Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

التنبؤ بعلم الأدوية الشبكي والتحقق من صحة الأيض لآلية Fructus Phyllanthi ضد فرط شحميات الدم

Published: April 7, 2023 doi: 10.3791/65071
Automatic Translation
*1,2,3, *1,2,3, *1,2,3, 1,2,3, 1,2,3, 1,2,3, 1,2,3, 2,3
1School of Health Preservation and Rehabilitation, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2State Administration of Traditional Chinese Medicine Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine, Regimen and Health, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 3Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine Regimen and Health of Sichuan Province
* These authors contributed equally

Summary

يصف هذا البروتوكول استراتيجية متكاملة لاستكشاف الأهداف والآليات الرئيسية ل Fructus Phyllanthi ضد فرط شحميات الدم بناء على التنبؤ بعلم الأدوية الشبكي والتحقق من الأيض.

Abstract

أصبح فرط شحميات الدم عامل خطر رئيسي لأمراض القلب والأوعية الدموية وإصابات الكبد في جميع أنحاء العالم. Fructus Phyllanthi (FP) هو دواء فعال ضد فرط شحميات الدم في الطب الصيني التقليدي (TCM) ونظريات الطب الهندي ، ولكن الآلية المحتملة تتطلب مزيدا من الاستكشاف. يهدف البحث الحالي إلى الكشف عن آلية FP ضد فرط شحميات الدم بناء على استراتيجية متكاملة تجمع بين التنبؤ بعلم الأدوية الشبكي والتحقق من صحة الأيض. تم إنشاء نموذج الفئران التي يسببها نظام غذائي عالي الدهون (HFD) من خلال تقييم مستويات الدهون في البلازما ، بما في ذلك الكوليسترول الكلي (TC) والدهون الثلاثية (TG) وكوليسترول البروتين الدهني منخفض الكثافة (LDL-C) وكوليسترول البروتين الدهني عالي الكثافة (HDL-C). تم تطبيق علم الأدوية الشبكي لمعرفة المكونات النشطة ل FP والأهداف المحتملة ضد فرط شحميات الدم. تم إجراء الأيض للبلازما والكبد لتحديد المستقلبات التفاضلية والمسارات المقابلة لها بين المجموعة الطبيعية ومجموعة النموذج ومجموعة التدخل. تم بناء العلاقة بين علم الأدوية الشبكي والأيض للحصول على رؤية شاملة لعملية FP ضد فرط شحميات الدم. تم التحقق من البروتينات المستهدفة الرئيسية التي تم الحصول عليها عن طريق الالتحام الجزيئي. عكست هذه النتائج أن FP حسن مستويات الدهون في البلازما وإصابة الكبد من فرط شحميات الدم الناجم عن HFD. تم عرض حمض الغال ، كيرسيتين ، وبيتا سيتوستيرول في FP كمركبات نشطة رئيسية. تم العثور على ما مجموعه 16 وستة مستقلبات تفاضلية محتملة في البلازما والكبد ، على التوالي ، للمشاركة في الآثار العلاجية ل FP ضد فرط شحميات الدم عن طريق الأيض. علاوة على ذلك ، أشار تحليل التكامل إلى أن تأثيرات التدخل كانت مرتبطة ب CYP1A1 و AChE و MGAM ، بالإضافة إلى تعديل L-kynurenine و corticosterone و acetylcholine و raffinose ، والتي تتضمن بشكل أساسي مسار استقلاب التربتوفان. يضمن الالتحام الجزيئي أن المكونات المذكورة أعلاه التي تعمل على أهداف البروتين المرتبطة بفرط شحميات الدم لعبت دورا رئيسيا في خفض الدهون. باختصار ، قدم هذا البحث إمكانية جديدة لمنع وعلاج فرط شحميات الدم.

Introduction

فرط شحميات الدم هو مرض استقلابي شائع له آثار خطيرة على صحة الإنسان ، وهو أيضا عامل الخطر الرئيسي لأمراض القلب والأوعية الدموية1. في الآونة الأخيرة ، كان هناك اتجاه هبوطي مرتبط بالعمر لهذا المرض ، وأصبح الشباب أكثر عرضة بسبب أنماط الحياة غير المنتظمة طويلة الأجل وعادات الأكل غير الصحية2. في العيادة ، تم استخدام العديد من الأدوية لعلاج فرط شحميات الدم. على سبيل المثال ، واحدة من الأدوية الأكثر استخداما للمرضى الذين يعانون من فرط شحميات الدم واضطرابات تصلب الشرايين ذات الصلة هي العقاقير المخفضة للكوليسترول. ومع ذلك ، فإن الاستخدام طويل الأمد للعقاقير المخفضة للكوليسترول له آثار جانبية لا يمكن إهمالها ، مما يؤدي إلى سوء التشخيص ، مثل عدم تحمل ، ومقاومة العلاج ، والأحداث الضائرة 3,4. أصبحت أوجه القصور هذه آلاما إضافية لمرضى فرط شحميات الدم. لذلك ، ينبغي اقتراح علاجات جديدة لفعالية مستقرة لخفض الدهون وآثار جانبية أقل.

يستخدم الطب الصيني التقليدي (TCM) على نطاق واسع لعلاج الأمراض بسبب فعاليته الجيدة وآثاره الجانبية القليلة5. Fructus Phyllanthi (FP) ، الفاكهة المجففة من Phyllanthus emblica Linn. (المعروف شعبيا باسم أملا التوت أو عنب الثعلب الهندي) ، هو دواء مشهور ومواد غذائية متماثلة من الأدوية الصينية والهندية التقليدية 6,7. تم استخدام هذا الدواء لإزالة الحرارة وتبريد الدم وتعزيز الهضم ، وفقا لنظريات الطب الصيني التقليدي8. أظهرت الدراسات الدوائية الحديثة أن FP غني بالمركبات النشطة بيولوجيا مثل أحماض الغال والأحماض الإيلاجية والكيرسيتين9 ، المسؤولة عن مجموعة من الخصائص البيولوجية متعددة الأوجه ، من خلال العمل كمضاد للأكسدة ، ومضاد للالتهابات ، وحماية الكبد ، ومضاد لنقص شحميات الدم ، وما إلى ذلك10. أظهرت الأبحاث الحديثة أيضا أن FP يمكن أن ينظم بشكل فعال نسبة الدهون في الدم للمرضى الذين يعانون من فرط شحميات الدم. على سبيل المثال ، أظهر Variya et al.11 أن عصير الفاكهة FP ومكونه الكيميائي الرئيسي لحمض الغال يمكن أن يقلل من نسبة الكوليسترول في البلازما ويقلل من تسلل الزيت في الكبد والشريان الأورطي. كانت الفعالية العلاجية مرتبطة بتنظيم FP في زيادة التعبير عن مستقبلات ألفا المنشطة بتكاثر البيروكسيسوم وتقليل النشاط الشحمي الكبدي. ومع ذلك ، ينبغي إجراء مزيد من التحقيق في الآلية الأساسية ل FP في تحسين فرط شحميات الدم ، لأن مكوناته النشطة بيولوجيا واسعة جدا. سعينا لاستكشاف الآلية المحتملة للفعالية العلاجية ل FP ، والتي قد تكون مفيدة لمزيد من التطوير والاستفادة من هذا الدواء.

حاليا ، يعتبر علم الصيدلة الشبكي تقنية شاملة وفعالة لدراسة الآلية العلاجية للطب الصيني التقليدي. بدلا من البحث عن جينات واحدة مسببة للأمراض وعقاقير تعالج هدفا فرديا فقط ، يتم إنشاء شبكة كاملة من مكونات الأدوية والجينات والأمراض للعثور على آلية متعددة الأهداف للدواء متعدد المكونات فيما يتعلق بعلاجهم الشامل12. هذه التقنية مناسبة بشكل خاص للطب الصيني التقليدي ، حيث أن تركيباتها الكيميائية ضخمة. لسوء الحظ ، لا يمكن استخدام علم الأدوية الشبكي إلا للتنبؤ بالأهداف المتأثرة بالمكونات الكيميائية من الناحية النظرية. يجب ملاحظة المستقلبات الداخلية في نموذج المرض للتحقق من فعالية علم الأدوية الشبكي. تعد طريقة الأيض ، التي تظهر مع تطور بيولوجيا الأنظمة ، أداة مهمة لرصد التغيرات في المستقلبات الداخلية13. تعكس التغييرات في المستقلبات تغيرات الحالة المستقرة للمضيف ، وهو أيضا مؤشر مهم لدراسة الآلية الداخلية. نجح بعض الباحثين في دمج علم الأدوية الشبكي والأيض لاستكشاف آلية التفاعل بين الأدوية والأمراض14,15.

تستكشف هذه المقالة الأساس الميكانيكي ل FP ضد فرط شحميات الدم من خلال دمج تقنيات علم الأدوية الشبكي والتمثيل الغذائي. تم تطبيق علم الأدوية الشبكي لتحليل العلاقة بين المكونات النشطة الرئيسية في FP والأهداف الجزيئية لفرط شحميات الدم. في وقت لاحق ، تم إجراء الأيض لمراقبة تغير المستقلبات الداخلية في النموذج الحيواني ، والتي يمكن أن تفسر إجراءات الدواء على مستوى التمثيل الغذائي. بالمقارنة مع تطبيق علم الأدوية الشبكي أو الأيض وحده ، قدم هذا التحليل المتكامل آلية بحث أكثر تحديدا وشمولا. بالإضافة إلى ذلك ، تم استخدام استراتيجية الالتحام الجزيئي لتحليل التفاعل بين المكونات النشطة والبروتينات الرئيسية. بشكل عام ، يمكن لهذا النهج المتكامل أن يعوض عن نقص الأدلة التجريبية لعلم الأدوية الشبكي وعدم وجود آلية داخلية لطريقة الأيض ، ويمكن استخدامه لتحليل الآلية العلاجية للطب الطبيعي. يظهر المخطط الانسيابي التخطيطي الرئيسي للبروتوكول في الشكل 1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تم إجراء جميع الإجراءات التي تنطوي على التعامل مع الحيوانات وفقا لدليل جامعة تشنغدو للطب الصيني التقليدي لرعاية واستخدام المختبر وتمت الموافقة عليها من قبل لجنة الأخلاقيات المؤسسية بجامعة تشنغدو للطب الصيني التقليدي (رقم البروتوكول 2020-36). تم استخدام ذكور C57BL / 6 الفئران (20 ± 2 جم) في هذه الدراسة. تم الحصول على الفئران من مصدر تجاري (انظر جدول المواد).

