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फेरिक क्लोराइड-प्रेरित धमनी घनास्त्रता और 3 डी इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी विश्लेषण के लिए नमूना संग्रह

Published: March 17, 2023 doi: 10.3791/64985
Automatic Translation
*1, 1, 1, 1, 1, 1, 2, 3, 3, 2, *1
1Department of Molecular and Cellular Biochemistry, University of Kentucky, 2Department of Physiology and Cell Biology, University of Arkansas for Medical Sciences, 3Laboratory of Cellular Imaging and Macromolecular Biophysics, National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering, National Institutes of Health
* These authors contributed equally

Summary

वर्तमान प्रोटोकॉल बताता है कि धमनी घनास्त्रता को प्रेरित करने के लिए एफईसीएल3-मध्यस्थता चोट का उपयोग कैसे करें, और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी विश्लेषण के लिए घनास्त्रता के विभिन्न चरणों में धमनी चोट के नमूने कैसे एकत्र करें और तैयार करें।

Abstract

कार्डियोवैस्कुलर बीमारियां दुनिया भर में मृत्यु दर और रुग्णता का एक प्रमुख कारण हैं। असामान्य घनास्त्रता मधुमेह और मोटापे जैसी प्रणालीगत स्थितियों और एथेरोस्क्लेरोसिस, कैंसर और ऑटोइम्यून बीमारियों जैसी पुरानी सूजन संबंधी बीमारियों की एक सामान्य विशेषता है। संवहनी चोट पर, आमतौर पर जमावट प्रणाली, प्लेटलेट्स और एंडोथेलियम चोट की जगह पर थक्का बनाकर रक्तस्राव को रोकने के लिए एक व्यवस्थित तरीके से कार्य करते हैं। इस प्रक्रिया में असामान्यताएं या तो अत्यधिक रक्तस्राव या अनियंत्रित घनास्त्रता / अपर्याप्त एंटीथ्रॉम्बोटिक गतिविधि का कारण बनती हैं, जो पोत रोड़ा और इसकी अगली कड़ी में बदल जाती है। FeCl3-प्रेरित कैरोटिड चोट मॉडल यह जांचने में एक मूल्यवान उपकरण है कि विवो में घनास्त्रता कैसे शुरू होती है और प्रगति करती है। इस मॉडल में घायल स्थल पर एंडोथेलियल क्षति / विनाश और बाद में थक्का गठन शामिल है। यह संवहनी क्षति के विभिन्न डिग्री के जवाब में संवहनी क्षति और थक्के के गठन की निगरानी के लिए एक अत्यधिक संवेदनशील, मात्रात्मक परख प्रदान करता है। एक बार अनुकूलित होने के बाद, इस मानक तकनीक का उपयोग थ्रोम्बोसिस के अंतर्निहित आणविक तंत्र का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है, साथ ही साथ बढ़ते थ्रोम्बस में प्लेटलेट्स में अल्ट्रास्ट्रक्चरल परिवर्तन भी होते हैं। यह परख एंटीथ्रोम्बोटिक और एंटीप्लेटलेट एजेंटों की प्रभावकारिता का अध्ययन करने के लिए भी उपयोगी है। यह लेख बताता है कि FeCl3-प्रेरित धमनी घनास्त्रता को कैसे शुरू और मॉनिटर किया जाए और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा विश्लेषण के लिए नमूने कैसे एकत्र किए जाएं।

Introduction

थ्रोम्बोसिस एक रक्त के थक्के का गठन है जो आंशिक रूप से या पूरी तरह से रक्त वाहिका को अवरुद्ध करता है, रक्त के प्राकृतिक प्रवाह को बाधित करता है। यह गंभीर और घातक कार्डियोवैस्कुलर घटनाओं की ओर जाता है, जैसे कि इस्केमिक हृदय रोग और स्ट्रोक। कार्डियोवैस्कुलर बीमारियां रुग्णता और मृत्यु दर का प्रमुख कारण हैं, और दुनिया भर में चार मौतों में से एक का कारणबनती हैं। यद्यपि घनास्त्रता संवहनी प्रणाली की खराबी के रूप में प्रकट होती है, यह एक अंतर्निहित माइक्रोबियल या वायरल संक्रमण, प्रतिरक्षा विकार, घातकता या चयापचय स्थिति का परिणाम हो सकता है। एंडोथेलियल कोशिकाओं, लाल / सफेद रक्त कोशिकाओं, प्लेटलेट्स और जमावट कारकों सहित संवहनी प्रणाली के विभिन्न घटकों के बीच जटिल बातचीत द्वारा रक्त का प्रवाह बनाए रखाजाता है। संवहनी चोट पर, प्लेटलेट्स सबेंडोथेलियल मैट्रिक्स पर चिपकने वाले प्रोटीन के साथ बातचीत करते हैं और उनकी दानेदार सामग्री जारी करते हैं, जो अधिक प्लेटलेट्सकी भर्ती करते हैं। समवर्ती रूप से, जमावट कैस्केड सक्रिय होता है, जिससे फाइब्रिन का गठन और जमाव होता है। अंततः, एक थक्का बनता है, जिसमें प्लेटलेट्स और लाल रक्त कोशिकाएं होती हैं जो एक फाइब्रिन जाल 6 के भीतर फंसजाती हैं। यद्यपि एंटीप्लेटलेट और एंटीकोआगुलेंट दवाएं घनास्त्रता को संशोधित करने के लिए उपलब्ध हैं, नकली रक्तस्राव इन उपचारों के साथ एक प्रमुख चिंता का विषय बना हुआ है, जिसके लिए इन दवाओं की खुराक और संयोजन को ठीक करने की आवश्यकता होती है। इस प्रकार, अभी भी नई एंटी-थ्रोम्बोटिक दवाओं की खोज करने की तत्काल आवश्यकताहै।

संवहनी चोट पहुंचाने के लिए कई तरीकों का उपयोग करके थ्रोम्बोसिस का अध्ययन किया जाता है: यांत्रिक (पोत बंधाव), थर्मल (लेजर चोट), और रासायनिक चोट (FeCl3 / Rose Bengal अनुप्रयोग)। घनास्त्रता की प्रकृति स्थान (धमनी बनाम शिरापरक), विधि, या चोट की सीमा के आधार पर भिन्न होती है। इन सभी प्रकारों में, FeCl3-प्रेरित संवहनी चोट सबसे व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली विधि है। यह चूहों, चूहों, खरगोशों, गिनी सूअरों और कुत्तों 8,9,10,11,12 में नियोजित किया गया है। विधि अपेक्षाकृत सरल है, उपयोग करने में आसान है, और यदि प्रमुख मापदंडों को मानकीकृत किया जाता है, तो यह विभिन्न संवहनी प्रणालियों (जैसे, धमनियों [कैरोटिड और ऊरु], नसों [जुगुलर], और धमनी [क्रेमास्टर और मेसेंटेरिक]) में संवेदनशील और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है (पूरक तालिका 1)।

इस मॉडल का उपयोग थक्का गठन के यांत्रिकी और आकृति विज्ञान की हमारी समझ को आगे बढ़ाने के लिए भी किया जा सकता है। यह तकनीक विशिष्ट रूप से विभिन्न प्रवाह दर बिंदुओं पर घनास्त्रता को रोकने का लाभ प्रदान करती है, ताकि प्रक्रिया के मध्यवर्ती चरणों का अध्ययन किया जा सके। थ्रोम्बोसिस अनुसंधान में हालिया प्रगति ने इस मॉडल का उपयोग थ्रोम्बोलिसिस13 के गैर-औषधीय तरीकों या एंटी-थ्रोम्बोटिक और / या फाइब्रिनोलिटिकएजेंटों के गैर-इनवेसिव वितरण पर ध्यान केंद्रित करने के लिए किया है। कई समूहों ने दिखाया है कि, जब प्लेटलेट झिल्ली को इन चिकित्सीय के साथ लेपित किया जाता है, तो थक्कों को लक्षित करने के लिए थर्मल उत्तेजना पर दवाओं को सक्रियकिया जा सकता है। यहां वर्णित तकनीकें एकल प्लेटलेट स्तर पर उनके निष्कर्षों के सत्यापन के रूप में ऐसे अध्ययनों के लिए उपयोगी हो सकती हैं। इस पांडुलिपि में, प्रोटोकॉल 1 मूल FeCl3-मध्यस्थता संवहनी चोट प्रक्रिया का वर्णन करता है, जबकि प्रोटोकॉल 2 इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा आगे के विश्लेषण के लिए संवहनी चोट के नमूने को एकत्र करने और ठीक करने की विधि का वर्णन करता है।

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Protocol

यहां चर्चा किए गए सभी प्रयोगों की समीक्षा की गई और केंटकी विश्वविद्यालय में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी) द्वारा अनुमोदित किया गया।

नोट: सर्जिकल उपकरण चित्रा 1 और सामग्री की तालिका में सूचीबद्ध हैं। सी 57बीएल /6 जे चूहों, 8-10 सप्ताह के, पुरुष / महिला या प्रासंगिक आनुवंशिक रूप से हेरफेर (नॉकआउट या नॉकिन) उपभेदों का उपयोग किया गया था।

1. FeCl3-प्रेरित कैरोटिड धमनी की चोट

  1. माउस एनेस्थीसिया प्रेरण
    1. माउस का वजन करें।
    2. 0.2 ग्राम / किग्रा ट्राइब्रोमोएथेनॉल समाधान इंट्रापरिटोनियल (यानी) इंजेक्ट करके माउस को एनेस्थेटाइज करें। सुनिश्चित करें कि एनेस्थेटिक समाधान इंजेक्शन लगाने से पहले कमरे के तापमान (आरटी) पर है। यह खुराक माउस को लगभग 1 घंटे तक बेहोश करने के लिए पर्याप्त है।
    3. इंजेक्शन के 5 मिनट बाद पैर की अंगुली को चुटकी मारकर पैर की अंगुली रिफ्लेक्स की जांच करें ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि माउस बेहोश है। यदि माउस बेहोश नहीं है, तो यह अपने पैर की अंगुली को दूर खींच लेगा। यदि ऐसा होता है, तो 5 मिनट प्रतीक्षा करें और फिर से जांचें।
    4. यदि माउस अभी भी पूरी तरह से बेहोश नहीं है, तो प्रारंभिक खुराक का 1/4 प्रशासित करें और 5 मिनट तक प्रतीक्षा करें।
    5. प्रक्रिया के दौरान, समय-समय पर पैर की अंगुली-चुटकी के माध्यम से माउस के एनेस्थेटिक विमान की निगरानी करें। इसके अतिरिक्त, इष्टतम संज्ञाहरण बनाए रखने के लिए श्वसन दर और शरीर के तापमान की भी निगरानी की जा सकती है।
  2. माउस को गतिहीन करें
    1. माउस को हीटिंग पैड (37 डिग्री सेल्सियस) पर लापरवाह स्थिति में रखें और छोरों को गतिहीन करने के लिए चिपकने वाले टेप का उपयोग करें।
    2. गर्दन क्षेत्र का विस्तार करने के लिए माउस के ऊपरी सामने के दांतों को धीरे से खींचने के लिए एक सर्जिकल थ्रेड (0.1 मिमी) का उपयोग करें। यह सर्जिकल क्षेत्र के बेहतर विज़ुअलाइज़ेशन और डॉपलर जांच की स्थिरता के लिए महत्वपूर्ण है। धागे का आकार महत्वपूर्ण नहीं है, क्योंकि इसका उपयोग केवल गर्दन का विस्तार करने के लिए जानवर के सामने के दांतों को खींचने के लिए किया जाता है।
  3. चीरा
    1. सर्जिकल क्षेत्र को 70% इथेनॉल के साथ स्प्रे करें या इसे अल्कोहल वाइप से पोंछें।
    2. एक कपास के फाहे का उपयोग करके, सर्जिकल क्षेत्र पर थोड़ी मात्रा में बाल हटाने वाली क्रीम लागू करें। 1-2 मिनट तक प्रतीक्षा करें और फिर क्रीम को हटाने के लिए गीले पेपर तौलिया या ऊतक का उपयोग करें।
      नोट: यह कदम एक स्वच्छ शल्य चिकित्सा क्षेत्र के लिए महत्वपूर्ण है।
    3. कैंची और फोर्स (चित्र 1B11,1B13) का उपयोग करके, जबड़े से सुप्रास्टर्नल नॉच तक एक मध्य रेखा चीरा लगाएं। क्षेत्र का बेहतर विज़ुअलाइज़ेशन प्राप्त करने के लिए त्वचा को वापस लें (चित्रा 2 ए)।
  4. कैरोटिड धमनी जोखिम
    1. सर्जिकल फोर्स और माइक्रो डिस्सेक्शनिंग फोर्सप्स का उपयोग करके, सतही प्रावरणी को कुंद रूप से विच्छेदित करें और इसे बाईं कैरोटिड धमनी को उजागर करने के लिए हटा दें (चित्रा 1 बी 12, 1 बी 13)। सुनिश्चित करें कि इस क्षेत्र में अन्य वाहिका को घायल करने से बचने के लिए इस स्तर पर कैंची का उपयोग न करें।
    2. कैरोटिड धमनी के आसपास के अतिरिक्त ऊतक को हटा दें। आसपास के ऊतक के अत्यधिक विच्छेदन से बचें, क्योंकि यह क्षेत्र वेगस तंत्रिका और कशेरुक धमनी को आश्रय देता है।
    3. कैरोटिड धमनी को सर्जिकल और सीवन-बाइंडिंग फोर्सप्स (चित्रा 1 बी 12, 1 बी 15, 2 सी) के साथ विच्छेदित करके आसपास के ऊतक से अलग करें। सुनिश्चित करें कि धमनी या आसपास के वाहिका को किसी भी यांत्रिक चोट से बचने के लिए धमनी का विस्तार या खिंचाव न करें।
    4. चोट के स्थान को चिह्नित करने के लिए धमनी के नीचे प्लास्टिक का एक टुकड़ा रखें (चित्रा 2 डी)। सर्जिकल क्षेत्र में देखना आसान बनाने के लिए रंगीन पारदर्शिता शीट का उपयोग करें।
  5. प्रवाह जांच का प्लेसमेंट
    1. सर्जरी से पहले लगभग 10 मिनट के लिए डॉपलर ट्रांसोनिक प्रवाह जांच को खारा घोल (डीएच2ओ में 0.9% एनएसीएल) में रखें। प्रवाह के पढ़ने की सुविधा के लिए फ्लोमीटर में एक अनुलग्नक में जांच के दूसरे छोर को डालें। फ़्लोमीटर को कंप्यूटर से अनुलग्न करें.
      नोट: सर्जरी के बीच, डॉपलर ट्रांसोनिक प्रवाह जांच खारा होना चाहिए। पूरी प्रक्रिया के दौरान जांच को नम और साफ रखना सुनिश्चित करें।
    2. अल्ट्रासाउंड डॉपलर ट्रांसोनिक प्रवाह जांच को प्लास्टिक के ऊपर की ओर धमनी के चारों ओर रखें (चित्रा 2 डी)। सुनिश्चित करें कि जांच का पोत धारक क्षेत्र बहुत विस्तारित नहीं है (चित्रा 1 सी, लाल तीर)।
      नोट: यदि आवश्यक हो, तो जांच की उचित ऊंचाई प्राप्त करने के लिए धुंध पैड (चित्रा 1 बी 1) के साथ जांच का समर्थन करें, इष्टतम पढ़ने की स्थिति की सुविधा प्रदान करें।
    3. यदि सर्जिकल क्षेत्र इस बिंदु तक सूखा है, तो क्षेत्र को नम रखने के लिए आरटी खारा की कुछ बूंदें जोड़ें। प्रवाह जांच रीडिंग की निगरानी करें। इष्टतम रीडिंग प्रत्येक जानवर के लिए भिन्न होती है और 0.6-1.2 एमएल / मिनट के बीच कहीं भी हो सकती है। यदि यह कम या स्थिर नहीं है, तो इष्टतम रीडिंग प्राप्त करने के लिए प्रवाह जांच की स्थिति बदलें।
      नोट: सुनिश्चित करें कि माउस की गर्दन बहुत विस्तारित नहीं है, और यह कि सर्जिकल क्षेत्र साफ है।
  6. प्रवाह आधार रेखा रिकॉर्ड करें
    1. जांच रखने के बाद, यह सुनिश्चित करने के लिए 2 मिनट के लिए रक्त प्रवाह की निगरानी करें कि प्रवाह स्थिर है। फिर, बेसलाइन के रूप में 2 मिनट (चित्रा 3 बी) के लिए प्रवाह रिकॉर्ड करें। फ्लोमीटर के विस्तृत विवरण के लिए, सुब्रमण्यम एट अल.17 देखें।
    2. रक्त प्रवाह रिकॉर्ड करने के लिए, WinDAQ सॉफ़्टवेयर प्रारंभ करें। फ़ाइल विकल्प पर क्लिक करें और फिर रिकॉर्ड पर क्लिक करें। एक नया फ़ोल्डर और फ़ाइल बनाएँ, और रिकॉर्डिंग प्रारंभ करें। रिकॉर्डिंग रोकने के लिए, फ़ाइल अनुभाग में रोकें पर क्लिक करें.
      नोट: WinDAQ सॉफ़्टवेयर प्रकाशक से स्वतंत्र रूप से उपलब्ध है: https://www.dataq.com/products/windaq/.
  7. चोट
    1. प्रवाह की रिकॉर्डिंग बंद करें। सुनिश्चित करें कि जांच की स्थिति में बदलाव न करें ताकि चोट के बाद रीडिंग सुसंगत रहे।
    2. पेपर तौलिया से क्षेत्र को अच्छी तरह से सुखाएं।
      नोट: अवशिष्ट तरल की एक छोटी मात्रा भी संवहनी चोट पहुंचाने के लिए उपयोग किए जाने वाले FeCl3 समाधान की एकाग्रता को बदल सकती है। यह परिवर्तनीय परिणामों की ओर जाता है और प्रजनन क्षमता को प्रभावित करता है। जब क्षेत्र पूरी तरह से सूखा होता है, तो जांच प्रवाह को मापने में सक्षम नहीं होती है।
    3. प्लास्टिक वजन वाली नाव में, एक गोलाकार फिल्टर पेपर (1 मिमी व्यास, 1 मिमी व्यास के कान पंच के साथ काटा गया) डालें। फ़िल्टर पेपर पर 6% FeCl 3 समाधान (dH 2O में बनाया गया) का 1 μL जोड़ें।
      नोट: फ़िल्टर पेपर का उपयोग करने से ठीक पहले FeCl3 समाधान जोड़ना सुनिश्चित करें। पेपर को बहुत जल्दी भिगोने से FeCl3 समाधान का वाष्पीकरण हो सकता है और चोट की गंभीरता बदल सकती है।
    4. ठीक बल का उपयोग करके, फ़िल्टर पेपर उठाएं और इसे प्लास्टिक द्वारा चिह्नित धमनी के हिस्से पर जांच के ऊपर की ओर धमनी पर रखें (चित्रा 2 डी, ई)। यह प्लास्टिक मार्कर और स्पेसर की तरह काम करता है। यह घायल क्षेत्र को चिह्नित करता है और आसपास के नम क्षेत्र के संपर्क से बचकर FeCl3 के आकस्मिक कमजोर पड़ने को रोकता है।
      नोट: सुनिश्चित करें कि फ़िल्टर पेपर सीधा है, किसी भी तरह से पिन या अन्यथा मुड़ा हुआ नहीं है। एक बार धमनी पर रखने के बाद, फिल्टर पेपर की स्थिति न बदलें; ऐसा करने से चोट की सीमा बदल जाती है।
    5. फिल्टर पेपर रखने के बाद, टाइमर शुरू करें और रक्त प्रवाह रिकॉर्ड करें। 3 मिनट के बाद, पेपर को हटा दें और FeCl3 को हटाने और चोट प्रक्रिया को रोकने के लिए चोट की जगह पर खारा जोड़ें। यह क्षेत्र को नम भी बनाता है। इस स्तर पर, रक्त प्रवाह बेसलाइन स्तर पर वापस आ जाना चाहिए, जैसा कि पूर्व-चोट दर्ज किया गया है।
    6. प्रवाह की निगरानी करें और रिकॉर्ड करें जब तक कि यह मूल रिकॉर्डिंग के 10% तक कम न हो जाए या शून्य तक न पहुंच जाए। चोट स्थल पर थ्रोम्बस बनने के बाद लगातार कमी होती है (चित्रा 3 सी)। इस समय के दौरान प्रवाह में किसी भी महत्वपूर्ण उतार-चढ़ाव पर ध्यान दें।
    7. थ्रोम्बस की स्थिरता का अध्ययन करने के लिए, प्रत्येक महत्वपूर्ण और लगातार कमी के बाद रक्त प्रवाह में तेजी से वृद्धि दर्ज करें। इन घटनाओं को अस्थिर घनास्त्रता (चित्रा 4 डी) के कारण एम्बोलाइजेशन के रूप में वर्गीकृत किया गया है। प्रवाह में लगातार कमी के बाद, ऑपरेटर प्रयोग की समाप्ति पर धमनी पर चोट को देखने में सक्षम है (चित्रा 2 एफ, नीला तीर / डॉटेड अंडाकार)।
    8. वाहिका रोड़ा समय को कम से कम 1 मिनट के लिए रक्त प्रवाह की पूर्ण समाप्ति के रूप में परिभाषित किया गया है। उस समय को रिकॉर्ड करें जिस पर एक ऑक्लुसिव थ्रोम्बस बनता है, जैसा कि शून्य रीडिंग या प्रवाह में महत्वपूर्ण कमी से पता चलता है।
    9. प्रयोग को 30 मिनट पर समाप्त करें। यदि थ्रोम्बस निगरानी के 30 मिनट के भीतर नहीं बनता है, तो प्रवाह रिकॉर्ड करें, रिकॉर्डिंग बंद करें, और जांच को हटा दें।
    10. किसी भी अवशिष्ट ऊतक / बाल या मलबे को हटाने के लिए 70% इथेनॉल और ब्रश के साथ जांच को साफ करें। भंडारण बॉक्स में रखने से पहले जांच को पूरी तरह से सुखा लें। लंबे समय तक भंडारण के लिए भंडारण बॉक्स में रखने से पहले जांच को पूरी तरह से सुखा लें।
    11. गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था द्वारा माउस को इच्छामृत्यु करें। शव को शव निपटान बैग में रखें, जिसे प्रयोगशाला के नाम और तारीख के साथ लेबल किया गया है।

2. एफईसीएल3-प्रेरित चोट के बाद सीरियल ब्लॉक फेस स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (एसबीएफ-एसईएम) अध्ययन के लिए नमूनों का संग्रह और तैयारी

नोट: प्रस्तुत ईएम प्रोटोकॉल एसबीएफ-एसईएम के लिए नमूना तैयारी के लिए उपयुक्त है। यह इमेजिंग तकनीक एक थक्के में प्लेटलेट्स की त्रि-आयामी संरचना का अध्ययन करने की अभूतपूर्व क्षमता प्रदान करती है। इस तकनीक के साथ, नमूना को अनुक्रमिक ब्लॉक एसईएम छवियों की एक श्रृंखला के रूप में देखा जाता है, जो नमूने के माध्यम से प्रगति के रूप में उत्पन्न होता है। इस तैयारी के लिए मुख्य बिंदु हैं: 1) नमूना भारी धातुओं के पूर्व-एम्बेडिंग से सना होना चाहिए; और 2) प्लास्टिक एम्बेडेड नमूने को एसईएम के भीतर बढ़ने के लिए उचित रूप से छंटनी की जानी चाहिए (छंटनी किए गए नमूनों के दृश्य के लिए चित्रा 6 देखें)। एसईएम के भीतर पोस्ट-एम्बेडिंग धुंधला होना संभव नहीं है। ईएम विश्लेषण के लिए एफईसीएल3-प्रेरित पोत की चोट से एक नमूना एकत्र करते समय, सर्जरी करते समय निम्नलिखित परिवर्तन किए जाने की आवश्यकता होती है। प्रस्तुत FeCl3 सर्जरी प्रोटोकॉल में संशोधन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के किसी भी रूप पर भी लागू होते हैं। संज्ञाहरण की स्थिति और चीरा लगाने और कैरोटिड धमनी को उजागर करने के चरण प्रोटोकॉल 1 के समान हैं।

  1. कैरोटिड धमनी को उजागर करने के बाद, दो सर्जिकल धागे (आकार: 0.1 मिमी) (चित्रा 5 ए, बी) के बीच के क्षेत्र को शिथिल रूप से घेरकर चोट की साइट को चिह्नित करें।
  2. जांच को धमनी के नीचे रखें, निचले धागे से बाहर (चित्रा 5 सी)।
  3. FeCl3 चोट (चित्रा 5 सी) के लिए साइट को चिह्नित करने के लिए दो धागों के बीच धमनी के नीचे प्लास्टिक का टुकड़ा डालें।
  4. बेसल प्रवाह को नोट करने के लिए चोट करने से पहले प्रवाह माप लें। इन मापों का उपयोग यह तय करने के लिए किया जाता है कि नमूना किस चरण में एकत्र किया जाएगा।
    नोट: सुनिश्चित करें कि फिक्सेटिव (3% पैराफॉर्मलडिहाइड / पीएफए + 0.1% ग्लूटारल्डिहाइड, दोनों 1x PBS में बने) तैयार है और RT पर है। वैकल्पिक रूप से, खारा पृष्ठभूमि में 2.5% ग्लूटाराल्डिहाइड के साथ निर्धारण का भी उपयोग किया जा सकता है।
    चेतावनी: पैराफॉर्मलडिहाइड और ग्लूटारल्डिहाइड दोनों अत्यधिक विषाक्त और परेशान हैं। उन्हें संभालते समय, एक्सपोजर से बचाने के लिए दस्ताने, एक आई शील्ड और मास्क का उपयोग किया जाना चाहिए। सभी फिक्सेटिव समाधान विषाक्त हैं, और निर्धारण चरणों को एक फ्यूम हुड में किया जाना चाहिए।
  5. 3 मिनट के लिए धमनी पर FeCl3-भिगोया हुआ फ़िल्टर पेपर रखकर चोट का प्रदर्शन करें (8% FeCl3 का उपयोग किया जाता है) (यह समय भी भिन्न हो सकता है)। 3 मिनट के बाद, फिल्टर पेपर को हटा दें और किसी भी अतिरिक्त अवशिष्ट FeCl3 को हटाने के लिए चोट स्थल पर खारा जोड़ें। चोट की परिवर्तनीय सीमा को रोकने और जांच द्वारा प्रवाह गिनती की सुविधा के लिए यह कदम आवश्यक है (चित्रा 5 डी)।
  6. प्रवाह पढ़ने की निगरानी करें। जब प्रवाह प्रारंभिक मूल्य के 50% से नीचे चला जाता है, तो जांच को हटा दें। जल्दी से क्षेत्र को सुखाएं और बाहरी रूप से चोट क्षेत्र को ठीक करने के लिए क्षेत्र में फिक्सेटिव जोड़ें।
  7. चोट वाले क्षेत्र के पास धमनी को तुरंत पकड़ें, और निचले धागे के नीचे और ऊपरी धागे के ऊपर की ओर काट लें। यदि आवश्यक हो, तो किसी अन्य व्यक्ति को एक छोर काटने में मदद करने के लिए कहें। प्लास्टिक टिशू कल्चर डिश पर ऊतक को उसी अभिविन्यास में रखें जैसा कि इसे एकत्र किया गया था, और फिक्सेटिव की कुछ बूंदें जोड़ें।
    नोट: धमनी को काटने से तत्काल व्यापक रक्तस्राव होता है, इसलिए पहली बार काटने से पहले धमनी को पकड़ना सुनिश्चित करें। इस परिदृश्य में, माउस को हटा दिया गया है। माउस को एक्ससेंग्यूनेशन और सर्वाइकल डिस्लोकेशन द्वारा इच्छामृत्यु दी जाती है।
  8. स्केलपेल का उपयोग करके, धमनी के आसपास के अतिरिक्त ऊतक को साफ करें। रक्त प्रवाह के अभिविन्यास को रिकॉर्ड करने के लिए सावधान रहें। इसे चिह्नित करने के लिए, एक छोर को क्षैतिज रूप से काटें और दूसरे टेपरिंग / तिरछे (चित्रा 5 ई)।
  9. आरटी पर 1 घंटे के लिए नमूने को फिक्सेटिव (3% पीएफए और 0.1% ग्लूटारल्डिहाइड) में रखें। फिर, नमूने को 4 डिग्री सेल्सियस पर 1% पीएफए में स्टोर करें जब तक कि इसे ईएम विश्लेषण के लिए नमूना प्रसंस्करण प्रयोगशाला में गीली बर्फ पर नहीं भेजा जाता।
    नोट: नमूने जमे हुए नहीं होना चाहिए। नमूना संग्रह की इस विधि के लिए चुनौतियां हैं:
    1. प्रारंभिक रीडिंग इष्टतम नहीं हो सकती है या चोट के बाद उतार-चढ़ाव हो सकता है। यह चोट की सीमा को प्रभावित कर सकता है जिसे ईएम विश्लेषण के लिए गिरफ्तार करने के लिए चुना जाता है। इस समस्या को हल करने के लिए, यह तय करने के लिए जांच रखने की विभिन्न स्थितियों की कोशिश करने के बाद, कुछ मिनटों के लिए बेसलाइन रीडिंग रिकॉर्ड करना सुनिश्चित करें कि कौन सी स्थिति इष्टतम है।
    2. विश्लेषण के लिए धमनी अनुभाग के बाहरी फिक्सेटिव और वास्तविक काटने को जोड़कर चोट को गिरफ्तार करने का समय घनास्त्रता की सीमा में परिवर्तनशीलता जोड़ सकता है। बाहरी रूप से ठीक करने के बाद नमूना संग्रह के दौरान त्वरित रहें।
  10. गीली बर्फ पर 1% पीएफए में ईएम विश्लेषण के लिए प्रसंस्करण के लिए नमूने प्राप्त करें। आगे की प्रक्रिया शुरू करने के लिए 0.1 एम कैकोडाइलेट बफर के साथ बर्फ पर 3 मिनट के लिए नमूने को कुल्ला करें।
  11. 0.1 एम कैकोडाइलेट बफर + 2.5% ग्लूटारल्डिहाइड + 2 एमएमसीएसीएल 2 में बर्फ पर 1 घंटे के लिए नमूने तय करें।
  12. फिक्सेटिव को छोड़ दें और नमूनों को ठंडे 0.1 एम सोडियम कैकोडिलेट बफर के साथ धोएं जिसमें 2 एमएम सीएसीएल2 (5 x 3 मिनट) (चित्रा 6 ए) होता है।
  13. बर्फ पर 1 घंटे के लिए ऑस्मियम समाधान (3% पोटेशियम फेरोसाइनाइड [K4C6N6Fe] + 0.3 M कैकोडाइलेट बफर + 4 mM CaCl2 के साथ मिश्रित 4% जलीय ऑस्मियम टेट्रोक्साइड [OsO 4; ddH2O में]) के साथ नमूने को ठीक करें।
  14. जब नमूने ठीक हो रहे हैं, तो डीडीएच2ओ में ताजा 1% ट्राइक्लोरोएसेटालडिहाइड हाइड्रेट (टीसीएच) समाधान बनाएं।
  15. ठीक करने के बाद, नमूने को 5 x 3 मिनट के लिए आरटी पर डीडीएच2ओ के साथ धो लें।
  16. आरटी पर20मिनट के लिए फ़िल्टर किए गए 1% टीसीएच समाधान (डीडीएच 2 ओ में बनाया गया) में नमूने को इनक्यूबेट करें।
  17. आरटी (5 x 3 मिनट) पर डीडीएच2ओ के साथ नमूने धोएं।
  18. आरटी पर 30 मिनट के लिए डीडीएच 2 ओ में2% ऑस्मियम टेट्रोक्साइड में नमूने ठीक करें।
  19. प्रत्येक 5 x 3 मिनट के लिए आरटी पर डीडीएच2ओ के साथ नमूने धोएं।
  20. नमूनों को 1% यूरिनिल एसीटेट (जलीय) में रखें और 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करें।
  21. प्रत्येक 5 x 3 मिनट के लिए आरटी पर डीडीएच2ओ के साथ नमूने धोएं, और उन्हें वाल्टन के लीड एस्पार्टेट स्टेनिंग के साथ संसाधित करें।
  22. En bloc वाल्टन का लीड एस्पार्टेट धुंधला3:
    1. डीडीएच2ओ में 30 एमएम एल-एस्पार्टिक एसिड समाधान बनाएं।
      नोट: यदि पीएच को 3.8 तक बढ़ाया जाता है तो एस्पार्टिक एसिड अधिक तेज़ी से घुल जाता है। यदि प्रशीतित किया जाता है तो यह स्टॉक समाधान 1-2 महीने के लिए स्थिर होता है।
    2. एस्पार्टिक एसिड स्टॉक के 10 एमएल में 20 एमएम लीड नाइट्रेट समाधान बनाएं, और पीएच को 1 एन कोह के साथ 5.5 में समायोजित करें।
    3. नमूने को 30 मिनट के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर लीड एस्पार्टेट समाधान में रखें, आरटी में डीडीएच2ओ के साथ पांच धोने के बाद, प्रत्येक 3 मिनट के लिए।
  23. एक वर्गीकृत इथेनॉल श्रृंखला के साथ नमूनों को निर्जलित करें। वाल्डिविया प्रोटोकॉल18 द्वारा रासायनिक निर्जलीकरण का उपयोग करें।
    1. नमूने को उत्तरोत्तर निर्जलित करने के लिए निम्नलिखित समाधानों में से प्रत्येक में नमूने धोएं (चित्रा 6 बी):
      3 मिनट के लिए 25% एथिल अल्कोहल
      3 मिनट के लिए 50% एथिल अल्कोहल
      3 मिनट के लिए 75% एथिल अल्कोहल
      3 मिनट के लिए 95% एथिल अल्कोहल
      10 मिनट के लिए 100% एथिल अल्कोहल, और चरण को दो बार दोहराएं (कुल तीन वॉश)।
  24. नमूने को 10 मिनट के लिए 100% प्रोपलीन ऑक्साइड (पीओ) में धोएं, और चरण को दो बार दोहराएं (कुल तीन वॉश)।
  25. आरटी पर रात भर डीएमपी 30 एक्टिवेटर के साथ 50% /50% पीओ / राल में इनक्यूबेट करें, और 48 घंटे के लिए डीएमपी 30 एक्टिवेटर के साथ 100% अराल्डाइट 502/ एम्बेड 812 / डीडीएसए में एम्बेड करें।

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Representative Results

डेटा को आम तौर पर रोड़ा के समय के रूप में प्रस्तुत किया जाता है, या पूरी तरह से ऑक्लुसिव थ्रोम्बस बनाने के लिए आवश्यक समय होता है। इन आंकड़ों को कपलान-मीयर उत्तरजीविता वक्र (चित्रा 4 ए) 19 के रूप में प्लॉट किया जा सकता है, एक डॉट प्लॉट जिसमें रक्त प्रवाह की समाप्ति या प्रयोग की समाप्ति के समय टर्मिनल रक्त प्रवाह दिखाया जाता है (चित्रा 4 बी), या एक लाइन ग्राफ (चित्रा 4 सी) के रूप में। इस तकनीक का उपयोग करके थ्रोम्बस स्थिरता का अध्ययन किया जा सकता है। ज्यादातर मामलों में, FeCl3 की चोट पर, थ्रोम्बस धीरे-धीरे बनता है, और जैसे-जैसे यह बढ़ता है, रक्त प्रवाह उत्तरोत्तर कम हो जाता है, जो वाहिका के पूर्ण रोड़ा पर शून्य तक पहुंच जाता है। कुछ मामलों में, कुछ मिनटों के लिए धीरे-धीरे कमी के बाद रक्त प्रवाह अचानक बढ़ जाता है। इसे बढ़ते थ्रोम्बस के आंशिक शेडिंग के रूप में व्याख्या की जाती है, और इसे एम्बोलाइजेशन घटना (चित्रा 4 डी) के रूप में माना जा सकता है। ऑक्लुसिव थ्रोम्बस आकृति विज्ञान (चित्रा 7 ए) का अध्ययन इस विधि का उपयोग करके भी किया जा सकता है।

तालिका 1: FeCl3-प्रेरित थ्रोम्बोसिस मॉडल और समाधानों में संभावित तकनीकी चुनौतियां। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 1
चित्रा 1: चूहों में FeCl3-प्रेरित कैरोटिड धमनी घनास्त्रता करने के लिए आवश्यक सर्जिकल उपकरण। (ए) 1: एलईआईसीए एस 8एपी 0 माइक्रोस्कोप और स्टैंड। 2: एल्यूमीनियम पन्नी में कवर किए गए छोटे जानवर गर्म पैड। (बी) 1: धुंध स्पंज। 2: 26 जी एक्स 3/8 सुई। 3: 1 मिलीलीटर सिरिंज। 4: बाँझ कपास-टिन वाले एप्लिकेटर। 5: काली चोटी वाला रेशम सीवन। 6: सर्जिकल ब्लेड। 7: स्टेनलेस स्टील चाकू हैंडल। 8: वाणिज्यिक बाल हटाने क्रीम। 9: कान पंच। 10: कैंची का विच्छेदन। 11: बढ़िया कैंची। 12: सर्जिकल बल। 13: सूक्ष्म विच्छेदन बल। 14: आंखों की ड्रेसिंग बल। 15: सीवन बांधने वाला बल। (सी) लचीले क्षेत्र (लाल तीर) और एक पायदान के साथ ट्रांसोनिक प्रवाह जांच जो एक पोत (काला तीर) रखती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: चोट के लिए कैरोटिड धमनी तैयार करने और पोत रोड़ा को मापने के लिए सर्जिकल कदम। कैंची और सर्जिकल फोर्स का उपयोग करके, एक मध्यरेखा खंड बनाएं और धीरे से ऊतक (ए) को इसके नीचे कैरोटिड धमनी को उजागर करने के लिए खींचें (बी)। काला तीर रक्त प्रवाह (बी) की दिशा को दर्शाता है। कैरोटिड धमनी (सी) को घेरने वाले आसपास के ऊतकों को साफ करें और प्लास्टिक पेपर (काले तीर द्वारा दिखाए गए पीले प्लास्टिक) और जांच (डी) का एक टुकड़ा रखें। धमनी (ई) पर FeCl3-भिगोया हुआ फ़िल्टर पेपर (एक लाल तीर द्वारा दिखाया गया) रखकर पोत को घायल करें। कागज को हटा दें और चोट की निगरानी करें। अंत में, चोट एक पीले-सफेद लकीर के रूप में दिखाई देती है, जो नीले तीर (एफ) द्वारा इंगित की जाती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: फ्लोमीटर का उपयोग करके रक्त प्रवाह रीडआउट। कैरोटिड धमनी में रक्त प्रवाह को फ्लोमीटर (ए) का उपयोग करके मापा जाता है। प्रवाह फ़ाइल टैब (बी) में एक रिकॉर्ड फ़ंक्शन का उपयोग करके दर्ज किया जाता है। चोट का संचालन करने से पहले बेसलाइन प्रवाह अपेक्षाकृत स्थिर होना चाहिए (लगभग 0.8 एमएल / मिनट, एक काले तीर द्वारा दिखाया गया) (बी)। चोट के बाद, रक्त प्रवाह समान रूप से कम हो जाता है (प्रारंभिक मूल्य से लगभग 50% की कमी, लगभग 0.4 एमएल / मिनट), एक काले तीर (सी) द्वारा दिखाया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: FeCl3-प्रेरित कैरोटिड चोट मॉडल से प्रतिनिधि डेटा प्रस्तुतियाँ। FeCl3-प्रेरित संवहनी चोट से डेटा प्रस्तुत करने के लिए उपलब्ध विभिन्न तरीकों को दिखाया गया है। कपलान-मीयर उत्तरजीविता वक्र प्रत्येक माउस के लिए रोड़ा का समय दिखाते हैं। सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए एक लॉग-रैंक परीक्षण किया जाता है। पी ≤ 0.001 (ए)। प्रयोग के अंत में रक्त प्रवाह को बार ग्राफ (बी) में भी दर्शाया जा सकता है। बी में दर्शाए गए डेटा के लिए, 0.001 ≤ *** पी का एक अप्रकाशित टी-टेस्ट किया गया था। त्रुटि पट्टी माध्य ± SD का प्रतिनिधित्व करती है. एक एकल जानवर से चोट के बाद एकत्र किए गए डॉपलर प्रवाह डेटा को एक लाइन ग्राफ (सी) में प्रस्तुत किया जा सकता है। विभिन्न समय बिंदुओं (डी) पर एक माउस में प्रवाह में निरंतर क्रमिक कमी के बाद रक्त प्रवाह में अचानक वृद्धि से संभावित एम्बोलाइजेशन घटना का उदाहरण। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी अध्ययन के लिए FeCl3-प्रेरित चोट के थक्कों का संग्रह। धमनी (ए) को उजागर करने के बाद, धागे (बी) को शिथिल रूप से बांधकर चोट स्थल को चिह्नित करें, और प्लास्टिक पेपर को धमनी के नीचे रखें और जांच को इसके (सी) नीचे की ओर रखें। चोट का प्रदर्शन करें और क्षति (डी) की निगरानी करें। पाठ में बताए गए अनुसार ऊतक एकत्र करें, और रक्त प्रवाह की दिशा दिखाने के लिए नमूने को सीधे एक तरफ और दूसरी तरफ तिरछा साफ और काटें (काला तीर रक्त प्रवाह की दिशा दिखाता है और लाल रूपरेखा घायल क्षेत्र को इंगित करती है) (ई)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 6
चित्रा 6: इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए पोस्ट-फिक्सेशन प्रोसेसिंग और नमूनों का माउंटिंग। नमूने प्रसंस्करण चरणों (ए) के बीच माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में धोए जाते हैं और इथेनॉल (बी) की बढ़ती एकाग्रता के साथ क्रमिक रूप से निर्जलित होते हैं। प्रसंस्करण के बाद, उन्हें राल (सी) में एम्बेडेड किया जाता है, और ब्लॉक को रक्त प्रवाह (डी) की दिशा के साथ चिह्नित किया जाता है और फिर इमेजिंग के लिए स्लाइस में काटा जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 7
चित्रा 7: एफईसीएल3-मध्यस्थता कैरोटिड चोट के बाद पूरी तरह से ऑक्लुसिव थ्रोम्बस के समीपस्थ और डिस्टल क्षेत्रों के प्रतिनिधि इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ। (ए) एक अवरुद्ध धमनी का एक पूर्ण अनुप्रस्थ खंड, चोट स्थल के समीपस्थ, नीचे इनसेट के साथ, उच्च आवर्धन (ए: 2 एक्स, और ए': 4 एक्स) पर संरचनाओं को दर्शाता है। घायल क्षेत्र को A. स्केल बार में एक तीर के साथ दर्शाया गया है: 100 μm. (B) चोट स्थल से दूर, चोट स्थल से दूर, नीचे इनसेट के साथ, उच्च आवर्धन (b: 2x, और b': 4x) पर संरचनाओं को दर्शाते हुए एक अवरुद्ध धमनी का एक पूर्ण अनुप्रस्थ खंड। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक तालिका 1: पशु मॉडल में भिन्नताओं का एक संक्षिप्त सर्वेक्षण, FeCl3 चोट साइट, FeCl3 एकाग्रता, चोट विधि, और घनास्त्रता समय। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

थ्रोम्बोसिस को प्रेरित करने के लिए वास्कुलचर के लिए FeCl3 का सामयिक अनुप्रयोग एक व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली तकनीक है, और विभिन्न प्लेटलेट रिसेप्टर्स, लिगैंड सिग्नलिंग मार्गों और उनके अवरोधकों 20,21,22,23 के लिए भूमिकाएं स्थापित करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है। जिस तंत्र के माध्यम से FeCl3 घनास्त्रता का कारण बनता है वह बहुआयामी है; पहले, एंडोथेलियल डेंसेशन को थ्रोम्बोसिस का कारण माना जाता था, हालांकि हाल के वर्षों में, कई रिपोर्टों ने इस प्रक्रिया में लाल रक्त कोशिकाओं और प्लाज्मा प्रोटीन की भूमिका का सुझाव दियाहै 24,25,26,27।

इस प्रोटोकॉल में सबसे महत्वपूर्ण कदम हैं: इष्टतम प्रवाह प्राप्त करने के लिए डॉपलर जांच का प्लेसमेंट, फिल्टर पेपर का प्लेसमेंट, और नमूना को पुनर्प्राप्त करने और तुरंत ठीक करने के लिए चोट की शीघ्र समाप्ति। इन चरणों में दुर्घटनाओं के परिणाम और उन्हें कैसे संबोधित किया जाए, तालिका 1 में वर्णित हैं। हालांकि सरल और संवेदनशील, यह तकनीक पशु मॉडल, पशु पृष्ठभूमि, संवहनी चोट की साइट, FeCl 3 की एकाग्रता,FeCl 3 आवेदन विधि, आवेदन की अवधि, पशु आयु और लिंग, और उपयोग किए जाने वाले संज्ञाहरण के प्रकार के आधार पर नियोजित करने के लिए चुनौतीपूर्ण हो सकती है। ये अंतर साहित्य में रिपोर्ट किए गए C57BL/6J में घनास्त्रता समय की अपेक्षाकृत विस्तृत श्रृंखला के लिए जिम्मेदार हो सकते हैं (पूरक तालिका 1)27,28,29,30,31,32। यह प्रोटोकॉल प्रयोग के लिए 8-10 सप्ताह के चूहों का उपयोग करने का प्रस्ताव करता है, क्योंकि वाहिका आकार की कल्पना करना और सर्जरी करना आसान है। कुछ समूहों ने 6 सप्ताह33 वर्ष की उम्र के चूहों का उपयोग किया है। विभिन्न पशु समूहों के बीच सुसंगत और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य तुलना के लिए चूहों की उम्र का मिलान करना अनिवार्य है। वर्णित संज्ञाहरण, ट्राइब्रोमोएथेनॉल, को प्राथमिकता दी जाती है क्योंकि यह आसानी से उपलब्ध है, प्रशासन करना आसान है, यह आवश्यक अवधि के लिए एक एनेस्थेटिक विमान बनाए रखता है, और आवश्यक खुराक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है। कई अन्य एनेस्थेटिक विकल्प उपलब्ध हैं, जिनमें आइसोफ्लुरेन और तृतीयक एमाइल अल्कोहल के साथ ट्राइब्रोमोएथेनॉल के विभिन्न संयोजन शामिल हैं। पशु की हृदय गति या रक्तचाप को नकारात्मक रूप से प्रभावित किए बिना बेहोश करने की क्रिया को प्राप्त करने के लिए एक इष्टतम खुराक का उपयोग करना अनिवार्य है। पूरे प्रयोग में संज्ञाहरण की एक ही विधि का उपयोग थ्रोम्बोसिस समय पर संभावित कंपाउंडिंग प्रभावों को रोकता है।

यह पांडुलिपि डेटा विविधताओं को कम करने और प्रजनन क्षमता बढ़ाने के लिए एक विस्तृत प्रक्रिया प्रस्तुत करती है। इस सर्जरी के दौरान उत्पन्न होने वाली कुछ समस्याओं के निवारण के लिए एक तालिका प्रदान की जाती है (तालिका 1)। इसके अतिरिक्त, यह पांडुलिपि चोट के अंत में नमूने एकत्र करने के लिए एक विधि का प्रस्ताव करती है ताकि एक ऑक्लुसिव थ्रोम्बस की संरचना और आकृति विज्ञान का अध्ययन किया जा सके (चित्रा 7)। ईएम का रिज़ॉल्यूशन एक बढ़ते हुए थोंबस में प्लेटलेट्स के पहले संभव25 की तुलना में बेहतर विज़ुअलाइज़ेशन प्रदान करता है, और वे संवहनी चोट के समीपस्थ और डिस्टल दोनों अन्य प्लेटलेट्स और एंडोथेलियम के साथ कैसे बातचीत करते हैं। इसका उपयोग चोट स्थल पर प्लेटलेट्स के विभिन्न सक्रियण चरणों का अध्ययन करने के लिए भी किया जा सकता है।

इस तकनीक का एक और महत्वपूर्ण लाभ यह है कि ऑपरेटर यह तय करने के लिए बेसलाइन रीडिंग का उपयोग कर सकता है कि थ्रोम्बस नमूना किस स्तर पर एकत्र किया जाता है। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि ये अनुमानित समय हैं और चोट / घनास्त्रता की सटीक सीमा को इंगित नहीं करते हैं। बेसल रीडिंग जांच के इष्टतम स्थान पर निर्भर हैं, और यदि सही तरीके से नहीं रखा जाता है, तो रीडिंग केवल आंशिक प्रवाह रिकॉर्ड कर सकती है। यह समाप्ति समय की दोषपूर्ण व्याख्या की ओर जाता है और इसलिए एकत्र किए गए नमूने की आकृति विज्ञान। लगातार और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम प्राप्त करने के लिए चोट प्रक्रिया की शीघ्र समाप्ति और नमूनों के तत्काल निर्धारण की आवश्यकता होती है।

यह प्रोटोकॉल ऑक्लुसिव थ्रोम्बोसिस के मूल्यांकन के लिए न्यूनतम आवश्यक सेटिंग्स प्रस्तुत करता है। माइक्रोस्कोपी में प्रगति के साथ, कई समूहों ने विवो थ्रोम्बोसिस के विशिष्ट पहलुओं की कल्पना करने और इसके कैनेटीक्स34,35 को निर्धारित करने के लिए प्लेटलेट्स / एंडोथेलियल कोशिकाओं और / या प्लेटलेट रिलीजेट, जैसे पीएफ 4 और पी-सेलेक्टिन और फाइब्रिन को फ्लोरोसेंटली लेबल करने के लिए इस तकनीक का उपयोग किया है। जैसा कि वर्णित है, यहां विधि एम्बोलाइजेशन घटनाओं पर रिपोर्ट कर सकती है, जो थ्रोम्बस अस्थिरता (चित्रा 4 डी) का संकेत देती है।

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Disclosures

लेखकों के पास इस अध्ययन से संबंधित हितों का कोई टकराव नहीं है।

ORCID प्रोफाइल: S.J.: 0000-0001-6925-2116; S.W.W.: 00000-0001-5577-0473.

Acknowledgments

लेखक इस पांडुलिपि के सावधानीपूर्वक अवलोकन के लिए व्हाइटहार्ट प्रयोगशाला के सदस्यों को धन्यवाद देते हैं। इस काम को एनआईएच, एनएचएलबीआई (एचएल 56652, एचएल 138179, और एचएल 150818) से अनुदान और एसडब्ल्यूडब्ल्यू को वेटरन्स अफेयर्स मेरिट अवार्ड विभाग, बी.एस. को आर01 एचएल 155519, और आर.डी.एल. को एनआईबीआईबी इंट्राम्यूरल प्रोग्राम अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.9% Saline  Fisher Scientific  BP358-212 NaCl used to make a solution of 0.9% saline 
1 mL Syringe  Becton, Dickinson and Company  309659
190 Proof Ethanol  KOPTEC V1101  Used to make a 70% ethanol solution to use for prepping the mouse for surgery 
2,2,2 Tribromoethanol Sigma Aldrich 48402
25 Yard Black Braided Silk Suture (5-0) DEKNATEL 136082-1204
26G x 3/8 Needle  Becton, Dickinson and Company  305110
2-methyl-2-butanol Sigma Aldrich 240486
7.5 mL Transfer Pipet, Graduated to 3 mL Globe Scientific Inc. 135010
Alcohol Prep Pads (70% Isopropyl Alcohol) Medline MDS090735
Araldite GY 502  Electron microscopy Services  10900
Cell Culture Dish 35mm X 10mm  Corning Incorporated  430165
Compact Scale  Ward's Science  470314-390
Dissecting Scissors, 12.5 cm long World Precision Instrument 15922-G
DMP-30 activator  Electron microscopy Services  13600
Dodenyl Succinic Anhydride/ DDSA Electron microscopy Services  13700
Doggy Poo Bags/animal carcass disposal bag Crown Products  PP-RB-200
Doppler FlowProbe Transonic Systems Inc. MA0.5PSB
EMBED 812 resin  Electron microscopy Services  14900
Ethyl Alcohol, anhydrous 200 proof  Electron microscopy Services  15055
Eye Dressing Forceps, 4" Full Curved, Standard, 0.8mm Wide Tips Integra Miltex 18-784
Filter Paper  VWR 28310-106
Fine Scissors - Sharp-Blunt Fine Science Tools  14028-10
Finger Loop Ear Punches  Fine Science Tools  24212-01
Gauze Sponges 2” x 2” – 12 Ply  Dukal Corporation 2128
Glutaraldehyde (10% solution) Electron microscopy Services  16120
Integra Miltex Carbon Steel Surgical Blade #10 Integra® Miltex® 4110
Iron (III) Chloride  SIGMA-ALDRICH 157740-100G
Knife Handle Miltex® Extra Fine Stainless Steel Size 3 Integra Lifesciences  157510
L-aspartic acid Sigma Fisher  A93100
L-aspartic acid Fisher Scientific  BP374-100
Lead Nitrate  Fisher Scientific  L-62
LEICA S8AP0 Microscope LEICA No longer available No longer available from the company
LEICA S8AP0 Microscope Stand  LEICA 10447255 No longer available from the company
Light-Duty Tissue Wipers  VWR 82003-822
Micro Dissecting Forceps; 1x2 Teeth, Full Curve; 0.8 mm Tip Width; 4" Length Roboz Surgical Instrument Company RS-5157
Osmium Tetroxide 4% aqueous solution  Electron microscopy Services  19150
Paraformaldehyde (16% solution) Electron microscopy Services  15710
Potassium ferricyanide SIGMA-ALDRICH P-8131
Propylene Oxide, ACS reagent  Electron microscopy Services  20401
Rainin Classic Pipette PR-10 Rainin 17008649
Research Flowmeter  Transonic Systems Inc. T402B01481 Model: T402
Scotch Magic Invisible Tape, 3/4" x 1000", Clear Scotch  305289
Small Animal Heated Pad K&H Manufacturing Inc. Model: HM10
Sodium Cacodylate Buffer 0.2M, pH7.4 Electron microscopy Services  11623
Sterile Cotton Tipped Applicators  Puritan Medical Products  25-806 1WC
Steromaster Illuminator  Fisher Scientific  12-562-21 No longer available from the company
Surgical Dumont #7 Forceps  Fine Science Tools  11271-30
Thiocarbohydrazide (TCH) SIGMA-ALDRICH 88535
Universal Low Retention Pipet Tip Reloads (0.1-10 µL) VWR 76323-394
Uranyl Acetate Electron microscopy Services  22400
Veet Gel Cream Hair Remover Reckitt Benckiser 3116875
White Antistatic Hexagonal Weigh Boats, Medium, 64 x 15 x 19 mm Fisher Scientific  S38975
WinDAQ/100 Software for Windows DATAQ Instruments, Inc. Version 3.38 Freely available to download. https://www.dataq.com/products/windaq/
ZEISS AxioCam Icc 1 ZEISS 57615

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चिकित्सा अंक 193
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Joshi, S., Smith, A. N., Prakhya, K. S., Alfar, H. R., Lykins, J., Zhang, M., Pokrovskaya, I., Aronova, M., Leapman, R. D., Storrie, B., Whiteheart, S. W. Ferric Chloride-Induced Arterial Thrombosis and Sample Collection for 3D Electron Microscopy Analysis. J. Vis. Exp. (193), e64985, doi:10.3791/64985 (2023).

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