Summary
Denne protokol beskriver, hvordan man bruger en FeCl3-medieret skade til at inducere arteriel trombose, og hvordan man indsamler og forbereder arterielle skadeprøver på forskellige stadier af trombose til elektronmikroskopianalyse.
Abstract
Hjerte-kar-sygdomme er en førende årsag til dødelighed og sygelighed på verdensplan. Afvigende trombose er et fælles træk ved systemiske tilstande som diabetes og fedme og kroniske inflammatoriske sygdomme som aterosklerose, kræft og autoimmune sygdomme. Ved vaskulær skade virker normalt koagulationssystemet, blodpladerne og endotelet på en orkestreret måde for at forhindre blødning ved at danne en blodprop på skadestedet. Abnormiteter i denne proces fører til enten overdreven blødning eller ukontrolleret trombose/utilstrækkelig antitrombotisk aktivitet, hvilket udmønter sig i karokklusion og dens følgevirkninger. FeCl 3-induceret carotisskademodel er et værdifuldt værktøj til at undersøge, hvordan trombose initierer og udvikler sig in vivo. Denne model involverer endotelskader / denudation og efterfølgende koagulationsdannelse på det skadede sted. Det giver et meget følsomt, kvantitativt assay til overvågning af vaskulær skade og koagulationsdannelse som reaktion på forskellige grader af vaskulær skade. Når den er optimeret, kan denne standardteknik bruges til at studere de molekylære mekanismer, der ligger til grund for trombose, såvel som de ultrastrukturelle ændringer i blodplader i en voksende trombose. Dette assay er også nyttigt til at studere effekten af antitrombotiske og antiplatelet midler. Denne artikel forklarer, hvordan man initierer og overvåger FeCl 3-induceret arteriel trombose, og hvordan man indsamler prøver til analyse ved elektronmikroskopi.
Introduction
Trombose er dannelsen af en blodprop, der helt eller delvis blokerer et blodkar, hvilket hæmmer blodets naturlige strømning. Dette fører til alvorlige og dødelige kardiovaskulære hændelser, såsom iskæmisk hjertesygdom og slagtilfælde. Hjerte-kar-sygdomme er den hyppigste årsag til sygelighed og dødelighed og forårsager et ud af fire dødsfald på verdensplan 1,2,3. Selvom trombose manifesteres som en funktionsfejl i vaskulærsystemet, kan det være et resultat af en underliggende mikrobiel eller viral infektion, immunforstyrrelse, malignitet eller metabolisk tilstand. Blodstrømmen opretholdes af den komplekse interaktion mellem forskellige komponenter i vaskulærsystemet, herunder endotelceller, røde / hvide blodlegemer, blodplader og koagulationsfaktorer4. Ved vaskulær skade interagerer blodplader med klæbende proteiner på subendotelmatrixen og frigiver deres granulære indhold, som rekrutterer flere blodplader5. Samtidig aktiveres koagulationskaskaden, hvilket fører til fibrindannelse og aflejring. I sidste ende dannes en blodprop, der indeholder blodplader og røde blodlegemer fanget i et fibrinnet6. Selvom antiplatelet og antikoagulerende lægemidler er tilgængelige for at modulere trombose, er falsk blødning fortsat et stort problem med disse terapier, hvilket kræver finjustering af doser og kombinationer af disse lægemidler. Der er således stadig et presserende behov for at opdage nye antitrombotiske lægemidler7.
Trombose undersøges ved hjælp af flere metoder til at påføre vaskulær skade: mekanisk (karligering), termisk (laserskade) og kemisk skade (FeCl3 / Rose Bengal applikation). Trombosens art varierer afhængigt af placeringen (arteriel vs. venøs), metode eller omfang af skaden. Blandt alle disse typer er FeCl 3-induceret vaskulær skade den mest anvendte metode. Det har været anvendt i mus, rotter, kaniner, marsvin og hunde 8,9,10,11,12. Metoden er relativt enkel, nem at bruge, og hvis vigtige parametre er standardiserede, er den følsom og reproducerbar i forskellige vaskulære systemer (fx arterier [carotis og lårben], vener [jugular] og arterioler [cremaster og mesenteric]) (supplerende tabel 1).
Denne model kan også bruges til at fremme vores forståelse af koagulationsdannelsens mekanik og morfologi. Denne teknik giver unikt fordelen ved at stoppe trombose ved forskellige strømningshastighedspunkter for at studere de mellemliggende stadier af processen, før den bliver okklusiv. Nylige fremskridt inden for tromboseforskning har brugt denne model til at fokusere opmærksomheden på ikke-farmakologiske metoder til trombolyse13 eller ikke-invasiv levering af antitrombotiske og / eller fibrinolytiske midler14,15. Flere grupper har vist, at når blodplademembraner er belagt med disse behandlinger, kan lægemidlerne aktiveres ved termisk stimulering for at målrette blodpropper16. De teknikker, der er beskrevet her, kan være nyttige for sådanne undersøgelser som validering af deres resultater på enkelt blodpladeniveau. I dette manuskript beskriver protokol 1 den grundlæggende FeCl3-medierede vaskulære skadeprocedure, mens protokol 2 beskriver metoden til indsamling og fiksering af den vaskulære skadeprøve til yderligere analyse ved elektronmikroskopi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimenter, der diskuteres her, blev gennemgået og godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved University of Kentucky.
BEMÆRK: Kirurgiske instrumenter er anført i figur 1 og materialetabellen. C57BL/6J mus, 8-10 uger gamle, han/hun eller relevante genetisk manipulerede (Knockout eller Knockin) stammer blev anvendt.
1. FeCl 3-induceret halspulsåreskade
- Induktion af musebedøvelse
- Vej musen.
- Bedøv musen ved at injicere 0,2 g / kg tribromethanolopløsning intraperitonealt (i.p.). Sørg for, at bedøvelsesopløsningen er ved stuetemperatur (RT), før du injicerer den. Denne dosis er tilstrækkelig til at berolige musen i ca. 1 time.
- Kontroller tårefleksen ved at klemme tåen 5 minutter efter injektion for at sikre, at musen er bedøvet. Hvis musen ikke er bedøvet, trækker den tåen væk. Hvis det sker, skal du vente 5 minutter og tjekke igen.
- Hvis musen stadig ikke er helt bedøvet, skal du administrere 1/4 af den indledende dosis og vente i 5 minutter.
- Under hele proceduren skal du regelmæssigt overvåge musens bedøvelsesplan via en tåklemme. Derudover kan respirationshastighed og kropstemperatur også overvåges for at opretholde optimal anæstesi.
- Immobiliser musen
- Læg musen på varmepuden (37 °C) i liggende stilling, og brug tape til at immobilisere ekstremiteterne.
- Brug en kirurgisk tråd (0,1 mm) til forsigtigt at trække i musens øverste fortænder for at udvide livmoderhals-/halsregionen. Dette er vigtigt for bedre visualisering af det kirurgiske område og stabiliteten af Doppler-sonden. Trådstørrelsen er ikke vigtig, da den kun bruges til at trække dyrets fortænder for at forlænge nakken.
- Indsnit
- Sprøjt det kirurgiske område med 70% ethanol eller tør det af med en alkoholserviet.
- Brug en vatpind til at anvende en lille mængde hårfjerningscreme på det kirurgiske område. Vent i 1-2 min, og brug derefter et vådt køkkenrulle eller servietter til at fjerne cremen.
BEMÆRK: Dette trin er vigtigt for et rent kirurgisk område. - Brug saks og tang (figur 1B11,1B13) til at lave et midterlinjesnit fra underkæben til det suprasternale hak. Træk huden tilbage for at opnå en bedre visualisering af området (figur 2A).
- Eksponering af halspulsåren
- Brug kirurgiske tang og mikrodissekerende tang til stump dissekering af den overliggende overfladiske fascia og fjern den for at udsætte venstre halspulsåre (figur 1B12,1B13). Sørg for ikke at bruge saks på dette tidspunkt for at undgå at skade anden vaskulatur i dette område.
- Fjern ekstra væv omkring halspulsåren. Undgå overdreven dissektion af det omgivende væv, da dette område har vagusnerven og hvirvelarterien.
- Adskil halspulsåren fra omgivende væv ved at dissekere det med kirurgiske og suturbindende tang (figur 1B12,1B15,2C). Sørg for ikke at forlænge eller trække arterien for at undgå mekanisk skade på arterien eller den omgivende vaskulatur.
- Placer et stykke plast under arterien for at markere placeringen af skaden (figur 2D). Brug et farvet gennemsigtighedsark for at gøre det lettere at se på det kirurgiske område.
- Placering af flowsonden
- Anbring Doppler transonic flow sonden i saltopløsning (0,9% NaCl i dH2O) i ca. 10 minutter før operationen. Indsæt den anden ende af sonden i en fastgørelse i flowmåleren for at lette aflæsningen af flowet. Tilslut flowmåleren til en computer.
BEMÆRK: Mellem operationerne skal Doppler transonic flow sonden være i saltvand. Sørg for at holde sonden fugtig og ren under hele proceduren. - Placer ultralyd Doppler transonic flow sonde omkring arterien opstrøms for plasten (figur 2D). Sørg for, at sondens fartøjsholderområde ikke er for udvidet (figur 1C, rød pil).
BEMÆRK: Understøt om nødvendigt sonden med gazebind (figur 1B1) for at opnå en passende højde på sonden, hvilket letter den optimale læseposition. - Hvis det kirurgiske område er tørt på dette tidspunkt, skal du tilføje et par dråber RT-saltvand for at holde området fugtigt. Overvåg flowsondeaflæsningen. Den optimale aflæsning varierer for hvert dyr og kan være hvor som helst mellem 0,6-1,2 ml / min. Hvis den er mindre eller ikke stabil, skal du ændre flowsondens position for at få en optimal aflæsning.
BEMÆRK: Sørg for, at musens hals ikke er for udstrakt, og at det kirurgiske område er rent.
- Anbring Doppler transonic flow sonden i saltopløsning (0,9% NaCl i dH2O) i ca. 10 minutter før operationen. Indsæt den anden ende af sonden i en fastgørelse i flowmåleren for at lette aflæsningen af flowet. Tilslut flowmåleren til en computer.
- Registrere flowets oprindelige plan
- Efter placering af sonden skal du overvåge blodgennemstrømningen i 2 minutter for at sikre, at strømmen er stabil. Registrer derefter flowet i 2 min (figur 3B) som en basislinje. For en detaljeret beskrivelse af flowmåleren henvises til Subramaniam et al.17.
- For at registrere blodgennemstrømningen skal du starte WinDAQ-softwaren. Klik på indstillingen Filer, og klik derefter på Optag. Opret en ny mappe og fil, og start optagelsen. For at stoppe optagelsen skal du klikke på Stop i filafsnittet.
BEMÆRK: WinDAQ-software er frit tilgængelig fra udgiveren: https://www.dataq.com/products/windaq/.
- Skade
- Stop optagelsen af flowet. Sørg for ikke at ændre sondepositionen, så aflæsningerne forbliver konsistente efter skaden.
- Tør området grundigt med en aftørring / køkkenrulle.
BEMÆRK: Selv en lille mængde resterende væske kan ændre koncentrationen afFeCl3-opløsning, der anvendes til at påføre vaskulær skade. Dette fører til variable resultater og påvirker reproducerbarheden. Når området er helt tørt, er sonden ikke i stand til at måle strømmen. - I en plastvejebåd skal du lægge et cirkulært filterpapir (1 mm diameter, skåret med en ørestans på 1 mm i diameter). Der tilsættes 1 μL 6%FeCl3-opløsning (fremstillet idH2O) på filtrerpapiret.
BEMÆRK: Sørg for at tilføje FeCl3-opløsning, lige før du bruger filterpapiret. Iblødsætning af papiret for tidligt kan føre til fordampning afFeCl3-opløsning og ændre skadens sværhedsgrad. - Brug fine tang til at samle filterpapiret op og læg det på arterien opstrøms for sonden på den del af arterien, der er markeret af plasten (figur 2D, E). Denne plastik fungerer som en markør og en afstandsstykke. Det markerer det skadede område og forhindrer utilsigtet fortynding afFeCl3 ved at undgå kontakt med det omgivende fugtige område.
BEMÆRK: Sørg for, at filterpapiret er lige, ikke klemt eller på anden måde foldet på nogen måde. Når det er placeret på arterien, må du ikke ændre filterpapirets position; Dette ændrer skadens omfang. - Når du har placeret filterpapiret, skal du starte timeren og registrere blodgennemstrømningen. Efter 3 minutter fjernes papiret og tilsættes saltvand på skadestedet for at fjerneFeCl3 og stoppe skadeprocessen. Det gør også området fugtigt. På dette stadium skal blodgennemstrømningen vende tilbage til baseline-niveauet som registreret før skaden.
- Overvåg og optag flowet, indtil det reduceres til 10% af den originale optagelse eller når nul. Der er et støt fald, når tromben begynder at danne sig på skadestedet (figur 3C). Bemærk eventuelle betydelige udsving i flowet i løbet af denne periode.
- For at studere trombens stabilitet skal du registrere den hurtige stigning i blodgennemstrømningen efter hvert signifikant og konsekvent fald. Disse hændelser klassificeres som embolisering på grund af ustabil trombose (figur 4D). Efter det konsekvente fald i flowet er operatøren i stand til at se skaden på arterien ved afslutningen af eksperimentet (figur 2F, blå pil / stiplet oval).
- Karets okklusionstid defineres som fuldstændig ophør af blodgennemstrømningen i mindst 1 min. Optag det tidspunkt, hvor en okklusiv trombose dannes, som vist ved nulaflæsningen eller signifikant fald i strømmen.
- Afslut eksperimentet efter 30 min. Hvis tromben ikke dannes inden for 30 minutter efter overvågning, skal du registrere strømmen, stoppe optagelsen og fjerne sonden.
- Rengør sonden med 70% ethanol og en børste for at fjerne eventuelt resterende væv/hår eller snavs. Tør sonden helt, inden du lægger den i opbevaringsboksen. Tør sonden helt, inden du lægger den i opbevaringsboksen til langtidsopbevaring.
- Aflive musen ved cervikal dislokation. Placer slagtekroppen i slagtekroppens bortskaffelsespose, mærket med laboratoriets navn og datoen.
2. Indsamling og forberedelse af prøver til serielle blok ansigtsscanning elektronmikroskopi (SBF-SEM) undersøgelser efter FeCl 3-induceret skade
BEMÆRK: Den præsenterede EM-protokol er egnet til prøveforberedelse til SBF-SEM. Denne billeddannelsesteknik giver en hidtil uset evne til at studere den tredimensionelle struktur af blodplader i en blodprop. Med denne teknik visualiseres prøven som en række sekventielle blok SEM-billeder, der genereres, når man skrider frem gennem prøven. Nøglepunkter for dette præparat er: 1) prøven skal farves med tungmetaller forindlejret; og 2) den indlejrede plastprøve skal trimmes hensigtsmæssigt til montering i SEM (se figur 6 for et billede af trimmede prøver). Farvning efter indlejring er ikke mulig inden for SEM. Når der indsamles en prøve fra en FeCl 3-induceret karskade til EM-analyse, skal følgende ændringer foretages under udførelsen af operationen. Ændringerne iFeCl3-operationsprotokollen, der præsenteres, gælder også for enhver form for elektronmikroskopi. Anæstesibetingelser og trinene til at lave et snit og udsætte halspulsåren er de samme som i protokol 1.
- Efter at have udsat halspulsåren, skal du markere skadestedet ved løst at omkranse regionen mellem to kirurgiske tråde (størrelse: 0,1 mm) (figur 5A, B).
- Placer sonden under arterien, distal fra den nederste tråd (figur 5C).
- Indsæt plaststykket under arterien mellem de to tråde for at markere stedet forFeCl3-skade (figur 5C).
- Tag flowmålinger, før du udfører skade for at notere basalstrømmen. Disse målinger bruges til at bestemme, på hvilket stadium prøven skal indsamles.
BEMÆRK: Sørg for, at fikseringsmidlet (3% paraformaldehyd/PFA + 0,1% glutaraldehyd, begge fremstillet i 1x PBS) er klar og ved RT. Alternativt kan fiksering med 2,5% glutaraldehyd i en saltholdig baggrund også anvendes.
FORSIGTIG: Både paraformaldehyd og glutaraldehyd er meget giftige og irriterende. Under håndtering af dem skal handsker, et øjenskærm og masker bruges til at beskytte mod eksponering. Alle fikseringsopløsninger er giftige, og fikseringstrin skal udføres i en stinkhætte. - Udfør skaden ved at placere FeCl 3-gennemblødt filterpapir på arterien (8%FeCl3 anvendes) i3 minutter (denne tid kan også variere). Efter 3 minutter fjernes filterpapiret, og der tilsættes saltvand på skadestedet for at fjerne eventuelle overskydende resterendeFeCl3. Dette trin er nødvendigt for at forhindre skadens varierende omfang og for at lette sondens flowtælling (figur 5D).
- Overvåg flowaflæsningen. Når strømmen falder til under 50% af den oprindelige værdi, skal du fjerne sonden. Tør hurtigt området og tilsæt fikseringsmidlet i området for eksternt at rette skadeområdet.
- Hold straks arterien nær skadeområdet med tang, og skær nedstrøms for den nederste tråd og opstrøms for den øverste tråd. Bed om nødvendigt en anden person om at hjælpe med at skære den ene ende. Sæt vævet på plastvævskulturskålen i samme retning som det blev opsamlet, og tilsæt et par dråber af fikseringsmidlet.
BEMÆRK: Skæring af arterien forårsager øjeblikkelig omfattende blødning, så sørg for at holde arterien, før du skærer den første gang. I dette scenarie ekssanguineres musen. Musen aflives ved ekssanguination og cervikal dislokation. - Brug en skalpel til at rense det ekstra væv omkring arterien. Vær opmærksom på at registrere orienteringen af blodgennemstrømningen. For at markere dette skal du skære den ene ende vandret og den anden tilspidset/skrå (figur 5E).
- Opbevar prøven i fikseringsmiddel (3% PFA og 0,1% glutaraldehyd) i 1 time ved RT. Derefter opbevares prøven i 1% PFA ved 4 °C, indtil den sendes på våd is til prøvebehandlingslaboratoriet til EM-analyse.
BEMÆRK: Prøverne må ikke fryses. Udfordringerne for denne metode til prøveindsamling er:- Den indledende aflæsning er muligvis ikke optimal eller kan svinge efter skaden. Dette kan påvirke omfanget af skade, der vælges at arrestere til EM-analyse. For at løse dette problem skal du sørge for at registrere baselineaflæsningen i et par minutter efter at have prøvet forskellige positioner for at placere sonden for at afgøre, hvilken position der er optimal.
- Tiden til at standse skaden ved at tilføje ekstern fiksativ og faktisk skæring af arteriesektionen til analyse kan tilføje variabilitet i omfanget af trombose. Vær hurtig under prøveopsamling efter ekstern fastgørelse.
- Modtag prøverne til behandling til EM-analyse i 1% PFA på våd is. Skyl prøverne i 3 minutter på is med 0,1 M cacodylatbuffer for at starte yderligere behandling.
- Prøverne fastgøres i 1 time på is i 0,1 M cacodylatbuffer + 2,5% glutaraldehyd + 2 mM CaCl2.
- Det fikserende middel kasseres, og prøverne vaskes med en kold 0,1 M natriumcacodylatbuffer indeholdende 2 mMCaCl2 (5 x 3 min) (figur 6A).
- Prøverne fastgøres med osmiumopløsning (3% kaliumferrocyanid [K4C6N6Fe]+ 0,3 M cacodylatbuffer + 4 mMCaCl2 blandet med et tilsvarende volumen 4% vandig osmiumtetroxid [OsO4; iddH2O]) i 1 time på is.
- Mens prøverne fikserer, fremstilles frisk 1% trichloracetaldehydhydratopløsning (TCH) i ddH2O. Opløsningen inkuberes ved 60 °C i 1 time, mens den blandes forsigtigt.
- Efter fiksering vaskes prøverne med ddH2O ved RT i 5 x 3 min.
- Inkuber prøverne i filtreret 1% TCH-opløsning (fremstillet i ddH2O) i 20 minutter ved RT.
- Prøverne vaskes med ddH2O ved RT (5 x 3 min).
- Prøverne fastgøres i 2% osmiumtetroxid i ddH2O i 30 minutter ved RT.
- Prøverne vaskes med ddH2O ved RT i 5 x 3 minutter hver.
- Prøverne anbringes i 1 % uranylacetat (vandigt) og inkuberes natten over ved 4 °C.
- Vask prøverne med ddH2O ved RT i 5 x 3 minutter hver, og behandl dem med en bloc Waltons blyaspartatfarvning.
- En bloc Waltons bly aspartat farvning3:
- Der fremstilles 30 mM L-asparaginsyreopløsning iddH2O.
BEMÆRK: Asparaginsyren opløses hurtigere, hvis pH hæves til 3,8. Denne stamopløsning er stabil i 1-2 måneder, hvis den opbevares nedkølet. - Lav 20 mM blynitratopløsning i 10 ml asparaginsyrestamme, og juster pH til 5,5 med 1 N KOH.
- Prøverne anbringes i bly-aspartatopløsning ved 60 °C i 30 minutter efter fem vaske med ddH2O ved RT i hver 3 minutter.
- Der fremstilles 30 mM L-asparaginsyreopløsning iddH2O.
- Dehydrerer prøverne med en sorteret ethanolserie. Brug den kemiske dehydrering i henhold til Valdivia protokol18.
- Prøverne vaskes i hver af følgende opløsninger for gradvis at dehydrere prøven (figur 6B):
25% ethylalkohol i 3 min
50% ethylalkohol i 3 min
75% ethylalkohol i 3 min
95% ethylalkohol i 3 min
100% ethylalkohol i 10 min, og gentag trinnet to gange (i alt tre vaske).
- Prøverne vaskes i hver af følgende opløsninger for gradvis at dehydrere prøven (figur 6B):
- Prøverne vaskes i 100 % propylenoxid (PO) i 10 minutter, og trinnet gentages to gange (i alt tre vaske).
- Inkuber i 50%/50% PO/harpiks med DMP 30 aktivator natten over ved RT, og indlejr i 100% Araldite 502/embed 812/DDSA med DMP30 aktivator i 48 timer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dataene præsenteres generelt som tid til okklusion eller tid, der kræves for at danne en fuldt okklusiv trombose. Disse data kan plottes som en Kaplan-Meier-overlevelseskurve (figur 4A)19, et prikplot med søjler, der viser den terminale blodgennemstrømning på tidspunktet for enten ophør af blodgennemstrømningen eller afslutning af et eksperiment (figur 4B) eller som et linjediagram (figur 4C). Trombosestabilitet kan studeres ved hjælp af denne teknik. I de fleste tilfælde, vedFeCl3-skade, dannes tromben gradvist, og når den vokser, falder blodgennemstrømningen gradvist og når nul ved fuldstændig okklusion af karret. I nogle tilfælde øges blodgennemstrømningen pludselig efter et gradvist fald i et par minutter. Dette fortolkes som delvis afgivelse af den voksende trombose og kan betragtes som en emboliseringshændelse (figur 4D). Okklusiv trombosemorfologi (figur 7A) kan også undersøges ved hjælp af denne metode.
Tabel 1: Potentielle tekniske udfordringer i FeCl 3-induceret trombosemodel og opløsninger. Klik her for at downloade denne tabel.
Figur 1: Kirurgiske instrumenter, der er nødvendige for at udføre FeCl 3-induceret halspulsåretrombose hos mus. (A) 1: LEICA S8AP0 mikroskop og stativ. 2: Lille dyr opvarmet pude dækket af aluminiumsfolie. B) 1: Gazesvampe. 2: 26 G x 3/8 nål. 3: 1 ml sprøjte. 4: Sterile applikatorer med bomuldsspids. 5: Sort flettet silkesutur. 6: Kirurgisk klinge. 7: Knivhåndtag i rustfrit stål. 8: Kommerciel hårfjerningscreme. 9: Øreslag. 10: Dissekering af saks. 11: Fin saks. 12: Kirurgisk tang. 13: Mikrodissekerende pincet. 14: Øjendressing tang. 15: Suturbindingspincet. (C) Transonisk strømningssonde med det fleksible område (rød pil) og et hak, der holder et fartøj (sort pil). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Kirurgiske trin for at forberede halspulsåren til skade og måle karokklusion. Brug saks og kirurgiske tang til at lave en midterlinjesektion og træk forsigtigt vævet væk (A) for at udsætte halspulsåren under det (B). Den sorte pil viser retningen af blodgennemstrømningen (B). Rens det omgivende væv, der omgiver halspulsåren (C), og læg et stykke plastpapir (gul plast vist med en sort pil) og sonden (D). Beholderen beskadiges ved at placere FeCl3-gennemblødt filterpapir (vist med en rød pil) på arterien (E). Fjern papiret og overvåg skaden. I slutningen er skaden synlig som en gul-hvid stribe, angivet med den blå pilespids (F). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Udlæsning af blodgennemstrømning ved hjælp af flowmåleren. Blodgennemstrømningen i halspulsåren måles ved hjælp af en flowmåler (A). Flowet registreres ved hjælp af en postfunktion under fanen Filer (B). Baseline-flowet skal være relativt konstant, før skaden udføres (ca. 0,8 ml/min, vist med en sort pil) (B). Efter skaden falder blodgennemstrømningen ensartet (ca. 50% fald fra startværdien, ca. 0,4 ml / min), vist med en sort pil (C). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Repræsentative datapræsentationer fra FeCl 3-induceret carotisskademodel. Forskellige tilgængelige metoder til at præsentere data fra FeCl 3-induceret vaskulær skade vises. Kaplan-Meier overlevelseskurver viser tiden til okklusion for hver mus. En log-rank test udføres til statistisk analyse. p ≤ 0,001 (A). Blodgennemstrømningen i slutningen af eksperimentet kunne også repræsenteres i et søjlediagram (B). For de data, der er repræsenteret i B, blev der udført en uparret t-test *** p ≤ 0,001. Fejllinjen repræsenterer middelværdien ± SD. Doppler-flowdata indsamlet efter skade fra et enkelt dyr kunne præsenteres i en linjegraf (C). Eksempel på en potentiel emboliseringshændelse ved den pludselige stigning i blodgennemstrømningen efter et vedvarende gradvist fald i strømmen i en enkelt mus på forskellige tidspunkter (D). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Indsamling af FeCl 3-inducerede skadespropper til elektronmikroskopiundersøgelser. Efter at have udsat en arterie (A), skal du markere skadestedet ved løst at binde trådene (B) og placere plastpapiret under arterien og sonden nedstrøms for den (C). Udfør skaden og overvåg skaden (D). Saml vævet som forklaret i teksten, og rengør og skær prøven lige på den ene side og skråt på den anden side for at vise retningen af blodgennemstrømningen (den sorte pil viser retningen af blodgennemstrømningen og den røde kontur angiver det skadede område) (E). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Efterfikseringsbehandling og montering af prøver til elektronmikroskopi. Prøverne vaskes i mikrocentrifugerør mellem forarbejdningstrin (A) og dehydreres serielt med en øget koncentration af ethanol (B). Efter forarbejdning er de indlejret i harpiks (C), og blokkene markeres med retningen af blodgennemstrømningen (D) og skæres derefter i skiver til billeddannelse. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 7: Repræsentative elektronmikrografier af proksimale og distale regioner af en fuldt okklusiv trombosepost FeCl3-medieret carotisskade. (A) Et komplet tværsnit af en okkluderet arterie, proksimal til skadestedet, med indsatser nedenfor, der viser strukturer ved højere forstørrelse (a: 2x og a': 4x). Det skadede område er angivet med en pil i A. Skalabjælke: 100 μm. (B) Et komplet tværsnit af en okkluderet arterie, distal til skadestedet, med indsatser nedenfor, der viser strukturer ved højere forstørrelse (b: 2x og b': 4x). Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende tabel 1: En kort oversigt over variationer i dyremodeller, FeCl3 skadested,FeCl3 koncentration, skadesmetode og trombosetider. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den topiske anvendelse af FeCl3 til vaskulaturen for at inducere trombose er en meget anvendt teknik og har været medvirkende til at etablere roller for forskellige blodpladereceptorer, ligandsignalveje og deres hæmmere20,21,22,23. Mekanismen, hvorigennemFeCl3 forårsager trombose, er mangefacetteret; Tidligere blev endoteldenudation betragtet som en årsag til trombose, men i de senere år har flere rapporter foreslået rollen som røde blodlegemer og plasmaproteiner i denne proces24,25,26,27.
De mest kritiske trin i denne protokol er: placeringen af Doppler-sonden for at få et optimalt flow, placeringen af filterpapiret og hurtig afslutning af skaden for at hente og straks rette prøven. Konsekvenserne af uheld i disse trin, og hvordan de håndteres, er beskrevet i tabel 1. Selvom den er enkel og følsom, kan denne teknik være udfordrende at anvende, afhængigt af dyremodellen, dyrebaggrund, stedet for vaskulær skade, koncentration af FeCl3,FeCl3 applikationsmetode, anvendelsesvarighed, dyrs alder og køn og type anæstesi, der anvendes. Disse forskelle kan forklare den relativt store vifte af trombosetider i C57BL/6J, der er rapporteret i litteraturen (supplerende tabel 1)27,28,29,30,31,32. Denne protokol foreslår at bruge 8-10 uger gamle mus til eksperimentet, da vaskulaturstørrelsen er lettere at visualisere og operere. Nogle grupper har brugt mus helt ned til 6 uger gamle33 år. Det er bydende nødvendigt at aldersmatche musene for konsekvent og reproducerbar sammenligning mellem forskellige dyregrupper. Den beskrevne anæstesi, tribromethanol, foretrækkes, fordi den er let tilgængelig, er lettere at administrere, den opretholder et bedøvelsesplan i den krævede varighed, og den krævede dosis er reproducerbar. Mange andre bedøvelsesmuligheder er tilgængelige, herunder isofluran og forskellige kombinationer af tribromethanol med tertiær amylalkohol med xylazin og / eller acepromazin. Det er bydende nødvendigt at anvende en optimal dosis for at opnå sedation uden at påvirke dyrets hjertefrekvens eller blodtryk negativt. Brug af den samme metode til anæstesi gennem hele eksperimentet forhindrer potentielle sammensatte virkninger på trombosetiden.
Dette manuskript præsenterer en detaljeret procedure for at minimere datavariationer og øge reproducerbarheden. Der findes en tabel til fejlfinding af nogle få problemer, der kan opstå under denne operation (tabel 1). Derudover foreslår dette manuskript en metode til at indsamle prøver i slutningen af skaden for at studere strukturen og morfologien af en okklusiv trombose (figur 7). Opløsningen af EM giver en bedre visualisering end tidligere muligt25 af blodplader i en voksende thombus, og hvordan de interagerer med andre blodplader og endotelet både proksimalt og distalt af vaskulær skade. Det kan også bruges til at studere forskellige aktiveringsstadier af blodplader på skadestedet.
En anden vigtig fordel ved denne teknik er, at operatøren kan bruge baselineaflæsninger til at bestemme, på hvilket stadium tromboseprøven opsamles. Det skal bemærkes, at disse er omtrentlige tidspunkter og ikke angiver det nøjagtige omfang af skade/trombose. Basalaflæsninger afhænger af sondens optimale placering, og hvis de ikke placeres korrekt, registrerer aflæsningerne muligvis kun delvis strømning. Dette fører til fejlagtig fortolkning af afslutningstiden og derfor morfologien af den indsamlede prøve. Omgående afslutning af skadesprocessen og øjeblikkelig fiksering af prøverne er nødvendig for at opnå konsistente og reproducerbare resultater.
Denne protokol præsenterer de minimale nødvendige indstillinger til evaluering af okklusiv trombose. Med fremskridt inden for mikroskopi har flere grupper brugt denne teknik til fluorescerende mærkning af blodpladerne / endotelcellerne og / eller blodpladefrigivelsen, såsom PF4 og P-Selectin og fibrin, for at visualisere specifikke aspekter af in vivo-trombose og for at bestemme dens kinetik34,35. Som beskrevet kan metoden her rapportere om emboliseringshændelser, hvilket indikerer trombose ustabilitet (figur 4D).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter relateret til denne undersøgelse.
ORCID profiler: S.J.: 0000-0001-6925-2116; S.W.W.: 00000-0001-5577-0473.
Acknowledgments
Forfatterne takker medlemmerne af Whiteheart Laboratory for deres omhyggelige gennemlæsning af dette manuskript. Arbejdet blev støttet af tilskud fra NIH, NHLBI (HL56652, HL138179 og HL150818) og en Department of Veterans Affairs Merit Award til S.W.W., R01 HL 155519 til BS og NIBIB intramural programtilskud til RDL.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% Saline | Fisher Scientific | BP358-212 | NaCl used to make a solution of 0.9% saline |
| 1 mL Syringe | Becton, Dickinson and Company | 309659 | |
| 190 Proof Ethanol | KOPTEC | V1101 | Used to make a 70% ethanol solution to use for prepping the mouse for surgery |
| 2,2,2 Tribromoethanol | Sigma Aldrich | 48402 | |
| 25 Yard Black Braided Silk Suture (5-0) | DEKNATEL | 136082-1204 | |
| 26G x 3/8 Needle | Becton, Dickinson and Company | 305110 | |
| 2-methyl-2-butanol | Sigma Aldrich | 240486 | |
| 7.5 mL Transfer Pipet, Graduated to 3 mL | Globe Scientific Inc. | 135010 | |
| Alcohol Prep Pads (70% Isopropyl Alcohol) | Medline | MDS090735 | |
| Araldite GY 502 | Electron microscopy Services | 10900 | |
| Cell Culture Dish 35mm X 10mm | Corning Incorporated | 430165 | |
| Compact Scale | Ward's Science | 470314-390 | |
| Dissecting Scissors, 12.5 cm long | World Precision Instrument | 15922-G | |
| DMP-30 activator | Electron microscopy Services | 13600 | |
| Dodenyl Succinic Anhydride/ DDSA | Electron microscopy Services | 13700 | |
| Doggy Poo Bags/animal carcass disposal bag | Crown Products | PP-RB-200 | |
| Doppler FlowProbe | Transonic Systems Inc. | MA0.5PSB | |
| EMBED 812 resin | Electron microscopy Services | 14900 | |
| Ethyl Alcohol, anhydrous 200 proof | Electron microscopy Services | 15055 | |
| Eye Dressing Forceps, 4" Full Curved, Standard, 0.8mm Wide Tips | Integra Miltex | 18-784 | |
| Filter Paper | VWR | 28310-106 | |
| Fine Scissors - Sharp-Blunt | Fine Science Tools | 14028-10 | |
| Finger Loop Ear Punches | Fine Science Tools | 24212-01 | |
| Gauze Sponges 2” x 2” – 12 Ply | Dukal Corporation | 2128 | |
| Glutaraldehyde (10% solution) | Electron microscopy Services | 16120 | |
| Integra Miltex Carbon Steel Surgical Blade #10 | Integra® Miltex® | 4110 | |
| Iron (III) Chloride | SIGMA-ALDRICH | 157740-100G | |
| Knife Handle Miltex® Extra Fine Stainless Steel Size 3 | Integra Lifesciences | 157510 | |
| L-aspartic acid | Sigma Fisher | A93100 | |
| L-aspartic acid | Fisher Scientific | BP374-100 | |
| Lead Nitrate | Fisher Scientific | L-62 | |
| LEICA S8AP0 Microscope | LEICA | No longer available | No longer available from the company |
| LEICA S8AP0 Microscope Stand | LEICA | 10447255 | No longer available from the company |
| Light-Duty Tissue Wipers | VWR | 82003-822 | |
| Micro Dissecting Forceps; 1x2 Teeth, Full Curve; 0.8 mm Tip Width; 4" Length | Roboz Surgical Instrument Company | RS-5157 | |
| Osmium Tetroxide 4% aqueous solution | Electron microscopy Services | 19150 | |
| Paraformaldehyde (16% solution) | Electron microscopy Services | 15710 | |
| Potassium ferricyanide | SIGMA-ALDRICH | P-8131 | |
| Propylene Oxide, ACS reagent | Electron microscopy Services | 20401 | |
| Rainin Classic Pipette PR-10 | Rainin | 17008649 | |
| Research Flowmeter | Transonic Systems Inc. | T402B01481 | Model: T402 |
| Scotch Magic Invisible Tape, 3/4" x 1000", Clear | Scotch | 305289 | |
| Small Animal Heated Pad | K&H Manufacturing Inc. | Model: HM10 | |
| Sodium Cacodylate Buffer 0.2M, pH7.4 | Electron microscopy Services | 11623 | |
| Sterile Cotton Tipped Applicators | Puritan Medical Products | 25-806 1WC | |
| Steromaster Illuminator | Fisher Scientific | 12-562-21 | No longer available from the company |
| Surgical Dumont #7 Forceps | Fine Science Tools | 11271-30 | |
| Thiocarbohydrazide (TCH) | SIGMA-ALDRICH | 88535 | |
| Universal Low Retention Pipet Tip Reloads (0.1-10 µL) | VWR | 76323-394 | |
| Uranyl Acetate | Electron microscopy Services | 22400 | |
| Veet Gel Cream Hair Remover | Reckitt Benckiser | 3116875 | |
| White Antistatic Hexagonal Weigh Boats, Medium, 64 x 15 x 19 mm | Fisher Scientific | S38975 | |
| WinDAQ/100 Software for Windows | DATAQ Instruments, Inc. | Version 3.38 | Freely available to download. https://www.dataq.com/products/windaq/ |
| ZEISS AxioCam Icc 1 | ZEISS | 57615 |
References
- Lozano, R., et al. Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010. Lancet. 380 (9859), 2095-2128 (2012).
- Raskob, G. E., et al. Thrombosis: a major contributor to global disease burden. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (11), 2363-2371 (2014).
- Walton, J. Lead aspartate, an en bloc contrast stain particularly useful for ultrastructural enzymology. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 27 (10), 1337-1342 (1979).
- Palta, S., Saroa, R., Palta, A.
- Joshi, S., Whiteheart, S. W. The nuts and bolts of the platelet release reaction. Platelets. 28 (2), 129-137 (2017).
- Periayah, M. H., Halim, A. S., Mat Saad, A. Z. Mechanism action of platelets and crucial blood coagulation pathways in hemostasis. International Journal of Hematology-Oncology and Stem Cell Research. 11 (4), 319-327 (2017).
- Alexopoulos, D., Katogiannis, K., Sfantou, D., Lekakis, J. Combination antiplatelet treatment in coronary artery disease patients: A necessary evil or an overzealous practice. Platelets. 29 (3), 228-237 (2018).
- Kurz, K. D., Main, B. W., Sandusky, G. E. Rat model of arterial thrombosis induced by ferric chloride. Thrombosis Research. 60 (4), 269-280 (1990).
- Denis, C. V., et al. Towards standardization of in vivo thrombosis studies in mice. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 9 (8), 1641-1644 (2011).
- Marsh Lyle, E., et al. Assessment of thrombin inhibitor efficacy in a novel rabbit model of simultaneous arterial and venous thrombosis. Thrombosis and Haemostasis. 79 (3), 656-662 (1998).
- Kato, Y., et al. Inhibition of arterial thrombosis by a protease-activated receptor 1 antagonist, FR171113, in the guinea pig. European Journal of Pharmacology. 473 (2-3), 163-169 (2003).
- Huttinger, A. L., et al. Ferric chloride-induced canine carotid artery thrombosis: a large animal model of vascular injury. Journal of Visualized Experiments. (139), e57981 (2018).
- Zhang, W., et al. Antithrombotic therapy by regulating the ROS-mediated thrombosis microenvironment and specific nonpharmaceutical thrombolysis Using Prussian blue nanodroplets. Small. 18 (15), 2106252 (2022).
- Liu, B., et al. Platelet membrane cloaked nanotubes to accelerate thrombolysis by thrombus clot-targeting and penetration. Small. , 2205260 (2022).
- Refaat, A., et al. Near-infrared light-responsive liposomes for protein delivery: Towards bleeding-free photothermally-assisted thrombolysis. Journal of Controlled Release. 337, 212-223 (2021).
- Li, S., et al. Biomimetic nanoplatelets to target delivery hirudin for site-specific photothermal/photodynamic thrombolysis and preventing venous thrombus formation. Small. 18 (51), 2203184 (2022).
- Subramaniam, S., Kanse, S. M. Ferric chloride-induced arterial thrombosis in mice. Current Protocols in Mouse Biology. 4 (4), 151-164 (2014).
- Cocchiaro, J. L., Kumar, Y., Fischer, E. R., Hackstadt, T., Valdivia, R. H. Cytoplasmic lipid droplets are translocated into the lumen of the Chlamydia trachomatis parasitophorous vacuole. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (27), 9379-9384 (2008).
- Kaplan, E. L., Meier, P.
- Chauhan, A. K., Kisucka, J., Lamb, C. B., Bergmeier, W., Wagner, D. D. von Willebrand factor and factor VIII are independently required to form stable occlusive thrombi in injured veins. Blood. 109 (6), 2424-2429 (2007).
- Andre, P., et al. CD40L stabilizes arterial thrombi by a beta3 integrin--dependent mechanism. Nature Medicine. 8 (3), 247-252 (2002).
- Ni, H., et al. Persistence of platelet thrombus formation in arterioles of mice lacking both von Willebrand factor and fibrinogen. Journal of Clinical Investigation. 106 (3), 385-392 (2000).
- Bergmeier, W., et al. The role of platelet adhesion receptor GPIbalpha far exceeds that of its main ligand, von Willebrand factor, in arterial thrombosis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (45), 16900-16905 (2006).
- Ciciliano, J. C., et al. Resolving the multifaceted mechanisms of the ferric chloride thrombosis model using an interdisciplinary microfluidic approach. Blood. 126 (6), 817-824 (2015).
- Eckly, A., et al. Mechanisms underlying FeCl3-induced arterial thrombosis. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 9 (4), 779-789 (2011).
- Woollard, K. J., Sturgeon, S., Chin-Dusting, J. P. F., Salem, H. H., Jackson, S. P. Erythrocyte hemolysis and hemoglobin oxidation promote ferric chloride-induced vascular injury. Journal of Biological Chemistry. 284 (19), 13110-13118 (2009).
- Shim, Y., et al. Characterization of ferric chloride-induced arterial thrombosis model of mice and the role of red blood cells in thrombosis acceleration. Yonsei Medical Journal. 62 (11), 1032-1041 (2021).
- Ghosh, S., et al. Evaluation of the prothrombotic potential of four-factor prothrombin complex concentrate (4F-PCC) in animal models. PLoS One. 16 (10), 0258192 (2021).
- Wilbs, J., et al. Cyclic peptide FXII inhibitor provides safe anticoagulation in a thrombosis model and in artificial lungs. Nature Communications. 11 (1), 3890 (2020).
- Wei, Y., Deng, X., Sheng, G., Guo, X. B. A rabbit model of cerebral venous sinus thrombosis established by ferric chloride and thrombin injection. Neuroscience Letters. 662, 205-212 (2018).
- Jacob-Ferreira, A. L., et al. Antithrombotic activity of Batroxase, a metalloprotease from Bothrops atrox venom, in a model of venous thrombosis. International Journal of Biological Macromolecules. 95, 263-267 (2017).
- Zhou, X., et al. A rabbit model of cerebral microembolic signals for translational research: preclinical validation for aspirin and clopidogrel. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 14 (9), 1855-1866 (2016).
- Yang, X., et al. Effect of evodiamine on collagen-induced platelet activation and thrombosis. BioMed Research International. 2022, 4893859 (2022).
- Li, W., McIntyre, T. M., Silverstein, R. L. Ferric chloride-induced murine carotid arterial injury: A model of redox pathology. Redox Biology. 1 (1), 50-55 (2013).
- Li, W., Nieman, M., Sen Gupta, A. Ferric chloride-induced murine thrombosis models. Journal of Visualized Experiments. (115), e54479 (2016).
- Holly, S. P., et al. Ether lipid metabolism by AADACL1 regulates platelet function and thrombosis. Blood Advances. 3 (22), 3818-3828 (2019).
- Bird, J. E., et al. Prediction of the therapeutic index of marketed anti-coagulants and anti-platelet agents by guinea pig models of thrombosis and hemostasis. Thrombosis Research. 123 (1), 146-158 (2008).