1. التنبؤ القائم على علم الأدوية الشبكي

ملاحظة: يستخدم علم الأدوية الشبكي للتنبؤ بالمكونات النشطة وأهدافها الرئيسية من FP ضد فرط شحميات الدم.

  1. اختيار المكونات النشطة والأهداف الرئيسية
    1. ابحث عن الكلمة الرئيسية "Phyllanthi Fructus" في قاعدة بيانات علم الأدوية لنظام الطب الصيني التقليدي (TCMSP ؛ http://tcmspw.com/tcmsp.php) للحصول على قائمة المكونات النشطة المرشحة وأهداف FP.
      ملاحظة: عادة ، يتم تضمين المكونات ذات التوافر البيولوجي الفموي (OB) ≥30٪ والقيم الشبيهة بالأدوية (DL) ≥0.18 في قاعدة البيانات كمكونات نشطة.
    2. ابحث عن الكلمة الرئيسية "فرط شحميات الدم" في قاعدة بيانات GeneCards (https://www.genecards.org/) ، وقاعدة بيانات الوراثة المندلية عبر الإنترنت في الإنسان (OMIM ؛ https://omim.org/) ، وقاعدة بيانات الهدف العلاجي (TTD ؛ http://db.idrblab.net/ttd/) للحصول على الأهداف المرشحة المعنية لفرط شحميات الدم. قم بتنزيل جداول بيانات أهداف المرض. احذف الأهداف المتكررة للحصول على قائمة أهداف فرط شحميات الدم.
    3. انسخ هذه القوائم من الخطوتين 1.1.1 و1.1.2 إلى جدول بيانات جديد. استخدم وظيفة "البيانات - تحديد التكرارات" في شريط الأدوات للحصول على أهداف التقاطع. قم باستيراد قائمة هدف التقاطع إلى UniProtKB (http://www.uniprot.org/) لتوحيد أسماء الجينات والبروتينات.
      ملاحظة: ترتبط هذه الأهداف بكل من FP وفرط شحميات الدم. لذلك ، توقع أهداف التقاطع هذه كأهداف FP ضد فرط شحميات الدم.
  2. بناء شبكة تفاعل البروتين والبروتين
    1. افتح قاعدة بيانات STRING (https://string-db.org/) 11.5. الصق قائمة هدف التقاطع ل FP ضد فرط شحميات الدم في مربع الحوار "قائمة الأسماء". حدد الإنسان العاقل في "الكائنات الحية" وانقر على البحث > متابعة.
      ملاحظة: البشر والفئران لديهم جينات متشابهة للغاية. لذلك ، يتم إجراء مزيد من التحقق التجريبي مع الفئران.
    2. عندما تكون النتائج متاحة ، حدد إخفاء العقد غير المتصلة في الشبكة في "الإعدادات المتقدمة". قم بتعيين أعلى ثقة (0.900) في "الحد الأدنى من نقاط التفاعل المطلوبة" ، ثم انقر فوق الزر تحديث .
    3. انقر فوق الصادرات في شريط العنوان ، وقم بتنزيل النص الجدولي القصير لشبكة تفاعل البروتين والبروتين (PPI) بتنسيق PNG و TSV.
  3. بناء شبكة مستهدفة من مكونات الأدوية والأمراض
    1. افتح Cytoscape 3.9.1 (انظر جدول المواد). قم باستيراد ملف تنسيق TSV للخطوة 1.2.3. قم بتحسين لون عقد الشبكة وخطها وجانبها من خلال شريط الأنماط في لوحة التحكم.
    2. استخدم وظيفة "تحليل الشبكة" لتحليل طبولوجيا الشبكة. الحصول على جينات المحور بواسطة CytoHubba في Cytoscape. إنشاء شبكة الأدوية والمكونات والأمراض المستهدفة.
  4. تحليل التخصيب GO و KEGG
    1. افتح موارد المعلوماتية الحيوية DAVID (https://david.ncifcrf.gov/home.jsp). انقر فوق بدء التحليل والصق القائمة المستهدفة في مربع الحوار الأيسر. حدد رمز الجين الرسمي في "تحديد المعرف". حدد الإنسان العاقل في "حدد الأنواع". ضع علامة على قائمة الجينات في "نوع القائمة". انقر فوق إرسال القائمة.
    2. عندما تكون النتائج متاحة ، انقر فوق تحليل قائمة الجينات أعلاه باستخدام إحدى أدوات DAVID. ضع علامة GOTERM_BP_DIRECT ، GOTERM_CC_DIRECT ، GOTERM_MF_DIRECT في "علم الوجود الجيني" لتحليل إثراء وظيفة GO. ضع علامة KEGG_Pathway في "المسارات" لتحليل إثراء مسار KEGG.
    3. انقر فوق مخطط التعليقات التوضيحية الوظيفية لعرض النتائج.
      ملاحظة: تعيين عتبة الدلالة الإحصائية لتحليل الإثراء عند p < 0.05.

