Summary
Protokollet gör det möjligt att mäta deformationen av benmikrostrukturen i hela det proximala mänskliga lårbenet och dess seghet genom att kombinera mikro-CT-skanning med stora volymer, ett skräddarsytt kompressionssteg och avancerade bildbehandlingsverktyg.
Abstract
Avbildning av benets mikrostruktur under progressivt ökande belastningar gör det möjligt att observera benets mikrostrukturella felbeteende. Här beskriver vi ett protokoll för att erhålla en sekvens av tredimensionella mikrostrukturella bilder av hela det proximala lårbenet under progressivt ökande deformation, vilket orsakar kliniskt relevanta frakturer i lårbenshalsen. Protokollet demonstreras med hjälp av fyra femora från kvinnliga donatorer i åldern 66-80 år i den nedre delen av bentätheten i populationen (T-poängintervall = −2,09 till −4,75). Ett radiotransparent kompressionssteg utformades för att ladda proverna som replikerade en enbensställning, samtidigt som den applicerade belastningen registrerades under mikrodatortomografi (mikro-CT). Synfältet var 146 mm brett och 132 mm högt, och den isotropa pixelstorleken var 0,03 mm. Kraftökningen baserades på finita elementförutsägelser av brottbelastningen. Trycksteget användes för att applicera förskjutningen på provet och anta de föreskrivna kraftökningarna. Frakturer under huvudstaden på grund av öppning och skjuvning av lårbenshalsen inträffade efter fyra till fem belastningsökningar. Mikro-CT-bilderna och reaktionskraftmätningarna bearbetades för att studera benbelastningen och energiupptagningsförmågan. Instabilitet i cortex uppträdde vid de tidiga laddningsstegen. Det subkondrala benet i lårbenshuvudet uppvisade stora deformationer som nådde 16 % före fraktur, och en progressiv ökning av stödkapaciteten fram till fraktur. Deformationsenergin ökade linjärt med förskjutningen fram till brott, medan styvheten minskade till nära nollvärden omedelbart före brott. Tre fjärdedelar av brottenergin togs av provet under den sista 25-procentiga kraftökningen. Sammanfattningsvis avslöjade det utvecklade protokollet en anmärkningsvärd energiabsorptionsförmåga, eller skadetolerans, och en synergisk interaktion mellan det kortikala och trabekulära benet vid en avancerad donatorålder.
Introduction
Frakturer i lårbenshalsen är en stor börda för den åldrande befolkningen. Mikrodatortomografi (mikro-CT) och samtidig mekanisk testning gör det möjligt att observera benets mikrostruktur och studera dess förhållande till benstyrka, dess åldersrelaterade förändringar och förskjutningar under belastning 1,2. Fram till nyligen var dock mikro-CT-studier av ben under belastning begränsade till utskurna benkärnor3, små djur4 och mänskliga ryggradsenheter5. Det nuvarande protokollet kan kvantifiera förskjutningen av mikrostrukturen i hela det proximala mänskliga lårbenet under belastning och efter en fraktur.
Flera studier har genomförts för att undersöka det mänskliga lårbenets svikt, och ibland har dessa kommit fram till kontrasterande slutsatser. Till exempel tros den åldersrelaterade förtunningen av de kortikala och trabekulära strukturerna bestämma den åldersrelaterade känsligheten för frakturer genom att orsaka elastisk instabilitet i benet6,7, vilket står i uppenbar kontrast till den höga bestämningskoefficienten för kortikal töjning och förutsägelser av lårbensstyrka som inte antar någon elastisk instabilitet (R2 = 0,80-0,97)8,9. Ändå har sådana studier systematiskt underskattat lårbensstyrkan (med 21%-29%), vilket ifrågasätter de sköra och kvasisköra bensvaren som implementerats i modellerna 8,10. En möjlig förklaring till dessa till synes kontrasterande fynd kan ligga i ett annat frakturbeteende hos hela ben jämfört med isolerade benkärnor. Att observera deformations- och frakturresponsen hos benmikrostrukturen i hela proximala lårben kan därför öka kunskapen om höftfrakturmekanik och relaterade tillämpningar.
Nuvarande metoder för att avbilda hela mänskliga ben med mikrometrisk upplösning är begränsade. Portalen och detektorns storlek måste ha en lämplig arbetsvolym för att hysa det mänskliga proximala lårbenet (cirka 13 cm x 10 cm, bredd x längd) och eventuellt en pixelstorlek i storleksordningen 0,02–0,03 mm för att säkerställa att relevanta mikroarkitektoniska särdrag kan fångas11. Dessa specifikationer kan för närvarande uppfyllas av vissa synkrotronljusanläggningar1 och vissa kommersiellt tillgängliga mikro-CT-skannrar med stora volymer12,13. Kompressionssteget måste vara radiotransparent för att minimera röntgendämpning samtidigt som det genererar en kraft som är tillräcklig för att orsaka en fraktur på det mänskliga lårbenet (t.ex. mellan 0,9 kN och 14,3 kN för äldre vita kvinnor)14. Denna stora variation i brottbelastningen komplicerar planeringen av antalet belastningssteg till brott, den totala experimenttiden och motsvarande mängd data som produceras. För att lösa detta problem kan frakturbelastningen och platsen uppskattas via finita elementmodellering genom att använda bentäthetsfördelningen för provet från kliniska datortomografibilder (CT) 1,2. Slutligen, efter experimentet, måste den stora mängden data som genereras bearbetas för att studera felmekanismerna och energiförlustkapaciteten i hela det mänskliga lårbenet.
Här beskriver vi ett protokoll för att erhålla en sekvens av tredimensionella mikrostrukturella bilder av hela det proximala lårbenet under progressivt ökande deformation, vilket orsakar kliniskt relevanta frakturer i lårbenshalsen2. Protokollet inkluderar planering av den stegvisa ökningen av provkompressionen, laddning via ett anpassat radiotransparent kompressionssteg, avbildning via en mikro-CT-skanner med stor volym och bearbetning av bilderna och belastningsprofilerna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollet utvecklades och testades med 12 lårbensprover som erhållits från ett kroppsdonationsprogram. Proverna erhölls färska och förvarades vid −20 °C vid Biomechanics and Implants Laboratory vid Flinders University (Tonsley, South Australia, Australien). Benfuktigheten bibehölls under hela experimentet. Donatorerna var kaukasiska kvinnor (66-80 år). Etiskt godkännande erhölls från Social and Behavioural Research Ethics Committee (SBREC) vid Flinders University (Project # 6380).
1. Planering av en provspecifik belastningsstegsökning
- Skanna lårbensprovet med en klinisk CT-skanner som riktar in sig på en skivtjocklek och en pixelstorlek i planet på cirka 0,5-0,7 mm. Detta steg kan utföras av en expert radiograf på vilken offentlig bildbehandlingsanläggning som helst med hjälp av standardförinspelade bildprotokoll för benvisualisering.
- Skanna tillsammans med provet en CT-densitometrikalibreringsfantom med fem kända koncentrationer av dikaliumvätefosfat (K2HPO4, ekvivalent densitetsintervall ungefär mellan 59 mg∙cm−3 och 375 mg∙cm−3).
- Segmentera bengeometrin från de kliniska CT-bilderna15, maska benets segmenterade geometri och mappa de isotropa materialegenskaperna element för element till de kalibrerade bentäthetsvärdena genom att använda förhållandet mellan densitet och elastisk modul som rapporterats av Schileo et al.8. Spara nätet för vidare analys i finita elementprogramvaran. Slutför varje steg genom att följa de relevanta riktlinjerna som medföljer programvaran för segmentering och finita element.
- Importera nätet till programvaran för finita element. Begränsa modellens 3-6 mm distala ände helt. Anbringa en nominell kraft på 1 000 N, adducerad med 8° från lårbensaxeln i koronaplanet och passerar genom mitten av lårbenshuvudet. Det här belastningsvillkoret efterliknar en statisk enbensställningsuppgift (orthoload.com).
- Lös finita elementmodellen med hjälp av den inbyggda PCG-lösaren (konvergenstolerans: 1 x 10−7).
OBS: Här användes finita elementprogramvaran ANSYS.- Generera en elementtabell som innehåller de första och tredje huvudstamkomponenterna vid elementcentroiden genom att köra följande kommandon:
/INLÄGG1
ETABLE,, EPTO1,1
ETABLE,, EPTO3,3 - Beräkna töjningsförhållandet mellan den första och tredje huvudtöjningskomponenten i modellen och benutbytetöjning i spänning (0,73 % töjning) och kompression (1,04 % töjning)8 (figur 1) genom att utföra följande kommandon:
SMULT,RFT,EPTO1,,1/0.0074,1,
SMULT, RFT,EPTO3, ,1/0.0104,1,
- Generera en elementtabell som innehåller de första och tredje huvudstamkomponenterna vid elementcentroiden genom att köra följande kommandon:
- Skala den nominella kraften med topptöjningsförhållandet i både spänning och kompression, och kassera den största av de två för att få en uppskattning av brottbelastningen. Bestäm lastökningen som 1/4 av den beräknade brottbelastningen1.
Figur 1: Beräkning av brottbelastningen. Töjningskartan för finita element, ekvationerna som används för att omvandla den nominella kraften till brottbelastningen (vänster) och belastningsschemat som visar lårbenet (mitten till höger), den distala aluminiumkoppen (överst till höger) och tryckhylsan av polyeten (nederst till höger). Klicka här för att se en större version av denna figur.
2. Förberedelse av montering av lårbensprovet (figur 2)
- Ta ut provet ur frysen (−20 °C).
- Tina i rumstemperatur (RT) i 24 timmar medan du förvarar provet i en vattentät plastpåse insvept i absorberande material indränkt i en fysiologisk lösning för att bibehålla benfukten.
- Skär av lårbensdiafysen 180 mm från det proximala lårbenshuvudet.
- Centrera lårbenshuvudet på den vertikala axeln på inriktningsriggen genom att rikta in den konkava tryckhylsan av polyeten (Figur 2D) och lårbenshuvudet.
- Rikta in planet som innehåller lårbenshalsen och diafysaxeln med frontalplanet (figur 2).
- Vrid diafysaxeln till 8° adduktion så att den vertikala axeln representerar orienteringen av höftreaktionskraften under en statisk enbensställning (figur 2).
- Förbered tandcementet genom att följa tillverkarens instruktioner.
- Plantera den distala änden av provet i en aluminiumkruka som är 55 mm djup och fyll upp aluminiumkoppen med tandcement. Låt cementen härda i minst 30 minuter.
- Förvara provenheten vid −20 °C.
Figur 2: Uppriktningsriggen. Ett foto framifrån (vänster) och lateralt (höger) av inriktningsriggen som visar (A) ramen, (B) ingjutningskoppen i aluminium, (C) ett syntetiskt lårben och (D) den sfäriskt formade tryckhylsan. Klicka här för att se en större version av denna figur.
3. Montering av kompressionssteg
OBS: Kompressionsstegets yttre mått är 245 mm diameter, 576 mm höjd och 14 kg vikt, exklusive provet. Kompressionssteget består av två huvuddelar: kompressionskammaren och ställdonet, som är monterade enligt följande:
- Kompressionskammare
- Montera tryckhylsan av polyeten (104 mm diameter, 60 mm höjd) i botten av aluminiumcylindern (203 mm diameter, 3 mm väggtjocklek), som är stängd av en svetsad aluminiumplatta i ena änden (botten).
- Ställdon
- Montera den övre strukturen med hjälp av skivan, de tre stängerna, den triangulära plattan och den vertikala skenan (Figur 3).
- Montera domkraftsmekanismen (slaglängd: 150 mm, maximal belastning: 10 000 N, utväxling: 27:1, slagvolym per varv: 0,148 mm) på den triangulära plattan.
- Montera vinkeladaptern på linjärskenan.
- Montera XY-bordet med låg friktion på vinkeladaptern.
- Montera lastcellen med sex frihetsgrader (maximalt mätfel: 0,005 %; maximal kraft: 10 000 N; maximalt vridmoment: 500 Nm) på lågfriktionsbordet genom att rikta in lastcellens x-z-plan mot toppstrukturens frontplan.
- Anslut ställdonets skruv till vinkeladaptern.
Figur 3: Den specialtillverkade radiotransparenta kompressionsstegsenheten. Ett foto (vänster) och en modell (höger) av trycksteget. A) Kompressionskammaren, som är en 3 mm tjock aluminiumcylinder som är stängd i botten. (B) ställdonsenheten med den övre strukturen; C) Domkraftsmekanismen. D) Lågfriktionsbordet x-y. och (E) den sexaxliga lastcellen visas och indikeras på modellen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
4. Ställa in experimentet
- Tina provet vid RT i 24 timmar medan du förvarar det i en vattentät plastpåse insvept i absorberande material indränkt i en fysiologisk lösning för att bibehålla benfukten.
- Montera aluminiumkoppprovenheten på lastcellen genom att rikta in provenhetens frontplan med ställdonets.
- Montera den övre strukturen, inklusive provet, i kompressionskammaren. Var noga med att rikta in lårbenshuvudet med den sfäriska konkaviteten på tryckhylsan av polyeten. Se till att lårbenshuvudet är inkopplat men slakt i tryckuttagets sfäriska hålighet.
- Placera kompressionssteget på rotationssteget på mikro-CT-skannern vid bildbehandling och medicinsk strålrör (IMBL).
- Anslut lastcellen (fel < 0,005 %; maximal kraft: 10 000 N; maximalt vridmoment: 500 Nm) till töjningsförstärkaren.
- Anslut, via USB, töjningsförstärkaren till en bärbar dator utrustad med applikationsprogramvaran som medföljer lastcellen.
- Aktivera skruvmekanismen i kompressionssteget genom att flytta provet nedåt mot tryckhylsan samtidigt som du övervakar reaktionskraften som mäts av lastcellen i den bärbara datorn. Stoppa skruvmekanismen när en kompressionskraft lika med 100 N uppnås. Lossa provet till 50 N förspänning.
- Välj den linskopplade scintillatorn "Ruby" (http://archive.synchrotron.org.au/31-australian-synchrotron/imbl/811-preparation-for-imaging-experiments) med enkel pco.edge-sensor.
- Ställ in synfältet på 76,31 mm x 64,39 mm, vilket ger en pixelstorlek på 2 560 x 2 160 pixlar för matrisstorleken 29,81 μm.
- Ställ in rotationsscenens axel på 8 mm (horisontellt) från synfältets axel (förskjutet skanningsläge) för att utöka synfältet till 145,71 mm x 64,39 mm vid en pixelstorlek på 29,81 μm.
- Ställ in skanningsparametrarna på en strålenergi på 60 keV, en rotationsökning på 0,1°, två omgångar med 180° rotation (off-set-scanning), en exponeringstid på 50 μs och ett frame-medelvärde på två per rotationsposition.
- Ställ in skanningen så att den hämtar fem på varandra följande, vertikalt staplade skanningar, med en vertikal förskjutning på 26 mm vardera, så att den totala höjden på den skannade volymen är 132,2 mm för en total skanningstid på 30 minuter.
5. Mekanisk provning med samtidig mikrostrukturell avbildning
- Utför mikro-CT (pixelstorlek: 0,03 mm) två gånger i referenstillståndet (taget som ett nolltöjningstillstånd).
- Applicera kraftökningen genom att manuellt manövrera domkraftsmekanismen med en konstant hastighet av cirka 1 s per varv (0,1-0,2 mm/s).
- Utför mikro-CT-avbildning.
- Upprepa steg 5.2 och steg 5.3 tills provet fraktureras, vilket indikeras av en plötslig minskning av reaktionskraften.
- Utför mikro-CT-avbildning av det frakturerade provet.
- Sy ihop de 1 800 projektionsbilderna (2 560 pixlar x 896 pixlar i storlek, 76,8 mm x 26,88 mm, bredd x höjd, 32-bitars flyttalsbilder). Processen sammanfogar två projektionsbilder (tagna i horisontellt offset-skanningsläge) och de fem vertikalt förskjutna bilderna, vilket ger en enda projektionsbild.
- Rekonstruera volymen på tvärsnittsbilderna (4 407 bilder, varje bild 4 888 x 4 888 pixlar i storlek) och spara dem som 32-bitars flyttalsfiler i . TIFF-format (upptar 392 GB diskutrymme).
- Använd ett 3 x 3 Gaussiskt filter för att minska bruset. Konvertera bilderna till 8-bitars (256 grånivåbilder, sparade i bitmappsformat, upptar cirka 100 GB per volym).
OBS: I detta arbete utfördes bearbetningen av bilderna med hjälp av programvara som finns tillgänglig vid Australian Synchrotron under ledning av operatören av IMBL.
6. Beräkning av förskjutnings- och töjningsfältet
- Subsampla tvärsnittsbilderna med fyra (120 μm/pixel) för att minska beräkningstiden.
- Registrera i rymden på ett strikt sätt bilderna av provexemplaret under belastning med bilderna av provexemplaret i det obelastade referenstillståndet. Använd distal diafys som mål för samregistreringen (tilläggsfil 1 och tilläggsfil 2).
- Skapa tredimensionella ytmodeller (. STL-filer) för visualisering efter binärisering av mikro-CT-bilderna11.
- Registrera bildvolymen elastiskt till referensvolymen med hjälp av en rutnätsstorlek som är lika med 50 pixlar (SDER = 0,076 % töjningsfel, BoneDVC, https://bonedvc.insigneo.org/dvc/) för att bestämma förskjutningarna vid rutnätets noder.
- Konvertera rutnätet till en finita elementmodell. Tillämpa nodförskjutningen som beräknas av BoneDVC på modellen. Lös modellen för att bestämma töjningstensorn över hela benvolymen.
- Upprepa analysen i det område som visar de högsta töjningsnivåerna med hjälp av de högupplösta bilderna.
- Mappa DVC-töjningskartorna till de högupplösta bilderna med hjälp av kubisk interpolation med interp3-funktionen (Matlab)2.
- Visualisera förskjutningar, töjningar och mikrostrukturella bilder för visualisering och animering av stora volymer (Matlab)2.
7. Bedömning
- Visa den permanenta deformationen av benet (skada) genom att lägga över bilderna som erhållits under obelastade förhållanden och efter frakturen2.
- Visa den progressiva mikrostrukturella deformationen av benet genom att överlagra de tredimensionella modellerna under obelastade förhållanden, vid ökande belastningsnivåer och efter fraktur2.
- Visa belastningen av benet på frakturstället2.
- Analysera deformationsenergi, styvhet och förskjutning med hjälp av deskriptiv statistik och regressionsmetoder2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bilderna visar hela det proximala lårbenet, tryckhylsan, tandcementet, aluminiumkoppen och omslagsservetten. Benets mikroarkitektur kan ses gradvis deformeras när belastningen ökar före frakturen och efter frakturen (figur 4).
Figur 4: Trycksteget som är anslutet till den bärbara datorn. (A) Trycksteget, (B) den bärbara datorn och (C) datainsamlingsenheten. Provenheten är överlagrad med transparens på kompressionskammaren (höger). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Lårbenshuvudet roterade medialt och progressivt upp till fraktur. Frakturerna var ofullständiga, öppnade sig i den övre halsbarken eller uppvisade skjuvbrott under huvudstaden (Video 1 och Figur 5). Huvudets krökning är tillplattad i kontaktområdet med hylsan, där lokal elastisk instabilitet i det kortikala skalet kan observeras. Ingen elastisk instabilitet över den trabekulära volymen har dock observerats.
Video 1: Animering av hela lårbenet som deformeras och spricker. Animering av hela lårbenet när det deformeras och bryts (mikro-CT-bilder subsamplade 4x, tredimensionell rendering). Klicka här för att ladda ner den här videon.
Figur 5: Mikrostrukturbilder med förfluten tid och motsvarande belastningar. Sekvensen av koronala mikro-CT-tvärsnittsbilder (överst till vänster), den applicerade kraften och momentprofilerna (nederst till vänster) för ett representativt prov. Tredimensionell återgivning av mikro-CT-bilder av en 1 mm tjock skiva av lårbenet före belastningen, under belastning och efter att frakturen inträffat visas överlagrade. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Benförtätning inträffade i områden med maximal kompression (till exempel i det övre lårbenshuvudet), där deformationen kvarstod efter en fraktur. Frakturdebut inträffade i områden med ökad krökning, vilket tyder på böjning av det övre kortikala skalet genom öppning och skjuvning. Kortikal öppning fortskred i normala vinklar genom den huvudsakliga dragtrabekulära gruppen och den övre halsbarken, rörde sig distalt i riktning mot den huvudsakliga kompressiva trabekulära gruppen och slutade i kalkalkregionen. Skjuvbrott orsakade trabekulärt brott längs skjuvplanet, cirka 45° från huvudhuvudtryckstrabekuläraxeln. Efter frakturen återhämtade mikroarkitekturen det mesta av förskjutningen och visade en övervägande elastisk återhämtning av benet överallt utom huvudregionen i närheten av kontaktytan under toppkompression. Nodalavståndet för den digitala volymkorrelationsanalysen var 50 pixlar, vilket visade ett töjningsfel på 0,1 % i nolltöjningstestet. Töjningen överskred sträckgränsen för benet i det övre lårbenshuvudet och subkapitalhalsen när kraften översteg 50 % av den FE-förutspådda provstyrkan och nådde 8 - 16 % kompression i de högupplösta bilderna (video 2 och figur 6).
Video 2: Full upplösning. Animering av det trabekulära nätverket som gradvis deformeras och spricker (mikro-CT-bilder i full upplösning, tredimensionell rendering). Klicka här för att ladda ner den här videon.
Figur 6: Deformationen av lårbenshuvudet. Superposition av det proximala lårbenet innan belastningen applicerades och under belastning (vänster kolumn); ytan på det övre lårbenshuvudet före belastning och efter fraktur (andra och tredje kolonnen); superposition av mikrostrukturen i det övre lårbenshuvudet vid olika belastningsstadier (fjärde kolonnen); och detaljer om instabiliteten i cortex på det övre lårbenshuvudet (höger). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Felet inträffade under ett komplext töjningstillstånd som visade kompression (8%-12%), spänning (4%-8%) och skjuvning (3%-10%) töjning. Deformationsenergin var en linjär funktion av förskjutningen (R2 = 0,97-0,99, p < 0,01) fram till brottet, vilket visade ett stabilt brottbeteende (Figur 7).
Figur 7: Töjningsfältet före frakturen och lårbenets energiupptagningsförmåga. Skjuv- och dragtöjningskartorna och brottmönstret (överst). Deformationsenergin normaliserad av frakturenergin, Emax, plottas mot förhållandet mellan förskjutningen och förskjutningen vid frakturen, Dmax, för fyra donatorer mellan 66 och 80 år vid dödsfallet. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Tilläggsfil 1: Skärmdump som visar samregistrering av mikro-CT-bilderna. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Tilläggsfil 2: Animering av samregistrerade koronala mikro-CT tvärsnittsbilder, som visar den deformerande mikrostrukturen vid ökande belastningar upp till brott. Klicka här för att ladda ner den här videon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det nuvarande protokollet gör det möjligt att studera den tidsförflutna mikromekaniken för höftfrakturer i tre dimensioner ex vivo. Ett radiotransparent (aluminium) trycksteg som kan applicera en progressiv deformation på den proximala halvan av det mänskliga lårbenet och mäta reaktionskraften har skräddarsytts, tillverkats och testats. En mikro-CT-skanner med stor volym används i detta protokoll för att ge en tidssekvens av bildvolymer som visar hela det proximala lårbenet med progressiv belastning med mikrometrisk upplösning. I detta arbete beräknades förskjutnings- och töjningsfälten med hjälp av elastisk samregistrering av bilderna. Protokollet gör det möjligt att visa deformationen av mikrostrukturen i det proximala lårbenet och ger provets deformationsenergi och styvhet som svar på en föreskriven inkrementell belastning fram till brottpunkten.
Kritiska aspekter av protokollet involverar a) bestämning av belastningssteget i varje prov för att kontrollera experimenttiden, b) bibehållande av benfuktigheten under hela experimentet, c) möjliggörande av mikro-CT-avbildning av benet under belastning fram till frakturpunkten, d) säkerställande av minimal rörelse av benet under avbildning, och e) lagring och bearbetning av stora bildvolymer. Även om det ursprungligen designades och användes för att testa det proximala lårbenet vid en specifik synkrotronanläggning (Imaging and Medical Beamline, Australian Synchrotron, Clayton VIC, Australien), har detta protokoll nyligen använts med en kommersiellt tillgänglig mikro-CT-skanner med stor volym och för olika anatomiska regioner12,13, vilket ger bevis på dess bredare tillämplighet. Olika skannrar kan dock kräva andra bildinställningar än de som rapporteras här, beroende på det avsedda experimentet, och tillhandahåller vanligtvis avbildningsrekonstruktioner och analysprogram som skiljer sig från de som rapporteras här. Signifikanta bildartefakter observerades i 3/40 skanningsvolymer som erhölls genom att använda låg eller minimal förladdning, vilket minskade användbarheten av dessa data. Detta berodde sannolikt på att provet rörde sig under minimal belastning under avbildningen. Den geometriska överensstämmelsen mellan lårbenshuvudet och tryckhylsan, den applicerade belastningen och tiden mellan appliceringen av belastningen och avbildningen kan optimeras för att minska risken för betydande rörelser under avbildningen. Dessutom verkade cirka 20 mm avstånd mellan provet och aluminiumcylinderväggen vara tillräckligt för att undvika betydande kantartefakter. Slutligen innebär bearbetning av stora volymer bilder utmaningar för datalagring och bearbetning. Den anpassade koden som utvecklades och de många analyserna för olika intressanta regioner med olika rumsliga upplösningar (först med början från de nedsamplade bilderna och sedan vidare till de högupplösta bilderna) möjliggjorde en framgångsrik bearbetning av bildvolymerna i den proximala halvan av det mänskliga lårbenet med 30 μm per pixel. Ändå krävde processen en arbetsstation i toppklass utrustad med 128 GB RAM.
Den huvudsakliga begränsningen i detta protokoll är de kvasistatiska belastningarna, eftersom högdynamisk belastning, såsom den som uppstår vid ett fall, kan framkalla en instabil elastisk respons som annars inte kan replikeras i det nuvarande protokollet. Icke desto mindre verkar det elastiskt stabila frakturbeteendet som observerats här stå i direkt kontrast till de instabila svar som tidigare observerats i isolerade benkärnor under kvasistatisk belastning, vilket motiverade en stor mängd forskning om frakturprediktion 6,7. Den stora bendeformationen (8%-16%) som observerats med detta protokoll före fraktur, den lokala instabiliteten i det kortikala skalet och den linjära ökningen av deformationsenergin fram till frakturen representerar ett annat frakturbeteende jämfört med det som observerats i isolerade benkärnor, vilket sannolikt betonar vikten av inneslutningen som det kortikala skalet ger till det inre trabekulära benet när det är under belastning.
Sammanfattningsvis möjliggör detta protokoll studier av de mikrostrukturella felmekanismerna i hela det proximala mänskliga lårbenet och dess energiabsorptionsförmåga eller seghet. Detta protokoll kan bidra till att förbättra den nuvarande förståelsen av höftfrakturmekanismen och stödja utvecklingen av metoder för förutsägelse, förebyggande och behandling av bräcklighet genom analys av fler prover och olika anatomiska regioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Samtliga författare uppger att det inte föreligger några intressekonflikter.
Acknowledgments
Finansiering från Australian Research Council (FT180100338; IC190100020) tas tacksamt emot.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Absorbent tissue | N/A | Maintain the bone moisture throughout the experiment | |
| Alignment rig | Custom-made | Rig for positioning the specimen in the potting cup | |
| Aluminium potting cup | Custom-made | Potting cup | |
| Bone saw | N/A | Cut the specimen to size | |
| Calibration phantom QCT Pro | Mindways Software, Inc., Austin, USA | CT Calibration 13002 | Calibrate grey levels in the images into equivalent bone mineral (ash) density levels |
| Clinical Computed-Tmography scanner | General Electric Medical Systems Co., Wisconsin, USA | Optima CT660 | Preliminary imaging for the prediction of the load step to fracture |
| Compressive stage | Custom-made | A 10 kg, radiotransparent compressive stage for applying and maintaining throught imaging a prescribed deformation to the specimen. | |
| Dental cement | Soesterberg, The Netherlands | Vertex RS | |
| Femur specimen | Science Care, Phoenix, USA | ||
| Finite-element analysis software | ANSYS Inc., Canonsburg, USA | ANSYS Mechanical APDL | Finite-element software package |
| Freezer | N/A | Store specimens at -20 °C | |
| Hard Drive | Dell | Disk space: 500 GB per volume | |
| Image bnarization and segmentation software | Skyscan-Bruker, Kontich, Belgium | CT analyzer | Image processing software |
| Image elastic segmentation | The University of Sheffield | Bone DVC | https://bonedvc.insigneo.org/dvc/ |
| Image processing and automation software | The MathWork Inc. | Matlab | Image processing software |
| Image registration software | Skyscan-Bruker, Kontich, Belgium | DataViewer | Image processing software |
| Image segmentation and FE modelling software | Simpleware, Exeter, UK | Scan IP | Bone egmentation software |
| Image stiching script | Australian syncrotron, Clayton, VIC, AU | The script is available at IMBL | |
| Image visualization | Kitware, Clifton Park, NY, USA | Paraview | Image visualization |
| Image visualization | Australian National University | Dristhi | Image visualization: doi:10.1117/12.935640 |
| Imaging and Medical beamline | Australian syncrotron, Clayton, VIC, AU | Large object micro-CT beamline at the Australian Synchrotron | |
| Laptop | Dell Inc., USA | ||
| Low-friction x-y table | THK Co., Tokyo, Japan | ||
| NI signal acquisition software | National Instruments, Austin, TX | NI-DAQmx | |
| Phosphate-buffered saline solution | Custom-made | Maintain the bone moisture throughout the experiment | |
| Plastic bag | N/A | Maintain the bone moisture throughout the experiment | |
| Rail | SKF Inc., Lansdale, PA, USA | ||
| Screw-jack mechanism | Benzlers, Örebro, Sweden | Serie BD (warm gear unit) | stroke: 150 mm, maximal load: 10,000 N, gear ratio: 27:1, a displacement per revolution: 0.148 mm |
| Single pco.edge sensor, lens coupled scintillator | Australian syncrotron, Clayton, VIC, AU | Detector Ruby FOV: 141 x 119 mm; 2560 x 2160 px; 55 µm/px; 50 fps | |
| Six axis load cell | ME-Meßsysteme GmbH, Hennigsdorf, GE | K6D6 | Maximal measurement error: 0.005%; maximal force: 10000 N; maximal torque: 500 Nm |
| Strain amplifier | ME-Meßsysteme GmbH, Hennigsdorf, GE | GSV-1A8USB K6D/M16 |
References
- Martelli, S., Perilli, E. Time-elapsed synchrotron-light microstructural imaging of femoral neck fracture. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 84, 265-272 (2018).
- Martelli, S., Giorgi, M., Dall' Ara, E., Perilli, E. Damage tolerance and toughness of elderly human femora. Acta Biomaterialia. 123, 167-177 (2021).
- Perilli, E., et al. Dependence of mechanical compressive strength on local variations in microarchitecture in cancellous bone of proximal human femur. Journal of Biomechanics. 41 (2), 438-446 (2008).
- Thurner, P. J., et al. Time-lapsed investigation of three-dimensional failure and damage accumulation in trabecular bone using synchrotron light. Bone. 39 (2), 289-299 (2006).
- Jackman, T. M. Quantitative, 3D visualization of the initiation and progression of vertebral fractures under compression and anterior flexion. Journal of Bone and Mineral Research. 31 (4), 777-788 (2016).
- Mayhew, P. M., et al. Relation between age, femoral neck cortical stability, and hip fracture risk. Lancet. 366 (9480), 129-135 (2005).
- Nazarian, A., Stauber, M., Zurakowski, D., Snyder, B. D., Müller, R. The interaction of microstructure and volume fraction in predicting failure in cancellous bone. Bone. 39 (6), 1196-1202 (2006).
- Schileo, E., et al. To what extent can linear finite element models of human femora predict failure under stance and fall loading configurations. Journal of Biomechanics. 47 (14), 3531-3538 (2014).
- Schileo, E., et al. An accurate estimation of bone density improves the accuracy of subject-specific finite element models. Journal of Biomechanics. 41 (11), 2483-2491 (2008).
- Dall'ara, E., et al. A nonlinear QCT-based finite element model validation study for the human femur tested in two configurations in vitro. Bone. 52 (1), 27-38 (2013).
- Perilli, E., Parkinson, I. H., Reynolds, K. J. Micro-CT examination of human bone: from biopsies towards the entire organ. Annali dell'Istituto Superiore di Sanità. 48 (1), 75-82 (2012).
- Wearne, L. S., Rapagna, S., Taylor, M., Perilli, E. Micro-CT scan optimisation for mechanical loading of tibia with titanium tibial tray: A digital volume correlation zero strain error analysis. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 134, 105336 (2022).
- Bennett, K. J., et al. Ex vivo assessment of surgically repaired tibial plateau fracture displacement under axial load using large-volume micro-CT. Journal of Biomechanics. 144, 111275 (2022).
- Falcinelli, C., et al. Multiple loading conditions analysis can improve the association between finite element bone strength estimates and proximal femur fractures: A preliminary study in elderly women. Bone. 67, 71-80 (2014).
- Orthopedic Image Segmentation. Synopsys. , Available from: https://www.synopsys.com/simpleware/news-and-events/ortho-medical-image-segmentation.html (2020).
