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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

Mesure en temps réel du profil bioénergétique mitochondrial des neutrophiles

Published: June 2, 2023 doi: 10.3791/64971
Automatic Translation
1, 2,3, 1
1Department of Immunology, School of Medicine, UConn Health, 2Arthritis and Clinical Immunology Program, Oklahoma Medical Research Foundation, 3Department of Microbiology and Immunology, University of Oklahoma Health Science Center

Summary

Nous décrivons des protocoles par étapes mesurant la respiration mitochondriale des neutrophiles de souris et humaines et des cellules HL60 à l’aide de l’analyseur de flux extracellulaire métabolique.

Abstract

Les neutrophiles sont la première ligne de défense et les leucocytes les plus abondants chez l’homme. Ces cellules effectrices remplissent des fonctions telles que la phagocytose et l’éclatement oxydatif, et créent des pièges extracellulaires (TNE) de neutrophiles pour la clairance microbienne. De nouvelles connaissances sur les activités métaboliques des neutrophiles remettent en question le concept initial selon lequel ils reposent principalement sur la glycolyse. La mesure précise des activités métaboliques peut révéler différentes exigences métaboliques des neutrophiles, y compris le cycle de l’acide tricarboxylique (TCA) (également connu sous le nom de cycle de Krebs), la phosphorylation oxydative (OXPHOS), la voie du pentose phosphate (PPP) et l’oxydation des acides gras (FAO) dans des conditions physiologiques et dans des états pathologiques. Cet article décrit un protocole étape par étape et des prérequis pour mesurer le taux de consommation d’oxygène (OCR) en tant qu’indicateur de la respiration mitochondriale sur les neutrophiles dérivés de la moelle osseuse de souris, les neutrophiles dérivés du sang humain et la lignée cellulaire HL60 de type neutrophile, en utilisant l’analyse du flux métabolique sur un analyseur de flux extracellulaire métabolique. Cette méthode peut être utilisée pour quantifier les fonctions mitochondriales des neutrophiles dans des conditions normales et pathogènes.

Introduction

Les mitochondries jouent un rôle majeur dans la bioénergétique cellulaire, qui génère de l’adénosine triphosphate (ATP) par phosphorylation oxydative (OXPHOS). En plus de cela, le rôle des mitochondries s’étend à la génération et à la détoxification des espèces réactives de l’oxygène, à la régulation du calcium dans la matrice cytoplasmique et mitochondriale, à la synthèse cellulaire, au catabolisme et au transport des métabolites dans la cellule1. La respiration mitochondriale est essentielle dans toutes les cellules, car leur dysfonctionnement peut entraîner des problèmes métaboliques 2, dont des maladies cardiovasculaires3 et une grande variété de maladies neurodégénératives, telles que la dégénérescence maculaire liée à l’âge4, les maladies de Parkinson et d’Alzheimer5 et la maladie de Charcot-Marie-Tooth2 A (CMT2A)6.

Des études de microscopie électronique sur les neutrophiles ont révélé qu’il y a relativement peu de mitochondries7, et qu’elles dépendent fortement de la glycolyse pour leur production d’énergie car les taux de respiration mitochondriale sont très faibles8. Cependant, les mitochondries sont cruciales pour les fonctions des neutrophiles, telles que la chimiotaxie9 et l’apoptose10,11,12. Une étude antérieure a révélé un réseau mitochondrial complexe dans les neutrophiles humains à fort potentiel membranaire. La perte potentielle de la membrane mitochondriale est un indicateur précoce de l’apoptose des neutrophiles10. Le traitement par découpleur mitochondrial carbonyl cyanure m-chlorophényl hydrazone (CCCP) a montré une inhibition significative de la chimiotaxie, ainsi qu’une modification de la morphologie mitochondriale 9,10.

Bien que la principale source d’énergie pour les neutrophiles soit la glycolyse, les mitochondries fournissent l’ATP qui initie l’activation des neutrophiles en alimentant la première phase de la signalisation purinergique, qui stimule la signalisation Ca2+, amplifie la production d’ATP mitochondrial et initie les réponses fonctionnelles des neutrophiles13. Le dysfonctionnement de la chaîne respiratoire mitochondriale entraîne une production excessive d’espèces réactives toxiques de l’oxygène (ROS) et entraîne des dommages pathogènes14,15,16. NETosis, qui est le processus de formation de pièges extracellulaires (TNE) de neutrophiles, est une propriété essentielle des neutrophiles qui les aide à lutter contre les agents pathogènes17 et contribue à de nombreuses pathologies, y compris le cancer, la thrombose et les maladies auto-immunes18. Les ROS dérivés des mitochondries contribuent à NETosis19, l’ADN mitochondrial peut être un composant des NETs18, et l’homéostasie mitochondriale altérée altère NETosis 20,21,22,23,24. De plus, lors de la différenciation ou de la maturation normale, la reprogrammation métabolique des neutrophiles est inversée en limitant l’activité glycolytique, et ils s’engagent dans la respiration mitochondriale et mobilisent les lipides intracellulaires25,26.

L’analyseur de flux extracellulaire métabolique peut surveiller et quantifier en permanence la respiration mitochondriale et la glycolyse des cellules vivantes. L’analyseur utilise une cartouche de capteur de format plaque de 96 puits et deux fluorophores pour quantifier la concentration d’oxygène (O2) et les changements de pH. La cartouche du capteur est au-dessus de la monocouche cellulaire pendant le test et forme une microchambre de ~200 nm de haut. Les faisceaux de fibres optiques de l’analyseur sont utilisés pour exciter les fluorophores et détecter les changements d’intensité fluorescents. Les changements en temps réel de la concentration d’O2 et du pH sont automatiquement calculés et affichés sous forme de taux de consommation d’oxygène (OCR) et de taux d’acidification extracellulaire (ECAR). Il y a quatre ports sur la cartouche de capteur qui permettent de charger jusqu’à quatre composés dans chaque puits pendant les mesures de dosage. Ce protocole se concentre sur la quantification de la respiration mitochondriale des neutrophiles de souris et humains, ainsi que des cellules HL60 de type neutrophile, à l’aide de l’analyseur de flux extracellulaire métabolique.

