsplanet ca. 45° fra hovedtryktrabekulær akse. Efter bruddet genvandt mikroarkitekturen det meste af forskydningen og viste en overvejende elastisk genopretning af knoglen overalt undtagen hovedregionen i nærheden af kontaktområdet under maksimal kompression. Nodeafstanden for den digitale volumenkorrelationsanalyse var 50 pixels, hvilket viste en belastningsfejl på 0,1% i nulbelastningstesten. Stammen oversteg udbyttestammen af knogle i det overlegne lårbenshoved og underkapitalhals, når kraften oversteg 50% af den FE-forudsagte prøvestyrke og nåede 8 - 16% komprimering i billederne i fuld opløsning (video 2 og figur 6).
Video 2: Fuld opløsning. Animation af det trabekulære netværk, der gradvist deformeres og fraktureres (mikro-CT-billeder i fuld opløsning, tredimensionel gengivelse). Klik her for at downloade denne video.
Figur 6: Deformationen af lårbenshovedet. Overlejring af den proksimale lårben, før belastningen blev påført og under belastning (venstre kolonne); overfladen af det overlegne lårbenshoved før belastning og efter brud (anden og tredje kolonne); overlejring af mikrostrukturen i det overlegne lårbenshoved ved forskellige belastningstrin (fjerde kolonne); og detaljer om cortexens ustabilitet på det overlegne lårbenshoved (højre). Klik her for at se en større version af denne figur.
Fejlen opstod under en kompleks belastningstilstand, der viste kompression (8% -12%), spænding (4% -8%) og forskydning (3% -10%) belastning. Deformationsenergien var en lineær funktion af forskydningen (R2 = 0,97-0,99, p < 0,01) op til brud, hvilket viste en stabil brudadfærd (figur 7).
Figur 7: Belastningsfeltet forud for frakturet og lårbenets energiabsorptionsevne. Forskydnings- og trækbelastningskortene og brudmønsteret (øverst). Deformationsenergien normaliseret af brudenergien, Emax, plottes mod forholdet mellem forskydningen og forskydningen ved bruddet, Dmax, for fire donorer mellem 66 og 80 år ved døden. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende fil 1: Skærmbillede, der viser samtidig registrering af mikro-CT-prøvebillederne. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil 2: Animation af samregistrerede koronale mikro-CT-tværsnitsbilleder, der viser den deformerende mikrostruktur ved stigende belastninger op til brud. Klik her for at downloade denne video.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol gør det muligt at studere den forløbne mikromekanik af hoftefrakturer i tre dimensioner ex vivo. Et radiogennemsigtigt (aluminium) tryktrin, der er i stand til at anvende en progressiv deformation på den proksimale halvdel af den menneskelige lårben og måle reaktionskraften, er blevet specialdesignet, fremstillet og testet. En mikro-CT-scanner med stort volumen anvendes i denne protokol til at tilvejebringe en tidsmæssig sekvens af billedvolumener, der viser hele det proksimale lårben med progressiv belastning ved mikrometrisk opløsning. I dette arbejde blev forskydnings- og belastningsfelterne beregnet ved hjælp af elastisk samregistrering af billederne. Protokollen gør det muligt at vise deformationen af mikrostrukturen i den proksimale lårben og tilvejebringer prøvens deformationsenergi og stivhed som reaktion på en foreskrevet trinvis belastning op til brudpunktet.
Kritiske aspekter af protokollen involverer a) bestemmelse af belastningstrinnet i hver prøve for at kontrollere eksperimenttiden, b) opretholdelse af knoglefugtigheden under hele eksperimentet, c) aktivering af mikro-CT-billeddannelse af knoglen under belastning op til brudpunktet, d) sikring af minimal bevægelse af knoglen under billeddannelse og e) lagring og behandling af store billedvolumener. Selvom den oprindeligt blev designet og brugt til test af den proksimale lårben på en specifik synkrotronfacilitet (Imaging and Medical Beamline, Australian Synchrotron, Clayton VIC, Australien), er denne protokol for nylig blevet brugt med en kommercielt tilgængelig mikro-CT-scanner med stort volumen og til forskellige anatomiske regioner12,13, hvilket giver bevis for dets bredere anvendelighed. Ikke desto mindre kan forskellige scannere kræve forskellige billedbehandlingsindstillinger end dem, der er rapporteret her, afhængigt af det tilsigtede eksperiment, og leverer typisk billedrekonstruktioner og analysesoftware, der er forskellige fra dem, der rapporteres her. Væsentlige billedartefakter blev observeret i 3/40 scanningsvolumener opnået ved hjælp af lav eller minimal forudindlæsning, hvilket reducerede nytten af disse data. Dette skyldtes sandsynligvis prøvens bevægelse under minimal belastning under billeddannelse. Den geometriske overensstemmelse mellem lårbenshovedet og trykkontakten, den påførte belastning og tiden mellem påføring af belastningen og billeddannelsen kan optimeres for at reducere risikoen for betydelig bevægelse under billeddannelse. Desuden syntes ca. 20 mm afstand mellem prøven og aluminiumscylindervæggen tilstrækkelig til at undgå betydelige grænseartefakter. Endelig giver behandling af store mængder billeder udfordringer for datalagring og -behandling. Den brugerdefinerede kode, der blev udviklet, og de mange analyser for forskellige interesseområder ved forskellige rumlige opløsninger (først startende fra de nedsamplede billeder og derefter videre til billederne i fuld opløsning) muliggjorde en vellykket behandling af billedvolumenerne i den proksimale halvdel af den menneskelige lårben ved 30 μm pr. pixel. Ikke desto mindre krævede processen en top-end arbejdsstation udstyret med 128 GB RAM.
Hovedbegrænsningen ved denne protokol er de kvasistatiske belastninger, da højdynamisk belastning, såsom den, der følger af et fald, kan fremkalde en ustabil elastisk respons, som ellers ikke kan replikeres i denne protokol. Ikke desto mindre synes den elastisk stabile frakturadfærd, der observeres her, at være i direkte kontrast til de ustabile reaktioner, der tidligere blev observeret i isolerede knoglekerner under kvasistatisk belastning, hvilket motiverede en stor mængde forskning i frakturforudsigelse 6,7. Den store knogledeformation (8%-16%) observeret med denne protokol før brud, den lokale ustabilitet af den kortikale skal og den lineære stigning i deformationsenergien op til brud repræsenterer en anden brudadfærd sammenlignet med den, der observeres i isolerede knoglekerner, hvilket sandsynligvis understreger betydningen af indeslutningen, som den kortikale skal tilvejebringer til den indre trabekulære knogle, når den er under belastning.
Afslutningsvis muliggør denne protokol undersøgelsen af de mikrostrukturelle fejlmekanismer i hele den proksimale humane lårben og dens energiabsorptionskapacitet eller sejhed. Denne protokol kan hjælpe med at forbedre den nuværende forståelse af hoftefrakturmekanismen og støtte udviklingen af metoder til forudsigelse, forebyggelse og behandling af skrøbelighed gennem analyse af flere prøver og forskellige anatomiske regioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Finansiering fra Australian Research Council (FT180100338; IC190100020) er taknemmeligt anerkendt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Absorbent tissue | N/A | Maintain the bone moisture throughout the experiment | |
| Alignment rig | Custom-made | Rig for positioning the specimen in the potting cup | |
| Aluminium potting cup | Custom-made | Potting cup | |
| Bone saw | N/A | Cut the specimen to size | |
| Calibration phantom QCT Pro | Mindways Software, Inc., Austin, USA | CT Calibration 13002 | Calibrate grey levels in the images into equivalent bone mineral (ash) density levels |
| Clinical Computed-Tmography scanner | General Electric Medical Systems Co., Wisconsin, USA | Optima CT660 | Preliminary imaging for the prediction of the load step to fracture |
| Compressive stage | Custom-made | A 10 kg, radiotransparent compressive stage for applying and maintaining throught imaging a prescribed deformation to the specimen. | |
| Dental cement | Soesterberg, The Netherlands | Vertex RS | |
| Femur specimen | Science Care, Phoenix, USA | ||
| Finite-element analysis software | ANSYS Inc., Canonsburg, USA | ANSYS Mechanical APDL | Finite-element software package |
| Freezer | N/A | Store specimens at -20 °C | |
| Hard Drive | Dell | Disk space: 500 GB per volume | |
| Image bnarization and segmentation software | Skyscan-Bruker, Kontich, Belgium | CT analyzer | Image processing software |
| Image elastic segmentation | The University of Sheffield | Bone DVC | https://bonedvc.insigneo.org/dvc/ |
| Image processing and automation software | The MathWork Inc. | Matlab | Image processing software |
| Image registration software | Skyscan-Bruker, Kontich, Belgium | DataViewer | Image processing software |
| Image segmentation and FE modelling software | Simpleware, Exeter, UK | Scan IP | Bone egmentation software |
| Image stiching script | Australian syncrotron, Clayton, VIC, AU | The script is available at IMBL | |
| Image visualization | Kitware, Clifton Park, NY, USA | Paraview | Image visualization |
| Image visualization | Australian National University | Dristhi | Image visualization: doi:10.1117/12.935640 |
| Imaging and Medical beamline | Australian syncrotron, Clayton, VIC, AU | Large object micro-CT beamline at the Australian Synchrotron | |
| Laptop | Dell Inc., USA | ||
| Low-friction x-y table | THK Co., Tokyo, Japan | ||
| NI signal acquisition software | National Instruments, Austin, TX | NI-DAQmx | |
| Phosphate-buffered saline solution | Custom-made | Maintain the bone moisture throughout the experiment | |
| Plastic bag | N/A | Maintain the bone moisture throughout the experiment | |
| Rail | SKF Inc., Lansdale, PA, USA | ||
| Screw-jack mechanism | Benzlers, Örebro, Sweden | Serie BD (warm gear unit) | stroke: 150 mm, maximal load: 10,000 N, gear ratio: 27:1, a displacement per revolution: 0.148 mm |
| Single pco.edge sensor, lens coupled scintillator | Australian syncrotron, Clayton, VIC, AU | Detector Ruby FOV: 141 x 119 mm; 2560 x 2160 px; 55 µm/px; 50 fps | |
| Six axis load cell | ME-Meßsysteme GmbH, Hennigsdorf, GE | K6D6 | Maximal measurement error: 0.005%; maximal force: 10000 N; maximal torque: 500 Nm |
| Strain amplifier | ME-Meßsysteme GmbH, Hennigsdorf, GE | GSV-1A8USB K6D/M16 |
References
- Martelli, S., Perilli, E. Time-elapsed synchrotron-light microstructural imaging of femoral neck fracture. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 84, 265-272 (2018).
- Martelli, S., Giorgi, M., Dall' Ara, E., Perilli, E. Damage tolerance and toughness of elderly human femora. Acta Biomaterialia. 123, 167-177 (2021).
- Perilli, E., et al. Dependence of mechanical compressive strength on local variations in microarchitecture in cancellous bone of proximal human femur. Journal of Biomechanics. 41 (2), 438-446 (2008).
- Thurner, P. J., et al. Time-lapsed investigation of three-dimensional failure and damage accumulation in trabecular bone using synchrotron light. Bone. 39 (2), 289-299 (2006).
- Jackman, T. M. Quantitative, 3D visualization of the initiation and progression of vertebral fractures under compression and anterior flexion. Journal of Bone and Mineral Research. 31 (4), 777-788 (2016).
- Mayhew, P. M., et al. Relation between age, femoral neck cortical stability, and hip fracture risk. Lancet. 366 (9480), 129-135 (2005).
- Nazarian, A., Stauber, M., Zurakowski, D., Snyder, B. D., Müller, R. The interaction of microstructure and volume fraction in predicting failure in cancellous bone. Bone. 39 (6), 1196-1202 (2006).
- Schileo, E., et al. To what extent can linear finite element models of human femora predict failure under stance and fall loading configurations. Journal of Biomechanics. 47 (14), 3531-3538 (2014).
- Schileo, E., et al. An accurate estimation of bone density improves the accuracy of subject-specific finite element models. Journal of Biomechanics. 41 (11), 2483-2491 (2008).
- Dall'ara, E., et al. A nonlinear QCT-based finite element model validation study for the human femur tested in two configurations in vitro. Bone. 52 (1), 27-38 (2013).
- Perilli, E., Parkinson, I. H., Reynolds, K. J. Micro-CT examination of human bone: from biopsies towards the entire organ. Annali dell'Istituto Superiore di Sanità. 48 (1), 75-82 (2012).
- Wearne, L. S., Rapagna, S., Taylor, M., Perilli, E. Micro-CT scan optimisation for mechanical loading of tibia with titanium tibial tray: A digital volume correlation zero strain error analysis. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 134, 105336 (2022).
- Bennett, K. J., et al. Ex vivo assessment of surgically repaired tibial plateau fracture displacement under axial load using large-volume micro-CT. Journal of Biomechanics. 144, 111275 (2022).
- Falcinelli, C., et al. Multiple loading conditions analysis can improve the association between finite element bone strength estimates and proximal femur fractures: A preliminary study in elderly women. Bone. 67, 71-80 (2014).
- Orthopedic Image Segmentation. Synopsys. , Available from: https://www.synopsys.com/simpleware/news-and-events/ortho-medical-image-segmentation.html (2020).