2. التصميم التجريبي

  1. إعداد مستخلص مائي FP
    ملاحظة: تتم معالجة FP في مختبر البروفيسور لينا شيا في جامعة تشنغدو في TCM8.
    1. نقع مسحوق المجففة من FP (90 غرام) في 1 لتر من الماء النقي في قارورة حجمية نظيفة 2 لتر. استخدم العلاج بالموجات فوق الصوتية (في حمام مائي 4 درجات مئوية ، الطاقة: 250 واط ، التردد: 35 كيلو هرتز) للمساعدة في الذوبان لمدة 30 دقيقة. قم بتصفية المحلول للحصول على المستخلص بشاش طبي معقم مزدوج الطبقة ، 1 مم × 1 مم. كرر العملية المذكورة أعلاه ثلاث مرات لضمان الحل الكامل ل FP.
    2. استخدم طريقة التبخر الدوار لمزيد من التركيز. اضبط سرعة الدوران على 50 دورة في الدقيقة مع درجة حرارة 60 درجة مئوية لمدة 4 ساعات. تركيز المستخلص المائي إلى 100 مل.
    3. قسم المستخلص الخام من FP (0.9 جم / مل) بالتساوي إلى جزأين (50 مل). يستخدم جزء واحد كجرعة عالية من سائل FP (0.9 جم / مل). أضف 50 مل من الماء النقي إلى جزء آخر ، واعتبره سائل FP منخفض الجرعة (0.45 جم / مل). استخدم المحاليل المائية FP عالية الجرعة والمنخفضة للإدارة. يخزن السائل في درجة حرارة -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
  2. إعداد الحيوان
    1. ضع 50 ذكرا من ذكور C57BL / 6 فئران (20 ± 2 جم) في غرفة جيدة التهوية في درجة حرارة الغرفة ، مع دورة 12 ساعة من الضوء والظلام والوصول المجاني إلى الطعام والماء النقي.
    2. قم بتعيين الفئران بشكل عشوائي إلى مجموعتين: إطعام 10 فئران بنظام غذائي عادي و 40 فأرا بنظام غذائي غني بالدهون (انظر جدول المواد) للحث على فرط شحميات الدم.
      ملاحظة: بعد الرضاعة لمدة 8 أسابيع ، تم فحص الفئران لمزيد من التدخل الدوائي.
    3. في الأسبوع 8 ، سحب حوالي 200 ميكرولتر من الدم من كل مدار الفأر. طرد مركزي الدم لمدة 10 دقائق عند 5733 × جم عند 4 درجات مئوية للحصول على عينات البلازما. حدد مستويات TC و TG باستخدام مجموعات الفحص المتاحة تجاريا (انظر جدول المواد).
    4. حدد ستة فئران ذات مستويات الدهون الأكثر طبيعية كمجموعة التحكم في عدم العلاج (NC). حدد 24 فأرا ذات مستوى دهون أعلى بكثير كمجموعة نظام غذائي عالي الدهون ، وقسمها عشوائيا إلى أربع مجموعات: مجموعة النظام الغذائي عالي الدهون (HFD) ، ومجموعة FP (FP_L) منخفضة الجرعة ، ومجموعة FP (FP_H) عالية الجرعة ، ومجموعة التحكم الإيجابي (PC).
    5. تطبيق الري المعدي لدى المجموعتين FP_L و FP_H بجرعتين من FP (جرعة منخفضة، 4.5 غ/كغ وجرعة عالية، 9 غ/كغ)، على التوالي؛ ري المعدة لمجموعة PC باستخدام أقراص سيمفاستاتين (5 مجم / كجم ؛ انظر جدول المواد) ؛ وري المعدة لمجموعات NC و HFD بنفس الحجم من المحلول الملحي الفسيولوجي مرة واحدة يوميا لمدة 4 أسابيع.
      ملاحظة: استخدمت الدراسة الحالية المحاليل المائية ل FP و simvastatin للعلاج.
    6. في الأسبوع الثاني عشر ، بعد التخدير بنسبة 1٪ بنتوباربيتال الصوديوم (30 ملغم / كغم) ، التضحية الفئران من جميع المجموعات. جمع ~ 400 ميكرولتر عينات الدم من الوريد المداري لكل فأر.
      ملاحظة: تحفيز أصابع وباطن الفئران بالملاقط. إذا لم يكن هناك رد فعل ، فإنه يثبت التخدير الكافي.
    7. طرد مركزي الدم لمدة 10 دقائق عند 5733 × جم عند 4 درجات مئوية للحصول على عينات البلازما ، وتحديد مستويات TC و TG و LDL-C و HDL-C مع مجموعات الفحص المتاحة تجاريا (انظر جدول المواد). الحصول على عينات أنسجة الكبد16 وإخضاعها للتحليل النسيجي المرضي. استخدم عينات البلازما والكبد المتبقية لتحليل الأيض (الخطوة 3).
      ملاحظة: يتم تخزين جميع العينات في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
  3. فحص أمراض الأنسجة الكبدية
    1. إصلاح أنسجة الكبد الطازجة مع محلول بارافورمالدهيد 4 ٪ لأكثر من 24 ساعة. أخرج الأنسجة من المثبت وقم بتنعيم الأنسجة المستهدفة بمشرط. ضع المنديل والملصق المقابل في المجفف.
    2. الجفاف في تدرج الإيثانول: 75٪ كحول لمدة 4 ساعات ، 85٪ كحول لمدة 2 ساعة ، 90٪ كحول لمدة 2 ساعة ، 95٪ كحول لمدة 1 ساعة ، إيثانول مطلق لمدة 1 ساعة ، زيلين لمدة 30 دقيقة. ضع علبة المناديل في قالب مناديل في شمع البارافين لمدة ثلاث غسلات ، 30 دقيقة لكلمنها 16.
    3. ضع المناديل المنقوعة بالشمع في أداة تضمين الأنسجة (انظر جدول المواد). قبل أن يصلب الشمع ، قم بإزالة الأنسجة من المجفف ، وضعها في الصندوق المضمن ، وأرفق الملصق المقابل.
    4. قم بتبريد كتل الشمع في طاولة تجميد -20 درجة مئوية ، وقم بإزالتها من الإطار المضمن ، وقم بقص كتلة الشمع.
    5. قطع كتل الشمع المشذبة إلى أقسام بسمك 3 ميكرومتر باستخدام ميكروتوم (انظر جدول المواد). تطفو المقاطع في ماء 40 درجة مئوية ، وتخرجها من الشرائح ، وتخبز في فرن 60 درجة مئوية. بعد الخبز بالماء والشمع الجاف ، أخرجه واحتفظ به في درجة حرارة الغرفة.
    6. ضع الأقسام على التوالي في الزيلين I لمدة 10 دقائق ، والزيلين II لمدة 10 دقائق ، والزيلين الثالث لمدة 10 دقائق ، والإيثانول المطلق I لمدة 5 دقائق ، والإيثانول المطلق II لمدة 5 دقائق ، والكحول بنسبة 75٪ لمدة 5 دقائق ، واغسله بالماء16.
    7. قم بتلطيخ الأقسام بمحلول تلطيخ الهيماتوكسيلين لمدة 4 دقائق ، ومحلول كحول حمض الهيدروكلوريك 1٪ (75٪ كحول) للتمايز ، ومحلول ماء الأمونيا 1٪ باللون الأزرق ، واغسلها بالماء.
    8. تلطيخ المقاطع بمحلول تلطيخ eosin لمدة 2 دقيقة واغسلها بالماء.
    9. راقب الأقسام باستخدام مجهر بصري بتكبير 200x و 400x.
  4. تحليل الكروماتوغرافيا السائلة - قياس الطيف الكتلي (LC-MS)
    1. تحديد مكونات FP
      ملاحظة: يتم إجراء التحليل باستخدام كروماتوغرافيا سائلة فائقة الأداء مقترنة بقياس الطيف الكتلي الهجين رباعي الأقطاب المداري عالي الدقة (UPLC-Q-Orbirap HRMS, LC-MS; انظر جدول المواد).
      1. قم بقياس 1 غرام من مسحوق FP المجفف بدقة ووضعه في قارورة حجمية نظيفة سعة 50 مل.
      2. أضف 25 مل من 70٪ ميثانول إلى الدورق الحجمي وقم بوزنه بدقة. استخدم العلاج بالموجات فوق الصوتية (في حمام مائي 4 درجات مئوية ، الطاقة: 250 واط ، التردد: 35 كيلو هرتز) لمدة 30 دقيقة للمساعدة في الذوبان. قم بالوزن بدقة مرة أخرى لتحديد الخسارة بدقة بعد الذوبان ، واستخدم 70٪ ميثانول لتعويض الخسارة.
        ملاحظة: لا تقيس الحجم ، لأن مقياس القارورة الحجمية غير دقيق ، خاصة بعد حمام الماء 4 درجات مئوية.
      3. رج العبوة حتى تمتزج تماما. استخدم غشاء صغير يسهل اختراقه 0.22 ميكرومتر للتصفية.
    2. إعداد عينة البلازما
      1. أضف بدقة 100 ميكرولتر من البلازما (الخطوة 2.2.7) إلى حجم مزدوج (200 ميكرولتر) من الأسيتونيتريل في أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 مل ، وقم بدوامته بهزاز دوامة لمدة 30 ثانية على الأقل. اتبع هذا الإجراء لجميع العينات.
      2. أجهزة الطرد المركزي جميع العينات عند 17200 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. نقل المواد الطافية بعد الطرد المركزي إلى أنبوب طرد مركزي جديد سعة 1.5 مل. تجفيف المواد الطافية تحت النيتروجين. إعادة تكوين مع 200 ميكرولتر من مذيب الاستخراج (الأسيتونيتريل: الماء = 4: 1 [v / v]).
      3. دوامة الحل المعاد تشكيله لمدة 30 ثانية على الأقل واستخدام العلاج بالموجات فوق الصوتية لمدة 10 دقائق (في حمام مائي 4 درجات مئوية ، الطاقة: 250 واط ، التردد: 35 كيلو هرتز). أجهزة الطرد المركزي عند 17200 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
      4. قم بتصفية المواد الطافية بأغشية مرشح 0.22 ميكرومتر واحتفظ بها عند 4 درجات مئوية للتحليل.
    3. تحضير عينة الكبد
      1. تجانس 90 ملغ من أنسجة الكبد (الخطوة 2.2.7) لمدة دقيقة واحدة في ماء الميثانول المثلج البارد (1: 1 ، v / v ، 1 مل) وطردها مركزيا عند 21500 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. نقل المادة الطافية إلى أنابيب طرد مركزي سعة 1.5 مل. اتبع هذا الإجراء لجميع العينات.
      2. استخرج الرواسب مرة أخرى باتباع نفس الإجراء ، وقم بتجميع المواد الطافية معا في أنابيب طرد مركزي جديدة سعة 1.5 مل. تجفيف المواد الطافية تحت النيتروجين. إعادة تكوين مع 300 ميكرولتر من مذيب الاستخراج (الميثانول: الماء = 4: 1 [v / v]).
      3. دوامة الحل المعاد تشكيله لمدة 30 ثانية على الأقل واستخدام العلاج بالموجات فوق الصوتية لمدة 10 دقائق (في حمام مائي 4 درجات مئوية ، الطاقة: 250 واط ، التردد: 35 كيلو هرتز). أجهزة طرد مركزي عند 17200 × جم لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
      4. قم بتصفية المواد الطافية بأغشية مرشح 0.22 ميكرومتر واحتفظ بها عند 4 درجات مئوية للتحليل.
        ملاحظة: تم تحضير عينات مراقبة الجودة المجمعة (QC) عن طريق خلط 10 ميكرولتر من كل عينة بلازما وكبد (واحدة لكل ست عينات).
    4. معلمات تحليل LC-MS
      ملاحظة: يتكون الطور المتحرك من 0.1٪ حمض الفورميك (المذيب A) والأسيتونيتريل (المذيب B). انقل هذه المذيبات إلى زجاجة زجاجية نظيفة وقم بتوصيلها بنظام LC-MS.
      1. اضبط برامج التدرج لعينات البلازما في "ملف المدخل" لنظام LC-MS على النحو التالي: 1٪ B (0-1.5 دقيقة) ، 1٪ -60٪ B (1.5-13.0 دقيقة) ، 60٪ -99٪ B (13.0-20.0 دقيقة) ، الحفاظ على 99٪ B (20.0-25.0 دقيقة) ، 99٪ -1٪ B (25.0-25.1 دقيقة) ، والحفاظ على 1٪ B حتى 27 دقيقة.
      2. اضبط شروط أخذ العينات الأوتوماتيكية لعينات البلازما في "ملف المدخل" لنظام LC-MS على النحو التالي: حجم الحقن ، 2 ميكرولتر ؛ ومعدل التدفق ، 0.3 مل / دقيقة ، لكل تحليل.
      3. اضبط برنامج التدرج لعينات الكبد في "ملف المدخل" لنظام LC-MS على النحو التالي: 1٪ B (0-1 دقيقة) ، 1٪ -53٪ B (1-15 دقيقة) ، 53٪ -70٪ B (15-30 دقيقة) ، 70٪ -90٪ B (30-32 دقيقة) ، 90٪ -95٪ B (32-40 دقيقة) ، 95٪ -1٪ B (40-42 دقيقة) ، والحفاظ على 1٪ B حتى 45 دقيقة.
      4. اضبط شروط أخذ العينات الأوتوماتيكية لعينات الكبد في "ملف المدخل" لنظام LC-MS على النحو التالي: حجم الحقن ، 5 ميكرولتر ؛ ومعدل التدفق ، 0.3 مل / دقيقة ، لكل تحليل.
      5. قم بتعيين شروط اكتشاف مرض التصلب العصبي المتعدد لكل من عينات البلازما والكبد في "ملف ضبط MS" لنظام LC-MS. قم بإجراء اكتساب MS باستخدام أوضاع التأين الموجبة والسالبة.
        ملاحظة: معلمات التأين بالرش الكهربائي المسخن هي كما يلي: جهد الرش: 3.5 كيلو فولت للتأين الإيجابي و 3.8 كيلو فولت للتأين السلبي ؛ تدفق غاز الغمد: 55 ARB ؛ تدفق الغاز الإضافي: 15 ARB ؛ درجة حرارة سخان المسبار: 300 °C ؛ ودرجة حرارة الشعيرات الدموية: 350 درجة مئوية.
      6. قم باستيراد البيانات الأولية المجمعة إلى برنامج Compound Discoverer، وقم بتعيين قالب الطريقة باتباع إرشادات الشركة المصنعة (انظر جدول المواد).

3. التحقق من التمثيل الغذائي

ملاحظة: يتم استيراد بيانات التنميط الأيضي لمستقلبات البلازما والكبد إلى برنامج Compound Discoverer لإجراء استخراج ميزة التمثيل الغذائي من خلال اعتماد خوارزمية استخراج الميزة الجزيئية. اضبط المعلمات على النحو التالي: انحراف الكتلة ، 5 × 10-6 ؛ نطاق الكتلة ، 100-1500 ؛ عتبة نسبة الإشارة إلى الضوضاء (SNR) ، 3 ؛ وانحراف وقت الاستبقاء ، 0.05. تقييم استقرار وتكرار الأيض من خلال الانحراف المعياري النسبي (RSD) لمناطق ذروة مراقبة الجودة.