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Protocol

Des échantillons de sang total héparinés ont été prélevés sur des donneurs humains sains après avoir obtenu un consentement éclairé, tel qu’approuvé par le comité d’examen institutionnel de UConn Health conformément à la Déclaration d’Helsinki. Toutes les expériences sur les animaux ont suivi les lignes directrices du Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux (IACUC) de UConn Health, et l’approbation de l’utilisation de rongeurs a été obtenue de l’UConn Health IACUC selon les critères décrits dans le Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire des National Institutes of Health. Des souris C57BL/6 mâles âgées de 6 semaines ont été utilisées dans cette étude.

1. Préparation de la plaque à 96 puits pour le test de flux extracellulaire métabolique

  1. Une cartouche de capteur est emballée au-dessus de la plaque de 96 puits spécialement conçue pour le test de flux extracellulaire métabolique. Hydratez la cartouche en la soulevant avec précaution et placez 200 μL/puits de milieu d’étalonnage dans chaque puits de la plaque sous-jacente. Placer la cartouche sur la plaque avec calibrant dans un incubateur à 37 °C sans CO2 humidifié pendant une nuit pour l’hydrater.
  2. En fonction du type de cellule, utilisez un revêtement spécifique pour la plaque de culture afin d’assurer l’adhésion cellulaire. Pour les cellules HL60 indifférenciées et indifférenciées des neutrophiles humains, recouvrir la plaque à 96 puits d’une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) stérile contenant 50 μL d’anticorps anti-CD18 humain purifié de souris à 5 μg/mL (Clone TS1/18) à 4 °C pendant la nuit. Pour les neutrophiles de souris, enduire la plaque à 96 puits de 25 μL de 22,4 μg/mL de Cell Tak à pH 8,0 dans 0,1 M de NaHCO3 à température ambiante (RT) pendant 20 min.
  3. Lavez deux fois les plaques avec 200 μL de PBS stérile.
  4. Ajouter un milieu complet aux puits d’angle (A1, A12, H1 et H12) de la plaque de culture cellulaire (sans cellules) pour la correction de fond dans les plaques de culture cellulaire pendant l’ensemencement.
    REMARQUE : L’évaporation pendant le revêtement et l’étalonnage peut affecter le volume du milieu d’étalonnage et la normalisation. Utilisez un plateau ou une chambre avec un tissu stérile mouillé à l’eau et placez la plaque avec le calibrant au-dessus pour empêcher l’évaporation.

2. Préparation et ensemencement des cellules

  1. Préparation du milieu de dosage
    1. Préparer le milieu de dosage en ajoutant 1 mM de pyruvate, 10 mM de glucose et 2 mM de glutamine au milieu Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco.
  2. Isolement des neutrophiles de souris de la moelle osseuse
    1. Isolez les neutrophiles de souris de la moelle osseuse à l’aide du kit d’enrichissement en neutrophiles de souris, conformément aux instructions du fabricant.
    2. Anesthésier les souris par injection intrapéritonéale (i.p.) de kétamine (125 mg/kg) et de xylazine (12,5 mg/kg), puis euthanasier les souris par luxation cervicale.
    3. Récolter les fémurs et les tibias, comme décrit précédemment27. Brièvement, coupez la peau pour exposer la jambe avec les muscles. Coupez l’articulation de la hanche pour enlever la jambe du corps. Ensuite, retirez les muscles pour recueillir le fémur et le tibia.
    4. Coupez les plus petites extrémités des fémurs et des tibias. En tenant les extrémités coupées vers le bas, placez-les dans un tube à centrifuger de 0,5 mL avec deux trous perforés à l’aiguille de seringue de 25 G dans le fond, et placez le tube de 0,5 mL dans un tube à centrifuger de 1,5 mL (figure 1A). Ajouter 50 μL de PBS dans le tube de 0,5 mL pour éviter le dessèchement des cellules de la moelle osseuse.
    5. Centrifuger à 5 900 × g à TA pendant 15 s pour recueillir la moelle osseuse au fond du tube de 1,5 mL. Remettez en suspension les cellules de la moelle osseuse avec 1 mL de DMEM. Ajouter 50 μL de sérum de rat de la trousse, mélanger délicatement par pipetage et transférer la suspension cellulaire dans un tube à essai de culture de polystyrène de 5 mL.
    6. Ajouter 50 μL de cocktail d’enrichissement du kit d’enrichissement en neutrophiles de souris et incuber pendant 15 min à TA. Centrifuger à 300 × g à TA pendant 5 min.
    7. Remettez les cellules en suspension avec 1 mL de DMEM, ajoutez 50 μL de cocktail de sélection de biotine du kit, mélangez délicatement par pipetage et incuber pendant 15 min à TA.
    8. Ajouter 150 μL de particules magnétiques vortex du kit, mélanger délicatement par pipetage et incuber pendant 10 min à TA.
    9. Ajouter ~1,3 mL de DMEM, mélanger doucement par pipetage, placer le tube dans l’aimant pendant 3 minutes et transférer le surnageant contenant des neutrophiles de souris purifiés dans un nouveau tube à essai de culture de polystyrène de 5 mL en retournant le tube d’origine avec l’aimant.
    10. Centrifuger à 300 × g à TA pendant 5 min. Après avoir retiré le surnageant par aspiration intra-utérine, remettre les cellules en suspension avec 1 mL de milieu de dosage.
    11. Comptez les cellules manuellement à l’aide d’un hémocytomètre.
    12. Ajuster la densité cellulaire à 1,1 × 106 cellules/mL en ajoutant le milieu d’essai, ensemencer 180 μL de la suspension de neutrophiles de souris (2 × 105 cellules) par puits dans la plaque préparée à 96 puits (étapes 1.2-1.4) et centrifuger la plaque à 300 × g à TA pendant 3 min sans frein pour assurer une bonne adhérence des cellules au fond de la plaque.
    13. Incuber la plaque dans un incubateur à 37 °C sans CO2, humidifié, pendant 1 heure pour prééquilibrer les cellules avec le milieu de dosage.
      NOTE: La pureté des neutrophiles est critique pour le test car il s’agit d’un biais potentiel. La pureté de l’isolement des neutrophiles de la souris est de 69,9% à 88,7% par ce protocole. Il existe d’autres méthodes pour isoler les neutrophiles de la moelle osseuse de souris, telles que la centrifugation par gradient de densité28. Il existe également d’autres kits d’isolation des neutrophiles d’autres fournisseurs, basés sur la sélection magnétique négative utilisant les anticorps monoclonaux contre les antigènes qui ne sont pas exprimés sur les neutrophiles.
  3. Isolement des neutrophiles humains du sang périphérique
    1. Ajouter 8 mL de solution de polysaccharide dans un tube à centrifuger de 15 mL, puis déposer plus de 4 mL de sang périphérique sur la solution de polysaccharide sans mélanger.
    2. Centrifuger à 550 × g à 20 °C pendant 30 min. Faites décélérer le rotor à 1.
      REMARQUE : Le temps de séparation des neutrophiles peut varier d’un donneur à l’autre. Il s’agit d’un minimum de 30 minutes, et 10 à 20 minutes supplémentaires peuvent être nécessaires si la séparation des neutrophiles échoue.
    3. Observer la séparation du plasma/plaquettes et des cellules mononucléaires après la centrifugation, comme le montre la figure 1B. Retirer délicatement le liquide jaune supérieur sur le dessus (plasma et plaquettes) et la bande trouble supérieure (cellules mononucléaires) sans perturber la bande trouble inférieure (neutrophiles) à l’aide d’une pipette de 1 mL.
    4. Recueillir la bande trouble inférieure et ~3-4 mL du liquide clair ci-dessous dans un nouveau tube à centrifuger de 15 mL contenant 10 mL de PBS.
    5. Centrifuger à 400 × g à 20 °C pendant 10 min et retirer le surnageant par aspiration sous vide.
    6. Resuspendre les cellules avec 5 mL de PBS et centrifuger à 300 × g à 20 °C pendant 5 min.
    7. Après avoir retiré le surnageant, remettre les cellules en suspension avec 1 mL de milieu de dosage.
    8. Comptez les cellules manuellement à l’aide d’un hémocytomètre.
      REMARQUE: Étant donné que les érythrocytes dans le sang n’ont pas de mitochondries, la contamination érythrocytaire n’affecte pas le test de stress mitochondrial et empêche l’activation / l’amorçage des neutrophiles29,30. Les érythrocytes doivent être lysés pendant le comptage cellulaire pour obtenir une concentration précise de neutrophiles. Ajouter 10 μL de la suspension cellulaire à 891 μL d’eau désionisée pendant 10-30 s pour lyser les érythrocytes, puis ajouter 99 μL de PBS 10x pour équilibrer la pression osmotique, en évitant la lyse des neutrophiles.
    9. Ajuster la densité cellulaire à 2,2 × 106 cellules/mL en ajoutant le milieu d’essai, en ensemençant 180 μL de neutrophiles humains (~4 × 105) par puits dans la plaque préparée à 96 puits, et centrifuger la plaque à 300 × g à TA pendant 3 minutes sans frein pour assurer une bonne adhérence des cellules au fond de la plaque.
    10. Incuber la plaque dans un incubateur non CO2, humidifié, à 37 °C pendant 1 h pour prééquilibrer les cellules avec le milieu de dosage.
      REMARQUE : La pureté des neutrophiles est critique pour l’essai, car il s’agit d’un biais potentiel. La pureté de l’isolement des neutrophiles humains est de 86,6% à 96,8%. Il existe d’autres méthodes de centrifugation par gradient de densité pour isoler les neutrophiles du sang humain, y compris l’isolement de Percoll ainsi qu’une combinaison d’isolement de Ficoll et de sédimentation de dextrane31.
  4. Culture cellulaire HL60 et différenciation dirigée par les neutrophiles
    1. Maintenir les cellules HL60 dans un milieu du Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 contenant 10 % de sérum bovin fœtal (FBS), 100 μg/mL de pénicilline, 100 μg/mL de streptomycine et 250 ng/mL d’amphotéricine B à 37 °C et 5 % de CO2.
    2. Pour la différenciation dirigée par les neutrophiles, maintenir les cellules HL60 (cellules en suspension) dans une fiole T25 à une densité de 1 × 105 cellules/mL dans un milieu RPMI-1640 contenant 10 % de FBS, 100 μg/mL de pénicilline, 100 μg/mL de streptomycine, 250 ng/mL d’amphotéricine B et 1,3 % de diméthylsulfoxyde (DMSO) à 37 °C et 5 % de CO2 pendant 6 jours.
    3. Le jour de l’essai, compter les cellules manuellement à l’aide de l’hémocytomètre, centrifuger les cellules HL60 différenciées ou indifférenciées à 300 × g à TA pendant 5 min, laver avec DMEM une fois et remettre les cellules en suspension avec le milieu de dosage pour obtenir une densité cellulaire de 1,39 × 106 cellules/mL.
    4. Ensemencer 180 μL de cellules HL60 différenciées ou indifférenciées (~2,5 × 105) par puits dans la plaque préparée à 96 puits et centrifuger la plaque à 300 × g à TA pendant 3 min sans frein pour assurer une bonne adhérence des cellules au fond de la plaque.
    5. Incuber la plaque dans un incubateur à 37 °C sans CO2, humidifié, pendant 1 heure pour prééquilibrer les cellules avec le milieu de dosage.
      REMARQUE: Confirmez l’adhérence complète des cellules à l’aide d’un microscope avant l’étape suivante.

Figure 1
Figure 1 : Schéma de principe de l’isolement des cellules de la moelle osseuse et des neutrophiles. (A) Prélèvement de cellules de moelle osseuse sur une souris et (B) isolement des neutrophiles du sang humain. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Type de cellule Cellules par puits Composés/Réactifs Concentration de la solution de travail Volume d’injection aux ports Concentration finale dans les puits
Neutrophiles de souris 2 × 105 Oligomycine 25 μM 20 μL 2,5 μM
FCCP 7,5 μM 17,6 μL 0,61 μM
Roténone Antimycine Un mélange 10 μM 24 μL 1 μM
Neutrophiles humains 4 × 105 Oligomycine 10 μM 20 μL 1 μM
FCCP 12,5 μM 22 μL 1,25 μM
Roténone Antimycine Un mélange 10 μM 24 μL 1 μM
Cellules HL60 indifférenciées ou différenciées 2,5 × 105 Oligomycine 25 μM 20 μL 2,5 μM
FCCP 15 μM 22 μL 1,5 μM
Roténone Antimycine Un mélange 10 μM 24 μL 1 μM

Tableau 1 : Nombre de cellules et concentrations de réactifs pour le test de stress mitochondrial.

3. Préparation des composés dans le kit de test de stress mitochondrial

  1. Ouvrez le kit de test de stress mitochondrial et préparez les réactifs.
    NOTE: Les différentes concentrations de solution de travail, le volume d’injection dans les puits et les concentrations finales dans les puits d’oligomycine, de carbonylcyanure de p-trifluorométhoxyphénylhydrazone (FCCP) et de roténone/antimycine A mélange utilisé pour les neutrophiles de souris, les neutrophiles humains et les cellules HL60 sont présentés dans le tableau 1.
    1. Préparer la solution mère d’oligomycine en reconstituant l’oligomycine avec 630 μL de milieu d’essai pour obtenir une solution mère de 100 μM.
      REMARQUE: Il est recommandé d’utiliser la solution mère le même jour.
      1. Préparer la solution de travail d’oligomycine pour les dosages de neutrophiles et de cellules HL60 chez la souris en mélangeant 630 μL de solution mère avec 1 890 μL de milieu de dosage pour obtenir une solution de travail de 25 μM.
      2. Préparer la solution de travail d’oligomycine pour le dosage des neutrophiles humains en mélangeant 300 μL de solution mère avec 2 700 μL de milieu de dosage pour obtenir une solution de travail de 10 μM.
        NOTE: La liaison de l’oligomycine à la sous-unité de la plaque de base Fo de l’ATPase Fo / F1 (ATP synthase) empêche la ré-entrée des protons dans les mitochondries et inhibe la synthèse de l’ATP32. Cela réduit considérablement le flux d’électrons à travers la chaîne de transport d’électrons et l’OCR. Cependant, le flux d’électrons ne s’arrête pas complètement en raison d’une fuite de protons à travers la membrane mitochondriale interne33.
    2. Préparer la solution mère de FCCP en reconstituant le FCCP avec 720 μL de milieu d’essai pour obtenir une solution mère de 100 μM.
      1. Préparer la solution de travail pour le dosage des neutrophiles chez la souris en mélangeant 300 μL de solution mère avec 3 700 μL de milieu d’essai pour obtenir une solution de travail de 7,5 μM.
      2. Préparer la solution de travail pour l’essai des neutrophiles humains en mélangeant 375 μL de solution mère avec 2 625 μL de milieu d’essai pour obtenir une solution de travail de 12,5 μM.
      3. Préparer la solution de travail pour le dosage sur cellules HL60 en mélangeant 720 μL de solution mère avec 4 080 μL de milieu de dosage pour obtenir une solution de travail de 15 μM.
        NOTE: L’ajout de FCCP révèle la capacité maximale des mitochondries à utiliser OXPHOS. C’est un acide liposoluble, faiblement perméable aux mitochondries qui entraîne la dissipation du potentiel transmembranaire. La décharge du gradient de protons à travers la membrane interne mitochondriale et le détournement du flux de protons de Fo/F1 ATP synthase entraînent un découplage mitochondrial. Cet effet de découplage augmente brusquement la consommation d’oxygène mitochondrial pour préserver le gradient de protons34.
    3. Préparer roténone/antimycine Une solution mère en reconstituant la roténone/antimycine Un mélange avec 540 μL de milieu d’essai pour obtenir une solution mère de 50 μM.
      1. Préparer la roténone/antimycine Une solution de travail pour tous les dosages en mélangeant 540 μL de solution mère avec 2 160 μL de milieu de dosage pour obtenir une solution de travail de 10 μM.
        NOTE: La roténone bloque le complexe I en inhibant le transfert d’électrons des centres fer-soufre du complexe I vers l’ubiquinone, tandis que l’antimycine A bloque le complexe III de la chaîne de transport d’électrons, conduisant à un blocage d’OXPHOS avec une synthèse limitée d’ATP35. Ainsi, cela révèle une respiration non mitochondriale36,37.
  2. Charger la cartouche avec des réactifs; charger le mélange oligomycine, FCCP et roténone/antimycine A préparés dans les orifices A, B et C, respectivement, de la cartouche pour préparations injectables (Figure 2). Utilisez le modèle d’encart disponible avec la cartouche pour faciliter le chargement des réactifs vers les ports. Remplissez les orifices inutilisés avec 20 μL de milieu de dosage.
    1. Pour le dosage des neutrophiles chez la souris, chargez 20 μL d’oligomycine (25 μM; chaque puits de la plaque de 96 puits contient 180 μL de milieu de dosage au début, donc la concentration finale est de 2,5 μM) dans les orifices A. Charger 17,6 μL de FCCP (7,5 μM; concentration finale : ~0,61 μM) dans les orifices B. Charger 24 μL de mélange roténone/antimycine A (10 μM; concentration finale: ~1 μM) dans les orifices C.
    2. Pour l’essai des neutrophiles humains, chargez 20 μL d’oligomycine (10 μM; chaque puits de la plaque de 96 puits contient 180 μL de milieu de dosage au début, donc la concentration finale est de 1 μM) dans les orifices A. Charger 22 μL de FCCP (12,5 μM; concentration finale: ~1,25 μM) dans les orifices B. Charger 24 μL de mélange roténone/antimycine A (10 μM; concentration finale: ~1 μM) dans les orifices C.
    3. Pour le dosage des cellules HL60 et dHL60, chargez 20 μL d’oligomycine (25 μM; chaque puits de la plaque de 96 puits contient 180 μL de milieu de dosage au début, donc la concentration finale est de 2,5 μM) dans les orifices A. Chargez 22 μL de FCCP (15 μM; concentration finale : ~1,5 μM) dans les orifices B. Charger 24 μL de mélange roténone/antimycine A (10 μM; concentration finale: ~1 μM) dans les orifices C.
      REMARQUE: Pipeter la solution médicamenteuse dans le port sans toucher le fond de l’orifice. Ne tapotez pas la plaque après le chargement pour éviter les fuites, car les liquides sont retenus par les forces capillaires. Les puits de fond de la plaque de culture et les orifices de la cartouche de capteur sont chargés avec un milieu de dosage ou avec le même orifice de chargement des réactifs que dans les puits d’échantillon pour normaliser l’effet des réactifs sur les valeurs de fond. Les réactifs doivent être ajoutés aux orifices respectifs sans soulever la cartouche de la plaque utilitaire contenant le calibrant pour éviter tout piège à air. Remplissez le dernier orifice de tous les puits avec le milieu comme indiqué à la figure 2.

Figure 2
Figure 2 : La cartouche d’essai de stress mitochondrial et ses ports d’injection. L’image montre la cartouche du test de stress mitochondrial et une image agrandie montrant le chargement de médicaments individuels / milieu aux ports. Abréviation : FCCP = cyanure de carbonyle p-trifluorométhoxyphénylhydrazone. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

4. Exécution du test de stress mitochondrial

  1. Allumez l’analyseur métabolique et l’ordinateur, ouvrez le logiciel Wave et cliquez sur Heater On pour configurer la machine à 37 °C au moins 5 heures à l’avance. Après avoir atteint la température, le coin inférieur gauche du logiciel d’onde affiche prêt.
  2. Ouvrez un modèle pour le kit de test de stress mitochondrial dans le logiciel. Cliquez sur Définition de groupe dans la barre de menu supérieure.
  3. Pré-configurer séparément chaque définition sur le côté gauche, comme les stratégies d’injection, les prétraitements, les milieux de dosage et les types de cellules (biomatériaux utilisés).
  4. Cliquez sur stratégies d’injection sur le côté gauche, puis cliquez sur Ajouter et nommez la condition d’injection comme Neutrophiles humains / Neutrophiles de souris / HL60. Sélectionnez le port A-D en cliquant sur chacun et cliquez sur Ajouter un composé et entrez Oligomycine / FCCP / Rotenone Antimycin A avec les concentrations respectives (Tableau 1).
  5. Cliquez sur prétraitement sur le côté gauche, puis cliquez sur Ajouter et nommez-les CD18 et Cell Tak séparément. Cliquez sur le biomatériau utilisé sur le côté gauche, puis cliquez sur Ajouter et nommez-les comme neutrophiles humains, neutrophiles de souris et HL60 / dHL60 avec densité d’ensemencement.
  6. Définissez les groupes en cliquant sur Ajouter un groupe (p. ex., pour le test des neutrophiles humains) et en cliquant sur la définition sous-jacente (p. ex., stratégies d’injection selon le tableau 1 – Neutrophiles humains, prétraitement sous forme de CD18 et type cellulaire sous forme de neutrophiles humains).
  7. Cliquez sur Carte des plaques dans le menu supérieur pour observer tous les groupes, avec les définitions sur le côté gauche et la carte des plaques sur la droite. Faites glisser et déposez pour ajouter chaque puits au groupe tout en conservant les quatre puits d’angle en arrière-plan (par défaut).
  8. Configurez le protocole en cliquant sur Protocole dans le menu supérieur et définissez trois cycles de mélange, oligomycine, FCCP, roténone et antimycine A en définissant le temps sur Mélanger à 3 min, Reste à 0 min et Mesure à 7 min.
  9. Accédez à la page Exécuter le test , fournissez les informations récapitulatives du projet pour référence, puis cliquez sur Démarrer l’exécution.
  10. Indiquez l’emplacement d’enregistrement des fichiers, afin que tous les résultats soient enregistrés après la fin du test.
  11. Après le chargement automatique du test, attendez que le plateau s’ouvre pour placer la cartouche et la plaque du capteur avec 200 μL d’étalonnage (étape 1.1). Réglez la direction du code-barres de la cartouche vers la droite. Exécutez l’étalonnage en cliquant sur Je suis prêt, ce qui prend environ 20 min.
  12. Après l’étalonnage, cliquez sur Ouvrir le bac. Remplacez la plaque par la plaque ensemencée par la cellule et cliquez sur Plaque de cellule de charge pour continuer l’essai.
  13. Une fois le test terminé, les données sont automatiquement enregistrées. Cliquez sur Afficher les résultats et exportez-les sous forme de feuille de calcul ou d’un autre fichier de logiciel d’analyse.
  14. Représenter graphiquement et analyser les données (Figure 3 et Figure 4).
  15. Calculer les paramètres respiratoires, y compris la respiration mitochondriale basale, la respiration liée aux fuites de protons, la respiration liée à l’ATP, la respiration maximale, la capacité respiratoire de réserve et la respiration non mitochondriale (Figure 4A)38,39,40,41.
    1. Calculer la respiration mitochondriale basale en soustrayant la valeur de l’OCR mesurée après addition du mélange roténone/antimycine A de l’OCR avant injection d’oligomycine (Figure 4A, a).
    2. Calculer la respiration liée à une fuite de protons en soustrayant la valeur de l’OCR après injection de mélange roténone/antimycine A de la valeur OCR mesurée après injection d’oligomycine (Figure 4A,b).
    3. Estimez la respiration liée à l’ATP en calculant la différence entre la respiration mitochondriale basale et la respiration liée aux fuites de protons. Soustrayez la première valeur de ROC mesurée après injection d’oligomycine de la première valeur de ROC avant l’injection d’oligomycine (figure 4A,c).
    4. La respiration maximale est la fréquence respiratoire maximale qu’une cellule peut atteindre après l’ajout de FCCP. Calculez cela en soustrayant la valeur OCR après injection de mélange roténone/antimycine A de la valeur OCR mesurée après injection FCCP (Figure 4A,d).
    5. La capacité respiratoire de réserve fait référence à la capacité d’une cellule à répondre à la demande d’énergie plus élevée grâce à OXPHOS. Calculez cela en trouvant la différence entre la respiration maximale et la respiration mitochondriale basale (Figure 4A, e).
    6. La respiration non mitochondriale est la quantité d’oxygène consommée par les sources non mitochondriales. Mesurez cela après l’addition du mélange roténone/antimycine A (figure 4A,f).
  16. Effectuer une analyse statistique à l’aide du test t de Student pour comparer différents paramètres respiratoires de cellules HL60 indifférenciées et différenciées. Considérez p < 0,05 comme statistiquement significatif.
    REMARQUE : Les répétitions avec des valeurs OCR ou ECAR inférieures à zéro sont considérées comme une erreur dans la préparation de l’échantillon, l’injection de composés ou la mesure. Ils sont exclus de l’analyse future.

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Representative Results

Une dynamique représentative de l’OCR indique les changements respiratoires mitochondriaux en réponse à l’oligomycine, au FCCP et au mélange roténone/antimycine A de neutrophiles de souris (Figure 3A), de neutrophiles humains (Figure 3B) et de cellules HL60 indifférenciées et différenciées (Figure 3C). Dans toutes les cellules, le traitement à l’oligomycine diminue la valeur OCR en inhibant le canal protonique de l’ATP synthase; Le traitement FCCP restaure la valeur OCR en augmentant le flux d’électrons et la consommation d’oxygène pour maintenir le potentiel membranaire et atteindre une respiration maximale; et roténone/antimycine Un traitement en mélange élimine la respiration mitochondriale en bloquant les complexes I et III de la chaîne de transport d’électrons.

Nous avons observé qu’après différenciation dirigée par les neutrophiles, les cellules HL60 présentaient une diminution de la respiration mitochondriale (Figure 3C). Après avoir quantifié différents paramètres respiratoires, mentionnés ci-dessus, les cellules HL60 différenciées ont montré une respiration mitochondriale basale significativement plus faible (Figure 4B), une respiration liée à une fuite de protons (Figure 4C), une respiration liée à l’ATP (Figure 4D) et une respiration non mitochondriale (Figure 4G). La respiration maximale (Figure 4E) dans les cellules HL60 différenciées a augmenté, mais pas de manière significative. La capacité respiratoire de réserve (figure 4F) a été considérablement augmentée.

Figure 3
Figure 3 : Graphiques représentatifs montrant les changements dynamiques de l’OCR pendant le test de stress mitochondrial. (A) Moyenne ± écart-type à partir de n = 3 réplicas de neutrophiles de souris. (B) Moyenne ± écart-type de n = 3 réplicas de neutrophiles humains. (C) Moyenne ± écart-type de n = 3 réplicas de cellules HL60 indifférenciées (HL60, bleu) et différenciées (dHL60, rouge). Abréviation : OCR = taux de consommation d’oxygène. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Paramètres respiratoires obtenus à partir de la dynamique OCR. (A) Schéma montrant comment calculer (a) la respiration mitochondriale basale, (b) la respiration liée à une fuite de protons, (c) la respiration liée à l’ATP, (d) la respiration maximale, (e) la capacité respiratoire de réserve et (f) la respiration non mitochondriale. (B-G) Moyenne ± écart-type de n = 3; (B) respiration mitochondriale basale, (C) respiration liée à une fuite de protons, (D) respiration liée à l’ATP, (E) respiration maximale, (F) capacité respiratoire de réserve et (G) respiration non mitochondriale des cellules HL60 indifférenciées (HL60) et différenciées (dHL60). ns (non significatif) p > 0,05, *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001 par test t de Student non apparié. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Discussion

La procédure standard qui mesure la respiration mitochondriale des neutrophiles à l’aide de l’analyseur de flux extracellulaire métabolique est limitée par de nombreux facteurs, notamment le nombre de cellules, la croissance cellulaire et la viabilité. La concentration de chaque composé varie selon le type et la source des cellules dans ce test. L’oligomycine et la roténone/antimycine A sont principalement utilisées à une concentration similaire dans la plupart des types de cellules. Cependant, comme la fréquence respiratoire maximale induite par le FCCP varie d’une cellule à l’autre, un titrage minutieux du FCCP est nécessaire pour optimiser la concentration42. Il est également préférable d’effectuer des ajouts séquentiels de FCCP lors de l’optimisation. Bien que l’analyseur de flux extracellulaire métabolique injecte les médicaments dans la plaque sous pression d’air43, l’imperméabilité de la membrane cellulaire à certains inhibiteurs du complexe mitochondrial limite leur utilisation dans le cas de cellules intactes par rapport aux mitochondries isolées44. Le chargement dans les ports doit être effectué avec soin pour éviter la contamination croisée. La concentration du substrat (par exemple, glucose, pyruvate, glutamine) dans le milieu peut également influencer l’activité mitochondriale et doit être optimisée.

Outre les concentrations de médicament, la densité d’ensemencement cellulaire est également un paramètre critique pour obtenir une bonne valeur OCR. La densité optimale d’ensemencement cellulaire varie selon le type de cellule, et il est recommandé d’utiliser différentes densités d’ensemencement dans les expériences préliminaires pour tester l’efficacité de la mesure. Un comptage précis des cellules est obligatoire pour réduire la variabilité entre les groupes, et les matériaux de revêtement appropriés pour la plaque de culture doivent être testés pour assurer l’adhérence des cellules au fond de la plaque. La centrifugation de la plaque de culture à une vitesse de 300 × g à TA pendant 5 min sans frein aide à la sédimentation et à la fixation rapides des cellules. Avant d’ensemencer les cellules, un lavage suffisant est souhaitable après l’aspiration du matériau de revêtement.

L’ensemencement des cellules est effectué par pipetage des cellules sur le bord inférieur, afin d’éviter les effets de bord et d’assurer une répartition uniforme des cellules45. Les cellules sont maintenues à 37 °C et laissées au repos pendant au moins 1 heure pour minimiser l’effet de bord46. Il est recommandé de les maintenir dans un incubateur sans CO2 pour dégazer la plaque de culture cellulaire avant la mesure, car le niveau d’oxygène dans le mélange gazeux peut différer selon l’expérience et le type de cellule, avec des valeurs d’hypoxie différentes pour différents tissus et types de cellules47. Le milieu d’essai doit être préparé le jour de l’essai (70 mL de milieu est suffisant pour le dosage). La normalisation des données avec le nombre de cellules peut être effectuée à l’aide du dosage du bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényl-2,5-tétrazolium (MTT), du test de fragmentation nucléaire avec Hoechst, du test de comptage cellulaire ou des dosages de quantification des protéines ou de l’ADN48. Étant donné que différents inhibiteurs mitochondriaux sont utilisés, la viabilité cellulaire doit être considérée comme un facteur pour le résultat. Il est recommandé d’effectuer un test de viabilité cellulaire à la fin du test pour exclure un éventuel effet cytotoxique des médicaments utilisés.

En plus de l’OCR, l’analyseur de flux extracellulaire métabolique peut également mesurer l’ECAR, qui est couramment utilisé pour quantifier la glycolyse49. Cependant, dans le test de stress mitochondrial, les valeurs ECAR reflètent l’acidité générée à la fois par la glycolyse et le cycle de l’acide tricarboxylique (via CO2) dans la respiration mitochondriale. Pour mesurer la glycolyse, un kit de test d’effort de glycolyse est recommandé. Initialement, l’OCR avant l’ajout des composés montre la respiration basale des neutrophiles. La respiration basale se produit en raison du transport des protons de la matrice mitochondriale vers l’espace intermembranaire passant à travers la membrane mitochondriale interne, en fonction de la composition de la membrane mitochondriale interne. La respiration basale représente ~30%-50% du taux métabolique des cellules au repos 1,50.

Les calculs basés sur la respiration basale du test pourraient réduire la variabilité entre les groupes et les types de cellules. La normalisation des données a été réalisée par comparaison avec la respiration basale sans ajout de médicaments, ce qui permet de normaliser les changements en fonction du nombre de cellules et de l’erreur de banc sur le test. La capacité respiratoire de réserve est la différence entre l’OCR maximale et l’OCR basale et est un indicateur de la proximité du fonctionnement des cellules à leur limite bioénergétique. Une diminution de la respiration maximale indique une réduction du transport d’électrons dans la chaîne respiratoire des complexes I et II aux complexes III et IV, et éventuellement à l’oxygène moléculaire. La figure 4A montre la représentation schématique des calculs de l’essai.

L’augmentation de la capacité respiratoire de réserve indique que les cellules peuvent bien répondre à d’autres demandes d’énergie, ce qui est une condition préalable dans le cas des neutrophiles car ils finissent en rafale respiratoire lors de l’activation 51,52,53,54,55. Cependant, les données ECAR du test de stress mitochondrial ne peuvent pas représenter le taux de glycolyse des neutrophiles. Certaines évaluations peuvent être faites sur les données; par exemple, la réduction des valeurs ECAR chez les neutrophiles de souris et d’humains après l’ajout de roténone et d’antimycine A implique que les valeurs ECAR avant l’ajout de ces inhibiteurs complexes I et III sont principalement dues à la production de CO2 à partir du cycle TCA. Dans le cas des lignées cellulaires, les valeurs ECAR sont constantes après l’ajout de roténone et d’antimycine A, ce qui suggère que les valeurs ECAR avant l’addition sont dues à la glycolyse45.

Les troubles mitochondriaux sont des conditions cliniques caractérisées par un OXPHOS défectueux. Dans le cas des neutrophiles, la mesure de l’OCR est faible en raison de l’absence de prolifération cellulaire, du faible nombre mitochondrial et de la sénescence précoce56. Dans les troubles neurodégénératifs, les neutrophiles extravasent dans les zones de dépôt de β amyloïde (Aβ). Le peptide Aβ42 déclenche l’activation de l’intégrine et l’adhésion rapide des neutrophiles57. Au cours de l’apoptose, les mitochondries des neutrophiles libèrent des protéines proapoptotiques dans le cytosol58. Il est également démontré que la vitesse de migration des neutrophiles est réduite et que la chimiotaxie est abolie lorsqu’elle est traitée avec CCCP9. Cela suggère le rôle potentiel des mitochondries et de la respiration mitochondriale dans la fonction des neutrophiles. Des activités mitochondriales dans divers types de cellules dans de nombreuses conditions pathologiques ont été rapportées et liées à la pathogenèse, telles que la maladie d’Alzheimer5, la schizophrénie59, les maladies respiratoires chroniques60, les troubles bipolaires, la septicémie, les diabétiques, l’asthme, l’hypertension pulmonaire et la drépanocytose. Des thérapies émergentes, telles que l’amélioration du flux de chaînes respiratoires en utilisant des antioxydants (par exemple, CoQ10, idébénone, acide alpha-lipoïque, vitamine C et E) et / ou des cofacteurs (par exemple, la riboflavine, la thiamine) et l’administration de substrats mitochondriaux tels que la L-carnitine, ont été utilisées dans le traitement des troubles mitochondriaux. Cependant, ces traitements ne sont pas normalisés et peuvent ne pas être efficaces61. Une méthodologie standardisée non invasive, telle que l’utilisation de l’analyseur de flux extracellulaire métabolique, pour quantifier les fonctions mitochondriales dans les cellules pertinentes pour la maladie, telles que les neutrophiles, pourrait servir de biomarqueur diagnostique en thérapeutique.

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Disclosures

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent.

Acknowledgments

Nous remercions le Dr Anthony T. Vella et la Dre Federica Aglianoin du Département d’immunologie de UConn Health pour leur formation à l’utilisation de l’analyseur de flux extracellulaire métabolique, et la Dre Lynn Puddington du Département d’immunologie de UConn Health pour son soutien aux instruments. Nous remercions le Dr Geneva Hargis de l’École de médecine de l’UConn pour son aide dans la rédaction scientifique et l’édition de ce manuscrit. Cette recherche a été soutenue par des subventions des National Institutes of Health, du National Heart, Lung, and Blood Institute (R01HL145454), de l’Institut national des sciences médicales générales (R35GM147713 et P20GM139763), d’un fonds de démarrage de UConn Health et d’une bourse de rentrée professionnelle de l’American Association of Immunologists.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
37 °C non-CO2 incubator Precision Economy Model 2EG Instrument
Biorender Software Application
Centrifuge Eppendorf Model 5810R Instrument
Corning Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive Corning 102416-100 Reagent
EasySep Magnet STEMCELL 18000 Magnet
EasySepMouse Neutrophil Enrichment kit STEMCELL 19762A Reagents
Graphpad Prism 9 Software Application
Human Serum Albumin Solution (25%) GeminiBio 800-120 Reagents
Ketamine (VetaKet) DAILYMED NDC 59399-114-10 Anesthetic
PBS Cytiva SH30256.01 Reagents
Plate buckets Eppendorf UL155 Accessory
PolymorphPrep PROGEN 1895 (previous 1114683) polysaccharide solution
Purified mouse anti-human CD18 antibody Biolegend 302102 Clone TS1/18
RPMI 1640 Medium Gibco 11-875-093 Reagents
Seahorse metabolic extracellular flux analyzer Agilent XFe96 Instrument
Seahorse XF Cell Mito Stress Test Kit Agilent 103015-100 mitochondrial stress test Kit
Swing-bucket rotor Eppendorf A-4-62 Rotor
Vactrap 2 Vacum Trap Fox Lifesciences 3052101-FLS Instrument
Wave Software Application
XF 1.0 M Glucose Solution Agilent 103577-100 Reagent
XF 100 mM Pyruvate Solution Agilent 103578-100 Reagent
XF 200 mM Glutamine Solution Agilent 103579-100 Reagent
XF DMEM medium Agilent 103575-100 Reagent
XFe96 FluxPak Agilent 102601-100 Material
Xylazine (AnaSed Injection) DAILYMED NDC 59399-110-20 Anesthetic

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Pulikkot, S., Zhao, M., Fan, Z. Real-Time Measurement of the Mitochondrial Bioenergetic Profile of Neutrophils. J. Vis. Exp. (196), e64971, doi:10.3791/64971 (2023).

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