Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Realtidsmätning av den mitokondriella bioenergetiska profilen för neutrofiler

Published: June 2, 2023 doi: 10.3791/64971
Automatic Translation
1, 2,3, 1
1Department of Immunology, School of Medicine, UConn Health, 2Arthritis and Clinical Immunology Program, Oklahoma Medical Research Foundation, 3Department of Microbiology and Immunology, University of Oklahoma Health Science Center

Summary

Vi beskriver stegvisa protokoll som mäter mitokondriell andning hos mus- och humana neutrofiler och HL60-celler med hjälp av metabolisk extracellulär flödesanalysator.

Abstract

Neutrofiler är den första försvarslinjen och de vanligaste leukocyterna hos människor. Dessa effektorceller utför funktioner som fagocytos och oxidativ burst och skapar neutrofila extracellulära fällor (NET) för mikrobiell clearance. Nya insikter i neutrofilernas metaboliska aktiviteter utmanar det tidiga konceptet att de främst förlitar sig på glykolys. Exakt mätning av metaboliska aktiviteter kan utveckla olika metaboliska behov av neutrofiler, inklusive trikarboxylsyra (TCA) -cykeln (även känd som Krebs-cykeln), oxidativ fosforylering (OXPHOS), pentosfosfatväg (PPP) och fettsyraoxidation (FAO) under fysiologiska förhållanden och i sjukdomstillstånd. Detta dokument beskriver ett steg-för-steg-protokoll och förutsättningar för att mäta syreförbrukningshastighet (OCR) som en indikator på mitokondriell andning på benmärgshärledda neutrofiler från mus, humana blod-härledda neutrofiler och den neutrofilliknande HL60-cellinjen, med hjälp av metabolisk flödesanalys på en metabolisk extracellulär flödesanalysator. Denna metod kan användas för att kvantifiera mitokondriella funktioner hos neutrofiler under normala och sjukdomsförhållanden.

Introduction

Mitokondrier spelar en viktig roll i cellbioenergetik, som genererar adenosintrifosfat (ATP) genom oxidativ fosforylering (OXPHOS). Utöver detta sträcker sig mitokondriernas roll in i generering och avgiftning av reaktiva syrearter, cytoplasmatisk och mitokondriell matriskalciumreglering, cellulär syntes, katabolism och transport av metaboliter inom cellen1. Mitokondriell andning är avgörande i alla celler, eftersom deras dysfunktion kan leda till metaboliska problem 2, inklusive hjärt-kärlsjukdomar3 och en mängd olika neurodegenerativa sjukdomar, såsom åldersrelaterad makuladegeneration4, Parkinsons och Alzheimers sjukdomar5 och Charcot-Marie-Tooths sjukdom2 A (CMT2A)6.

Elektronmikroskopiska studier på neutrofiler avslöjade att det finns relativt få mitokondrier7, och de är starkt beroende av glykolys för sin energiproduktion eftersom mitokondriell andning är mycket låg8. Mitokondrier är dock avgörande för neutrofila funktioner, såsom kemotaxis9 och apoptos10,11,12. En tidigare studie avslöjade ett komplext mitokondriellt nätverk hos humana neutrofiler med hög membranpotential. Den mitokondriella membranpotentialförlusten är en tidig indikator på neutrofil apoptos10. Behandling med mitokondriell uncoupler karbonylcyanid m-klorfenylhydrazon (CCCP) visade signifikant hämning i kemotaxi, tillsammans med en förändring i mitokondriell morfologi 9,10.

Även om den primära energikällan för neutrofiler är glykolys, tillhandahåller mitokondrier ATP som initierar neutrofilaktivering genom att driva den första fasen av purinergisk signalering, vilket ökar Ca2+ signalering, förstärker mitokondriell ATP-produktion och initierar neutrofila funktionella svar13. Dysfunktion i den mitokondriella andningskedjan resulterar i överdriven produktion av giftiga reaktiva syreradikaler (ROS) och leder till patogena skador14,15,16. NETosis, som är processen att bilda neutrofila extracellulära fällor (NET), är en kritisk egenskap hos neutrofiler som hjälper dem att bekämpa patogener17 och bidrar till många patologiska tillstånd, inklusive cancer, trombos och autoimmuna störningar18. Mitokondriellt härledd ROS bidrar till NETosis19, mitokondriellt DNA kan vara en komponent i NET18 och förändrad mitokondriell homeostas försämrar NETosis 20,21,22,23,24. Dessutom, under normal differentiering eller mognad, vänds neutrofil metabolisk omprogrammering genom att begränsa glykolytisk aktivitet, och de engagerar sig i mitokondriell andning och mobiliserar intracellulära lipider25,26.

Den metaboliska extracellulära flödesanalysatorn kan kontinuerligt övervaka och kvantifiera levande cellmitokondriell andning och glykolys. Analysatorn använder en sensorpatron med 96 brunnar och två fluoroforer för att kvantifiera syrekoncentration (O2) och pH-förändringar. Sensorpatronen ligger ovanför cellmonoskiktet under analysen och bildar en ~ 200 nm hög mikrokammare. De optiska fiberbuntarna i analysatorn används för att excitera fluoroforerna och detektera de fluorescerande intensitetsförändringarna. Realtidsförändringar i O2-koncentration och pH beräknas automatiskt och visas som syreförbrukningshastighet (OCR) och extracellulär försurningshastighet (ECAR). Det finns fyra portar på sensorpatronen som gör det möjligt att ladda upp till fyra föreningar i varje brunn under analysmätningarna. Detta protokoll fokuserar på att kvantifiera mitokondriell andning hos mus och humana neutrofiler, såväl som neutrofilliknande HL60-celler, med hjälp av den metaboliska extracellulära flödesanalysatorn.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Hepariniserade helblodprover erhölls från friska mänskliga givare efter att ha erhållit informerat samtycke, vilket godkänts av Institutional Review Board of UConn Health i enlighet med Helsingforsdeklarationen. Alla djurförsök följde UConn Health Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) riktlinjer, och godkännande för användning av gnagare erhölls från UConn Health IACUC enligt kriterier som beskrivs i Guide for the Care and Use of Laboratory Animals från National Institutes of Health. Möss av typen C57BL / 6 för män vid 6 veckors ålder användes i denna studie.