  1. استخدم برنامج SIMCA-P (انظر جدول المواد) للتحليل الإحصائي متعدد المتغيرات للقيم المتكاملة التي تم الحصول عليها من نتائج LC-MS. استخدم التحليل التمييزي للمربعات الصغرى الجزئية المتعامدة (OPLS-DA) للبيانات المتمركزة حول المتوسط ونمذجة فئات العينة.
  2. بعد اختبار OPLS-DA ، ضع في اعتبارك المستقلبات ، مع تكامل مع أهمية متغيرة في قيم الإسقاط (VIP) البالغة >1 وقيمة p تبلغ <0.05 من اختبار t للطالب كمستقلبات تفاضلية محتملة.
  3. تحديد المستقلبات المضطربة والمسارات الأيضية من خلال مصادر قاعدة البيانات المفتوحة ، بما في ذلك الأيض البشري (HMDB ؛ http://www.hmdb.ca/) ، موسوعة كيوتو للجينات والجينوم (KEGG ؛ https://www.kegg.jp/) ، و MetaboAnalyst5.0 (https://www.metaboanalyst.ca/).
  4. تصور طرق عرض النتائج بواسطة MetaboAnalyst5.0 ومنصة "Wu Kong" (https://www.omicsolution.com/wkomics/main/).

4. الالتحام الجزيئي

  1. قم بتنزيل بنية 3D لمكونات FP المحددة من قاعدة بيانات TCMSP ، على التوالي. ابحث في أسماء المكونات في مربع البحث "الاسم الكيميائي" وقم بتنزيل ملفات بنية 3D المقابلة بتنسيق mol2.
  2. قم بتنزيل الهياكل البلورية للأهداف الرئيسية من قاعدة بيانات بنية البروتين AlphaFold (Alphafold DB ؛ ، https://alphafold.ebi.ac.uk/). ابحث عن الأسماء المستهدفة في مربع البحث وقم بتنزيل ملفات الهياكل البلورية المقابلة بتنسيق pdb.
  3. استيراد المكونات وملف الهياكل الهدف إلى برنامج AutoDockTools. انقر فوق تحرير > حذف الماء لحذف جزيئات الماء. انقر فوق تحرير > الهيدروجين > إضافة لإضافة الهيدروجين . اضبط المكونات على أنها "ligand" وقم بإجراء التحام الأعمى عن طريق تحديد الأهداف بأكملها ك "المستقبل"17.
  4. أدخل قيمة في المربع خلف "المركز" و "الحجم" لضبط المساحة المطورة حديثا ، مما يجعل من الممكن تضمين الرباط والمستقبل بالكامل. احفظ ملفات الليجند والمستقبلات بتنسيق pdbqt.
  5. استخدم AutoDock Vina لإجراء الإرساء الجزيئي. اضبط شريط "المستقبلات" على اسم "receptor.pdbqt" ، وشريط "Ligand" على اسم "ligand.pdbqt". الحصول على الموقع الأمثل لربط يجند للمستقبلات. سجل قيمة طاقة الربط في الموضع الأمثل.
    ملاحظة: تم حساب عملية الإرساء بواسطة الخوارزمية الجينية14. كانت جميع خيارات تشغيل الإرساء قيما افتراضية. سيتم تصنيف إطارات الإرساء تلقائيا من أعلى إلى أدنى طاقة ربط.
  6. قم باستيراد ملفات الإرساء إلى PILP (https://plip-tool.biotec.tu-dresden.de/plip-web/plip/index منشئ ملفات تعريف تفاعل البروتين واليجند) للحصول على نموذج النظام المرئي. قم بتنزيل ملفات النموذج بتنسيق pse ، وقم باستيرادها إلى برنامج PyMOL (انظر جدول المواد) لإنشاء مزيد من التصور.

5. التحليل الإحصائي

ملاحظة: استخدم برنامج SPSS الإحصائي (انظر جدول المواد) لتحليل البيانات. ضع في اعتبارك قيمة p < 0.05 ذات دلالة إحصائية.

  1. التعبير عن القيم كوسائل ± الانحراف المعياري (SD).
  2. قم بإجراء ANOVA أحادي الاتجاه متبوعا بالفرق الأقل أهمية (LSD) أو Dunnett (في حالة التباين المتساوي) أو Dunnett's T3 (في حالة التباين غير المتكافئ) لاختبار الدلالة الإحصائية بين المجموعات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

علم الأدوية الشبكي
تم فحص ما مجموعه 18 مكونا محتملا في FP وفقا لخصائصها الدوائية والديناميكية الدوائية من قاعدة البيانات وتحليل LC-MS (يتم عرض إجمالي الكروماتوجرام الأيوني في الشكل التكميلي 1). من خلال الأدبيات ذات الصلة ، يكون محتوى حمض الغال أعلى بكثير من المكونات الأخرى وهو فعال في خفض الدهون 9,11. لذلك ، اعتبر هذا المكون مكونا محتملا أيضا. في المجموع ، تم تأسيس 19 مكونا و 134 هدفا متعلقا بالمكونات ل FP. جميع المكونات ال 19 موضحة في الجدول 1. لاختيار المكونات الأكثر تمثيلا لمزيد من التحليل ، تم استيراد هذه المكونات إلى أداة تحليل المعلوماتية الحيوية لقاعدة بيانات الميكانيكية الجزيئية للطب الصيني التقليدي (BATMAN-TCM ؛ http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/). وفقا لشبكة مرض المكون والهدف والمسار ، تم تحديد بعض المكونات النشطة بيولوجيا ، مثل حمض الغال والكيرسيتين وبيتا سيتوستيرول ، على أنها أهم مكونات FP المتعلقة بفرط كوليسترول الدم وتصلب الشرايين التاجية (الشكل التكميلي 2). من بين هذه ، حمض الغال هو واحد من الأحماض الفينولية الأكثر دراسة على نطاق واسع. هذا هو العنصر النشط بيولوجيا الرئيسي المقدم في FP18. وفي الوقت نفسه ، حمض الغال هو أيضا أعلى عنصر محتوى في FP. تركيزه عادة ما يكون 1 ٪ إلى 3 ٪. كشف الحسيني وآخرون 19 أن حمض الغال يمكن أن يحد من إصابة القلب ، ويحسن صورة الدهون ، ويقلل من علامات التهاب القلب. محتويات كيرسيتين وبيتا سيتوستيرول أقل ، لكن بعض الدراسات أثبتت تأثيرها على خفض الدهون. كيرسيتين ، باعتباره فلافونويد مهم موجود على نطاق واسع في النباتات ، له خصائص مختلفة ، مثل تأثيرات الحماية المضادة للأكسدة والمضادة للالتهابات والقلب والأوعية الدموية20. درس Lu et al.21 أن العصير المخصب بالكيرسيتين يمكن أن يخفف من مستويات TC و LDL-C و HDL-C لدى الأفراد الأصحاء المصابين بفرط كوليسترول الدم الخفيف. أما بالنسبة لبيتا سيتوستيرول ، فقد أظهرت الدراسات السريرية أن ستيرول النبات يمكن أن يمنع بشكل كبير فرط كوليسترول الدم وأمراض القلب والأوعية الدموية22,23. أثبت Althwab et al.24أن بيتا سيتوستيرول يمكن أن يحسن صورة الدهون ومؤشر تصلب الشرايين في الفئران HFD. يمكن ملاحظة أن تأثير خفض الدهون في FP قد يكون مرتبطا بهذه المكونات الثلاثة.

بالإضافة إلى ذلك ، تم جمع 1,552 هدفا مرتبطا بفرط شحميات الدم من قواعد بيانات Genecards و OMIM و TTD. بعد مطابقة 134 هدفا متعلقا ب FP مع الأهداف المتعلقة بفرط شحميات الدم ، تم تحديد 62 هدفا كأهداف محتملة ل FP ضد فرط شحميات الدم (الشكل 2 أ). تم تطبيع جميع الأهداف المتقاطعة إلى رموزها الرسمية ، وفقا لقاعدة بيانات UniProt. بعد ذلك ، تم إنشاء شبكة PPI بواسطة STRING (الشكل 2B) و Cytoscape (الشكل 2C). من خلال الجمع بين درجات الأساليب الحسابية ، كانت الأهداف العشرة الأولى هي ESR1 و RELA و FOS و EGFR و HIF1A و AR و CCND1 و IL6 و MAPK8 و MYC. وترد التفاصيل في الشكل التكميلي 3. كل هذه الأهداف ال 62 هي أساس لمزيد من التحليل ، والذي يتكامل مع نتائج الأيض.

تم تنفيذ مسارات GO و KEGG عن طريق تحليل الإثراء. تم اختيار أفضل 15 مسارا ، وفقا لعدد الأهداف ، للتحليل وفقا للقيمة الاحتمالية. أشارت نتائج إثراء GO إلى أن العمليات البيولوجية والوظيفة الجزيئية ل FP ضد فرط شحميات الدم كانت مرتبطة بشكل أساسي بالتعبير الجيني وربط البروتين (الشكل 2D). أثبت إثراء KEGG أن FP يمكن أن يتدخل في عملية استقلاب الدهون وتصلب الشرايين (الشكل 2E) ، مما يعني أن FP يخفف من فرط شحميات الدم من خلال التأثير على استقلاب الدهون.

تأثير FP على مستويات الدهون في البلازما ومؤشر الكبد
لاختبار التأثير المحسن ل FP على فرط شحميات الدم ، تم قياس التغيرات في TC و TG و LDL-C و HDL-C ومؤشر الكبد (نسبة وزن الكبد إلى وزن الجسم) أولا. بالمقارنة مع مجموعة NC ، أظهرت الفئران في مجموعة HFD زيادة كبيرة في مستويات البلازما من TC (p < 0.001) و LDL-C (p < 0.001) و TG (p < 0.05) ، مما يشير إلى أن تدخل HFD على المدى الطويل يمكن أن يزيد من مستويات الدهون ويحفز فرط شحميات الدم (الشكل 3).

بعد إعطاء المستخلص المائي FP ، انخفضت مستويات TC في مجموعات FP_L و FP_H بشكل ملحوظ (p < 0.05) بنسبة 18.8٪ و 12.4٪ على التوالي (الشكل 3 أ). انخفضت مستويات LDL-C في مجموعات FP_L و FP_H بشكل ملحوظ (p < 0.05) بنسبة 13.7٪ و 21.8٪ على التوالي (الشكل 3B). وفيما يتعلق بمستوى HDL-C، ارتفعت مجموعة FP_H زيادة معنوية (p < 0.01) من 1.81 ± 0.08 ملليمول/لتر إلى 2.65 ± 0.16 ملليمول/لتر، مقارنة بمجموعة HFD (الشكل 3C). على الرغم من أن مستوى TG ظل ضئيلا بعد تدخل FP ، فقد تم تخفيضه مقارنة بمجموعة HFD (الشكل 3D). أشارت الدراسات الحديثة إلى أن مؤشر نسبة LDL-C / HDL-C هو مؤشر أفضل من LDL-C أو HDL-C وحده في التنبؤ بأمراض القلب والأوعية الدموية25,26. بالمقارنة مع مجموعة HFD ، انخفضت نسبة LDL-C / HDL-C بشكل ملحوظ (p < 0.01) بنسبة 46.3٪ في المجموعة FP_H (الشكل 3E) ، مما يعني أن تدخل FP قلل من الكوليسترول السيئ وزاد من مستويات الكوليسترول الجيد. باعتباره العضو الأيضي الرئيسي للدهون ، يعكس وزن الكبد تخزين الدهون في الفئران إلى حد ما27. بعد 12 أسبوعا ، انخفضت مؤشرات الكبد في المجموعة FP_L ومجموعة FP_H بشكل ملحوظ (p < 0.01) مقارنة بمجموعة HFD (الشكل 3F). أظهرت مجموعة PC أيضا درجات مختلفة من الانخفاض في هذه المؤشرات أعلاه ، مما يدل على أن FP كان له تأثيرات مماثلة للستاتين ، وأظهر التأثير الوقائي علاقة بين الجرعة والاستجابة.

كشفت دراسات سريرية مختلفة أنه بعد تناول المستخلص أو FP الكامل لفترة من الوقت ، انخفضت مستويات TC و LDL-C بشكل ملحوظ. وفي الوقت نفسه ، تم رفع مستوى HDL-C بشكل ملحوظ عند الإدارة طويلة الأجل ل FP28,29. وجد Nambiar و Shetty30 أن عصير FP يمكن أن يقلل من البروتينات الدهنية منخفضة الكثافة المؤكسدة ، وبالتالي يقلل بشكل كبير من خطر تصلب الشرايين. قام Gopa et al.31 بتقييم تأثير نقص شحميات الدم ل FP في المرضى الذين يعانون من فرط شحميات الدم ومقارنته مع سيمفاستاتين. أدى العلاج باستخدام FP إلى انخفاض كبير في TC و LDL-C و TG ، وزيادة كبيرة في مستويات HDL-C ، مماثلة لمستويات سيمفاستاتين. في هذا البحث ، كان ل FP و simvastatin أيضا تأثيرات علاجية مماثلة ، وكان تأثير خفض LDL-C وعمل إصلاح الكبد ل FP متفوقا على سيمفاستاتين.

ملاحظة الكبد النسيجية المرضية
يظهر تأثير FP على التنكس الدهني الكبدي في الفئران HFD في الشكل 4. عبرت الأقسام المرضية للكبد في مجموعة NC عن مورفولوجيا خلايا الكبد العادية ، وحدود الخلايا المحددة بوضوح ، وعدم وجود فجوات دهنية واضحة (الشكل 4 أ ، ب). نسبيا ، كان لدى مجموعة HFD فجوات دهنية بأحجام مختلفة حول الأوعية الدموية وأظهرت تلفا كبديا واضحا ، كما يتميز بتورم الخلايا ، والتنكس الدهني ، وفقدان الحدود الخلوية ، والانكماش الخلوي ، ونخر خلايا الكبد (الشكل 4C ، D). كما هو موضح في الشكل 4E ، F ، يمكن أن يؤدي تدخل FP إلى تحسين تنكس دهني الكبد ، خاصة في المجموعة FP_L. بالمقارنة مع مجموعة HFD ، كان لدى FP_H (الشكل 4G ، H) ومجموعة الكمبيوتر الشخصي (الشكل 4I ، J) درجة معينة من استعادة بنية خلايا الكبد ، وتنكس الدهون ، وتقليل فجوة الدهون. هذا يعني أن تدخل FP يمكن أن يحمي أنسجة الكبد من الإصابة الكبدية التي يسببها HFD.

التنميط الأيضي
وفقا لمستوى الدهون في البلازما والملاحظة النسيجية المرضية للكبد ، كان للجرعة العالية من FP تأثير أفضل على فرط شحميات الدم من جرعة منخفضة FP. لذلك ، تم اختيار مجموعات NC و HFD و FP_H لتحليل تغيرهم في مستوى التمثيل الغذائي. تم عرض إجمالي الكروماتوجرام الأيوني لعينات مراقبة الجودة في الشكل التكميلي 4. لضمان دقة البيانات ، تمت إزالة الميزات ذات قيم RSD >30٪ من جميع عينات مراقبة الجودة. عكست PCA والكروماتوجرام الأيوني أن عينات مراقبة الجودة كانت مستقرة أثناء العملية (الشكل التكميلي 5). تم تحديد ما مجموعه 626 و 562 ميزة في البلازما والكبد بعد المعالجة المسبقة للبيانات. من بينها ، تم تحديد 120 و 124 مستقلبا في البلازما والكبد ، على التوالي ، بناء على قاعدة بيانات KEGG. تم استخدام تحليل OPLS-DA لاستكشاف الفصل بين مجموعات NC و HFD و FP_H. أظهر OPLS-DA أن نفس عينات المجموعة تجمعت معا وتميزت عينات المجموعة المختلفة بشكل جيد (الشكل 5 أ ، ب). أشارت هذه النتائج إلى أن تدخلات HFD و FP تسببت في اختلافات أيضية واضحة.

لتحديد المستقلبات التفاضلية المحتملة التي ساهمت في التمييز الأيضي ، تم إجراء المزيد من تحليلات OPLS-DA واختبار t ل NC مقابل HFD و HFD مقابل FP_H ، على التوالي. تميزت نتائج OPLS-DA بشكل جيد ، وأظهرت اختلافات كبيرة بين مجموعات مختلفة من النماذج14 (الشكل التكميلي 6). استنادا إلى VIP (متغير مهم في الإسقاط) >1 و p < 0.05 ، أظهر 32 مستقلبا في البلازما تمايزا بين مجموعة NC و HFD ، وأظهر 72 مستقلبا تمايزا بين HFD ومجموعة FP_H. في الكبد ، أظهر 38 مستقلبا تمايزا بين مجموعة NC و HFD ، وأظهر 17 مستقلبا تمايزا بين مجموعة HFD ومجموعة FP_H. أخيرا ، تم تحديد ما مجموعه 16 و 6 مستقلبات كمستقلبات تفاضلية في الفئران HFD التي تؤثر على FP في البلازما والكبد ، على التوالي (الشكل التكميلي 7). المعلومات عن هذه الأيضات موضحة في الجدول 2.

لتصور التباين في المستقلبات بين المجموعات الثلاث ، تم رسم خرائط الحرارة بواسطة MetaboAnalyst 5.0. تم تغيير جميع المستقلبات التفاضلية في البلازما والكبد في مجموعة HFD وتم عكس معظمها في مجموعة FP ، مما يشير إلى أن تدخل FP يمكن أن يحسن اضطراب التمثيل الغذائي (الشكل 5C ، D). علاوة على ذلك ، تم استيراد المستقلبات التفاضلية إلى MetaboAnalyst 5.0 لاستكشاف المسارات الأيضية ل FP في الفئران HFD. استنادا إلى p < 0.05 وتأثير المسار >0.10 ، تأثر استقلاب التربتوفان بشكل كبير في البلازما ، وكانت المستقلبات المتعلقة بهذا المسار هي D-tryptophan و L-kynurenine (الشكل 5E). درس Jung et al.32 أن فرط شحميات الدم لفترات طويلة قد يخفض مستويات مصل الكينورينين. تأثر استقلاب التورين والهيبوتورين بشكل كبير في الكبد ، وكان المستقلب المرتبط بالتورين (الشكل 5F). توراين هو حمض أميني مهم وضروري في جسم الحيوان. درس Dong et al.33 أن التورين يمكن أن يقلل بشكل معتدل من تلف نسبة الدهون في الدم ويقلل من خطر تصلب الشرايين الناجم عن HFD. في هذا البحث ، زاد تدخل FP من محتوى L-kynurenine و taurine ، والذي يرتبط بشكل إيجابي بتخفيض مستويات الدهون ، مما يدعم فعالية FP ضد فرط شحميات الدم.

التحليل المتكامل لعلم الأدوية الشبكي والأيض
أصبحت الاستراتيجية المتكاملة لعلم الصيدلة الشبكي جنبا إلى جنب مع الأيض لا غنى عنها أكثر فأكثر في دراسة آليات المرض واستراتيجيات التدخل. تم إثبات الصلة بين علم الأدوية الشبكي والأيض مع أدلة محدودة. للحصول على رؤية شاملة لآلية FP ضد فرط شحميات الدم ، تم بناء شبكات التفاعل القائمة على علم الأدوية الشبكي والأيض. تم استيراد المستقلبات التفاضلية إلى المكون الإضافي MetScape في Cytoscape ومطابقة الجينات المحورية المحددة في علم الأدوية الشبكي لجمع شبكات الجينات المركبة والتفاعل والإنزيم (الشكل 6). كما هو موضح في الجدول 3 ، في مستقلبات البلازما ، كان L-kynurenine والكورتيكوستيرون مرتبطين ب CYP1A1 ، والذي يمكن أن يحفز بيروكسيد الدهون ويحفز مرض الكبد الدهني غير الكحولي34,35 ؛ كانت المسارات المصابة هي استقلاب التربتوفان والتخليق الحيوي لهرمون الستيرويد ، على التوالي. كان الأسيتيل كولين مرتبطا ب AChE وأثر على استقلاب الغليسيروفوسفوليبيد. في مستقلبات الكبد ، ارتبطت MGAM ورافينوز باستقلاب الجالاكتوز. أظهرت العديد من الدراسات أن تناول السكريات قليلة السكاريد من عائلة رافينوز يمكن أن يحسن الاضطرابات الأيضية في الفئران HFD36.

علاوة على ذلك ، تم إنشاء شبكة مسارات المكونات والأهداف والمستقلبات (الشكل 7). في المكونات ، ربط كيرسيتين معظم الحواف ، مما يشير إلى أن كيرسيتين FP يلعب الدور الأكثر أهمية في خفض الدهون. كشف التحليل المتكامل أعلاه عن الأهداف الرئيسية والمستقلبات ومسارات FP ضد فرط شحميات الدم ، والتي يمكن أن تكون أساسا لمزيد من الدراسة للآلية العلاجية لهذا الدواء والتطبيق السريري.

الالتحام الجزيئي
لمزيد من التحقيق في إمكانية التفاعل بين المكونات المختارة والأهداف الرئيسية ، تم استخدام الالتحام الجزيئي لتحليل تفاعلات الموقع النشطة للرباط. تم استخدام برنامج AutoDock Vina (انظر جدول المواد) لأداء الالتحام الجزيئي ، وتم إخراج وضع الإرساء الأول وفقا لرتبة وظيفة التسجيل. تظهر نتائج الإرساء في الشكل 8.

في التحليل المتكامل ، كانت CYP1A1 و AChE و MGAM مرتبطة بالمستقلبات التفاضلية. لقد بنوا جسورا بين الأهداف والمستقلبات. تم إجراء مزيد من الالتحام الجزيئي للتحقق من العلاقة بين الهدف والمكونات. كانت نتائج التحام المكونات مع CYP1A1 على النحو التالي: شكل حمض الغال أربع روابط هيدروجينية من خلال بقايا الأحماض الأمينية Asn-185 و Tyr-187 و Asn-219 و His-500 ، وشكل تفاعل تكديس π-π من خلال بقايا الأحماض الأمينية Tyr-187 (الشكل 8 أ) ؛ شكل كيرسيتين ثلاث روابط هيدروجينية من خلال Asn-185 و Asn-219 و His-500 ، والتفاعل الكارهة للماء ، وتفاعل التراص π-π من خلال Tyr-187 (الشكل 8B) ؛ شكل بيتا سيتوستيرول أربع روابط هيدروجينية من خلال Arg-362 و Ser-363 و Leu-365 و Arg-464 ، والتفاعل الكارهة للماء من خلال Glu-369 و Ile-439 (الشكل 8C). كانت طاقات الربط 5.3 و 7.0 و 7.3 كيلو كالوري / مول على التوالي. في التفاعل مع AChE ، استقر حمض الغال بواسطة روابط هيدروجينية مع Arg-237 و Arg-238 و Arg-480 (الشكل 8D) ؛ تم تثبيت كيرسيتين بواسطة روابط هيدروجينية مع Arg-237 و Phe-474 ، عن طريق التفاعل الكارهة للماء مع Phe-157 ، وتفاعل التراص π-π مع Tyr-478 (الشكل 8E) ؛ استقر بيتا سيتوستيرول عن طريق التفاعل الكارهة للماء مع Phe-157 و Val-244 و Ile-248 و Phe-474 و Ala477 و TYR478 (الشكل 8F). كانت طاقات الربط 5.0 و 6.5 و 8.0 كيلو كالوري / - مول على التوالي. في التفاعل مع MGAM ، استقر حمض الغال بواسطة روابط هيدروجينية مع Ile-1716 و Gly-1747 و Trp-1749 ، وعن طريق التفاعل الكارهة للماء مع Tyr-1715 و Trp-1749 (الشكل 8G) ؛ تم تثبيت كيرسيتين بواسطة روابط هيدروجينية مع Arg-1311 و Thr-1726 و Gln-1731 و Trp-1752 ، وبواسطة روابط هيدروجينية مع Arg-1730 ، وبواسطة π-π التراص مع His-1727 (الشكل 8H) ؛ استقر بيتا سيتوستيرول عن طريق التفاعل الكارهة للماء مع Pro-1159 و Trp-1355 و Phe-1427 و Phe-1560 ، وكانت طاقات الربط 5.9 و 8.1 و 6.9 كيلو كالوري / مول على التوالي. وترد في الجدول 4 معلومات مفصلة عن التفاعلات والصلات الملزمة. تفسر مواقع الربط المتعددة وطاقات الربط العالية التقارب العالي بين المكونات وأهداف البروتين ، مما يؤكد أن هذه المكونات تلعب دور خفض الدهون من خلال العمل على الأهداف المرتبطة بفرط شحميات الدم.

Figure 1
الشكل 1: مخطط انسيابي تخطيطي للاستراتيجية المتكاملة. تم استخراج مكونات وجينات المحور بواسطة علم الأدوية الشبكي (الجزء 1). تم تحليل المستقلبات التفاضلية ل FP ضد فرط شحميات الدم عن طريق البلازما وأيض الكبد (الجزء 2). تم تحديد الأهداف الرئيسية والمستقلبات والمسارات وربطها بناء على تحليل متكامل للجزء 1 والجزء 2 (الجزء 3). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: فحص الهدف ، وبناء الشبكة ، وتحليل الإثراء لتأثير FP ضد فرط شحميات الدم . (أ) مخطط فن لأهداف FP-hyperlipidemia. (ب) شبكة الأدوية والمكونات والأهداف والمرض النشطة المحتملة: رموز ألوان مختلفة كما هو مذكور هنا: المرض (أحمر) ، دواء (أزرق) ، مكونات (أخضر) ، وأهداف (أصفر). (ج) شبكة PPI بواسطة سلسلة. (د) تحليل إثراء مسار GO. (ه) تحليل إثراء مسار KEGG. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: تأثير FP على مستويات الدهون في البلازما ومؤشر الكبد في الفئران المصابة بفرط شحميات الدم الناجم عن HFD (ن = 6). (أ) مستويات TC. (ب) مستويات LDL-C. (ج) مستوى HDL-C. (د) مستوى TG. (ه) نسبة LDL-C/HDL-C. (و) مؤشرات الكبد.* ع < 0.05 ، ** ع < 0.01 ، ** ع < 0.001. تم تقييم الفروق ذات الدلالة الإحصائية باستخدام ANOVA أحادي الاتجاه متبوعا باختبار المقارنات المتعددة لدونيت أو التحليل اللاحق. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: تأثير FP على أنسجة الكبد في الفئران المصابة بفرط شحميات الدم الناجم عن HFD (تلطيخ H&E ). (أ ، ب) مجموعة NC ، (C ، D) مجموعة HFD ، (E ، F) مجموعة FP_L ، (G ، H) مجموعة FP_H ، (I ، J) مجموعة PC (n = 6). شريط المقياس: (A,C,E = 200 μm; ب ، د ، و = 50 ميكرومتر). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: مخططات درجات OPLS-DA ، وخرائط الحرارة ، والمسارات الأيضية للمستقلبات التفاضلية. مخططات درجة OPLS-DA ل FP على الفئران HFD في البلازما (A) والكبد (B). الخرائط الحرارية للمستقلبات التفاضلية في البلازما (C) والكبد (D). المسارات الأيضية للمستقلبات التفاضلية في البلازما (E) والكبد (F). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6: شبكات التفاعلات المركبة والإنزيمات الجينية للمستقلبات والأهداف الرئيسية. تمت إزالة العقد ذات الدرجة المنخفضة. تمثل الأشكال السداسية الحمراء والدوائر الزرقاء والمستطيلات الخضراء المستديرة والماسات الرمادية المركبات النشطة والجينات والبروتينات والتفاعلات على الترتيب. تم تضخيم الأهداف الرئيسية والمستقلبات. يتم تنظيم المسارات ذات الخلفية البيضاء بشكل كبير في البلازما. يتم تنظيم المسار ذو الخلفية الرمادية بشكل كبير في الكبد. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 7
الشكل 7: شبكة مسارات المكونات-الأهداف-الأيضات. كلما كان اللون أغمق ، زادت الحواف المتصلة ، مما يدل على أن العقدة أكثر أهمية في هذه الشبكة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 8
الشكل 8: مخططات التفاعل لمكونات FP والأهداف الرئيسية. أ: حمض الغال الذي يعمل على CYP1A1 . (ب) كيرسيتين يعمل على CYP1A1. (ج) بيتا سيتوستيرول يعمل على CYP1A1. د: حمض الغال المؤثر على AChE . ه: كيرسيتين يعمل على AChE. (و) عمل بيتا سيتوستيرولينج على AChE. (ز) حمض الغال الذي يعمل على MGAM. (ح) كيرسيتين يعمل على MGAM. (ط) بيتا سيتوستيرول يعمل على MGAM. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 9
الشكل 9: نظرة عامة على FP ضد نتيجة فرط شحميات الدم. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1: المكونات المختارة من المستخلص المائي FP. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول 2: المستقلبات التفاضلية بين المجموعات الثلاث. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول 3: معلومات عن الأهداف الرئيسية والمستقلبات والمسارات. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول 4: مواقع الربط وقوى العمل بين مكونات FP والبروتينات المستهدفة. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

الشكل التكميلي 1: الكروماتوجرام الأيوني الموجب والسالب للمستخلص المائي FP. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 2: شبكة مكونات FP - الهدف - المسار - المرض بواسطة BATMAN-TCM. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 3: تحليل تردد الجينات المحورية في علم الأدوية الشبكي. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 4: الكروماتوجرام الأيوني لعينات مراقبة الجودة في البلازما والكبد. الكروماتوجرام الأيوني الموجب (A) والسالب (B) لعينات مراقبة الجودة في البلازما. الكروماتوجرام الأيوني الموجب (C) والسالب (D) لعينات مراقبة الجودة للكبد. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 5: مخططات درجة PCA لعينات مراقبة الجودة في البلازما (A) والكبد (B). الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 6: مخططات درجة OPLS-DA لعينات البلازما (A و B) والكبد (C و D). الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 7: مخططات فن للمستقلبات التفاضلية في عينات البلازما (أ) والكبد (ب). الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

في السنوات الأخيرة ، كان معدل الإصابة بفرط شحميات الدم في ازدياد ، ويرجع ذلك أساسا إلى عادات الأكل غير الصحية على المدى الطويل. الطب الصيني التقليدي ومكوناته الكيميائية لها أنشطة دوائية مختلفة ، والتي تمت دراستها على نطاق واسع في السنوات الأخيرة37,38. FP هو نوع من موارد الفاكهة ، ويستخدم كدواء وغذاء ، ولديه إمكانات مهمة لعلاج فرط شحميات الدم. ومع ذلك ، فإن الآلية العلاجية المحتملة ل FP ضد فرط شحميات الدم تحتاج إلى مزيد من الدراسة.

يقوم علم الأدوية الشبكي بتقييم التأثيرات الدوائية المتعددة الأدوية على المستوى الجزيئي ، ويتنبأ بتفاعل المنتجات الطبيعية والبروتينات لتحديد الآلية الرئيسية39. الخطوة الأولى هي اختيار المكونات النشطة والأهداف الرئيسية للدواء. في هذا البحث ، تم العثور على تسعة مكونات نشطة و 62 جينا محوريا. لمزيد من فهم الآلية الجزيئية ل FP على فرط شحميات الدم ، تم إنشاء PPI وشبكات استهداف المكونات بناء على تحليل علم الأدوية الشبكي. لتضييق نطاق المكونات والأهداف الرئيسية ، تم تأسيس ثلاثة مكونات رئيسية (حمض الغال ، كيرسيتين ، وبيتا سيتوستيرول) المتعلقة بفرط كوليسترول الدم وتصلب الشرايين التاجية بواسطة BATMAN-TCM. كل هذه المكونات يمكن أن تقلل من مستويات LDL-C أو تزيد من مستويات HDL-C ، مما يؤكد صحة الآثار المحددة ل FP على فرط شحميات الدم. إلى جانب ذلك ، وفقا لتحليل إثراء KEGG ، ترتبط وظيفة FP على فرط شحميات الدم بنشاط مسار الدهون وتصلب الشرايين. على الرغم من أن هذه الطريقة تعتمد كثيرا على قاعدة البيانات وتفتقر إلى التحقق التجريبي ، إلا أن لها قيمة نظرية وتوفر أفكارا لأبحاث التحقق التجريبية اللاحقة.

لمزيد من التحقق التجريبي ، تم تغذية الفئران بنظام غذائي مكمل للدهون لمدة 8 أسابيع للحث على فرط شحميات الدم. أظهرت النتائج أن مستويات البلازما TC و LDL-C و TG قد زادت بشكل ملحوظ. على الرغم من انخفاض مستوى HDL-C بشكل ملحوظ ، إلا أن نسبة LDL-C إلى HDL-C زادت بشكل ملحوظ. أظهرت الملاحظات النسيجية المرضية أن أنسجة الكبد من الفئران HFD قد تضررت بشدة ، ولكن لم تكن هناك زيادة كبيرة في مؤشر الكبد. قد تستغرق التغيرات في وزن الجسم والوزن الحشوي وقتا أطول. أظهرت تغيرات الدهون والكبد بشكل كاف تأثير تدخل FP على فرط شحميات الدم. ومع ذلك ، فإن الآلية الداخلية لتأثير التدخل لا تزال بحاجة إلى مزيد من الاستكشاف.

يوفر الأيض قائمة بالمستقلبات المحتملة والمسارات ذات الصلة ، والتي تهدف إلى استكشاف آلية الأمراض الأيضية وعمل الأدوية العلاجية40. يمكن أن تتأثر نتيجة الأيض بنوع العينة. بالنظر إلى الخصائص المسببة للأمراض لفرط شحميات الدم ، تم اختيار عينات البلازما والكبد للتحليل الأيضي في هذا البحث. وفقا لنتائج OPLS-DA ، تم التمييز بشكل جيد بين مستقلبات NC و HFD و FP_H المجموعات. تم العثور على ما مجموعه 16 مستقلبا تفاضليا في البلازما ، وتم العثور على 6 مستقلبات تفاضلية في الكبد. كان هناك مستقلبات أكثر تأثرا في البلازما منها في الكبد ، مما يثبت أن الدم هو المكان الرئيسي للاضطراب الأيضي الناجم عن فرط شحميات الدم. يمكن لتدخل FP عكس تغيير هذه المستقلبات تحت تأثير HFD. علاوة على ذلك ، تم استيراد هذه المستقلبات التفاضلية إلى قاعدة بيانات KEGG. كانت المسارات الأيضية الهامة للمستقلبات التفاضلية في البلازما هي استقلاب التربتوفان ، وفي الكبد كانت استقلاب التورين والهيبوتورين. في هذا البحث ، زاد تدخل FP من محتوى L-kynurenine من استقلاب التربتوفان ومحتوى التورين في استقلاب التورين والهيبوتورين ، مما يعني أن FP يمكن أن يكون فعالا في تعديل الاضطرابات الأيضية وفرط شحميات الدم بشكل إيجابي. كشف تحليل الأيض عن المستقلبات التي كانت مرتبطة بفرط شحميات الدم أو تدخل FP ، وحدد آلية المصب لتأثير FP.

من خلال الجمع بين نتيجة علم الأدوية الشبكي والأيض ، تم تحديد ثلاثة أهداف رئيسية (CYP1A1 و AChE و MGAM) في شبكات الجينات ذات التفاعل المركب والإنزيم. وفقا لتحليل الالتحام الجزيئي ، أظهرت هذه الأهداف تقاربا كبيرا مع مكونات FP (حمض الغال ، كيرسيتين ، وبيتا سيتوستيرول). تم تحديد أربعة مستقلبات (L-kynurenine ، الكورتيكوستيرون ، الأسيتيل كولين ، والرافينوز) وأربعة مسارات ذات صلة (استقلاب التربتوفان ، التخليق الحيوي لهرمون الستيرويد ، استقلاب الغليسيروفوسفوليبيد ، واستقلاب الجالاكتوز) على أنها المستقلبات الرئيسية والمسارات الأيضية. من بين هؤلاء ، ارتبط كيرسيتين بمعظم الأهداف ، وظهر استقلاب التربتوفان في كل من الأيض والنتائج المتكاملة. أنها تلعب الدور الأكثر أهمية في التأثير العلاجي ل FP ضد فرط شحميات الدم. أظهرت نتيجة الالتحام الجزيئي أن CYP1A1 و AChE و MGAM لها صلات عالية بالمكونات. تثبت النتائج المذكورة أعلاه أن هذه الأهداف التي تم فحصها ترتبط ارتباطا وثيقا بالتأثير العلاجي ل FP.

في البحث الحالي ، تم تحديد حمض الغال ، كيرسيتين ، وبيتا سيتوستيرول كمكونات نشطة FP نحو مكافحة فرط شحميات الدم ، واستقلاب التربتوفان هو المسار الأيضي الرئيسي للعلاج FP في الفئران HFD. تظهر نظرة عامة على النتيجة في الشكل 9. قدم هذا البحث البيانات والدعم النظري لمزيد من الدراسات للآليات وقدم أساسا للتطبيق السريري لطب FP. كما أثبت أن الطعام الطبيعي قد يكون خيارا واعدا مع آفاق كبيرة في الممارسة السريرية. ومع ذلك ، لا تزال هناك بعض أوجه القصور في هذا البحث. لم يتم التحقق من التأثير العلاجي للعنصر النشط وحده على فرط شحميات الدم. وبالإضافة إلى ذلك، لم تتم دراسة مسار الأهداف الرئيسية؛ كما يحتاج إلى مزيد من تجارب البيولوجيا الجزيئية المنهجية للتحقق من الآلية الدقيقة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

يعلن جميع المؤلفين أنه ليس لديهم تضارب في المصالح.

Acknowledgments

تم دعم هذا البحث من قبل فريق تطوير المنتجات والابتكار في TCM Health Conservation and Rehabilitation (2022C005) والبحث حول تكامل الأعمال الجديدة عبر الحدود ل "الحفاظ على الصحة وإعادة التأهيل +".

Materials

Name Company Catalog Number Comments
101-3B Oven Luyue Instrument and Equipment Factory \
80312/80302 Glass Slide Jiangsu Sitai Experimental Equipment Co., LTD \
80340-1630 Cover Slip Jiangsu Sitai Experimental Equipment Co., LTD \
AccucoreTM C18 (3 mm × 100 mm, 2. 6 μm) Thermo Fisher Scientific \
Acetonitrile Fisher Chemical A998 Version 1.5.6
ACQUITY UPLC HSS T3 Column (2.1 mm × 100 mm, 1.8 μm) Thermo Fisher Scientific \
Aethanol Fisher Chemical A995 Version 3.0
Ammonia Solution Chengdu Cologne Chemicals Co., LTD 1336-21-6 Version 3.9.1
AutoDockTools Scripps Institution of Oceanography \
BS-240VT Full-automatic Animal Biochemical Detection System Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Co., Ltd. \
Compound Discoverer Thermo Fisher Scientific \
Cytoscape Cytoscape Consortium \
DM500 Optical Microscope Leica \
DV215CD Electronic Balance Ohaus Corporation ., Ltd T15A63
Ethyl Alcohol Chengdu Cologne Chemicals Co., LTD 64-17-5
Formic Acid Fisher Chemical A118
HDL-C Assay Kit Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute A112-1-1
Hematoxylin Staining Solution Biosharp BL700B
High Fat Diet ENSIWEIER 202211091031
Hitachi CT15E/CT15RE Centrifuge Hitachi., Ltd. \
Homogenizer Oulaibo Technology Co., Ltd \
Hydrochloric Acid Chengdu Cologne Chemicals Co., LTD 7647-01-0
Image-forming System LIOO \
JB-L5 Freezer Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd \
JB-L5 Tissue Embedder Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd \
JK-5/6 Microtome Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd \
JT-12S Hydroextractor Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd \
KQ3200E Ultrasonic Cleaner Kun Shan Ultrasonic Instruments Co., Ltd \
LDL-C Assay Kit Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute A113-1-1
Male C57BL/6 Mice  SBF Biotechnology Co., Ltd. \ Version 2.3.2
Neutral Balsam Shanghai Yiyang Instrument Co., Ltd 10021190865934
Pure Water Guangzhou Watson's Food & Beverage Co., Ltd GB19298
PyMOL DeLano Scientific LLC \ Version 14.1
RE-3000 Rotary Evaporator Yarong Biochemical Instrument Factory ., Ltd \
RM2016 Pathological Microtome Shanghai Leica Instruments Co., Ltd \ Version 26.0
SIMCA-P Umetrics AB \
Simvastatin Merck Sharp & Dohme., Ltd 14202220051
SPSS International Business Machines Corporation \
TC Assay Kit Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute A111-1-1
TG Assay Kit Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute A110-1-1
UPLC-Q-Exactive Quadrupole Electrostatic Field Orbital Hydrazine High Resolution Mass Spectrometry Thermo Fisher Scientific \
Vortex Vibrator Beijing PowerStar Technology Co., Ltd. LC-Vortex-P1
Xylene Chengdu Cologne Chemicals Co., LTD 1330-20-7

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nelson, R. H. Hyperlipidemia as a risk factor for cardiovascular disease. Primary Care: Clinics in Office Practice. 40 (1), 195-211 (2013).
  2. Mach, F., et al. 2019 ESC/EAS Guidelines for the management of dyslipidaemias: lipid modification to reduce cardiovascular risk: the Task Force for the management of dyslipidaemias of the European Society of Cardiology (ESC) and European Atherosclerosis Society (EAS). European Heart Journal. 41 (1), 111-188 (2020).
  3. Oesterle, A., Laufs, U., Liao, J. K. Pleiotropic effects of statins on the cardiovascular system. Circulation Research. 120 (1), 229-243 (2017).
  4. Last, A. R., Ference, J. D., Menzel, E. R. Hyperlipidemia: drugs for cardiovascular risk reduction in adults. American Family Physician. 95 (2), 78-87 (2017).
  5. Wu, S., et al. Recent advances of tanshinone in regulating autophagy for medicinal research. Front Pharmacol. 13, 1059360 (2022).
  6. Mirunalini, S., Krishnaveni, M. Therapeutic potential of Phyllanthus emblica (amla): the ayurvedic wonder. Journal of Basic and Clinical Physiology and Pharmacology. 21 (1), 93-105 (2010).
  7. Zhao, H. J., et al. Fructus phyllanthi tannin fraction induces apoptosis and inhibits migration and invasion of human lung squamous carcinoma cells in vitro via MAPK/MMP pathways. Acta Pharmacologica Sinica. 36 (6), 758-768 (2015).
  8. Yan, X., et al. Current advances on the phytochemical composition, pharmacologic effects, toxicology, and product development of Phyllanthi Fructus. Frontiers in Pharmacology. 13, 1017628 (2022).
  9. Yang, F., et al. Chemical constituents from the fruits of Phyllanthus emblica L. Biochemical Systematics and Ecology. 92, 104122 (2020).
  10. Wu, L., et al. Phytochemical analysis using UPLC-MSn combined with network pharmacology approaches to explore the biomarkers for the quality control of the anticancer tannin fraction of Phyllanthus emblica L. habitat in Nepal. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2021, 6623791 (2021).
  11. Variya, B. C., Bakrania, A. K., Chen, Y., Han, J., Patel, S. S. Suppression of abdominal fat and anti-hyperlipidemic potential of Emblica officinalis: Upregulation of PPARs and identification of active moiety. Biomedicine & Pharmacotherapy. 108, 1274-1281 (2018).
  12. Gertsch, J. Botanical drugs, synergy, and network pharmacology: forth and back to intelligent mixtures. Planta Medica. 77 (11), 1086-1098 (2011).
  13. Nicholson, J. K., Wilson, I. D. Understanding 'global' systems biology: metabonomics and the continuum of metabolism. Nature Reviews Drug Discovery. 2 (8), 668-676 (2003).
  14. Li, T., et al. Integrated metabolomics and network pharmacology to reveal the mechanisms of hydroxysafflor yellow A against acute traumatic brain injury. Computational and Structural Biotechnology Journal. 19, 1002-1013 (2021).
  15. Wang, F., et al. Network pharmacology combined with metabolomics to investigate the anti-hyperlipidemia mechanism of a novel combination. Journal of Functional Foods. 87, 104848 (2021).
  16. Adams, J. M., Jafar-Nejad, H. Determining bile duct density in the mouse liver. Journal of Visualized Experiments. (146), e59587 (2019).
  17. Wang, J. Y., et al. Use of viral entry assays and molecular docking analysis for the identification of antiviral candidates against coxsackievirus A16. Journal of Visualized Experiments. (149), e59920 (2019).
  18. Wu, L. F., Liang, W. Y., Zhang, L. Z. Determination of main components of Tibetan medicine Phyllanthus emblica L. World Science and Technology-Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica. 22 (8), 2857-2863 (2022).
  19. El-Hussainy, E. H. M., Hussein, A. M., Abdel-Aziz, A., El-Mehasseb, I. Effects of aluminum oxide (Al2O3) nanoparticles on ECG, myocardial inflammatory cytokines, redox state, and connexin 43 and lipid profile in rats: possible cardioprotective effect of gallic acid. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 94 (8), 868-878 (2016).
  20. Huang, W. Y., et al. Quercetin, hyper, and chlorogenic acid improve endothelial function by antioxidant, antiinflammatory, and ACE inhibitory effects. Journal of Food Science. 82 (5), 1239-1246 (2017).
  21. Lu, T. M., et al. Hypocholesterolemic efficacy of quercetin rich onion juice in healthy mild hypercholesterolemic adults: a pilot study. Plant Foods for Human Nutrition. 70 (4), 395-400 (2015).
  22. Witkowska, A. M., et al. Dietary plant sterols and phytosterol-enriched margarines and their relationship with cardiovascular disease among polish men and women: The WOBASZ II cross-sectional study. Nutrients. 14 (13), 2665 (2022).
  23. Turini, E., et al. Efficacy of plant sterol-enriched food for primary prevention and treatment of hypercholesterolemia: a systematic literature review. Foods. 11 (6), 839 (2022).
  24. Alamro, S. A., et al. Fermented camel milk enriched with plant sterols improves lipid profile and atherogenic index in rats fed high-fat and-cholesterol diets. Heliyon. , e10871 (2022).
  25. Gao, P., Wen, X., Ou, Q., Zhang, J. Which one of LDL-C/HDL-C ratio and non-HDL-C can better predict the severity of coronary artery disease in STEMI patients. BMC Cardiovascular Disorders. 22 (1), 318 (2022).
  26. Sun, T., et al. Predictive value of LDL/HDL ratio in coronary atherosclerotic heart disease. BMC Cardiovascular Disorders. 22 (1), 273 (2022).
  27. Maegawa, K., et al. Dietary raffinose ameliorates hepatic lipid accumulation induced by cholic acid via modulation of enterohepatic bile acid circulation in rats. British Journal of Nutrition. 127 (11), 1621-1630 (2022).
  28. Antony, B., Merina, B., Sheeba, V. AmlamaxTM in the management of dyslipidemia in humans. Indian Journal of Pharmaceutical Sciences. 70 (4), 504 (2008).
  29. Antony, B., Benny, M., Kaimal, T. N. B. A pilot clinical study to evaluate the effect of Emblica officinalis extract (Amlamax™) on markers of systemic inflammation and dyslipidemia. Indian Journal of Clinical Biochemistry. 23 (4), 378-381 (2008).
  30. Nambiar, S. S., Shetty, N. P. Phytochemical profiling and assessment of low-density lipoprotein oxidation, foam cell-preventing ability and antioxidant activity of commercial products of Emblica officinalis fruit. Journal of Food Biochemistry. 39 (3), 218-229 (2015).
  31. Gopa, B., Bhatt, J., Hemavathi, K. G. A comparative clinical study of hypolipidemic efficacy of Amla (Emblica officinalis) with 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme-A reductase inhibitor simvastatin. Indian Journal of Pharmacology. 44 (2), 238 (2012).
  32. Jung, T. W., et al. Administration of kynurenic acid reduces hyperlipidemia-induced inflammation and insulin resistance in skeletal muscle and adipocytes. Molecular and Cellular Endocrinology. , 518 (2020).
  33. Dong, Y., Li, X., Liu, Y., Gao, J., Tao, J. The molecular targets of taurine confer anti-hyperlipidemic effects. Life Sciences. 278, 119579 (2021).
  34. Huang, B., Bao, J., Cao, Y. R., Gao, H. F., Jin, Y. Cytochrome P450 1A1 (CYP1A1) catalyzes lipid peroxidation of oleic acid-induced HepG2 cells. Biochemistry. 83 (5), 595-602 (2018).
  35. Xia, H., et al. Alpha-naphthoflavone attenuates non-alcoholic fatty liver disease in oleic acid-treated HepG2 hepatocytes and in high fat diet-fed mice. Biomedicine & Pharmacotherapy. 118, 109287 (2019).
  36. Dai, Z., et al. Protective effects of α-galacto-oligosaccharides against a high-fat/western-style diet-induced metabolic abnormalities in mice. Food & Function. 10 (6), 3660-3670 (2019).
  37. Wang, X., et al. Salidroside, a phenyl ethanol glycoside from Rhodiola crenulata, orchestrates hypoxic mitochondrial dynamics homeostasis by stimulating Sirt1/p53/Drp1 signaling. J Ethnopharmacol. 293, 115278 (2022).
  38. Hou, Y., et al. Salidroside intensifies mitochondrial function of CoCl(2)-damaged HT22 cells by stimulating PI3K-AKT-MAPK signaling pathway. Phytomedicine. 109, 154568 (2023).
  39. Noor, F., et al. Network pharmacology approach for medicinal plants: review and assessment. Pharmaceuticals. 15 (5), 572 (2022).
  40. Li, X., et al. Role of potential bioactive metabolites from traditional Chinese medicine for type 2 diabetes mellitus: An overview. Front Pharmacol. 13, 1023713 (2022).

Tags

التراجع، العدد 194،
التنبؤ بعلم الأدوية الشبكي والتحقق من صحة الأيض لآلية Fructus Phyllanthi ضد فرط شحميات الدم
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zeng, B., Qi, L., Wu, S., Liu, N.,… More

Zeng, B., Qi, L., Wu, S., Liu, N., Wang, J., Nie, K., Xia, L., Yu, S. Network Pharmacology Prediction and Metabolomics Validation of the Mechanism of Fructus Phyllanthi against Hyperlipidemia. J. Vis. Exp. (194), e65071, doi:10.3791/65071 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter