Summary
Протокол позволяет измерять деформацию микроструктуры кости во всем проксимальном отделе бедренной кости человека и ее прочность, сочетая микрокомпьютерную томографию большого объема, компрессионную стадию, изготовленную по индивидуальному заказу, и передовые инструменты обработки изображений.
Abstract
Визуализация микроструктуры кости при прогрессивно возрастающих нагрузках позволяет наблюдать за поведением микроструктурного разрушения кости. В данной работе мы описываем протокол получения последовательности трехмерных микроструктурных изображений всего проксимального отдела бедренной кости при прогрессивно нарастающей деформации, вызывающей клинически значимые переломы шейки бедренной кости. Протокол продемонстрирован на примере четырех бедренных костей доноров женского пола в возрасте 66-80 лет с нижней границей минеральной плотности костной ткани в популяции (диапазон Т-критерия = от −2,09 до −4,75). Радиопрозрачный компрессионный столик был разработан для нагружения образцов, воспроизводящих стойку на одной ноге, с одновременным регистрированием приложенной нагрузки при микрокомпьютерной томографии (микро-КТ). Поле зрения составляло 146 мм в ширину и 132 мм в высоту, а размер изотропного пикселя — 0,03 мм. Приращение силы было основано на конечно-элементных прогнозах нагрузки на разрушение. Стадия сжатия использовалась для приложения смещения к образцу и введения заданного приращения усилия. Субкапитальные переломы из-за вскрытия и сдвига шейки бедренной кости происходили после четырех-пяти приращений нагрузки. Микро-КТ-изображения и измерения силы реакции были обработаны для изучения деформации кости и способности поглощать энергию. Нестабильность коры головного мозга проявилась на ранних этапах нагрузки. Субхондральная кость головки бедренной кости демонстрировала большие деформации, достигавшие 16% до перелома, и прогрессирующее увеличение опорной способности вплоть до перелома. Энергия деформации линейно возрастала со смещением вплоть до разрушения, в то время как жесткость снижалась до околонулевых значений непосредственно перед разрушением. Три четверти энергии разрушения было поглощено образцом во время заключительного 25-процентного приращения силы. В заключение, разработанный протокол показал замечательную способность поглощать энергию, или устойчивость к повреждениям, а также синергетическое взаимодействие между кортикальной и трабекулярной костью в пожилом возрасте донора.
Introduction
Переломы шейки бедренной кости являются серьезным бременем для стареющего населения. Микрокомпьютерная томография (микро-КТ) и сопутствующее механическое исследование позволяют наблюдать микроструктуру кости и изучать ее связь с прочностью кости, ее возрастными изменениями и смещениями под нагрузкой 1,2. Однако до недавнего времени микро-КТ исследований костей под нагрузкой ограничивались иссеченными костными ядрами3, мелкими животными4 и позвоночником человека5. Настоящий протокол позволяет количественно оценить смещение микроструктуры всего проксимального отдела бедренной кости человека под нагрузкой и после перелома.
Было проведено несколько исследований по изучению недостаточности бедренной кости человека, и иногда они приходили к противоположным выводам. Например, считается, что возрастное истончение кортикальных и трабекулярных структур определяет возрастную предрасположенность к переломам, вызывая эластическую нестабильность кости6,7, что явно контрастирует с высоким коэффициентом определения деформации коры и прогнозов прочности бедренной кости при условии отсутствия эластической нестабильности (R2 = 0,80-0,97)8,9. Тем не менее, такие исследования систематически недооценивали прочность бедренной кости (на 21%-29%), что ставит под сомнение хрупкие и квазихрупкие костные реакции, реализованные в моделях 8,10. Одно из возможных объяснений этих, казалось бы, противоречащих друг другу результатов может заключаться в различном поведении при переломе целых костей по сравнению с изолированными костными ядрами. Таким образом, наблюдение за реакцией на деформацию и перелом микроструктуры кости во всем проксимальном отделе бедренной кости может углубить знания о механике перелома бедра и связанных с ней приложениях.
Существующие методы визуализации целых костей человека с микрометрическим разрешением ограничены. Размер портала и детектора должен обеспечивать подходящий рабочий объем для размещения проксимального отдела бедренной кости человека (примерно 13 см x 10 см, ширина x длина) и, возможно, размер пикселя порядка 0,02-0,03 мм, чтобы обеспечить возможность захвата соответствующих микроархитектурных элементов11. В настоящее время этим спецификациям могут соответствовать некоторые синхротронныеустановки1 и некоторые коммерчески доступные микрокомпьютерные томографыбольшого объема 12,13. Компрессионная ступень должна быть радиопрозрачной, чтобы свести к минимуму ослабление рентгеновского излучения и создать силу, достаточную для того, чтобы вызвать перелом бедренной кости человека (например, от 0,9 кН до 14,3 кН для пожилых белых женщин)14. Такое большое изменение нагрузки на трещину усложняет планирование количества этапов нагружения до разрушения, общего времени эксперимента и соответствующего объема получаемых данных. Для решения этой проблемы нагрузка и локализация перелома могут быть оценены с помощью конечно-элементного моделирования с использованием распределения плотности костной ткани образца по изображениям клинической компьютерной томографии (КТ) 1,2. Наконец, после эксперимента большой объем полученных данных необходимо обработать для изучения механизмов отказа и способности к диссипации энергии во всей бедренной кости человека.
Здесь мы описываем протокол получения последовательности трехмерных микроструктурных изображений всего проксимального отдела бедренной кости при прогрессивно нарастающей деформации, которая вызывает клинически значимые переломы шейки бедренной кости2. Протокол включает в себя планирование ступенчатого приращения сжатия образца, нагружение с помощью специальной радиопрозрачной компрессионной ступени, визуализацию с помощью микрокомпьютерного томографа большого объема и обработку изображений и профилей нагрузки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Протокол был разработан и протестирован на 12 образцах бедренной кости, полученных в рамках программы донорства тела. Образцы получали свежими и хранили при температуре −20 °C в Лаборатории биомеханики и имплантатов Университета Флиндерса (Тонсли, Южная Австралия, Австралия). Влажность костей поддерживалась на протяжении всего эксперимента. Донорами выступили женщины кавказской расы (66-80 лет). Этическое разрешение было получено от Комитета по этике социальных и поведенческих исследований (SBREC) Университета Флиндерса (Project # 6380).
1. Планирование шага нагрузки для конкретного образца
- Отсканируйте образец бедренной кости с помощью клинического компьютерного томографа, ориентируясь на толщину среза и размер пикселя в плоскости примерно 0,5-0,7 мм. Этот этап может быть выполнен экспертом-рентгенологом в любом общественном учреждении визуализации с использованием стандартных предварительно записанных протоколов визуализации для визуализации костей.
- Вместе с образцом отсканируйте калибровочный фантом для КТ-денситометрии с пятью известными концентрациями дикалийгидрофосфата (K2HPO4, эквивалентный диапазон плотности примерно от 59 мг∙см−3 до 375 мг∙см−3).
- Сегментируйте геометрию кости по клиническим КТ-изображениям15, создайте сетку сегментированной геометрии кости и сопоставьте изотропные свойства материала элемент за элементом с калиброванными значениями плотности костной ткани, используя зависимость плотности от модуля упругости, о которой сообщили Schileo et al.8. Сохраните сетку для дальнейшего анализа в программном обеспечении конечных элементов. Выполняйте каждый шаг, следуя соответствующим рекомендациям, прилагаемым к программному обеспечению сегментации и конечных элементов.
- Импортируйте сетку в конечно-элементное программное обеспечение. Полностью ограничьте дистальный конец модели на 3-6 мм. Приложите номинальное усилие 1000 Н, приводимое под углом 8° от оси бедренного стержня в корональной плоскости и проходящее через центр головки бедренной кости. Это условие нагружения имитирует статическую задачу стояния на одной ноге (orthoload.com).
- Решить конечно-элементную модель с помощью встроенного решателя PCG (допуск сходимости: 1 x 10−7).
ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь использовалось конечно-элементное программное обеспечение ANSYS.- Сгенерируйте таблицу элементов, содержащую первый и третий компоненты главной деформации в центроиде элемента, выполнив следующие команды:
/ПОСТ1
ETABLE,, EPTO1,1
ETABLE,, EPTO3,3 - Рассчитайте коэффициент деформации между первым и третьим основными компонентами деформации в модели и деформацией текучести кости при растяжении (деформация 0,73%) и сжатии (деформация 1,04%)8 (рис. 1), выполнив следующие команды:
SMULT,RFT,EPTO1, ,1/0.0074,1,
СМУЛЬТ, РФТ, ЭПТО3, ,1/0,0104,1,
- Сгенерируйте таблицу элементов, содержащую первый и третий компоненты главной деформации в центроиде элемента, выполнив следующие команды:
- Масштабируйте номинальную силу по коэффициенту пиковой деформации как при растяжении, так и при сжатии и отбрасывайте наибольший из двух, чтобы получить оценку нагрузки на разрушение. Определите приращение нагрузки как 1/4 расчетной нагрузки разрушения1.
Рисунок 1: Расчет нагрузки на разрушение. Карта деформации конечных элементов, уравнения, используемые для преобразования номинальной силы в нагрузку на разрушение (слева), и схема нагружения, отображающая бедренную кость (в центре справа), дистальную алюминиевую чашку (вверху справа) и полиэтиленовую напорную раструбку (внизу справа). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
2. Подготовка образца бедренной кости в сборе (Рисунок 2)
- Достаньте образец из морозильной камеры (−20 °C).
- Разморозьте при комнатной температуре (RT) в течение 24 часов, держа образец в водонепроницаемом полиэтиленовом пакете, завернутом в абсорбирующий материал, пропитанный физиологическим раствором для поддержания влажности кости.
- Разрезают диафиз бедренной кости на расстоянии 180 мм от проксимального отдела головки бедренной кости.
- Центрируйте головку бедренной кости по вертикальной оси юстировочной установки, совместив вогнутое полиэтиленовое напорное гнездо (рис. 2D) и головку бедренной кости.
- Совместите плоскость, содержащую шейку бедренной кости и ось диафиза, с фронтальной плоскостью (рисунок 2).
- Поверните диафизарную ось до приведения 8° так, чтобы вертикальная ось представляла ориентацию силы реакции бедра во время статической стойки на одной ноге (рис. 2).
- Приготовьте стоматологический цемент, следуя инструкциям производителя.
- Поместите дистальный конец образца в алюминиевый стаканчик глубиной 55 мм, заполнив алюминиевый стаканчик стоматологическим цементом. Подождите не менее 30 минут, чтобы цемент полностью затвердел.
- Храните образец в сборе при температуре −20 °C.
Рисунок 2: Юстировочная установка. Фронтальная (слева) и боковая (справа) фотография юстировочного стенда, на которой изображены (A) рама, (B) алюминиевый стаканчик для заливки, (C) синтетическая модель бедренной кости и (D) напорное гнездо сферической формы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
3. Сборка ступени сжатия
ПРИМЕЧАНИЕ: Внешние размеры ступени сжатия составляют 245 мм в диаметре, 576 мм в высоту и вес 14 кг без учета образца. Ступень сжатия состоит из двух основных частей: камеры сжатия и привода, которые собраны следующим образом:
- Камера сжатия
- Установите полиэтиленовый напорный патрубок (диаметр 104 мм, высота 60 мм) в нижней части алюминиевого баллона (диаметр 203 мм, толщина стенки 3 мм), который закрывается приваренной алюминиевой пластиной с одного конца (снизу).
- Привод
- Соберите верхнюю конструкцию с помощью диска, трех стержней, треугольной пластины и вертикальной направляющей (Рисунок 3).
- Установите винтовой домкратный механизм (ход: 150 мм, максимальная нагрузка: 10 000 Н, передаточное число: 27:1, рабочий объем на оборот: 0,148 мм) на треугольной пластине.
- Установите угловой адаптер на линейную направляющую.
- Установите стол x-y с низким коэффициентом трения на угловой адаптер.
- Установите тензодатчик с шестью степенями свободы (максимальная погрешность измерения: 0,005%; максимальная сила: 10 000 Н; максимальный крутящий момент: 500 Нм) на стол с низким коэффициентом трения, совместив плоскость x-z тензодатчика с фронтальной плоскостью верхней конструкции.
- Подсоедините винт привода к угловому адаптеру.
Рисунок 3: Изготовленная по индивидуальному заказу радиопрозрачная ступень сжатия. Фотография (слева) и модель (справа) компрессионной ступени. (A) Камера сжатия, представляющая собой алюминиевый цилиндр толщиной 3 мм, закрытый снизу; (B) привод в сборе с верхней конструкцией; (C) винтовой домкратный механизм; (D) таблица x-y с низким коэффициентом трения; и (E) шестиосевой тензодатчик отображаются и указываются на модели. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
4. Постановка эксперимента
- Разморозьте образец в RT в течение 24 часов, храня его в водонепроницаемом пластиковом пакете, завернутом в абсорбирующий материал, пропитанный физиологическим раствором для поддержания влажности кости.
- Установите узел образца из алюминиевой чашки на тензодатчик, совместив фронтальную плоскость узла образца с плоскостью привода.
- Соберите верхнюю конструкцию, включая образец, в камеру сжатия. Позаботьтесь о том, чтобы головка бедренной кости совпадала со сферической вогнутостью на полиэтиленовом напорном гнезде. Убедитесь, что головка бедренной кости задействована, но провисает в сферической полости напорной впадины.
- Поместите компрессионный столик на вращающийся столик микро-КТ-сканера в центре визуализации и медицинского пучка (IMBL).
- Подключите тензодатчик (погрешность < 0,005%; максимальное усилие: 10 000 Н; максимальный крутящий момент: 500 Нм) к усилителю деформации.
- Подключите усилитель деформации через USB к портативному компьютеру, оснащенному прикладным программным обеспечением, поставляемым с тензодатчиком.
- Приводите в действие винтовой механизм на стадии сжатия, перемещая образец вниз к нажимному гнезду, одновременно контролируя силу реакции, измеряемую тензодатчиком в ноутбуке. Остановите винтовой механизм, как только будет достигнуто усилие сжатия, равное 100 Н. Выгрузите образец до предварительной нагрузки 50 Н.
- Выберите сцинтиллятор с одним датчиком pco.edge "Ruby" (http://archive.synchrotron.org.au/31-australian-synchrotron/imbl/811-preparation-for-imaging-experiments).
- Установите поле зрения 76,31 мм x 64,39 мм, что для размера массива 2 560 x 2 160 пикселей обеспечивает размер пикселя 29,81 мкм.
- Установите ось вращающегося столика на расстоянии 8 мм (по горизонтали) от оси поля зрения (режим сканирования со смещением), чтобы расширить поле зрения до 145,71 мм x 64,39 мм при размере пикселя 29,81 мкм.
- Установите параметры сканирования на энергию луча 60 кэВ, приращение вращения 0,1°, две партии поворота на 180° (сканирование со смещением), время экспозиции 50 мкс и усреднение кадров по два на положение вращения.
- Настройте сканирование на получение пяти последовательных вертикальных сканов со сдвигом по вертикали на 26 мм каждое, чтобы общая высота сканируемого тома составляла 132,2 мм при общем времени сканирования 30 минут.
5. Механические испытания с сопутствующей микроструктурной визуализацией
- Выполните микрокомпьютерную томографию (размер пикселя: 0,03 мм) дважды в эталонном состоянии (принятом как условие нулевой деформации).
- Приращение усилия осуществляется путем ручного приведения в действие винтового домкрата с постоянной скоростью примерно 1 с на патрон (0,1-0,2 мм/с).
- Выполните микрокомпьютерную томографию.
- Повторите шаги 5.2 и 5.3 до тех пор, пока образец не будет разрушен, на что указывает внезапное падение силы реакции.
- Выполните микрокомпьютерную томографию образца с переломом.
- Сшите 1 800 проекционных изображений (размер 2 560 пикселей x 896 пикселей, 76,8 мм x 26,88 мм, ширина x высота, 32-битные изображения с плавающей запятой). В ходе этого процесса сшиваются два проекционных изображения (снятых в режиме горизонтального офсетного сканирования) и пять изображений, сдвинутых по вертикали, в результате чего получается единое проекционное изображение.
- Восстановите объем изображений поперечного сечения (4 407 изображений, каждое изображение размером 4 888 x 4 888 пикселей) и сохраните их в виде 32-разрядных файлов с плавающей запятой в формате . Формат TIFF (занимающий 392 ГБ дискового пространства).
- Примените фильтр Гаусса 3 x 3 для уменьшения шума. Преобразуйте изображения в 8-битные (256 изображений с уровнями серого, сохраненных в растровом формате, занимающих примерно 100 ГБ на том).
ПРИМЕЧАНИЕ: В данной работе обработка изображений проводилась с использованием программного обеспечения, имеющегося на Австралийском синхротроне, под руководством оператора IMBL.
6. Расчет поля перемещений и деформаций
- Субдискретизация изображений поперечного сечения на четыре (120 мкм/пиксель) для сокращения времени вычисления.
- Жесткая совместная регистрация в пространстве изображений образца под нагрузкой с изображениями образца в ненагруженном эталонном состоянии. Используйте дистальный диафиз в качестве мишени для совместной регистрации (Дополнительный файл 1 и Дополнительный файл 2).
- Создание трехмерных моделей поверхностей (. STL) для визуализации после бинаризации микро-КТ изображений11.
- Упруго зарегистрируйте объем изображения до эталонного объема, используя размер сетки, равный 50 пикселям (SDER = 0,076% погрешности деформации, BoneDVC, https://bonedvc.insigneo.org/dvc/) для определения смещений в узлах сетки.
- Преобразуйте сетку в конечно-элементную модель. Примените к модели узловое смещение, рассчитанное с помощью BoneDVC. Решите модель, чтобы определить тензор деформации по всему объему кости.
- Повторите анализ в области, показывающей самые высокие уровни деформации, используя изображения с полным разрешением.
- Сопоставьте карты деформации DVC с изображениями с полным разрешением с помощью кубической интерполяции с функцией interp3 (Matlab)2.
- Визуализация изображений смещений, деформаций и микроструктур для визуализации больших объемов и анимации (Matlab)2.
7. Анализ
- Отображение остаточной деформации кости (повреждения) путем наложения изображений, полученных в ненагруженных условиях и после перелома2.
- Отображение прогрессирующей микроструктурной деформации кости путем наложения трехмерных моделей в ненагруженных условиях, при возрастающих уровнях нагрузки и после перелома2.
- Отобразите деформацию кости в месте перелома2.
- Анализ энергии деформации, жесткости и смещения с использованием описательной статистики и методов регрессии2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
На изображениях видна вся проксимальная часть бедренной кости, прижимная впадина, зубной цемент, алюминиевая чашка и оберточная ткань. Микроархитектура кости прогрессивно деформируется по мере увеличения нагрузки до и после перелома (рис. 4).
Рисунок 4: Компрессионная ступень, подключенная к портативному компьютеру. (A) Компрессионная ступень, (B) ноутбук и (C) устройство сбора данных. Сборка образца наносится прозрачным слоем на камеру сжатия (справа). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Головка бедренной кости вращалась медиально и прогрессивно вплоть до перелома. Переломы были неполными, открывались в верхней коре шеи или показывали разрушение субкапитального сдвига (Видео 1 и Рисунок 5). Искривление головки сглаживается в области соприкосновения с лункой, где может наблюдаться локальная эластическая нестабильность кортикальной оболочки. Однако упругой нестабильности над трабекулярным объемом не наблюдалось.
Видео 1: Анимация деформации и разрушения всей бедренной кости. Анимация всей бедренной кости в процессе ее деформации и перелома (микро-КТ изображения с субдискретизацией 4x, трехмерный рендеринг). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать это видео.
Рисунок 5: Микроструктурные изображения по прошествии времени и соответствующие нагрузки. Последовательность изображений поперечного сечения корональной микроКТ (вверху слева), приложенное усилие и профили момента (внизу слева) для одного репрезентативного образца. Наложены трехмерные изображения микро-КТ среза бедренной кости толщиной 1 мм до приложения нагрузки, под нагрузкой и после перелома. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Уплотнение кости происходило в областях пиковой компрессии (например, в верхней головке бедренной кости), где деформация сохранялась после перелома. Начало перелома происходило в областях повышенной кривизны, что указывает на искривление верхней кортикальной оболочки при раскрытии и сдвиге. Кортикальное отверстие прогрессировало под нормальными углами через основную напряженную трабекулярную группу и верхнюю кору шеи, двигаясь дистально в направлении основной компрессионной трабекулярной группы и заканчиваясь в области пяточной кости. Сдвиговое разрушение вызвало трабекулярное разрушение вдоль плоскости сдвига, под углом около 45° от главной оси сжатия трабекулярной оси. После перелома микроархитектура восстановила большую часть смещения, демонстрируя преимущественно упругое восстановление кости везде, кроме области головки в непосредственной близости от контактной области при пиковой компрессии. Расстояние между узлами для цифрового объемного корреляционного анализа составило 50 пикселей, что свидетельствует о погрешности деформации 0,1% в тесте на нулевую деформацию. Деформация превышала деформацию кости в верхней головке бедренной кости и субкапитальной шейке, когда сила превышала 50% от прогнозируемой КЭ прочности образца, достигая 8-16% сжатия на изображениях с полным разрешением (Видео 2 и Рисунок 6).
Видео 2: Полное разрешение. Анимация трабекулярной сети с прогрессирующей деформацией и трещиноватостью (микро-КТ изображения с полным разрешением, трехмерный рендеринг). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать это видео.
Рисунок 6: Деформация головки бедренной кости. Наложение проксимального отдела бедренной кости до и под нагрузкой (левая колонка); поверхность верхней головки бедренной кости до нагрузки и после перелома (вторая и третья колонки); суперпозиция микроструктуры в верхней головке бедренной кости на разных этапах нагрузки (четвертая колонка); и детали нестабильности коры головки верхней бедренной кости (справа). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Разрушение произошло в сложном деформированном состоянии, демонстрирующем деформацию сжатия (8%-12%), растяжения (4%-8%) и сдвига (3%-10%). Энергия деформации была линейной функцией смещения (R2 = 0,97-0,99, p < 0,01) до разрушения, демонстрируя стабильное поведение разрушения (рис. 7).
Рисунок 7: Поле деформации, предшествующее перелому, и способность бедренной кости поглощать энергию. Карты деформации сдвига и растяжения, а также характер разрушения (вверху). Энергия деформации, нормированная энергией разрушения, Emax, построена в зависимости от соотношения между смещением и смещением при переломе, Dmax, для четырех доноров в возрасте от 66 до 80 лет на момент смерти. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительный файл 1: Снимок экрана, показывающий совместную регистрацию образцов микро-КТ изображений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.
Дополнительный файл 2: Анимация совместно зарегистрированных изображений поперечного сечения корональной микро-КТ, отображающих деформирующую микроструктуру при возрастающих нагрузках вплоть до разрушения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать это видео.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Настоящий протокол позволяет изучать микромеханику переломов шейки бедра в трех измерениях ex vivo. Радиопрозрачная (алюминиевая) компрессионная ступень, способная оказывать прогрессирующую деформацию на проксимальную половину бедренной кости человека и измерять силу реакции, была специально разработана, изготовлена и испытана. В этом протоколе используется микрокомпьютерный томограф большого объема для обеспечения временной последовательности объемов изображений, отображающих весь проксимальный отдел бедренной кости с прогрессивной нагрузкой с микрометрическим разрешением. В данной работе поля смещения и деформации были рассчитаны с использованием упругой совместной регистрации изображений. Протокол позволяет отображать деформацию микроструктуры проксимального отдела бедренной кости и обеспечивает энергию деформации и жесткость образца в ответ на заданную приращительную нагрузку до точки разрушения.
Важнейшие аспекты протокола включают в себя: а) определение шага нагрузки в каждом образце для контроля времени эксперимента, б) поддержание влажности кости на протяжении всего эксперимента, в) возможность микро-КТ визуализации кости под нагрузкой до момента перелома, г) обеспечение минимального движения кости во время визуализации и д) хранение и обработку больших объемов изображений. Несмотря на то, что первоначально этот протокол был разработан и использовался для тестирования проксимального отдела бедренной кости в конкретном синхротронном учреждении (Imaging and Medical Beamline, Australian Synchrotron, Clayton VIC, Australia), в последнее время он был использован с коммерчески доступным микро-КТ-сканером большого объема и для различных анатомических областей12,13, что свидетельствует о его более широкой применимости. Тем не менее, для различных сканеров могут потребоваться различные настройки визуализации, отличные от описанных здесь, в зависимости от предполагаемого эксперимента, и, как правило, программное обеспечение для реконструкции и анализа изображений, отличное от описанного здесь. Существенные артефакты изображения наблюдались в 3/40 объемах сканирования, полученных при использовании низкой или минимальной предварительной загрузки, что снижало полезность этих данных. Вероятно, это было связано с перемещением образца при минимальной нагрузке во время визуализации. Геометрическое соответствие между головкой бедренной кости и гильзой, приложенной нагрузкой и временем между приложением нагрузки и визуализацией может быть оптимизировано для снижения риска значительных движений во время визуализации. Кроме того, расстояние около 20 мм между образцом и алюминиевой стенкой цилиндра оказалось достаточным, чтобы избежать значительных артефактов границы. Наконец, обработка больших объемов изображений сопряжена с трудностями при хранении и обработке данных. Разработанный пользовательский код и многократный анализ для различных областей интереса при различных пространственных разрешениях (сначала начиная с изображений с пониженной дискретизацией, а затем переходя к изображениям с полным разрешением) позволили успешно обработать объемы изображений проксимальной половины бедренной кости человека с разрешением 30 мкм на пиксель. Тем не менее, для процесса требовалась топовая рабочая станция, оснащенная оперативной памятью на 128 ГБ.
Основным ограничением настоящего протокола являются квазистатические нагрузки, так как высокодинамическая нагрузка, например, возникающая в результате падения, может вызвать нестабильную упругую реакцию, которая в противном случае не может быть воспроизведена в настоящем протоколе. Тем не менее, упруго стабильное поведение при переломе, наблюдаемое здесь, по-видимому, находится в прямом противоречии с нестабильными реакциями, наблюдавшимися ранее в изолированных костных стержнях при квазистатической нагрузке, что послужило стимулом для большого количества исследований по прогнозированию переломов 6,7. Большая деформация кости (8%-16%), наблюдаемая в данном протоколе до перелома, локальная нестабильность кортикальной оболочки и линейное увеличение энергии деформации до перелома представляют собой иное поведение перелома по сравнению с тем, которое наблюдается в изолированных костных ядрах, что, вероятно, подчеркивает важность удержания, обеспечиваемого кортикальной оболочкой внутренней трабекулярной кости при нагрузке.
В заключение, этот протокол позволяет изучить механизмы микроструктурных разрушений во всем проксимальном отделе бедренной кости человека и ее способность поглощать энергию или прочность. Этот протокол может помочь улучшить современное понимание механизма перелома шейки бедра и поддержать развитие методов прогнозирования, профилактики и лечения хрупкости путем анализа большего количества образцов и различных анатомических областей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Все авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Acknowledgments
Финансирование со стороны Австралийского исследовательского совета (FT180100338; IC190100020) с благодарностью.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Absorbent tissue | N/A | Maintain the bone moisture throughout the experiment | |
| Alignment rig | Custom-made | Rig for positioning the specimen in the potting cup | |
| Aluminium potting cup | Custom-made | Potting cup | |
| Bone saw | N/A | Cut the specimen to size | |
| Calibration phantom QCT Pro | Mindways Software, Inc., Austin, USA | CT Calibration 13002 | Calibrate grey levels in the images into equivalent bone mineral (ash) density levels |
| Clinical Computed-Tmography scanner | General Electric Medical Systems Co., Wisconsin, USA | Optima CT660 | Preliminary imaging for the prediction of the load step to fracture |
| Compressive stage | Custom-made | A 10 kg, radiotransparent compressive stage for applying and maintaining throught imaging a prescribed deformation to the specimen. | |
| Dental cement | Soesterberg, The Netherlands | Vertex RS | |
| Femur specimen | Science Care, Phoenix, USA | ||
| Finite-element analysis software | ANSYS Inc., Canonsburg, USA | ANSYS Mechanical APDL | Finite-element software package |
| Freezer | N/A | Store specimens at -20 °C | |
| Hard Drive | Dell | Disk space: 500 GB per volume | |
| Image bnarization and segmentation software | Skyscan-Bruker, Kontich, Belgium | CT analyzer | Image processing software |
| Image elastic segmentation | The University of Sheffield | Bone DVC | https://bonedvc.insigneo.org/dvc/ |
| Image processing and automation software | The MathWork Inc. | Matlab | Image processing software |
| Image registration software | Skyscan-Bruker, Kontich, Belgium | DataViewer | Image processing software |
| Image segmentation and FE modelling software | Simpleware, Exeter, UK | Scan IP | Bone egmentation software |
| Image stiching script | Australian syncrotron, Clayton, VIC, AU | The script is available at IMBL | |
| Image visualization | Kitware, Clifton Park, NY, USA | Paraview | Image visualization |
| Image visualization | Australian National University | Dristhi | Image visualization: doi:10.1117/12.935640 |
| Imaging and Medical beamline | Australian syncrotron, Clayton, VIC, AU | Large object micro-CT beamline at the Australian Synchrotron | |
| Laptop | Dell Inc., USA | ||
| Low-friction x-y table | THK Co., Tokyo, Japan | ||
| NI signal acquisition software | National Instruments, Austin, TX | NI-DAQmx | |
| Phosphate-buffered saline solution | Custom-made | Maintain the bone moisture throughout the experiment | |
| Plastic bag | N/A | Maintain the bone moisture throughout the experiment | |
| Rail | SKF Inc., Lansdale, PA, USA | ||
| Screw-jack mechanism | Benzlers, Örebro, Sweden | Serie BD (warm gear unit) | stroke: 150 mm, maximal load: 10,000 N, gear ratio: 27:1, a displacement per revolution: 0.148 mm |
| Single pco.edge sensor, lens coupled scintillator | Australian syncrotron, Clayton, VIC, AU | Detector Ruby FOV: 141 x 119 mm; 2560 x 2160 px; 55 µm/px; 50 fps | |
| Six axis load cell | ME-Meßsysteme GmbH, Hennigsdorf, GE | K6D6 | Maximal measurement error: 0.005%; maximal force: 10000 N; maximal torque: 500 Nm |
| Strain amplifier | ME-Meßsysteme GmbH, Hennigsdorf, GE | GSV-1A8USB K6D/M16 |
References
- Martelli, S., Perilli, E. Time-elapsed synchrotron-light microstructural imaging of femoral neck fracture. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 84, 265-272 (2018).
- Martelli, S., Giorgi, M., Dall' Ara, E., Perilli, E. Damage tolerance and toughness of elderly human femora. Acta Biomaterialia. 123, 167-177 (2021).
- Perilli, E., et al. Dependence of mechanical compressive strength on local variations in microarchitecture in cancellous bone of proximal human femur. Journal of Biomechanics. 41 (2), 438-446 (2008).
- Thurner, P. J., et al. Time-lapsed investigation of three-dimensional failure and damage accumulation in trabecular bone using synchrotron light. Bone. 39 (2), 289-299 (2006).
- Jackman, T. M. Quantitative, 3D visualization of the initiation and progression of vertebral fractures under compression and anterior flexion. Journal of Bone and Mineral Research. 31 (4), 777-788 (2016).
- Mayhew, P. M., et al. Relation between age, femoral neck cortical stability, and hip fracture risk. Lancet. 366 (9480), 129-135 (2005).
- Nazarian, A., Stauber, M., Zurakowski, D., Snyder, B. D., Müller, R. The interaction of microstructure and volume fraction in predicting failure in cancellous bone. Bone. 39 (6), 1196-1202 (2006).
- Schileo, E., et al. To what extent can linear finite element models of human femora predict failure under stance and fall loading configurations. Journal of Biomechanics. 47 (14), 3531-3538 (2014).
- Schileo, E., et al. An accurate estimation of bone density improves the accuracy of subject-specific finite element models. Journal of Biomechanics. 41 (11), 2483-2491 (2008).
- Dall'ara, E., et al. A nonlinear QCT-based finite element model validation study for the human femur tested in two configurations in vitro. Bone. 52 (1), 27-38 (2013).
- Perilli, E., Parkinson, I. H., Reynolds, K. J. Micro-CT examination of human bone: from biopsies towards the entire organ. Annali dell'Istituto Superiore di Sanità. 48 (1), 75-82 (2012).
- Wearne, L. S., Rapagna, S., Taylor, M., Perilli, E. Micro-CT scan optimisation for mechanical loading of tibia with titanium tibial tray: A digital volume correlation zero strain error analysis. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 134, 105336 (2022).
- Bennett, K. J., et al. Ex vivo assessment of surgically repaired tibial plateau fracture displacement under axial load using large-volume micro-CT. Journal of Biomechanics. 144, 111275 (2022).
- Falcinelli, C., et al. Multiple loading conditions analysis can improve the association between finite element bone strength estimates and proximal femur fractures: A preliminary study in elderly women. Bone. 67, 71-80 (2014).
- Orthopedic Image Segmentation. Synopsys. , Available from: https://www.synopsys.com/simpleware/news-and-events/ortho-medical-image-segmentation.html (2020).