1. Beredning av 96-brunnsplattan för metabolisk extracellulär flödesanalys

  1. En sensorpatron är förpackad ovanpå den specialdesignade 96-brunnsplattan för metabolisk extracellulär flödesanalys. Hydrera cylinderampullen genom att försiktigt lyfta den och placera 200 μl/brunn kalibreringsmedium i varje brunn på den underliggande plattan. Placera cylinderampullen över plattan med calibrant i en icke-CO2, fuktad, 37 °C inkubator över natten för att återfukta.
  2. Baserat på celltypen, använd en specifik beläggning för odlingsplattan för att säkerställa celladhesion. För humana neutrofiler-odifferentierade och differentierade HL60-celler-belägg 96-brunnsplattan med steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS) innehållande 50 μL 5 μg/ml renad musanti-human CD18-antikropp (klon TS1/18) vid 4 °C över natten. För neutrofiler hos mus, täck 96-brunnsplattan med 25 μL 22,4 μg/ml Cell Tak vid pH 8,0 i 0,1 M NaHCO3 vid rumstemperatur (RT) i 20 minuter.
  3. Tvätta plattorna med 200 μL steril PBS två gånger.
  4. Tillsätt komplett medium till hörnbrunnarna (A1, A12, H1 och H12) på cellodlingsplattan (utan celler) för bakgrundskorrigering i cellodlingsplattorna under sådd.
    OBS: Avdunstning under beläggning och kalibrering kan påverka kalibreringsmediets volym och normalisering. Använd en bricka eller kammare med steril vattenfuktad vävnad och placera plattan med kalibraren ovanför för att förhindra avdunstning.

2. Förberedelse och sådd av celler

  1. Beredning av analysmedium
    1. Förbered analysmedium genom att tillsätta 1 mM pyruvat, 10 mM glukos och 2 mM glutamin till Dulbeccos modifierade Eagle-medium (DMEM).
  2. Isolering av musneutrofiler från benmärgen
    1. Isolera musneutrofiler från benmärgen med hjälp av Mouse Neutrophil Enrichment Kit, enligt tillverkarens instruktioner.
    2. Bedöva mössen genom intraperitoneal (i.p.) injektion av ketamin (125 mg / kg) och xylazin (12,5 mg / kg) och sedan avliva mössen genom cervikal dislokation.
    3. Skörda lårben och skenben, som beskrivits tidigare27. Skär kortfattat huden för att exponera benet med musklerna. Skär höftleden för att ta bort benet från kroppen. Ta sedan bort musklerna för att samla lårbenet och skenbenet.
    4. Skär de mindre ändarna av lårbenen och skenbenet. Håll de skurna ändarna nedåt, placera dem i ett 0,5 ml centrifugrör med två 25 G sprutnålstansade hål i botten och placera 0,5 ml röret i ett 1,5 ml centrifugrör (figur 1A). Tillsätt 50 μL PBS i 0,5 ml röret för att förhindra torkning av benmärgsceller.
    5. Centrifugera vid 5 900 × g vid rumstemperatur i 15 s för att samla upp benmärgen i botten av 1,5 ml röret. Resuspendera benmärgscellerna med 1 ml DMEM. Tillsätt 50 μL råttserum från satsen, blanda försiktigt genom pipettering och överför cellsuspensionen till ett 5 ml polystyrenodlingsprovrör.
    6. Tillsätt 50 μl anrikningscocktail från Mouse Neutrophil Enrichment Kit och inkubera i 15 minuter vid rumstemperatur. Centrifugera vid 300 × g vid rumstemperatur i 5 minuter.
    7. Återsuspendera cellerna med 1 ml DMEM, tillsätt 50 μL biotinvalscocktail från satsen, blanda försiktigt genom pipettering och inkubera i 15 minuter vid rumstemperatur.
    8. Tillsätt 150 μL virvlade magnetiska partiklar från satsen, blanda försiktigt genom pipettering och inkubera i 10 minuter vid rumstemperatur.
    9. Tillsätt ~ 1,3 ml DMEM, blanda försiktigt genom pipettering, placera röret i magneten i 3 minuter och överför supernatanten innehållande renade musneutrofiler till ett nytt 5 ml polystyrenodlingsprovrör genom att invertera originalröret tillsammans med magneten.
    10. Centrifugera vid 300 × g vid rumstemperatur i 5 minuter. Efter avlägsnande av supernatanten genom vakuumaspiration, suspendera cellerna igen med 1 ml analysmedium.
    11. Räkna cellerna manuellt med hjälp av en hemocytometer.
    12. Justera celldensiteten till 1,1 × 106 celler/ml genom att tillsätta analysmedium, frö 180 μL av musens neutrofilsuspension (2 × 105 celler) per brunn i den förberedda 96-brunnsplattan (steg 1.2-1.4) och centrifugera plattan vid 300 × g vid RT i 3 minuter utan broms för att säkerställa korrekt vidhäftning av cellerna på plattans botten.
    13. Inkubera plattan i en icke-CO2, fuktad, 37 °C inkubator i 1 timme för att förbereda cellerna med analysmediet.
      OBS: Renheten hos neutrofilerna är avgörande för analysen eftersom det är en potentiell bias. Renheten hos musens neutrofilisolering är 69,9% -88,7% enligt detta protokoll. Det finns andra metoder för att isolera neutrofiler från benmärg från mus, såsom densitetsgradientcentrifugering28. Det finns också alternativa neutrofilisoleringssatser från andra leverantörer, baserat på det negativa magnetiska urvalet med användning av monoklonala antikroppar mot antigener som inte uttrycks på neutrofiler.
  3. Isolering av humana neutrofiler från perifert blod
    1. Tillsätt 8 ml polysackaridlösning i ett 15 ml centrifugrör och skikt sedan över 4 ml perifert blod ovanpå polysackaridlösningen utan att blanda.
    2. Centrifugera vid 550 × g vid 20 °C i 30 minuter. Låt rotorn sakta ner vid 1.
      OBS: Separationstiden för neutrofila granulocyter kan variera mellan donatorer. Det är minst 30 minuter, och ytterligare 10-20 minuter kan behövas om neutrofilseparationen misslyckas.
    3. Observera separationen av plasma/trombocyter och mononukleära celler efter centrifugeringen, såsom visas i figur 1B. Ta försiktigt bort den övre gula vätskan ovanpå (plasma och blodplättar) och det övre grumliga bandet (mononukleära celler) utan att störa det nedre grumliga bandet (neutrofiler) med en 1 ml pipett.
    4. Samla det nedre grumliga bandet och ~ 3-4 ml av den klara vätskan nedan i ett nytt 15 ml centrifugrör innehållande 10 ml PBS.
    5. Centrifugera vid 400 × g vid 20 °C i 10 minuter och avlägsna supernatanten genom vakuumaspiration.
    6. Suspendera cellerna igen med 5 ml PBS och centrifugera vid 300 × g vid 20 °C i 5 minuter.
    7. Efter avlägsnande av supernatanten, suspendera cellerna igen med 1 ml analysmedium.
    8. Räkna cellerna manuellt med hjälp av en hemocytometer.
      OBS: Eftersom erytrocyter i blodet inte har några mitokondrier påverkar erytrocytkontaminering inte mitokondriell stresstestanalys och förhindrar neutrofilaktivering/priming29,30. Erytrocyter måste lyseras under cellräkning för att få en korrekt neutrofilkoncentration. Tillsätt 10 μL av cellsuspensionen till 891 μL avjoniserat vatten i 10-30 s för att lysera erytrocyterna, tillsätt sedan 99 μL 10x PBS för att balansera det osmotiska trycket och undvik lys av neutrofilerna.
    9. Justera celldensiteten till 2,2 × 106 celler/ml genom att tillsätta analysmedium, frö 180 μL humana neutrofiler (~4 × 105) per brunn i den förberedda 96-brunnsplattan och centrifugera plattan vid 300 × g vid RT i 3 minuter utan broms för att säkerställa korrekt vidhäftning av cellerna på botten av plattan.
    10. Inkubera plattan i en icke-CO2, fuktad, 37 °C inkubator i 1 timme för att förbereda cellerna med analysmediet.
      OBS: Renheten hos neutrofiler är avgörande för analysen eftersom det är en potentiell bias. Renheten för human neutrofilisolering är 86,6% -96,8%. Det finns andra täthetsgradientcentrifugeringsmetoder för att isolera neutrofiler från humant blod, inklusive Percoll-isolering samt en kombination av Ficoll-isolering och dextransedimentering31.
  4. HL60 cellodling och neutrofilriktad differentiering
    1. Underhålla HL60-celler i Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640-medium innehållande 10% fetalt bovint serum (FBS), 100 μg / ml penicillin, 100 μg / ml streptomycin och 250 ng / ml amfotericin B vid 37 ° C och 5% CO2.
    2. För neutrofilriktad differentiering, behåll HL60-cellerna (suspenderade celler) i en T25-kolv vid en densitet av 1 × 10 5 celler/ml i RPMI-1640-medium innehållande 10% FBS, 100 μg/ml penicillin, 100 μg/ml streptomycin, 250 ng/ml amfotericin B och 1,3% dimetylsulfoxid (DMSO) vid 37 °C och5 %CO2 i 6 dagar.
    3. På analysdagen räknas cellerna manuellt med hemocytometern, centrifugerade differentierade eller odifferentierade HL60-celler vid 300 × g vid RT i 5 minuter, tvättas med DMEM en gång och suspenderar cellerna igen med analysmediet för att få en celldensitet på 1,39 × 106 celler / ml.
    4. Frö 180 μL differentierade eller odifferentierade HL60-celler (~ 2,5 × 105) per brunn i den beredda 96-brunnsplattan och centrifugera plattan vid 300 × g vid RT i 3 minuter utan broms för att säkerställa korrekt vidhäftning av cellerna på botten av plattan.
    5. Inkubera plattan i en icke-CO2, fuktad, 37 °C inkubator i 1 timme för att förbereda cellerna med analysmediet.
      OBS: Bekräfta fullständig vidhäftning av celler med hjälp av ett mikroskop före nästa steg.

Figure 1
Figur 1: Schematiskt diagram över isoleringen av benmärgsceller och neutrofiler. (A) Skörda benmärgsceller från en mus och (B) isolera neutrofiler från humant blod. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Typ av cell Celler per brunn Föreningar/reagenser Koncentration av arbetslösning Injektionsvolym till portar Slutlig koncentration i brunnar
Mus neutrofiler 2 × 105 Oligomycin 25 μM 20 μL 2,5 μM
FCCP 7,5 μM 17,6 μL 0,61 μM
Rotenonantimycin A-blandning 10 μM 24 μL 1 μM
Mänskliga neutrofiler 4 × 105 Oligomycin 10 μM 20 μL 1 μM
FCCP 12,5 μM 22 μL 1,25 μM
Rotenonantimycin A-blandning 10 μM 24 μL 1 μM
Odifferentierade eller differentierade HL60-celler 2.5 × 105 Oligomycin 25 μM 20 μL 2,5 μM
FCCP 15 μM 22 μL 1,5 μM
Rotenonantimycin A-blandning 10 μM 24 μL 1 μM

Tabell 1: Cellantal och reagenskoncentrationer för mitokondriellt stresstest.

3. Förbereda föreningar i mitokondriell stresstestkit

  1. Öppna mitokondriens stresstestkit och förbered reagenserna.
    OBS: De olika arbetslösningskoncentrationerna, injektionsvolymen i brunnarna och de slutliga koncentrationerna i brunnarna av oligomycin, karbonylcyanid p-trifluormetoxifenylhydrazon (FCCP) och rotenon / antimycin En blandning som används för musneutrofiler, humana neutrofiler och HL60-celler visas i tabell 1.
    1. Bered oligomycinstamlösning genom att rekonstituera oligomycin med 630 μl analysmedium för att erhålla en 100 μM stamlösning.
      OBS: Det rekommenderas att använda stamlösningen samma dag.
      1. Bered oligomycinarbetslösning för musneutrofila analyser och HL60-cellanalyser genom att blanda 630 μl stamlösning med 1,890 μl analysmedium för att erhålla en 25 μM arbetslösning.
      2. Bered oligomycinarbetslösning för neutrofiltest av människa genom att blanda 300 μl stamlösning med 2 700 μl analysmedium för att erhålla en 10 μM arbetslösning.
        OBS: Bindningen av oligomycin till Fo-basplattans underenhet i Fo / F1 ATPas (ATP-syntas) förhindrar återinträde av protoner i mitokondrier och hämmar ATP-syntes32. Detta minskar elektronflödet avsevärt genom elektrontransportkedjan och OCR. Elektronflödet stannar emellertid inte helt på grund av protonläckage över det inre mitokondriella membranet33.
    2. Bered stamlösning genom att rekonstituera FCCP med 720 μl analysmedium så att en stamlösning på 100 μM erhålls.
      1. Bered arbetslösningen för musanalys av neutrofila granulocyter genom att blanda 300 μl stamlösning med 3 700 μl analysmedium för att erhålla en arbetslösning på 7,5 μM.
      2. Bered arbetslösning för test av humana neutrofila granulocyter genom att blanda 375 μl stamlösning med 2 625 μl analysmedium för att erhålla en 12,5 μM arbetslösning.
      3. Bered arbetslösningen för HL60-cellanalysen genom att blanda 720 μl stamlösning med 4,080 μL analysmedium för att erhålla en 15 μM arbetslösning.
        OBS: Tillägget av FCCP avslöjar mitokondriernas maximala kapacitet att använda OXPHOS. Det är en lipidlöslig, svag syra som är permeabel för mitokondrier resulterar i dissipitation av transmembranpotential. Urladdning av protongradienten över det mitokondriella inre membranet och avledning av protonflödet från Fo / F1 ATP-syntas resulterar i mitokondriell frikoppling. Denna frikopplingseffekt ökar plötsligt mitokondriell syreförbrukning för att bevara protongradienten34.
    3. Bered rotenon/antimycin A-stamlösning genom att rekonstituera rotenon/antimycin En blandning med 540 μl analysmedium så att en 50 μM stamlösning erhålls.
      1. Bered rotenon/antimycin En arbetslösning för alla tester genom att blanda 540 μl stamlösning med 2 160 μl analysmedium för att erhålla en 10 μM arbetslösning.
        Rotenon blockerar komplex I genom att hämma elektronöverföring från järn-svavelcentra i komplex I till ubiqinon, medan antimycin A blockerar komplex III i elektrontransportkedjan, vilket leder till en blockad av OXPHOS med en begränsad syntes av ATP35. Därmed avslöjar detta icke-mitokondriell andning36,37.
  2. Ladda patronen med reagens; ladda beredd oligomycin, FCCP och rotenon/antimycin A-blandning i A-, B- respektive C-portarna i cylinderampullen för injektioner (figur 2). Använd mallinsatsen som finns tillsammans med patronen för att underlätta laddningen av reagens till portarna. Fyll de oanvända portarna med 20 μl analysmedium.
    1. För musanalys av neutrofila granulocyter, fyll 20 μL oligomycin (25 μM; varje brunn på 96-brunnsplattan har 180 μL analysmedium i början, så den slutliga koncentrationen är 2,5 μM) i A-portarna. Fyll 17,6 μL FCCP (7,5 μM; slutkoncentration: ~0,61 μM) i B-portarna. Fyll 24 μl rotenon/antimycin A-blandning (10 μM; slutkoncentration: ~1 μM) i C-portarna.
    2. För analys av humana neutrofila granulocyter, fyll 20 μL oligomycin (10 μM; varje brunn på 96-brunnsplattan har 180 μL analysmedium i början, så den slutliga koncentrationen är 1 μM) i A-portarna. Fyll 22 μL FCCP (12,5 μM; slutkoncentration: ~1,25 μM) i B-portarna. Fyll 24 μl rotenon/antimycin A-blandning (10 μM; slutkoncentration: ~1 μM) i C-portarna.
    3. För HL60- och dHL60-cellanalysen, ladda 20 μL oligomycin (25 μM; varje brunn på 96-brunnsplattan har 180 μL analysmedium i början, så den slutliga koncentrationen är 2,5 μM) i A-portarna. Fyll 22 μL FCCP (15 μM; slutkoncentration: ~1,5 μM) i B-portarna. Fyll 24 μl rotenon/antimycin A-blandning (10 μM; slutkoncentration: ~1 μM) i C-portarna.
      OBS: Pipettera läkemedelslösningen i porten utan att vidröra portens botten. Knacka inte på plattan efter påfyllning för att undvika läckage, eftersom vätskorna hålls av kapillärkrafterna. Odlingsplattans bakgrundsbrunnar och portarna på sensorpatronen laddas med analysmedium eller med samma port för laddning av reagens som i provbrunnarna för att normalisera effekten av reagens på bakgrundsvärdena. Reagenserna måste läggas till respektive portar utan att lyfta patronen från den kalibrerande innehållande verktygsplattan för att undvika luftfälla. Fyll den sista porten i alla brunnar med mediet enligt figur 2.

Figure 2
Figur 2: Cylinderampullen för mitokondriell stress och deras injektionsportar. Bilden visar patronen för mitokondriell stressanalys och en förstorad bild som visar laddningen av enskilda läkemedel / medium till portarna. Förkortning: FCCP = karbonylcyanid p-trifluormetoxifenylhydrazon. Klicka här för att se en större version av denna figur.

4. Köra mitokondriell stressanalys

  1. Slå på den metaboliska analysatorn och datorn, öppna Wave-programvaran och klicka på Heater On för att ställa in maskinen vid 37 ° C minst 5 timmar i förväg. Efter att ha nått temperaturen visar det nedre vänstra hörnet av vågprogramvaran redo.
  2. Öppna en mall för mitokondriell stressanalyssats i programvaran. Klicka på Gruppdefinition i den övre menyraden.
  3. Förinställ separat varje definition på vänster sida, såsom injektionsstrategier, förbehandlingar, analysmedia och (biomaterial som används) celltyper.
  4. Klicka på injektionsstrategier på vänster sida, klicka sedan på Lägg till och namnge injektionstillståndet som humana neutrofiler / musneutrofiler / HL60. Välj port A-D genom att klicka på var och en och klicka på Lägg till förening och ange Oligomycin/FCCP/Rotenonantimycin A med respektive koncentration (tabell 1).
  5. Klicka på förbehandling på vänster sida, klicka sedan på Lägg till och namnge dem som CD18 och Cell Tak separat. Klicka på biomaterialet som används på vänster sida, klicka sedan på Lägg till och namnge dem som humana neutrofiler, musneutrofiler och HL60 / dHL60 med sådddensitet.
  6. Definiera grupperna genom att klicka på Lägg till grupp (t.ex. för den humana neutrofilanalysen) och genom att klicka på den underliggande definitionen (t.ex. injektionsstrategier enligt tabell 1-humana neutrofiler, förbehandling som CD18 och celltyp som humana neutrofiler).
  7. Klicka på Plattkarta i toppmenyn för att observera alla grupper, med definitioner till vänster och plattkartan till höger. Dra och släpp för att lägga till varje källa i gruppen samtidigt som de fyra hörnbrunnarna behålls som bakgrund (standard).
  8. Ställ in protokollet genom att klicka på Protokoll i toppmenyn och definiera tre cykler av baslinjen, oligomycin, FCCP, rotenon och antimycin A-blandning genom att ställa in tiden för att blanda som 3 min, vila som 0 min och mätning som 7 min.
  9. Gå till sidan Kör analys , ange projektsammanfattningsinformationen som referens och klicka på Starta körning.
  10. Ange platsen för att spara filerna, så att alla resultat sparas efter avslutad analys.
  11. Efter automatisk laddning av analysen, vänta tills brickan öppnas för att placera sensorpatronen och plattan med 200 μL kalibrat (steg 1.1). Ställ patronens streckkodsriktning vänd åt höger. Kör kalibreringen genom att klicka på Jag är klar, vilket tar cirka 20 minuter.
  12. Efter kalibreringen klickar du på Öppna fack. Byt ut plattan mot den cellsådda plattan och klicka på Load Cell Plate för att fortsätta analysen.
  13. När analysen har slutförts sparas data automatiskt. Klicka på Visa resultat och exportera den som ett kalkylblad eller annan analysprogramfil.
  14. Rita och analysera data (figur 3 och figur 4).
  15. Beräkna andningsparametrar, inklusive basal mitokondriell andning, protonläckagelänkad andning, ATP-länkad andning, maximal andning, ledig andningskapacitet och icke-mitokondriell andning (figur 4A)38,39,40,41.
    1. Beräkna den basala mitokondriella andningen genom att subtrahera OCR-värdet uppmätt efter tillsats av rotenon/antimycin A-blandning från OCR före injektion av oligomycin (figur 4A, a).
    2. Beräkna protonläckagelänkad andning genom att subtrahera OCR-värdet efter rotenon/antimycin A-blandningsinjektion från OCR-värdet uppmätt efter oligomycininjektion (figur 4A,b).
    3. Uppskatta ATP-länkad andning genom att beräkna skillnaden mellan basal mitokondriell andning och protonläckagelänkad andning. Subtrahera det första OCR-värdet uppmätt efter oligomycininjektion från det första OCR-värdet före oligomycininjektion (figur 4A,c).
    4. Maximal andning är den maximala andningshastigheten som en cell kan uppnå efter tillsats av FCCP. Beräkna detta genom att subtrahera OCR-värdet efter injektion av rotenon/antimycin A från OCR-värdet uppmätt efter FCCP-injektion (figur 4A,d).
    5. Reservandningskapacitet avser en cells kapacitet att möta det högre energibehovet genom OXPHOS. Beräkna detta genom att hitta skillnaden mellan maximal andning och basal mitokondriell andning (figur 4A, e).
    6. Icke-mitokondriell andning är mängden syre som förbrukas av icke-mitokondriella källor. Mät detta efter tillsats av rotenon/antimycin A-blandning (figur 4A,f).
  16. Utföra statistisk analys med hjälp av Students t-test för att jämföra olika andningsparametrar för odifferentierade och differentierade HL60-celler. Betrakta p < 0,05 som statistiskt signifikant.
    OBS: Replikat med OCR- eller ECAR-värden under noll anses vara ett fel i provberedning, sammansatt injektion eller mätning. De är uteslutna från framtida analys.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Representativ OCR-dynamik visas som indikerar mitokondriell andning förändringar som svar på oligomycin, FCCP och rotenon / antimycin En blandning av musneutrofiler (figur 3A), humana neutrofiler (figur 3B) och odifferentierade och differentierade HL60-celler (figur 3C). I alla celler minskar oligomycinbehandling OCR-värdet genom att hämma protonkanalen för ATP-syntas; FCCP-behandling återställer OCR-värdet genom att öka flödet av elektroner och syreförbrukningen för att bibehålla membranpotentialen och uppnå maximal andning; och rotenon / antimycin En blandningsbehandling eliminerar mitokondriell andning genom att blockera komplex I och III i elektrontransportkedjan.

Vi observerade att efter neutrofilriktad differentiering visade HL60-celler minskad mitokondriell andning (figur 3C). Efter kvantifiering av olika andningsparametrar, som nämnts ovan, visade differentierade HL60-celler signifikant lägre basal mitokondriell (figur 4B) andning, protonläckagekopplad andning (figur 4C), ATP-länkad andning (figur 4D) och icke-mitokondriell andning (figur 4G). Maximal andning (figur 4E) i differentierade HL60-celler ökade, men inte signifikant. Den outnyttjade andningskapaciteten (figur 4F) ökade signifikant.

Figure 3
Figur 3: Representativa diagram som visar de dynamiska förändringarna av OCR under testet av mitokondriella stresstester. (A) Medelvärde ± SD från n = 3 replikat av neutrofiler hos mus. (B) Medelvärde ± SD från n = 3 replikat av humana neutrofiler. (C) Medelvärde ± SD från n = 3 replikat av odifferentierade (HL60, blå) och differentierade (dHL60, röda) HL60-celler. Förkortning: OCR = syreförbrukning. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 4
Figur 4: Andningsparametrar erhållna från OCR-dynamik. (A) Schematisk bild som visar hur man beräknar (a) basal mitokondriell andning, (b) protonläckagelänkad andning, (c) ATP-länkad andning, (d) maximal andning, (e) ledig andningskapacitet och (f) icke-mitokondriell andning. (B-G) Medelvärde ± SD av n = 3; (B) basal mitokondriell andning, (C) protonläckagekopplad andning, (D) ATP-länkad andning, (E) maximal andning, (F) ledig andningskapacitet och (G) icke-mitokondriell andning av odifferentierade (HL60) och differentierade (dHL60) HL60-celler. ns (icke-signifikant) p > 0,05, *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001 genom oparad Students t-test. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Standardproceduren som mäter mitokondriell andning av neutrofiler med hjälp av den metaboliska extracellulära flödesanalysatorn begränsas av många faktorer, inklusive cellantal, celltillväxt och livskraft. Varje föreningskoncentration varierar beroende på typ och källa till celler i denna analys. Oligomycin och rotenon / antimycin A används mest i en liknande koncentration bland de flesta celltyper. Eftersom den FCCP-inducerade maximala andningsfrekvensen varierar mellan olika celler krävs dock noggrann titrering av FCCP för att optimera koncentrationen42. Det är också bättre att utföra sekventiella tillägg av FCCP under optimeringen. Även om den metaboliska extracellulära flödesanalysatorn injicerar läkemedlen i plattan under lufttryck43, begränsar cellmembranets ogenomtränglighet för vissa mitokondriella komplexhämmare deras användning vid intakta celler jämfört med isolerade mitokondrier44. Lastningen i hamnarna måste utföras noggrant för att undvika korskontaminering. Substratkoncentrationen (t.ex. glukos, pyruvat, glutamin) i mediet kan också påverka mitokondriell aktivitet och måste optimeras.

Förutom läkemedelskoncentrationerna är cellsådddensiteten också en kritisk parameter för att erhålla ett bra OCR-värde. Optimal cellsådddensitet varierar beroende på celltyp, och det rekommenderas att använda olika sådddensiteter i preliminära experiment för att testa mätningens effektivitet. Noggrann cellräkning är obligatorisk för att minska variationen mellan grupper, och lämpliga beläggningsmaterial för odlingsplattan måste testas för att säkerställa att cellerna fäster i botten av plattan. Centrifugering av odlingsplattan med en hastighet av 300 × g vid RT i 5 minuter utan broms hjälper till snabb sedimentering och fastsättning av cellerna. Före sådd av cellerna är tillräcklig tvättning önskvärd efter aspirering av beläggningsmaterialet.

Såningen av celler utförs genom pipettering av celler i nedre kanten, för att undvika kanteffekter och för att säkerställa jämn spridning av cellerna45. Cellerna hålls vid 37 °C och får vila i minst 1 timme för att minimera kanteffekten46. Att hålla dem i en icke-CO2-inkubator för att avgasa cellodlingsplattan före mätning rekommenderas eftersom syrehalten i gasblandningen kan variera beroende på experiment och celltyp, med olika hypoxivärden för olika vävnader och celltyper47. Analysmediet måste beredas samma dag som testet utförs (70 ml medium är tillräckligt för analysen). Normalisering av data med cellnummer kan utföras med hjälp av 3-(4,5-dimetyltiazol-2-yl)-2,5-difenyl-2,5-tetrazoliumbromid (MTT) -test, kärnfragmenteringsanalysen med Hoechst, cellräkningsanalysen eller protein- eller DNA-kvantifieringsanalyser48. Eftersom olika mitokondriella hämmare används måste cellviabiliteten beaktas som en faktor för resultatet. Det rekommenderas att utföra ett cellviabilitetstest i slutet av analysen för att utesluta en eventuell cytotoxisk effekt av de använda läkemedlen.

Förutom OCR kan den metaboliska extracellulära flödesanalysatorn också mäta ECAR, som vanligtvis används vid kvantifiering av glykolys49. I mitokondriell stressanalys återspeglar ECAR-värdena emellertid surheten som genereras av både glykolys och trikarboxylsyracykeln (via CO2) vid mitokondriell andning. För att mäta glykolys rekommenderas ett glykolysstresstestkit. Initialt visar OCR före tillsatsen av föreningarna den basala andningen av neutrofilerna. Basal andning sker på grund av protonerna som transporteras från mitokondriell matris till intermembranutrymmet som passerar genom det inre mitokondriella membranet, beroende på den inre mitokondriella membrankompositionen. Basal andning står för ~ 30% -50% av den metaboliska hastigheten för vilande celler 1,50.

Beräkningar baserade på analysens basala andning kan minska variationen mellan grupper och typer av celler. Normalisering av data har uppnåtts genom jämförelse med basalandningen utan tillsats av några läkemedel, vilket möjliggör normalisering av förändringar beroende på cellantal och bänkfel på analysen. Reservandningskapacitet är skillnaden mellan maximal OCR och basal OCR och är en indikator på hur nära cellerna fungerar till sin bioenergetiska gräns. En minskning av maximal andning indikerar minskad elektrontransport i andningskedjan från komplex I och II till komplex III och IV, och så småningom till molekylärt syre. Figur 4A visar den schematiska representationen av beräkningarna av analysen.

Ökningen av ledig andningskapacitet indikerar att celler kan svara bra på ytterligare energibehov, vilket är en förutsättning för neutrofiler eftersom de hamnar i andningsutbrott vid aktivering 51,52,53,54,55. ECAR-data från mitokondriell stressanalys kan dock inte representera glykolyshastigheten för neutrofilerna. Vissa bedömningar kan göras på data; till exempel innebär minskningen av ECAR-värden i både mus och humana neutrofiler efter tillsats av rotenon och antimycin A att ECAR-värdena före tillsatsen av dessa komplexa I- och III-hämmare huvudsakligen beror på CO2-produktion från TCA-cykeln. När det gäller cellinjer är ECAR-värdena konstanta efter tillsats av rotenon och antimycin A, vilket tyder på att ECAR-värdena före tillsatsen beror på glykolys45.

Mitokondriella sjukdomar är kliniska tillstånd som kännetecknas av felaktig OXPHOS. När det gäller neutrofiler är mätningen av OCR låg på grund av ingen cellproliferation, lågt mitokondriellt antal och tidig åldrande56. Vid neurodegenerativa sjukdomar extravaserar neutrofiler till amyloid-β (Aβ) insättningsområden. Aβ42-peptiden utlöser integrinaktivering och snabb neutrofiladhesion57. Under apoptos frisätter neutrofila mitokondrier proapoptotiska proteiner i cytosolen58. Det visas också att neutrofilmigrationshastigheten minskar och kemotaxis avskaffas vid behandling med CCCP9. Detta tyder på den potentiella rollen av mitokondrier och mitokondriell andning i neutrofilfunktionen. Mitokondriella aktiviteter i olika celltyper under många patologiska tillstånd har rapporterats och kopplats till patogenes, såsom Alzheimers5, schizofreni59, kroniska luftvägssjukdomar60, bipolära störningar, sepsis, diabetiker, astma, pulmonell hypertension och sicklecellsjukdom. Nya terapier, såsom att förbättra andningskedjeflödet genom att använda antioxidanter (t.ex.Q10, idebenon, alfa-liponsyra, vitamin C och E) och / eller kofaktorer (t.ex. riboflavin, tiamin) och administrering av mitokondriella substrat såsom L-karnitin, har använts vid behandling av mitokondriella störningar. Dessa behandlingar är dock inte standardiserade och kanske inte är effektiva61. En icke-invasiv standardiserad metodik, såsom användning av metabolisk extracellulär flödesanalysator, för att kvantifiera mitokondriella funktioner i sjukdomsrelevanta celler, såsom neutrofiler, kan fungera som en diagnostisk biomarkör i terapi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar inte något konkurrerande ekonomiskt intresse.

Acknowledgments

Vi erkänner Dr. Anthony T. Vella och Dr. Federica Aglianoin från Institutionen för immunologi vid UConn Health för deras utbildning i att använda den metaboliska extracellulära flödesanalysatorn och Dr. Lynn Puddington vid Institutionen för immunologi vid UConn Health för hennes stöd för instrumenten. Vi erkänner Dr. Geneva Hargis från UConn School of Medicine för hennes hjälp med vetenskapligt skrivande och redigering av detta manuskript. Denna forskning stöddes av bidrag från National Institutes of Health, National Heart, Lung and Blood Institute (R01HL145454), National Institute of General Medical Sciences (R35GM147713 och P20GM139763), en startfond från UConn Health och ett karriäråterinträdesstipendium från American Association of Immunologists.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
37 °C non-CO2 incubator Precision Economy Model 2EG Instrument
Biorender Software Application
Centrifuge Eppendorf Model 5810R Instrument
Corning Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive Corning 102416-100 Reagent
EasySep Magnet STEMCELL 18000 Magnet
EasySepMouse Neutrophil Enrichment kit STEMCELL 19762A Reagents
Graphpad Prism 9 Software Application
Human Serum Albumin Solution (25%) GeminiBio 800-120 Reagents
Ketamine (VetaKet) DAILYMED NDC 59399-114-10 Anesthetic
PBS Cytiva SH30256.01 Reagents
Plate buckets Eppendorf UL155 Accessory
PolymorphPrep PROGEN 1895 (previous 1114683) polysaccharide solution
Purified mouse anti-human CD18 antibody Biolegend 302102 Clone TS1/18
RPMI 1640 Medium Gibco 11-875-093 Reagents
Seahorse metabolic extracellular flux analyzer Agilent XFe96 Instrument
Seahorse XF Cell Mito Stress Test Kit Agilent 103015-100 mitochondrial stress test Kit
Swing-bucket rotor Eppendorf A-4-62 Rotor
Vactrap 2 Vacum Trap Fox Lifesciences 3052101-FLS Instrument
Wave Software Application
XF 1.0 M Glucose Solution Agilent 103577-100 Reagent
XF 100 mM Pyruvate Solution Agilent 103578-100 Reagent
XF 200 mM Glutamine Solution Agilent 103579-100 Reagent
XF DMEM medium Agilent 103575-100 Reagent
XFe96 FluxPak Agilent 102601-100 Material
Xylazine (AnaSed Injection) DAILYMED NDC 59399-110-20 Anesthetic

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Demine, S., Renard, P., Arnould, T. Mitochondrial uncoupling: a key controller of biological processes in physiology and diseases. Cells. 8 (8), 795 (2019).
  2. Noguchi, M., Kasahara, A. Mitochondrial dynamics coordinate cell differentiation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 500 (1), 59-64 (2018).
  3. Zhu, L., et al. Correlation between mitochondrial dysfunction, cardiovascular diseases, and traditional Chinese medicine. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2020, e2902136 (2020).
  4. Kaarniranta, K., et al. Mechanisms of mitochondrial dysfunction and their impact on age-related macular degeneration. Progress in Retinal and Eye Research. 79, 100858 (2020).
  5. Onyango, I. G., Khan, S. M., Bennett, J. P. Mitochondria in the pathophysiology of Alzheimer's and Parkinson's diseases. Frontiers in Bioscience. 22 (5), 854-872 (2017).
  6. Loiseau, D., et al. Mitochondrial coupling defect in Charcot-Marie-Tooth type 2A disease. Annals of Neurology. 61 (4), 315-323 (2007).
  7. Zucker-Franklin, D. Electron microscopic studies of human granulocytes: structural variations related to function. Seminars in Hematology. 5 (2), 109-133 (1968).
  8. Karnovsky, M. L. The metabolism of leukocytes. Seminars in Hematology. 5 (2), 156-165 (1968).
  9. Bao, Y., et al. mTOR and differential activation of mitochondria orchestrate neutrophil chemotaxis. The Journal of Cell Biology. 210 (7), 1153-1164 (2015).
  10. Fossati, G., et al. The mitochondrial network of human neutrophils: role in chemotaxis, phagocytosis, respiratory burst activation, and commitment to apoptosis. Journal of Immunology. 170 (4), 1964-1972 (2003).
  11. Pryde, J. G., Walker, A., Rossi, A. G., Hannah, S., Haslett, C. Temperature-dependent arrest of neutrophil apoptosis. Failure of Bax insertion into mitochondria at 15 degrees C prevents the release of cytochrome c. The Journal of Biological Chemistry. 275 (43), 33574-33584 (2000).
  12. Maianski, N. A., Mul, F. P. J., van Buul, J. D., Roos, D., Kuijpers, T. W. Granulocyte colony-stimulating factor inhibits the mitochondria-dependent activation of caspase-3 in neutrophils. Blood. 99 (2), 672-679 (2002).
  13. Bao, Y., et al. Mitochondria regulate neutrophil activation by generating ATP for autocrine purinergic signaling. The Journal of Biological Chemistry. 289 (39), 26794-26803 (2014).
  14. Chouchani, E. T., et al. Ischaemic accumulation of succinate controls reperfusion injury through mitochondrial ROS. Nature. 515 (7527), 431-435 (2014).
  15. Hayashi, G., Cortopassi, G. Oxidative stress in inherited mitochondrial diseases. Free Radical Biology and Medicine. 88, 10-17 (2015).
  16. Mailloux, R. J. An update on mitochondrial reactive oxygen species production. Antioxidants. 9 (6), 472 (2020).
  17. Abuaita, B. H., et al. The IRE1α stress signaling axis is a key regulator of neutrophil antimicrobial effector function. Journal of Immunology. 207 (1), 210-220 (2021).
  18. Lood, C., et al. Neutrophil extracellular traps enriched in oxidized mitochondrial DNA are interferogenic and contribute to lupus-like disease. Nature Medicine. 22 (2), 146-153 (2016).
  19. Douda, D. N., Khan, M. A., Grasemann, H., Palaniyar, N. SK3 channel and mitochondrial ROS mediate NADPH oxidase-independent NETosis induced by calcium influx. Proceedings of the National Academy of Sciencesa. 112 (9), 2817-2822 (2015).
  20. Monteith, A. J., et al. Altered mitochondrial homeostasis during systemic lupus erythematosus impairs neutrophil extracellular trap formation rendering neutrophils ineffective at combating Staphylococcus aureus. Journal of Immunology. 208 (2), 454-463 (2022).
  21. Monteith, A. J., Miller, J. M., Beavers, W. N., Juttukonda, L. J., Skaar, E. P. Increased dietary manganese impairs neutrophil extracellular trap formation rendering neutrophils ineffective at combating Staphylococcus aureus. Infection and Immunity. 90 (3), 0068521 (2022).
  22. Monteith, A. J., et al. Mitochondrial calcium uniporter affects neutrophil bactericidal activity during Staphylococcus aureus infection. Infection and Immunity. 90 (2), 0055121 (2022).
  23. Cao, Z., et al. Roles of mitochondria in neutrophils. Frontiers in Immunology. 13, 934444 (2022).
  24. Papayannopoulos, V., Metzler, K. D., Hakkim, A., Zychlinsky, A. Neutrophil elastase and myeloperoxidase regulate the formation of neutrophil extracellular traps. The Journal of Cell Biology. 191 (3), 677-691 (2010).
  25. Fan, Z., Ley, K. Developing neutrophils must eat…themselves. Immunity. 47 (3), 393-395 (2017).
  26. Riffelmacher, T., et al. Autophagy-dependent generation of free fatty acids is critical for normal neutrophil differentiation. Immunity. 47 (3), 466-480 (2017).
  27. Amend, S. R., Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. Murine hind limb long bone dissection and bone marrow isolation. Journal of Visualized Experiments. (110), e53936 (2016).
  28. Swamydas, M., Isolation Lionakis, M. S. purification and labeling of mouse bone marrow neutrophils for functional studies and adoptive transfer experiments. Journal of Visualized Experiments. (77), e50586 (2013).
  29. Gerner, M. C., et al. Packed red blood cells inhibit T-cell activation via ROS-dependent signaling pathways. The Journal of Biological Chemistry. 296, 100487 (2021).
  30. Zhang, Z. -W., et al. Red blood cell extrudes nucleus and mitochondria against oxidative stress. IUBMB Life. 63 (7), 560-565 (2011).
  31. Kuhns, D. B., Priel, D. A. L., Chu, J., Zarember, K. A. Isolation and functional analysis of human neutrophils. Current Protocols in Immunology. 111, 1-16 (2015).
  32. Hearne, A., Chen, H., Monarchino, A., Wiseman, J. S. Oligomycin-induced proton uncoupling. Toxicology In Vitro. 67, 104907 (2020).
  33. Plitzko, B., Loesgen, S. Measurement of oxygen consumption rate (OCR) and extracellular acidification rate (ECAR) in culture cells for assessment of the energy metabolism. Bio-Protocol. 8 (10), e2850 (2018).
  34. Nath, S. The molecular mechanism of ATP synthesis by F1F0-ATP synthase: a scrutiny of the major possibilities. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 74, 65-98 (2002).
  35. Heinz, S., et al. Mechanistic investigations of the mitochondrial complex I inhibitor rotenone in the context of pharmacological and safety evaluation. Scientific Reports. 7 (1), 45465 (2017).
  36. Hytti, M., et al. Antimycin A-induced mitochondrial damage causes human RPE cell death despite activation of autophagy. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2019, 1583656 (2019).
  37. Malecki, M., Kamrad, S., Ralser, M., Bähler, J. Mitochondrial respiration is required to provide amino acids during fermentative proliferation of fission yeast. EMBO Reports. 21 (11), e50845 (2020).
  38. Divakaruni, A. S., Paradyse, A., Ferrick, D. A., Murphy, A. N., Jastroch, M. Analysis and interpretation of microplate-based oxygen consumption and pH data. Methods in Enzymology. 547, 309-354 (2014).
  39. Marchetti, P., Fovez, Q., Germain, N., Khamari, R., Kluza, J. Mitochondrial spare respiratory capacity: Mechanisms, regulation, and significance in non-transformed and cancer cells. The FASEB Journal. 34 (10), 13106-13124 (2020).
  40. Nicholas, D., et al. Advances in the quantification of mitochondrial function in primary human immune cells through extracellular flux analysis. PLoS One. 12 (2), e0170975 (2017).
  41. Tur, J., et al. Mitofusin 2 in macrophages links mitochondrial ROS production, cytokine release, phagocytosis, autophagy, and bactericidal activity. Cell Reports. 32 (8), 108079 (2020).
  42. Benz, R., McLaughlin, S. The molecular mechanism of action of the proton ionophore FCCP (carbonylcyanide p-trifluoromethoxyphenylhydrazone). Biophysical Journal. 41 (3), 381-398 (1983).
  43. Wettmarshausen, J., Perocchi, F. Assessing calcium-stimulated mitochondrial bioenergetics using the seahorse XF96 analyzer. Methods in Molecular Biology. 1925, 197-222 (2019).
  44. Forkink, M., et al. Mitochondrial hyperpolarization during chronic complex I inhibition is sustained by low activity of complex II, III, IV and V. Biochimica et Biophysica Acta. 1837 (8), 1247-1256 (2014).
  45. Methods for Reducing Cell Growth Edge Effects in Agilent Seahorse XF Cell Culture Microplates. , Available from: https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/user-manual-methods-for-reducing-cell-growth-edge-effect-cell-analysis-5994-0240en-agilent.pdf (2019).
  46. Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays. Journal of Biomolecular Screening. 8 (5), 566-570 (2003).
  47. Wu, D., Yotnda, P. Induction and testing of hypoxia in cell culture. Journal of Visualized Experiments. (54), e2899 (2011).
  48. Normalisation of Seahorse XFe96 metabolic assaysto cell number with Hoechst stain using well-scan mode on the CLARIOstar Plus. BMG Labtech. , Available from: https://www.bmglabtech.com/cn/normalisation-of-seahorse-xfe96-metabolic-assays-to-cell-number-with-hoechst-stain/ (2020).
  49. Yetkin-Arik, B., et al. The role of glycolysis and mitochondrial respiration in the formation and functioning of endothelial tip cells during angiogenesis. Scientific Reports. 9 (1), 12608 (2019).
  50. Jastroch, M., Divakaruni, A. S., Mookerjee, S., Treberg, J. R., Brand, M. D. Mitochondrial proton and electron leaks. Essays in Biochemistry. 47, 53-67 (2010).
  51. Jandl, R. C., et al. Termination of the respiratory burst in human neutrophils. The Journal of Clinical Investigation. 61 (5), 1176-1185 (1978).
  52. Azevedo, E. P., et al. A metabolic shift toward pentose phosphate pathway is necessary for amyloid fibril- and phorbol 12-myristate 13-acetate-induced neutrophil extracellular trap (NET) formation. The Journal of Biological Chemistry. 290 (36), 22174-22183 (2015).
  53. Six, E., et al. AK2 deficiency compromises the mitochondrial energy metabolism required for differentiation of human neutrophil and lymphoid lineages. Cell Death & Disease. 6 (8), e1856 (2015).
  54. Kumar, S., Dikshit, M. Metabolic insight of neutrophils in health and disease. Frontiers in Immunology. 10, 2099 (2019).
  55. Rodríguez-Espinosa, O., Rojas-Espinosa, O., Moreno-Altamirano, M. M. B., López-Villegas, E. O., Sánchez-García, F. J. Metabolic requirements for neutrophil extracellular traps formation. Immunology. 145 (2), 213-224 (2015).
  56. Invernizzi, F., et al. Microscale oxygraphy reveals OXPHOS impairment in MRC mutant cells. Mitochondrion. 12 (2), 328-335 (2012).
  57. Zenaro, E., et al. Neutrophils promote Alzheimer's disease-like pathology and cognitive decline via LFA-1 integrin. Nature Medicine. 21 (8), 880-886 (2015).
  58. Maianski, N. A., et al. Functional characterization of mitochondria in neutrophils: a role restricted to apoptosis. Cell Death and Differentiation. 11 (2), 143-153 (2004).
  59. Bergman, O., Ben-Shachar, D. Mitochondrial oxidative phosphorylation system (OXPHOS) deficits in schizophrenia. Canadian Journal of Psychiatry. 61 (8), 457-469 (2016).
  60. Zhou, W., Qu, J., Xie, S., Sun, Y., Yao, H. Mitochondrial dysfunction in chronic respiratory diseases: implications for the pathogenesis and potential therapeutics. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2021, 5188306 (2021).
  61. Hirano, M., Emmanuele, V., Quinzii, C. M. Emerging therapies for mitochondrial diseases. Essays in Biochemistry. 62 (3), 467-481 (2018).

Tags

Immunologi och infektion utgåva 196
Realtidsmätning av den mitokondriella bioenergetiska profilen för neutrofiler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pulikkot, S., Zhao, M., Fan, Z.… More

Pulikkot, S., Zhao, M., Fan, Z. Real-Time Measurement of the Mitochondrial Bioenergetic Profile of Neutrophils. J. Vis. Exp. (196), e64971, doi:10.3791/64971 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter