Summary
O presente protocolo descreve como usar uma lesão mediada por FeCl3 para induzir trombose arterial e como coletar e preparar amostras de lesão arterial em vários estágios da trombose para análise por microscopia eletrônica.
Abstract
As doenças cardiovasculares são uma das principais causas de mortalidade e morbidade em todo o mundo. A trombose aberrante é uma característica comum de condições sistêmicas, como diabetes e obesidade, e de doenças inflamatórias crônicas, como aterosclerose, câncer e doenças autoimunes. Na lesão vascular, geralmente o sistema de coagulação, as plaquetas e o endotélio atuam de forma orquestrada para evitar o sangramento, formando um coágulo no local da lesão. Anormalidades nesse processo levam a sangramento excessivo ou trombose descontrolada/atividade antitrombótica insuficiente, o que se traduz em oclusão do vaso e suas sequelas. O modelo de lesão carotídea induzida por FeCl3 é uma ferramenta valiosa para investigar como a trombose se inicia e progride in vivo. Esse modelo envolve dano endotelial/desnudamento e subsequente formação de coágulos no local lesado. Ele fornece um ensaio quantitativo altamente sensível para monitorar o dano vascular e a formação de coágulos em resposta a diferentes graus de dano vascular. Uma vez otimizada, esta técnica padrão pode ser usada para estudar os mecanismos moleculares subjacentes à trombose, bem como as alterações ultraestruturais nas plaquetas em um trombo crescente. Este ensaio também é útil para estudar a eficácia de agentes antitrombóticos e antiplaquetários. Este artigo explica como iniciar e monitorar a trombose arterial induzida por FeCl3 e como coletar amostras para análise por microscopia eletrônica.
Introduction
A trombose é a formação de um coágulo sanguíneo que bloqueia parcial ou completamente um vaso sanguíneo, impedindo o fluxo natural do sangue. Isso leva a eventos cardiovasculares graves e fatais, como doença cardíaca isquêmica e acidentes vasculares cerebrais. As doenças cardiovasculares são a principal causa de morbidade e mortalidade, sendo responsáveis por uma em cada quatro mortes nomundo1,2,3. Embora a trombose se manifeste como um mau funcionamento do sistema vascular, pode ser resultado de uma infecção microbiana ou viral subjacente, distúrbio imunológico, malignidade ou condição metabólica. O fluxo sanguíneo é mantido pela complexa interação entre diversos componentes do sistema vascular, incluindo células endoteliais, hemácias/leucócitos, plaquetas e fatores de coagulação4. Na lesão vascular, as plaquetas interagem com proteínas adesivas na matriz subendotelial e liberam seu conteúdo granular, que recruta mais plaquetas5. Concomitantemente, a cascata de coagulação é ativada, levando à formação e deposição de fibrina. Em última análise, forma-se um coágulo contendo plaquetas e hemácias aprisionadas dentro de uma tela de fibrina6. Embora drogas antiplaquetárias e anticoagulantes estejam disponíveis para modular a trombose, o sangramento espúrio continua sendo uma grande preocupação com essas terapias, exigindo ajuste fino das dosagens e combinações dessas drogas. Assim, ainda é urgente a descoberta de novas drogas antitrombóticas7.
A trombose é estudada usando vários métodos para infligir lesão vascular: mecânica (ligadura do vaso), térmica (lesão a laser) e lesão química (aplicação de FeCl3/Rosa Bengala). A natureza da trombose varia dependendo da localização (arterial vs. venosa), método ou extensão da lesão. Dentre todos esses tipos, a lesão vascular induzida por FeCl3 é o método mais utilizado. Tem sido empregada em camundongos, ratos, coelhos, cobaias e cães 8,9,10,11,12. O método é relativamente simples, fácil de usar e, se os principais parâmetros forem padronizados, é sensível e reprodutível em vários sistemas vasculares (por exemplo, artérias [carótida e femoral], veias [jugular] e arteríolas [cremaster e mesentérica]) (Tabela Suplementar 1).
Este modelo também pode ser usado para aprofundar nossa compreensão da mecânica e morfologia da formação de coágulos. Esta técnica oferece exclusivamente a vantagem de parar a trombose em vários pontos de fluxo, para estudar os estágios intermediários do processo antes que ele se torne oclusivo. Avanços recentes na pesquisa da trombose têm utilizado esse modelo para focar a atenção em métodos não farmacológicos detrombólise13 ou na liberação não invasiva de agentes antitrombóticos e/ou fibrinolíticos14,15. Vários grupos têm demonstrado que, quando as membranas plaquetárias são revestidas com essas terapêuticas, os fármacos podem ser ativados por estimulação térmica para atingir coágulos16. As técnicas aqui descritas podem ser úteis para estudos como a validação de seus achados em nível plaquetário único. Neste manuscrito, o Protocolo 1 descreve o procedimento básico de lesão vascular mediada por FeCl3, enquanto o Protocolo 2 descreve o método de coleta e correção da amostra de lesão vascular para posterior análise por microscopia eletrônica.
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Protocol
Todos os experimentos aqui discutidos foram revisados e aprovados pelo Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) da Universidade de Kentucky.
NOTA: Os instrumentos cirúrgicos estão listados na Figura 1 e na Tabela de Materiais. Foram utilizados camundongos C57BL/6J, com 8-10 semanas de idade, machos/fêmeas ou cepas geneticamente manipuladas (Knockout ou Knockin).
1. Lesão da artéria carótida induzida por FeCl3
- Indução da anestesia em camundongos
- Pese o mouse.
- Anestesiar o camundongo injetando 0,2 g/kg de solução de tribromoetanol por via intraperitoneal (i.p.). Certifique-se de que a solução anestésica está à temperatura ambiente (RT) antes de injetá-la. Esta dose é suficiente para sedar o rato durante cerca de 1 h.
- Verifique o reflexo do dedo do pé apertando o dedo do pé 5 minutos após a injeção para se certificar de que o rato está sedado. Se o mouse não estiver sedado, ele puxará o dedo do pé para longe. Se isso acontecer, aguarde 5 min e verifique novamente.
- Se o rato ainda não estiver completamente sediado, administrar 1/4 da dose inicial e aguardar 5 minutos.
- Durante todo o procedimento, monitore periodicamente o plano anestésico do mouse através de uma pinça do dedo do pé. Além disso, a frequência respiratória e a temperatura corporal também podem ser monitoradas para manter a anestesia ideal.
- Imobilizar o mouse
- Coloque o mouse sobre a almofada de aquecimento (37 °C) em decúbito dorsal e use fita adesiva para imobilizar as extremidades.
- Use um fio cirúrgico (0,1 mm) para puxar suavemente os dentes anteriores superiores do mouse para estender a região cervical/cervical. Isso é importante para melhor visualização da área cirúrgica e estabilidade da sonda Doppler. O tamanho do fio não é importante, pois é usado apenas para puxar os dentes da frente do animal para estender o pescoço.
- Incisão
- Borrife a área cirúrgica com etanol 70% ou limpe-a com um lenço com álcool.
- Usando um cotonete, aplique uma pequena quantidade de creme depilatório na área cirúrgica. Aguarde 1-2 min e, em seguida, use uma toalha de papel molhada ou lenço de papel para remover o creme.
NOTA: Este passo é importante para uma área cirúrgica limpa. - Com tesoura e pinça (Figura 1B11,1B13), realizar uma incisão mediana desde a mandíbula até a fúrcula esternal. Retrair a pele para melhor visualização da área (Figura 2A).
- Exposição da artéria carótida
- Com pinça cirúrgica e micropinça dissecante, disseque a fáscia superficial sobreposta e a remova com foco na exposição da artéria carótida esquerda (Figura 1B12,1B13). Certifique-se de não usar tesoura nesta fase para evitar ferir outras vasculaturas nesta área.
- Remova o tecido extra ao redor da artéria carótida. Evitar a dissecção excessiva do tecido circundante, uma vez que esta área abriga o nervo vago e a artéria vertebral.
- Separar a artéria carótida do tecido circunjacente, dissecando-a com pinça cirúrgica e de sutura (Figura 1B12,1B15,2C). Certifique-se de não estender ou puxar a artéria para evitar qualquer lesão mecânica na artéria ou na vasculatura circundante.
- Colocar um pedaço de plástico sob a artéria para marcar o local da lesão (Figura 2D). Use uma folha de transparência colorida para facilitar a visualização no campo cirúrgico.
- Colocação da sonda de fluxo
- Colocar a sonda de fluxo transônico Doppler em solução salina (NaCl 0,9% em dH2O) por cerca de 10 min antes da cirurgia. Insira a outra extremidade da sonda em um acessório no medidor de vazão para facilitar a leitura do fluxo. Conecte o medidor de vazão a um computador.
OBS: Entre as cirurgias, a sonda de fluxo transônico com Doppler deve ser em soro fisiológico. Certifique-se de manter a sonda úmida e limpa durante todo o procedimento. - Colocar a sonda de fluxo transônico com Doppler ultrassom ao redor da artéria a montante do plástico (Figura 2D). Certifique-se de que a região do suporte do vaso da sonda não esteja muito estendida (Figura 1C, seta vermelha).
OBS: Se necessário, apoiar a sonda com compressas de gaze (Figura 1B1) para atingir uma altura adequada da sonda, facilitando a posição ideal de leitura. - Se a área cirúrgica estiver seca neste ponto, adicione algumas gotas de soro fisiológico RT para manter a área úmida. Monitore a leitura da sonda de fluxo. A leitura ideal varia para cada animal e pode estar entre 0,6-1,2 mL/min. Se for menor ou não estável, altere a posição da sonda de fluxo para obter uma leitura ideal.
NOTA: Certifique-se de que o pescoço do rato não está muito estendido e que a área cirúrgica está limpa.
- Colocar a sonda de fluxo transônico Doppler em solução salina (NaCl 0,9% em dH2O) por cerca de 10 min antes da cirurgia. Insira a outra extremidade da sonda em um acessório no medidor de vazão para facilitar a leitura do fluxo. Conecte o medidor de vazão a um computador.
- Registrar a linha de base do fluxo
- Depois de colocar a sonda, monitore o fluxo sanguíneo por 2 minutos para garantir que o fluxo seja constante. Em seguida, registre o fluxo por 2 min (Figura 3B) como linha de base. Para uma descrição detalhada do fluxômetro, consulte Subramaniam et al.17.
- Para registrar o fluxo sanguíneo, inicie o software WinDAQ. Clique na opção Arquivo e, em seguida, clique em Gravar. Crie uma nova pasta e arquivo e comece a gravar. Para interromper a gravação, clique em Parar na seção de arquivos.
Observação : software WinDAQ está disponível gratuitamente do editor: https://www.dataq.com/products/windaq/.
- Lesão
- Pare a gravação do fluxo. Certifique-se de não alterar a posição da sonda para que as leituras permaneçam consistentes após a lesão.
- Seque bem a área com um toalha/toalha de papel.
NOTA: Mesmo um pequeno volume de líquido residual pode alterar a concentração da solução de FeCl3 usada para infligir lesão vascular. Isso leva a resultados variáveis e afeta a reprodutibilidade. Quando a área está completamente seca, a sonda não é capaz de medir o fluxo. - Em um barco de pesagem de plástico, coloque um papel de filtro circular (1 mm de diâmetro, cortado com um furo de orelha de 1 mm de diâmetro). Adicionar 1 μL de solução de FeCl3 a 6% (fabricada em dH2O) ao papel de filtro.
NOTA: Certifique-se de adicionar a solução de FeCl3 imediatamente antes de usar o papel de filtro. Embeber o papel muito cedo pode levar à evaporação da solução de FeCl3 e alterar a gravidade da lesão. - Com pinça fina, pegue o papel filtro e coloque-o na artéria a montante da sonda, na parte da artéria marcada pelo plástico (Figura 2D,E). Este plástico atua como um marcador e um espaçador. Ele marca a área lesionada e evita a diluição acidental do FeCl3, evitando o contato com a área úmida circundante.
NOTA: Certifique-se de que o papel de filtro está reto, não beliscado ou dobrado de qualquer outra forma. Uma vez colocado na artéria, não altere a posição do papel de filtro; Isso altera a extensão da lesão. - Depois de colocar o papel de filtro, ligue o temporizador e registre o fluxo sanguíneo. Após 3 min, retire o papel e adicione soro fisiológico no local da lesão para remover a FeCl3 e interromper o processo de lesão. Também torna a área úmida. Nessa fase, o fluxo sanguíneo deve retornar ao nível basal, conforme registrado pré-lesão.
- Monitore e registre o fluxo até que ele reduza para 10% da gravação original ou atinja zero. Há uma diminuição constante quando o trombo começa a se formar no local da lesão (Figura 3C). Observe quaisquer flutuações significativas no fluxo durante esse período.
- Para estudar a estabilidade do trombo, registre o rápido aumento do fluxo sanguíneo após cada diminuição significativa e consistente. Esses eventos são classificados como embolização por trombose instável (Figura 4D). Após a diminuição consistente do fluxo, o operador é capaz de ver a lesão na artéria ao final do experimento (Figura 2F, seta azul/oval pontilhada).
- O tempo de oclusão do vaso é definido como a cessação completa do fluxo sanguíneo por pelo menos 1 min. Registre o tempo em que um trombo oclusivo é formado, como mostrado pela leitura de zero ou diminuição significativa do fluxo.
- Finalizar o experimento aos 30 min. Se o trombo não se formar dentro de 30 minutos após o monitoramento, registre o fluxo, pare a gravação e remova a sonda.
- Limpe a sonda com etanol 70% e uma escova para remover qualquer tecido residual/cabelo ou detritos. Seque completamente a sonda antes de colocá-la na caixa de armazenamento. Seque completamente a sonda antes de colocá-la na caixa de armazenamento para armazenamento a longo prazo.
- Eutanásia do camundongo por luxação cervical. Coloque a carcaça no saco de descarte de carcaça, rotulado com o nome do laboratório e a data.
2. Coleta e preparação de amostras para estudos seriados de microscopia eletrônica de varredura facial (SBF-SEM) pós-lesão induzida por FeCl3
OBS: O protocolo de ME apresentado é apropriado para o preparo da amostra para o SBF-MEV. Esta técnica de imagem oferece uma capacidade sem precedentes de estudar a estrutura tridimensional das plaquetas em um coágulo. Com essa técnica, a amostra é visualizada como uma série de imagens sequenciais de MEV em bloco, geradas à medida que se avança pela amostra. Os pontos-chave para essa preparação são: 1) a amostra deve ser corada com metais pesados pré-embutindo; e 2) a amostra embutida em plástico deve ser aparada adequadamente para montagem dentro do MEV (ver Figura 6 para uma visão das amostras aparadas). A coloração pós-incorporação não é possível dentro da MEV. Ao coletar uma amostra de uma lesão de vaso induzida por FeCl3 para análise de EM, as seguintes alterações precisam ser feitas durante a realização da cirurgia. As modificações no protocolo cirúrgico de FeCl3 apresentadas também são aplicáveis a qualquer forma de microscopia eletrônica. As condições anestésicas e os passos para incisão e exposição da artéria carótida são os mesmos do Protocolo 1.
- Após a exposição da artéria carótida, marcar o local da lesão circundando frouxamente a região entre dois fios cirúrgicos (tamanho: 0,1 mm) (Figura 5A,B).
- Colocar a sonda sob a artéria, distal ao fio inferior (Figura 5C).
- Inserir a peça plástica sob a artéria entre os dois fios para marcar o local da lesão da FeCl3 (Figura 5C).
- Realizar medições de fluxo antes de realizar a lesão para observar o fluxo basal. Essas medidas são usadas para decidir em qual estágio a amostra será coletada.
OBS: Certifique-se de que o fixador (paraformaldeído a 3%/PFA + glutaraldeído a 0,1%, ambos fabricados em 1x PBS) esteja pronto e em RT. Alternativamente, a fixação com glutaraldeído a 2,5% em fundo salino também pode ser usada.
CUIDADO: Tanto o paraformaldeído quanto o glutaraldeído são altamente tóxicos e irritantes. Ao manuseá-los, luvas, protetor ocular e máscaras devem ser usados para proteger da exposição. Todas as soluções fixadoras são tóxicas, e as etapas de fixação devem ser realizadas em uma capela de fumaça. - Realizar a lesão colocando papel de filtro embebido em FeCl 3 na artéria (8% FeCl 3 é usado) por3 min (esse tempo também pode variar). Após 3 min, remova o papel filtro e adicione soro fisiológico no local da lesão para remover qualquer excesso de FeClresidual 3. Essa etapa é necessária para evitar a extensão variável da lesão e facilitar a contagem do fluxo pela sonda (Figura 5D).
- Monitore a leitura do fluxo. Quando o fluxo cair abaixo de 50% do valor inicial, remova a sonda. Seque rapidamente a área e adicione o fixador na área para fixar externamente a área da lesão.
- Segurar prontamente a artéria próxima à área da lesão com pinça e cortar a jusante do fio inferior e a montante do fio superior. Se necessário, peça a outra pessoa que ajude a cortar uma das extremidades. Coloque o tecido na placa de cultura de tecido plástico na mesma orientação em que foi coletado e adicione algumas gotas do fixador.
NOTA: Cortar a artéria causa sangramento extenso imediato, por isso certifique-se de segurar a artéria antes de cortá-la pela primeira vez. Nesse cenário, o mouse é exanguinado. O camundongo é eutanasiado por exsanguinação e luxação cervical. - Usando um bisturi, limpe o tecido extra ao redor da artéria. Esteja atento para registrar a orientação do fluxo sanguíneo. Para marcá-lo, corte uma extremidade horizontalmente e a outra afilando/oblíqua (Figura 5E).
- Manter a amostra em fixador (PFA 3% e glutaraldeído 0,1%) por 1 h no TR. Em seguida, armazenar a amostra em PFA a 1% a 4 °C até enviá-la em gelo úmido para o laboratório de processamento de amostras para análise de EM.
NOTA: As amostras não devem ser congeladas. Os desafios para esse método de coleta de amostras são:- A leitura inicial pode não ser ótima ou flutuar após a lesão. Isso pode afetar a extensão da lesão escolhida para a análise de EM. Para resolver esse problema, certifique-se de registrar a leitura da linha de base por alguns minutos, depois de tentar várias posições de colocação da sonda para decidir qual posição é a ideal.
- O tempo para deter a lesão adicionando fixador externo e corte real do corte arterial para análise pode adicionar variabilidade à extensão da trombose. Seja rápido durante a coleta de amostras após a fixação externa.
- Receber as amostras para processamento para análise de EM em PFA 1% sobre gelo úmido. Enxaguar as amostras por 3 min, em gelo, com tampão cacodilato 0,1 M para iniciar o processamento posterior.
- Fixar as amostras por 1 h em gelo em tampão cacodilato 0,1 M + glutaraldeído 2,5% + CaCl2 mM.
- Descarte o fixador e lave as amostras com tampão cacodilato de sódio 0,1 M frio contendo CaCl2 2 mM (5 x 3 min) (Figura 6A).
- Fixar as amostras com solução de ósmio (ferrocianeto de potássio a 3% [K 4C 6 N6Fe] + tampão cacodilato 0,3 M + CaCl 2 4 mM misturado com um volume igual de tetróxido de ósmio aquoso a 4% [OsO4; em ddH2 O]) durante 1 h nogelo.
- Enquanto as amostras estão fixando, fazer solução fresca de hidrato de tricloroacetaldeído (TCH) a 1% em ddH2O. Incubar a solução a 60 °C por 1 h enquanto mistura suavemente.
- Após a fixação, lavar as amostras com ddH2O em TR por 5 x 3 min.
- Incubar as amostras em solução filtrada de TCH a 1% (fabricada em ddH2O) durante 20 min em RT.
- Lavar as amostras com ddH2O em TR (5 x 3 min).
- Fixar as amostras em tetróxido de ósmio a 2% em ddH2O durante 30 min em RT.
- Lavar as amostras com ddH2O em RT por 5 x 3 min cada.
- Colocar as amostras em acetato de uranilo a 1% (aquoso) e incubar durante a noite a 4 °C.
- Lave as amostras com ddH2O em RT por 5 x 3 min cada, e processe-as com coloração de aspartato de chumbo de Walton em bloco .
- Em bloco Coloração de aspartato de chumbo de Walton3:
- Fazer 30 mM solução de ácido L-aspártico em ddH2O.
NOTA: O ácido aspártico dissolve-se mais rapidamente se o pH for elevado para 3,8. Esta solução de estoque é estável por 1-2 meses se refrigerada. - Completar solução de nitrato de chumbo 20 mM em 10 mL de estoque de ácido aspártico e ajustar o pH para 5,5 com 1 N KOH.
- Colocar as amostras em solução de aspartato de chumbo a 60 °C durante 30 minutos, após cinco lavagens com ddH2O à RT, cada uma durante 3 minutos.
- Fazer 30 mM solução de ácido L-aspártico em ddH2O.
- Desidratar os espécimes com uma série graduada de etanol. Utilizar a desidratação química pelo protocolo de Valdivia18.
- Lavar as amostras em cada uma das seguintes soluções para desidratar progressivamente a amostra (figura 6B):
Álcool etílico a 25% por 3 min
Álcool etílico 50% por 3 min
álcool etílico 75% por 3 min
Álcool etílico 95% por 3 min
Álcool etílico 100% por 10 min, e repita o passo duas vezes (total de três lavagens).
- Lavar as amostras em cada uma das seguintes soluções para desidratar progressivamente a amostra (figura 6B):
- Lavar as amostras em óxido de propileno (PO) a 100% durante 10 minutos e repetir o passo duas vezes (total de três lavagens).
- Incubar em 50%/50% PO/resina com ativador DMP 30 durante a noite em RT e incorporar em 100% Araldite 502/embed 812/DDSA com ativador DMP30 por 48 h.
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Representative Results
Os dados são geralmente apresentados como tempo para a oclusão, ou tempo necessário para formar um trombo totalmente oclusivo. Esses dados podem ser plotados como uma curva de sobrevida de Kaplan-Meier (Figura 4A)19, um gráfico de pontos com barras mostrando o fluxo sanguíneo terminal no momento da cessação do fluxo sanguíneo ou do término de um experimento (Figura 4B), ou como um gráfico de linhas (Figura 4C). A estabilidade do trombo pode ser estudada por essa técnica. Na maioria dos casos, após a lesão da FeCl3, o trombo se forma gradualmente e, à medida que cresce, o fluxo sanguíneo diminui progressivamente, chegando a zero com a oclusão completa do vaso. Em alguns casos, o fluxo sanguíneo aumenta subitamente após uma diminuição gradual por alguns minutos. Isso é interpretado como excreção parcial do trombo em crescimento, podendo ser considerado como um evento de embolização (Figura 4D). A morfologia do trombo oclusivo (Figura 7A) também pode ser estudada por este método.
Tabela 1: Potenciais desafios técnicos no modelo e soluções de trombose induzida por FeCl3. Clique aqui para baixar esta tabela.
Figura 1: Instrumental cirúrgico necessário para a realização de trombose carotídea induzida por FeCl3 em camundongos. (A) 1: Microscópio LEICA S8AP0 e suporte. 2: Almofada aquecida animal pequena coberta em papel alumínio. (B) 1: Esponjas de gaze. 2: 26 G x 3/8 agulha. 3: seringa de 1 ml. 4: Aplicadores estéreis com ponta de algodão. 5: Sutura de seda trançada preta. 6: Lâmina cirúrgica. 7: Cabo da faca de aço inoxidável. 8: Creme depilatório comercial. 9: Soco na orelha. 10: Tesoura dissecante. 11: Tesoura fina. 12: Pinça cirúrgica. 13: Pinça microdissecante. 14: Pinça para curativo. 15: Pinça de amarração de sutura. (C) Sonda de fluxo transônico com a região flexível (seta vermelha) e um entalhe que segura um vaso (seta preta). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Etapas cirúrgicas para preparar a artéria carótida para a lesão e medir a oclusão do vaso. Com tesoura e pinça cirúrgica, faça um corte na linha média e puxe suavemente o tecido (A) para expor a artéria carótida abaixo dele (B). A seta preta mostra a direção do fluxo sanguíneo (B). Limpe o tecido circundante que circunda a artéria carótida (C) e coloque um pedaço de papel plástico (plástico amarelo mostrado por uma seta preta) e a sonda (D). Lesionar o vaso colocando papel de filtro embebido em FeCl3 (mostrado por uma seta vermelha) na artéria (E). Retire o papel e monitore a lesão. Ao final, a lesão é visível como uma estria amarelo-esbranquiçada, indicada pela ponta de seta azul (F). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Leitura do fluxo sanguíneo utilizando o fluxômetro. O fluxo sanguíneo na artéria carótida é medido por meio de fluxômetro (A). O fluxo é gravado usando uma função de registro na guia arquivo (B). O fluxo basal deve ser relativamente constante antes da realização da lesão (cerca de 0,8 mL/min, mostrado por seta preta) (B). Após a lesão, o fluxo sanguíneo diminui uniformemente (cerca de 50% de diminuição do valor inicial, cerca de 0,4 mL/min), mostrado por uma seta preta (C). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Apresentação dos dados representativos do modelo de lesão carotídea induzida por FeCl3. Vários métodos disponíveis para apresentar dados de lesão vascular induzida por FeCl3 são mostrados. As curvas de sobrevivência de Kaplan-Meier mostram o tempo de oclusão de cada camundongo. Um teste de log-rank é realizado para análise estatística. p ≤ 0,001 (A). O fluxo sanguíneo ao final do experimento também pôde ser representado em um gráfico de barras (B). Para os dados representados em B, foi realizado o teste t não pareado *** p ≤ 0,001. A barra de erro representa a média ± DP. Os dados de fluxo ao Doppler coletados após a lesão de um único animal puderam ser apresentados em um gráfico de linhas (C). Exemplo de um potencial evento de embolização pelo aumento súbito do fluxo sanguíneo após uma diminuição gradual sustentada do fluxo em um único camundongo em vários momentos (D). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Coleta de coágulos de lesão induzidos por FeCl3 para estudos de microscopia eletrônica. Após expor uma artéria (A), marcar o local da lesão amarrando frouxamente os fios (B) e colocar o papel plástico sob a artéria e a sonda a jusante (C). Realizar a lesão e monitorar o dano (D). Coletar o tecido conforme explicado no texto, limpar e cortar a amostra reta de um lado e oblíqua do outro lado para mostrar a direção do fluxo sanguíneo (a seta preta mostra a direção do fluxo sanguíneo e o contorno vermelho indica a região lesionada) (E). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Processamento pós-fixação e montagem de amostras para microscopia eletrônica. As amostras são lavadas em tubos de microcentrífuga entre as etapas de processamento (A) e desidratadas em série com aumento da concentração de etanol (B). Após o processamento, eles são embutidos em resina (C), e os blocos são marcados com a direção do fluxo sanguíneo (D) e, em seguida, cortados em fatias para obtenção de imagens. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: Micrografias eletrônicas representativas das regiões proximal e distal de um trombo totalmente oclusivo pós-lesão carotídea mediada por FeCl3. (A) Secção transversal completa de uma artéria ocluída, proximal ao local da lesão, com inserções abaixo, mostrando estruturas em maior aumento (a: 2x e a': 4x). A área lesada é indicada com seta em A. Barra de escala: 100 μm. (B) Secção transversal completa de uma artéria ocluída, distal ao local da lesão, com inserções abaixo, mostrando estruturas em maior aumento (b: 2x e b': 4x). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Tabela suplementar 1: Um breve levantamento das variações em modelos animais, local da lesão do FeCl 3, concentração do FeCl3, método da lesão e tempos de trombose. Clique aqui para baixar este arquivo.
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Discussion
A aplicação tópica de FeCl3 na vasculatura para induzir trombose é uma técnica amplamente utilizada e tem sido fundamental no estabelecimento de papéis para vários receptores plaquetários, vias de sinalização de ligantes e seus inibidores20,21,22,23. O mecanismo pelo qual a FeCl3 causa trombose é multifacetado; Anteriormente, o desnudamento endotelial era considerado causa de trombose, porém, nos últimos anos, vários relatos têm sugerido o papel das hemácias e proteínas plasmáticas nesse processo24,25,26,27.
As etapas mais críticas desse protocolo são: a colocação da sonda Doppler para obter um fluxo ideal, a colocação do papel de filtro e o término imediato da lesão para recuperar e fixar imediatamente a amostra. As consequências dos percalços nessas etapas e como resolvê-los estão descritas na Tabela 1. Embora simples e sensível, essa técnica pode ser desafiadora de empregar, dependendo do modelo animal, do histórico do animal, do local da lesão vascular, da concentração de FeCl 3, do método de aplicação do FeCl3, da duração da aplicação, da idade e do sexo do animal e do tipo de anestesia utilizada. Essas diferenças podem explicar a variação relativamente ampla de tempos de trombose no C57BL/6J relatada na literatura (Tabela Suplementar 1)27,28,29,30,31,32. Este protocolo propõe o uso de camundongos de 8 a 10 semanas de idade para o experimento, pois o tamanho da vasculatura é mais fácil de visualizar e sobrecarregar. Alguns grupos utilizaram camundongos a partir de 6 semanas de idade33. É imperativo equiparar a idade dos camundongos para uma comparação consistente e reprodutível entre vários grupos de animais. A anestesia descrita, tribromoetanol, é preferida por estar prontamente disponível, ser mais fácil de administrar, manter plano anestésico pelo tempo necessário e reprodutível a dose necessária. Muitas outras opções anestésicas estão disponíveis, incluindo isoflurano e várias combinações de tribromoetanol com álcool amílico terciário com xilazina e/ou acepromazina. É imperativo usar uma dose ideal para conseguir a sedação sem afetar negativamente a frequência cardíaca ou a pressão arterial do animal. O uso do mesmo método de anestesia durante todo o experimento previne potenciais efeitos compostos sobre o tempo de trombose.
Este manuscrito apresenta um procedimento detalhado para minimizar as variações dos dados e aumentar a reprodutibilidade. Uma tabela é fornecida para solucionar alguns problemas que podem surgir durante essa cirurgia (Tabela 1). Além disso, este manuscrito propõe um método de coleta de amostras ao final da lesão para estudo da estrutura e morfologia de um trombo oclusivo (Figura 7). A resolução do MP oferece uma melhor visualização do que era possívelanteriormente25 das plaquetas em um thombus em crescimento, e como elas interagem com outras plaquetas e com o endotélio proximal e distal da lesão vascular. Também pode ser usado para estudar vários estágios de ativação das plaquetas no local da lesão.
Outra vantagem importante dessa técnica é que o operador pode usar as leituras basais para decidir em que estágio a amostra de trombo é coletada. Deve-se notar que esses são tempos aproximados e não indicam a extensão exata da lesão/trombose. As leituras basais dependem do posicionamento ideal da sonda e, se não forem colocadas corretamente, as leituras podem registrar apenas o fluxo parcial. Isso leva a uma interpretação errônea do tempo de término e, portanto, da morfologia da amostra coletada. O término imediato do processo de lesão e a fixação imediata das amostras são necessários para alcançar resultados consistentes e reprodutíveis.
Este protocolo apresenta as configurações mínimas necessárias para a avaliação da trombose oclusiva. Com os avanços da microscopia, vários grupos têm utilizado essa técnica para marcar fluorescentemente as plaquetas/células endoteliais e/ou o plaquetário liberado, como PF4 e P-Selectina e fibrina, para visualizar aspectos específicos da trombose in vivo e determinar sua cinética34,35. Como descrito, o método pode relatar eventos embolizantes que indicam instabilidade do trombo (Figura 4D).
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Disclosures
Os autores não têm conflitos de interesse relacionados a este estudo.
Perfis ORCID: S.J.: 0000-0001-6925-2116; S.W.W.: 00000-0001-5577-0473.
Acknowledgments
Os autores agradecem aos membros do Whiteheart Laboratory por sua cuidadosa análise deste manuscrito. O trabalho foi apoiado por subsídios do NIH, NHLBI (HL56652, HL138179 e HL150818), e um Prêmio de Mérito do Departamento de Assuntos de Veteranos para S.W.W., R01 HL 155519 para B.S., e concessão do programa intramuros NIBIB para R.D.L.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% Saline | Fisher Scientific | BP358-212 | NaCl used to make a solution of 0.9% saline |
| 1 mL Syringe | Becton, Dickinson and Company | 309659 | |
| 190 Proof Ethanol | KOPTEC | V1101 | Used to make a 70% ethanol solution to use for prepping the mouse for surgery |
| 2,2,2 Tribromoethanol | Sigma Aldrich | 48402 | |
| 25 Yard Black Braided Silk Suture (5-0) | DEKNATEL | 136082-1204 | |
| 26G x 3/8 Needle | Becton, Dickinson and Company | 305110 | |
| 2-methyl-2-butanol | Sigma Aldrich | 240486 | |
| 7.5 mL Transfer Pipet, Graduated to 3 mL | Globe Scientific Inc. | 135010 | |
| Alcohol Prep Pads (70% Isopropyl Alcohol) | Medline | MDS090735 | |
| Araldite GY 502 | Electron microscopy Services | 10900 | |
| Cell Culture Dish 35mm X 10mm | Corning Incorporated | 430165 | |
| Compact Scale | Ward's Science | 470314-390 | |
| Dissecting Scissors, 12.5 cm long | World Precision Instrument | 15922-G | |
| DMP-30 activator | Electron microscopy Services | 13600 | |
| Dodenyl Succinic Anhydride/ DDSA | Electron microscopy Services | 13700 | |
| Doggy Poo Bags/animal carcass disposal bag | Crown Products | PP-RB-200 | |
| Doppler FlowProbe | Transonic Systems Inc. | MA0.5PSB | |
| EMBED 812 resin | Electron microscopy Services | 14900 | |
| Ethyl Alcohol, anhydrous 200 proof | Electron microscopy Services | 15055 | |
| Eye Dressing Forceps, 4" Full Curved, Standard, 0.8mm Wide Tips | Integra Miltex | 18-784 | |
| Filter Paper | VWR | 28310-106 | |
| Fine Scissors - Sharp-Blunt | Fine Science Tools | 14028-10 | |
| Finger Loop Ear Punches | Fine Science Tools | 24212-01 | |
| Gauze Sponges 2” x 2” – 12 Ply | Dukal Corporation | 2128 | |
| Glutaraldehyde (10% solution) | Electron microscopy Services | 16120 | |
| Integra Miltex Carbon Steel Surgical Blade #10 | Integra® Miltex® | 4110 | |
| Iron (III) Chloride | SIGMA-ALDRICH | 157740-100G | |
| Knife Handle Miltex® Extra Fine Stainless Steel Size 3 | Integra Lifesciences | 157510 | |
| L-aspartic acid | Sigma Fisher | A93100 | |
| L-aspartic acid | Fisher Scientific | BP374-100 | |
| Lead Nitrate | Fisher Scientific | L-62 | |
| LEICA S8AP0 Microscope | LEICA | No longer available | No longer available from the company |
| LEICA S8AP0 Microscope Stand | LEICA | 10447255 | No longer available from the company |
| Light-Duty Tissue Wipers | VWR | 82003-822 | |
| Micro Dissecting Forceps; 1x2 Teeth, Full Curve; 0.8 mm Tip Width; 4" Length | Roboz Surgical Instrument Company | RS-5157 | |
| Osmium Tetroxide 4% aqueous solution | Electron microscopy Services | 19150 | |
| Paraformaldehyde (16% solution) | Electron microscopy Services | 15710 | |
| Potassium ferricyanide | SIGMA-ALDRICH | P-8131 | |
| Propylene Oxide, ACS reagent | Electron microscopy Services | 20401 | |
| Rainin Classic Pipette PR-10 | Rainin | 17008649 | |
| Research Flowmeter | Transonic Systems Inc. | T402B01481 | Model: T402 |
| Scotch Magic Invisible Tape, 3/4" x 1000", Clear | Scotch | 305289 | |
| Small Animal Heated Pad | K&H Manufacturing Inc. | Model: HM10 | |
| Sodium Cacodylate Buffer 0.2M, pH7.4 | Electron microscopy Services | 11623 | |
| Sterile Cotton Tipped Applicators | Puritan Medical Products | 25-806 1WC | |
| Steromaster Illuminator | Fisher Scientific | 12-562-21 | No longer available from the company |
| Surgical Dumont #7 Forceps | Fine Science Tools | 11271-30 | |
| Thiocarbohydrazide (TCH) | SIGMA-ALDRICH | 88535 | |
| Universal Low Retention Pipet Tip Reloads (0.1-10 µL) | VWR | 76323-394 | |
| Uranyl Acetate | Electron microscopy Services | 22400 | |
| Veet Gel Cream Hair Remover | Reckitt Benckiser | 3116875 | |
| White Antistatic Hexagonal Weigh Boats, Medium, 64 x 15 x 19 mm | Fisher Scientific | S38975 | |
| WinDAQ/100 Software for Windows | DATAQ Instruments, Inc. | Version 3.38 | Freely available to download. https://www.dataq.com/products/windaq/ |
| ZEISS AxioCam Icc 1 | ZEISS | 57615 |
References
- Lozano, R., et al. Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010. Lancet. 380 (9859), 2095-2128 (2012).
- Raskob, G. E., et al. Thrombosis: a major contributor to global disease burden. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (11), 2363-2371 (2014).
- Walton, J. Lead aspartate, an en bloc contrast stain particularly useful for ultrastructural enzymology. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 27 (10), 1337-1342 (1979).
- Palta, S., Saroa, R., Palta, A.
- Joshi, S., Whiteheart, S. W. The nuts and bolts of the platelet release reaction. Platelets. 28 (2), 129-137 (2017).
- Periayah, M. H., Halim, A. S., Mat Saad, A. Z. Mechanism action of platelets and crucial blood coagulation pathways in hemostasis. International Journal of Hematology-Oncology and Stem Cell Research. 11 (4), 319-327 (2017).
- Alexopoulos, D., Katogiannis, K., Sfantou, D., Lekakis, J. Combination antiplatelet treatment in coronary artery disease patients: A necessary evil or an overzealous practice. Platelets. 29 (3), 228-237 (2018).
- Kurz, K. D., Main, B. W., Sandusky, G. E. Rat model of arterial thrombosis induced by ferric chloride. Thrombosis Research. 60 (4), 269-280 (1990).
- Denis, C. V., et al. Towards standardization of in vivo thrombosis studies in mice. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 9 (8), 1641-1644 (2011).
- Marsh Lyle, E., et al. Assessment of thrombin inhibitor efficacy in a novel rabbit model of simultaneous arterial and venous thrombosis. Thrombosis and Haemostasis. 79 (3), 656-662 (1998).
- Kato, Y., et al. Inhibition of arterial thrombosis by a protease-activated receptor 1 antagonist, FR171113, in the guinea pig. European Journal of Pharmacology. 473 (2-3), 163-169 (2003).
- Huttinger, A. L., et al. Ferric chloride-induced canine carotid artery thrombosis: a large animal model of vascular injury. Journal of Visualized Experiments. (139), e57981 (2018).
- Zhang, W., et al. Antithrombotic therapy by regulating the ROS-mediated thrombosis microenvironment and specific nonpharmaceutical thrombolysis Using Prussian blue nanodroplets. Small. 18 (15), 2106252 (2022).
- Liu, B., et al. Platelet membrane cloaked nanotubes to accelerate thrombolysis by thrombus clot-targeting and penetration. Small. , 2205260 (2022).
- Refaat, A., et al. Near-infrared light-responsive liposomes for protein delivery: Towards bleeding-free photothermally-assisted thrombolysis. Journal of Controlled Release. 337, 212-223 (2021).
- Li, S., et al. Biomimetic nanoplatelets to target delivery hirudin for site-specific photothermal/photodynamic thrombolysis and preventing venous thrombus formation. Small. 18 (51), 2203184 (2022).
- Subramaniam, S., Kanse, S. M. Ferric chloride-induced arterial thrombosis in mice. Current Protocols in Mouse Biology. 4 (4), 151-164 (2014).
- Cocchiaro, J. L., Kumar, Y., Fischer, E. R., Hackstadt, T., Valdivia, R. H. Cytoplasmic lipid droplets are translocated into the lumen of the Chlamydia trachomatis parasitophorous vacuole. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (27), 9379-9384 (2008).
- Kaplan, E. L., Meier, P.
- Chauhan, A. K., Kisucka, J., Lamb, C. B., Bergmeier, W., Wagner, D. D. von Willebrand factor and factor VIII are independently required to form stable occlusive thrombi in injured veins. Blood. 109 (6), 2424-2429 (2007).
- Andre, P., et al. CD40L stabilizes arterial thrombi by a beta3 integrin--dependent mechanism. Nature Medicine. 8 (3), 247-252 (2002).
- Ni, H., et al. Persistence of platelet thrombus formation in arterioles of mice lacking both von Willebrand factor and fibrinogen. Journal of Clinical Investigation. 106 (3), 385-392 (2000).
- Bergmeier, W., et al. The role of platelet adhesion receptor GPIbalpha far exceeds that of its main ligand, von Willebrand factor, in arterial thrombosis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (45), 16900-16905 (2006).
- Ciciliano, J. C., et al. Resolving the multifaceted mechanisms of the ferric chloride thrombosis model using an interdisciplinary microfluidic approach. Blood. 126 (6), 817-824 (2015).
- Eckly, A., et al. Mechanisms underlying FeCl3-induced arterial thrombosis. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 9 (4), 779-789 (2011).
- Woollard, K. J., Sturgeon, S., Chin-Dusting, J. P. F., Salem, H. H., Jackson, S. P. Erythrocyte hemolysis and hemoglobin oxidation promote ferric chloride-induced vascular injury. Journal of Biological Chemistry. 284 (19), 13110-13118 (2009).
- Shim, Y., et al. Characterization of ferric chloride-induced arterial thrombosis model of mice and the role of red blood cells in thrombosis acceleration. Yonsei Medical Journal. 62 (11), 1032-1041 (2021).
- Ghosh, S., et al. Evaluation of the prothrombotic potential of four-factor prothrombin complex concentrate (4F-PCC) in animal models. PLoS One. 16 (10), 0258192 (2021).
- Wilbs, J., et al. Cyclic peptide FXII inhibitor provides safe anticoagulation in a thrombosis model and in artificial lungs. Nature Communications. 11 (1), 3890 (2020).
- Wei, Y., Deng, X., Sheng, G., Guo, X. B. A rabbit model of cerebral venous sinus thrombosis established by ferric chloride and thrombin injection. Neuroscience Letters. 662, 205-212 (2018).
- Jacob-Ferreira, A. L., et al. Antithrombotic activity of Batroxase, a metalloprotease from Bothrops atrox venom, in a model of venous thrombosis. International Journal of Biological Macromolecules. 95, 263-267 (2017).
- Zhou, X., et al. A rabbit model of cerebral microembolic signals for translational research: preclinical validation for aspirin and clopidogrel. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 14 (9), 1855-1866 (2016).
- Yang, X., et al. Effect of evodiamine on collagen-induced platelet activation and thrombosis. BioMed Research International. 2022, 4893859 (2022).
- Li, W., McIntyre, T. M., Silverstein, R. L. Ferric chloride-induced murine carotid arterial injury: A model of redox pathology. Redox Biology. 1 (1), 50-55 (2013).
- Li, W., Nieman, M., Sen Gupta, A. Ferric chloride-induced murine thrombosis models. Journal of Visualized Experiments. (115), e54479 (2016).
- Holly, S. P., et al. Ether lipid metabolism by AADACL1 regulates platelet function and thrombosis. Blood Advances. 3 (22), 3818-3828 (2019).
- Bird, J. E., et al. Prediction of the therapeutic index of marketed anti-coagulants and anti-platelet agents by guinea pig models of thrombosis and hemostasis. Thrombosis Research. 123 (1), 146-158 (2008).
