Summary
В настоящем протоколе описывается комплексная стратегия изучения ключевых мишеней и механизмов Fructus Phyllanthi против гиперлипидемии, основанная на прогнозировании сетевой фармакологии и проверке метаболомики.
Abstract
Гиперлипидемия стала ведущим фактором риска сердечно-сосудистых заболеваний и повреждения печени во всем мире. Fructus Phyllanthi (FP) является эффективным препаратом против гиперлипидемии в традиционной китайской медицине (ТКМ) и теориях индийской медицины, однако потенциальный механизм требует дальнейшего изучения. Настоящее исследование направлено на выявление механизма ФП против гиперлипидемии на основе комплексной стратегии, сочетающей прогнозирование сетевой фармакологии с валидацией метаболомики. Модель мышей, индуцированная диетой с высоким содержанием жиров (HFD), была создана путем оценки уровней липидов в плазме, включая общий холестерин (TC), триглицериды (TG), холестерин липопротеинов низкой плотности (LDL-C) и холестерин липопротеинов высокой плотности (HDL-C). Сетевая фармакология была применена для выяснения активных ингредиентов FP и потенциальных мишеней против гиперлипидемии. Метаболомика плазмы и печени была выполнена для выявления дифференциальных метаболитов и соответствующих им путей среди нормальной группы, модельной группы и группы вмешательства. Взаимосвязь между сетевой фармакологией и метаболомикой была дополнительно построена для получения всестороннего представления о процессе ФП против гиперлипидемии. Полученные ключевые белки-мишени были верифицированы методом молекулярного докинга. Эти результаты показали, что FP улучшил уровень липидов в плазме и повреждение печени при гиперлипидемии, вызванной HFD. Галловая кислота, кверцетин и бета-ситостерол в FP были продемонстрированы в качестве ключевых активных соединений. Было обнаружено, что в общей сложности 16 и шесть потенциальных дифференциальных метаболитов в плазме и печени, соответственно, участвуют в терапевтических эффектах FP против гиперлипидемии путем метаболомики. Кроме того, интеграционный анализ показал, что эффекты вмешательства были связаны с CYP1A1, AChE и MGAM, а также с корректировкой L-кинуренина, кортикостерона, ацетилхолина и рафинозы, в основном с участием пути метаболизма триптофана. Молекулярный докинг гарантирует, что вышеуказанные ингредиенты, действующие на белковые мишени, связанные с гиперлипидемией, играют ключевую роль в снижении уровня липидов. Таким образом, это исследование предоставило новую возможность для профилактики и лечения гиперлипидемии.
Introduction
Гиперлипидемия является распространенным метаболическим заболеванием с серьезными последствиями для здоровья человека, а также основным фактором риска сердечно-сосудистых заболеваний1. В последнее время наблюдается тенденция к снижению возрастного заболевания, и молодые люди стали более восприимчивыми из-за длительного нерегулярного образа жизни и нездоровых привычек питания2. В клинике для лечения гиперлипидемии применялись различные препараты. Например, одним из наиболее часто используемых препаратов для пациентов с гиперлипидемией и связанными с ней атеросклеротическими расстройствами являются статины. Однако длительное применение статинов имеет побочные эффекты, которыми нельзя пренебрегать, которые приводят к плохому прогнозу, такие как непереносимость, резистентность к лечению и нежелательные явления 3,4. Эти недостатки стали дополнительными болями для пациентов с гиперлипидемией. Поэтому следует предложить новые методы лечения для стабильной гиполипидемической эффективности и меньшего количества побочных эффектов.
Традиционная китайская медицина (ТКМ) широко используется для лечения заболеваний из-за ее хорошей эффективности и небольшого количества побочных эффектов5. Fructus Phyllanthi (FP), сухофрукты Phyllanthus emblica Linn. (широко известный как ягода амлы или индийский крыжовник), является известным лекарственным и пищевым материалом, гомологичным для традиционных китайских и индийских лекарств 6,7. Это лекарство использовалось для очищения от жары, охлаждения крови и улучшения пищеварения в соответствии с теориями ТКМ8. Современные фармакологические исследования показали, что FP богат биологически активными соединениями, такими как галловые кислоты, эллаговые кислоты и кверцетин9, которые отвечают за ряд многогранных биологических свойств, действуя как антиоксидант, противовоспалительное средство, средство защиты печени, антигиполипидемическое и так далее10. Недавние исследования также показали, что FP может эффективно регулировать липиды крови пациентов с гиперлипидемией. Например, Variya et al.11 продемонстрировали, что фруктовый сок FP и его основной химический ингредиент галловая кислота могут снижать уровень холестерина в плазме и уменьшать инфильтрацию масла в печени и аорте. Терапевтическая эффективность была связана с регуляцией FP в увеличении экспрессии рецептора-альфа, активируемого пролифератором пероксисом, и снижении липогенной активности печени. Тем не менее, основной механизм FP в улучшении гиперлипидемии должен быть дополнительно изучен, поскольку его биологически активные ингредиенты довольно обширны. Мы стремились изучить потенциальный механизм терапевтической эффективности ФП, который может быть полезен для дальнейшей разработки и использования этого лекарства.
В настоящее время сетевая фармакология рассматривается как целостная и эффективная методика изучения терапевтического механизма ТКМ. Вместо того, чтобы искать отдельные болезнетворные гены и лекарства, лечащие исключительно индивидуальную мишень, строится полная сеть лекарств-ингредиентов-генов-заболеваний, чтобы найти многоцелевой механизм многокомпонентного лекарственного средства в отношении их комплексного лечения12. Этот метод особенно подходит для ТКМ, так как их химический состав огромен. К сожалению, сетевая фармакология может быть использована только для прогнозирования целей, на которые влияют химические ингредиенты в теории. Эндогенные метаболиты в модели заболевания следует наблюдать, чтобы подтвердить эффективность сетевой фармакологии. Метод метаболомики, появившийся с развитием системной биологии, является важным инструментом мониторинга изменений эндогенных метаболитов13. Изменения в метаболитах отражают устойчивые изменения состояния хозяина, что также является важным показателем для изучения внутреннего механизма. Некоторые исследователи успешно интегрировали сетевую фармакологию и метаболомику для изучения механизма взаимодействия между лекарствами и заболеваниями14,15.
В этой статье исследуются механистические основы ФП против гиперлипидемии путем интеграции методов сетевой фармакологии и метаболомики. Сетевая фармакология была применена для анализа взаимосвязи между основными активными ингредиентами в FP и молекулярными мишенями для гиперлипидемии. Впоследствии была проведена метаболомика для наблюдения изменения эндогенных метаболитов на животной модели, что может объяснить действие лекарства на метаболическом уровне. По сравнению с применением только сетевой фармакологии или метабономики, этот интегрированный анализ обеспечил более конкретный и всеобъемлющий механизм исследования. Кроме того, стратегия молекулярного докинга использовалась для анализа взаимодействия между активными ингредиентами и ключевыми белками. В целом, этот комплексный подход может компенсировать отсутствие экспериментальных данных по сетевой фармакологии и отсутствие эндогенного механизма для метода метаболомики и может быть использован для анализа терапевтического механизма натуральной медицины. Основная схематическая блок-схема протокола показана на рисунке 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры, связанные с обращением с животными, проводились в соответствии с Руководством Университета традиционной китайской медицины Чэнду по уходу за лабораторными животными и их использованию и были одобрены Комитетом по институциональной этике Университета традиционной китайской медицины Чэнду (протокол No 2020-36). Для настоящего исследования использовали самцов мышей C57BL/6 (20 ± 2 г). Мыши были получены из коммерческого источника (см. Таблицу материалов).
1. Прогнозирование на основе сетевой фармакологии
ПРИМЕЧАНИЕ: Сетевая фармакология используется для прогнозирования активных ингредиентов и их ключевых мишеней FP против гиперлипидемии.
- Выбор активных ингредиентов и ключевых мишеней
- Выполните поиск по ключевому слову «Phyllanthi Fructus» в базе данных фармакологии системы традиционной китайской медицины (TCMSP; http://tcmspw.com/tcmsp.php), чтобы получить список потенциальных активных ингредиентов и мишеней FP.
ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно в качестве активных ингредиентов включаются только ингредиенты с пероральной биодоступностью (OB) ≥30% и лекарственными (DL) значениями ≥0,18 в базе данных. - Выполните поиск по ключевому слову «гиперлипидемия» в базе данных GeneCards (https://www.genecards.org/), онлайн-базе данных менделевского наследования у человека (OMIM; https://omim.org/) и базе данных терапевтических мишеней (TTD; http://db.idrblab.net/ttd/), чтобы получить соответствующие мишени-кандидаты на гиперлипидемию. Загрузите электронные таблицы с целевыми показателями заболеваний. Удалите повторяющиеся мишени, чтобы получить список мишеней гиперлипидемии.
- Скопируйте эти списки из шагов 1.1.1 и 1.1.2 в новую электронную таблицу. Используйте функцию «Данные - Идентификация дубликатов» на панели инструментов, чтобы получить цели пересечения. Импортируйте список целевых пересечений в UniProtKB (http://www.uniprot.org/) для стандартизации названий генов и белков.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эти мишени связаны как с FP, так и с гиперлипидемией. Таким образом, предсказывайте эти перекрестные мишени как мишени FP против гиперлипидемии.
- Выполните поиск по ключевому слову «Phyllanthi Fructus» в базе данных фармакологии системы традиционной китайской медицины (TCMSP; http://tcmspw.com/tcmsp.php), чтобы получить список потенциальных активных ингредиентов и мишеней FP.
- Построение сети белково-белкового взаимодействия
- Откройте базу данных STRING (https://string-db.org/) 11.5. Вставьте список пересечений целей FP против гиперлипидемии в диалоговом окне «Список имен». Выберите Homo sapiens в разделе «Организмы» и нажмите на кнопку ПОИСК > ПРОДОЛЖИТЬ.
ПРИМЕЧАНИЕ: Люди и мыши имеют очень похожие гены. Поэтому дальнейшая экспериментальная проверка проводится на мышах. - Когда результаты будут доступны, поставьте галочку напротив скрытия отключенных узлов в сети в «Дополнительных настройках». Установите наивысшую достоверность (0,900) в «минимально необходимой оценке взаимодействия», затем нажмите кнопку ОБНОВИТЬ .
- Нажмите « Экспорт » в строке заголовка и загрузите короткий табличный текст сети белково-белкового взаимодействия (PPI) в формате PNG и TSV.
- Откройте базу данных STRING (https://string-db.org/) 11.5. Вставьте список пересечений целей FP против гиперлипидемии в диалоговом окне «Список имен». Выберите Homo sapiens в разделе «Организмы» и нажмите на кнопку ПОИСК > ПРОДОЛЖИТЬ.
- Создание целевой сети по лекарственным компонентам и болезням
- Откройте Cytoscape 3.9.1 (см. Таблицу материалов). Импортируйте файл формата TSV шага 1.2.3. Оптимизируйте цвет, шрифт и боковые стороны сетевых узлов с помощью панели стилей на панели управления.
- Используйте функцию «Анализ сети» для анализа топологии сети. Получите гены-концентраторы с помощью CytoHubba в Cytoscape. Создайте сеть лекарств-ингредиентов-мишеней-болезней.
- Анализ обогащения GO и KEGG
- Откройте ресурсы по биоинформатике DAVID (https://david.ncifcrf.gov/home.jsp). Нажмите «Начать анализ» и вставьте целевой список в левое диалоговое окно. Выберите OFFICIAL GENE SYMBOL в разделе «Select Identifier». Выберите Homo sapiens в разделе «Выбрать виды». Отметьте список генов в «Типе списка». Нажмите « Отправить список».
- Когда результаты будут доступны, нажмите « Проанализировать список генов» с помощью одного из инструментов DAVID. Отметьте GOTERM_BP_DIRECT, GOTERM_CC_DIRECT, GOTERM_MF_DIRECT в разделе «Онтология генов» для анализа обогащения функций GO. Отметьте KEGG_Pathway в разделе «Пути» для анализа обогащения пути KEGG.
- Нажмите на функциональную диаграмму аннотаций , чтобы отобразить результаты.
ПРИМЕЧАНИЕ: Установите порог статистической значимости анализа обогащения на уровне p < 0,05.
2. Экспериментальный дизайн
- Препарат водного экстракта FP
ПРИМЕЧАНИЕ: FP обрабатывается в лаборатории профессора Лины Ся в Университете Чэнду TCM8.- Замочите высушенный порошок FP (90 г) в 1 л чистой воды в чистой мерной колбе объемом 2 л. Используйте ультразвуковую обработку (на водяной бане 4 °C, мощность: 250 Вт, частота: 35 кГц), чтобы раствориться в течение 30 минут. Процеживают раствор для получения экстракта двухслойной стерильной медицинской марлей размером 1 мм х 1 мм. Повторите вышеописанную операцию три раза, чтобы обеспечить полное растворение ФП.
- Используйте метод ротационного выпаривания для дальнейшей концентрации. Установите скорость вращения 50 об/мин при температуре 60 °C в течение 4 ч. Сконцентрируйте водный экстракт до 100 мл.
- Разделите сырой экстракт FP (0,9 г / мл) равномерно на две части (50 мл). Одна часть используется в качестве жидкости для высоких доз FP (0,9 г / мл). Добавьте 50 мл чистой воды в другую часть и рассматривайте ее как жидкость с низкой дозой FP (0,45 г / мл). Для введения используйте водные растворы с высокими и низкими дозами ФП. Храните жидкость при температуре -20 °C до использования.
- Подготовка животных
- Содержание 50 мышей-самцов C57BL/6 (20 ± 2 г) в хорошо проветриваемом помещении при комнатной температуре, с 12-часовым циклом свет-темнота и свободным доступом к пище и чистой воде.
- Случайным образом распределите мышей на две группы: кормите 10 мышей обычной диетой и 40 мышей диетой с высоким содержанием жиров (см. Таблицу материалов), чтобы вызвать гиперлипидемию.
ПРИМЕЧАНИЕ: После кормления в течение 8 недель мышей обследовали для дальнейшего медикаментозного вмешательства. - На 8-й неделе изымают около 200 мкл крови с каждой орбиты мыши. Центрифугируют кровь в течение 10 мин при 5,733 x g при 4 °C для получения образцов плазмы. Определите уровни ТС и ТГ с помощью коммерчески доступных наборов для анализа (см. Таблицу материалов).
- Выберите шесть мышей с наиболее нормальным уровнем липидов в качестве контрольной группы без лечения (NC). Выберите 24 мыши со значительно более высоким уровнем липидов в качестве группы диеты с высоким содержанием жиров и случайным образом разделите их на четыре группы: группа диеты с высоким содержанием жиров (HFD), группа с низкими дозами FP (FP_L), группа с высокими дозами FP (FP_H) и группа положительного контроля (PC).
- Проводить промывание желудка в группах FP_L и FP_H двумя дозами ФП (низкая доза 4,5 г / кг и высокая доза 9 г / кг) соответственно; орошение желудка в группе ПК таблетками симвастатина (5 мг/кг; см. Таблицу материалов); и промывание желудка группам NC и HFD одинаковым объемом физиологического раствора один раз в сутки в течение 4 недель.
ПРИМЕЧАНИЕ: В текущем исследовании для лечения использовались водные растворы FP и симвастатина. - На 12-й неделе, после анестезии 1% пентобарбиталом натрия (30 мг/кг), жертвуют мышами всех групп. Соберите ~ 400 мкл образцов крови из орбитальной вены каждой мыши.
ПРИМЕЧАНИЕ: Стимулируйте пальцы ног и подошвы мышей пинцетом. Если реакции нет, это доказывает адекватную анестезию. - Центрифугируют кровь в течение 10 мин при 5,733 x g при 4 ° C для получения образцов плазмы и определения уровней TC, TG, LDLP-C и HDL-C с помощью коммерчески доступных наборов для анализа (см. Таблицу материалов). Получают образцы тканейпечени 16 и подвергают их гистопатологическому анализу. Используйте оставшиеся образцы плазмы и печени для анализа метаболомики (шаг 3).
ПРИМЕЧАНИЕ: Все образцы хранятся при температуре -80 °C до использования.
- Гистопатологическое исследование печени
- Фиксируют свежие ткани печени 4% раствором параформальдегида более 24 ч. Извлеките ткань из фиксатора и разгладьте ткани-мишени скальпелем. Поместите салфетку и соответствующую этикетку в дегидратор.
- Обезвоживание в градиенте этанола: 75% спирт в течение 4 ч, 85% спирт в течение 2 ч, 90% спирт в течение 2 ч, 95% спирт в течение 1 ч, абсолютный этанол в течение 1 ч, ксилол в течение 30 мин. Поместите тканевую кассету в тканевую форму в парафиновом воске на три стирки, по 30 мин каждая16.
- Поместите пропитанные воском салфетки в тканевую закладку (см. Таблицу материалов). Прежде чем воск застынет, извлеките салфетки из дегидратора, поместите их во встроенную коробку и прикрепите соответствующую этикетку.
- Охладите восковые блоки на морозильном столе с температурой -20 °C, извлеките их из встроенной рамы и обрежьте восковой блок.
- Разрежьте обрезанные восковые блоки на участки толщиной 3 мкм с помощью микротома (см. Таблицу материалов). Опустите срезы в воду с температурой 40 °C, снимите их с горок и запекайте в духовке при температуре 60 °C. После запекания водой и сухим воском выньте его и держите при комнатной температуре.
- Последовательно помещают срезы в ксилол I на 10 мин, ксилол II на 10 мин, ксилол III на 10 мин, абсолютный этанол I на 5 мин, абсолютный этанол II на 5 мин, 75% спирт на 5 мин и промывают в воде16.
- Окрасьте срезы раствором гематоксилина для окрашивания в течение 4 мин, 1% раствором солянокислого спирта (75% спиртом) для дифференциации, 1% раствором аммиачной воды обратно синего цвета и промойте их водой.
- Испачкайте срезы раствором для окрашивания эозином в течение 2 минут и промойте их водой.
- Наблюдайте за срезами с помощью оптического микроскопа с увеличением 200х и 400х.
- Жидкостная хромато-масс-спектрометрия (LC-MS) анализ
- Идентификация ингредиентов FP
ПРИМЕЧАНИЕ: Анализ проводится с использованием сверхвысокоэффективной жидкостной хроматографии в сочетании с гибридной квадрупольной масс-спектрометрией высокого разрешения (UPLC-Q-Orbirap HRMS, LC-MS; см. Таблицу материалов).- Точно отмерьте 1 г лиофилизированного порошка FP и поместите его в чистую мерную колбу объемом 50 мл.
- Добавьте 25 мл 70% метанола в мерную колбу и точно взвесьте. Используйте ультразвуковую обработку (на водяной бане 4 °C, мощность: 250 Вт, частота: 35 кГц) в течение 30 минут, чтобы помочь растворению. Снова точно взвесьте, чтобы точно определить потери после растворения, и используйте 70% метанола, чтобы восполнить потери.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не измеряйте объем, так как масштаб мерной колбы неточен, особенно после водяной бани 4 °C. - Взбейте, чтобы полностью перемешать. Для фильтрации используйте микропористую мембрану размером 0,22 мкм.
- Подготовка образцов плазмы
- Точно добавьте 100 мкл плазмы (этап 2.2.7) в двойной объем (200 мкл) ацетонитрила в центрифужной пробирке объемом 1,5 мл и встряхните его вихрем вибратора в течение не менее 30 с. Выполните эту процедуру для всех образцов.
- Центрифугу всех образцов при 17 200 x g в течение 10 мин при 4 °C. Перенесите надосадочные жидкости после центрифугирования в новую центрифужную пробирку объемом 1,5 мл. Высушите надосадочную жидкость под азотом. Восстановите 200 мкл экстракционного растворителя (ацетонитрил: вода = 4:1 [об./об.]).
- Встряхните восстановленный раствор в течение не менее 30 с и используйте ультразвуковую обработку в течение 10 мин (на водяной бане 4 °C, мощность: 250 Вт, частота: 35 кГц). Центрифуга при 17 200 x g в течение 10 мин при 4 °C.
- Отфильтруйте надосадочные жидкости с помощью фильтрующих мембран 0,22 мкм и держите их при температуре 4 °C для анализа.
- Подготовка образцов печени
- Гомогенизируют 90 мг ткани печени (стадия 2.2.7) в течение 1 мин в ледяной метанольной воде (1:1, об./об., 1 мл) и центрифугируют их при 21 500 x g в течение 10 мин при 4 °C. Перелейте надосадочную жидкость в центрифужные пробирки объемом 1,5 мл. Выполните эту процедуру для всех образцов.
- Снова извлеките осадки, следуя той же процедуре, и объедините надосадочные жидкости в новые центрифужные пробирки объемом 1,5 мл. Высушите надосадочную жидкость под азотом. Восстановите 300 мкл экстракционного растворителя (метанол: вода = 4:1 [об./об.]).
- Встряхните восстановленный раствор в течение не менее 30 с и используйте ультразвуковую обработку в течение 10 мин (на водяной бане 4 °C, мощность: 250 Вт, частота: 35 кГц). Центрифуга при 17 200 x g в течение 15 мин при 4 °C.
- Отфильтруйте надосадочные жидкости с помощью фильтрующих мембран 0,22 мкм и держите их при температуре 4 °C для анализа.
ПРИМЕЧАНИЕ: Объединенные образцы контроля качества (КК) были подготовлены путем смешивания 10 мкл аликвот из каждого образца плазмы и печени (один на шесть образцов).
- Параметры анализа LC-MS
ПРИМЕЧАНИЕ: Подвижная фаза состоит из 0,1% муравьиной кислоты (растворитель А) и ацетонитрила (растворитель В). Перелейте эти растворители в чистую стеклянную бутылку и соедините их с системой LC-MS.- Установите градиентные программы образцов плазмы в «входном файле» системы LC-MS следующим образом: 1% B (0-1,5 мин), 1%-60% B (1,5-13,0 мин), 60%-99% B (13,0-20,0 мин), поддерживать на уровне 99% B (20,0-25,0 мин), 99%-1% B (25,0-25,1 мин) и поддерживать на уровне 1% B до 27 мин.
- Установите условия автоподатчика образцов плазмы в «входном файле» системы LC-MS следующим образом: объем впрыска, 2 мкл; и расход 0,3 мл/мин для каждого анализа.
- Установите градиентную программу образцов печени во «входном файле» системы LC-MS следующим образом: 1% B (0-1 мин), 1%-53% B (1-15 мин), 53%-70% B (15-30 мин), 70%-90% B (30-32 мин), 90%-95% B (32-40 мин), 95%-1% B (40-42 мин) и поддерживайте на уровне 1% B до 45 мин.
- Установите условия автоподатчика образцов печени во «входном файле» системы LC-MS следующим образом: объем инъекции, 5 мкл; и расход 0,3 мл/мин для каждого анализа.
- Установите условия обнаружения МС образцов плазмы и печени в «файле настройки MS» системы LC-MS. Выполните сбор данных MS, используя как положительный, так и отрицательный режимы ионизации.
ПРИМЕЧАНИЕ: Параметры ионизации нагретого электрораспыления следующие: напряжение распыления: 3,5 кВ для положительной ионизации и 3,8 кВ для отрицательной ионизации; Расход газа в оболочке: 55 арб; Расход вспомогательного газа: 15 АРБ; температура нагревателя зонда: 300 °C; и капиллярная температура: 350 °C. - Импортируйте собранные необработанные данные в программное обеспечение Compound Discoverer и установите шаблон метода, следуя инструкциям производителя (см. Таблицу материалов).
- Идентификация ингредиентов FP
3. Метаболомная валидация
ПРИМЕЧАНИЕ: Данные метаболомного профилирования метаболитов плазмы и печени импортируются в программное обеспечение Compound Discoverer для выполнения экстракции метаболических признаков с использованием алгоритма экстракции молекулярных признаков. Установите параметры следующим образом: отклонение массы, 5 х 10-6; массовый диапазон, 100-1 500; пороговое значение отношения сигнал/шум (SNR), 3; и отклонение времени удержания - 0,05. Оцените стабильность и повторяемость метаболомики по относительному стандартному отклонению (RSD) областей пика КК.
- Используйте программное обеспечение SIMCA-P (см. Таблицу материалов) для многомерного статистического анализа интегральных значений, полученных по результатам LC-MS. Используйте ортогональный дискриминантный анализ частичных наименьших квадратов (OPLS-DA) для среднецентрированных данных и моделирования классов выборки.
- После теста OPLS-DA рассмотрите метаболиты с интегралом с переменной важностью в значениях проекции (VIP) >1 и p-значением <0,05 из t-критерия Стьюдента в качестве потенциальных дифференциальных метаболитов.
- Идентификация нарушенных метаболитов и метаболических путей с помощью открытых источников баз данных, включая Human Metabolome (HMDB; http://www.hmdb.ca/), Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG; https://www.kegg.jp/) и MetaboAnalyst5.0 (https://www.metaboanalyst.ca/).
- Визуализируйте представления результатов с помощью MetaboAnalyst5.0 и платформы Wu Kong (https://www.omicsolution.com/wkomics/main/).
4. Молекулярный докинг
- Загрузите 3D-структуру выбранных ингредиентов FP из базы данных TCMSP соответственно. Найдите названия ингредиентов в поле поиска «Химическое название» и загрузите соответствующие файлы 3D-структур в формате mol2.
- Загрузите кристаллические структуры ключевых мишеней из базы данных AlphaFold Protein Structure Database (Alphafold DB;, https://alphafold.ebi.ac.uk/). Найдите имена целевых объектов в поле поиска и загрузите соответствующие файлы кристаллических структур в формате pdb.
- Импортируйте файлы ингредиентов и целевых структур в программное обеспечение AutoDockTools. Нажмите « Изменить» > «Удалить воду », чтобы удалить молекулы воды. Нажмите «Изменить > водорода» > «Добавить », чтобы добавить водород. Установите ингредиенты в качестве «лиганда» и выполните слепую стыковку, выбрав целые мишени в качестве «рецептора»17.
- Введите значение в поле за «центром» и «размером», чтобы скорректировать вновь разработанное пространство, что позволит полностью охватить лиганд и рецептор. Сохраните файлы лиганда и рецептора в формате pdbqt.
- Используйте AutoDock Vina для выполнения молекулярной стыковки. Задайте для панели «Рецептор» имя «receptor.pdbqt», а для панели «Лиганд» — имя «ligand.pdbqt». Получение оптимального места для связывания лиганда с рецептором. Запишите значение энергии связи в оптимальном положении.
ПРИМЕЧАНИЕ: Процесс стыковки был рассчитан с помощью генетического алгоритма14. Все параметры прогона стыковки были значениями по умолчанию. Стыковочные рамы будут автоматически ранжированы от самой высокой до самой низкой энергии связи. - Импортируйте файлы стыковки в PILP (Protein-ligand Interaction Profiler' https://plip-tool.biotec.tu-dresden.de/plip-web/plip/index), чтобы получить визуальную модель системы. Загрузите файлы модели в формате pse и импортируйте их в программное обеспечение PyMOL (см. Таблицу материалов) для построения дальнейшей визуализации.
5. Статистический анализ
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте статистическое программное обеспечение SPSS (см. Таблицу материалов) для анализа данных. Рассмотрим значение p < 0,05 как статистически значимое.
- Выразите значения как среднее значение ± стандартное отклонение (SD).
- Выполните одностороннюю ANOVA, за которой следует постфактум наименьшая значимая разница (LSD), Даннетта (в случае равной дисперсии) или T3 Даннетта (в случае неравной дисперсии), чтобы проверить статистическую значимость среди групп.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Сетевая фармакология
В общей сложности 18 потенциальных ингредиентов в FP были проверены в соответствии с их фармакокинетическими и фармакодинамическими свойствами из базы данных и анализа LC-MS (общее количество ионных хроматограмм показано на дополнительном рисунке 1). Согласно соответствующей литературе, содержание галловой кислоты намного выше, чем у других ингредиентов, и эффективно снижает уровень липидов 9,11. Поэтому этот ингредиент также считался потенциальным ингредиентом. В общей сложности было найдено 19 ингредиентов и 134 связанных с ингредиентами мишеней FP. Все 19 ингредиентов показаны в таблице 1. Чтобы выбрать наиболее репрезентативные ингредиенты для дальнейшего анализа, эти ингредиенты были импортированы в базу данных Bioinformatics Analysis Tool for Molecular MechANism of Traditional Chinese Medicine (BATMAN-TCM; http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/). Согласно сети «ингредиент-мишень-путь-заболевание», некоторые биологически активные ингредиенты, такие как галловая кислота, кверцетин и бета-ситостерол, были идентифицированы как наиболее важные ингредиенты FP, связанные с гиперхолестеринемией и коронарным атеросклерозом (дополнительный рисунок 2). Среди них галловая кислота является одной из наиболее широко изученных фенольных кислот; это основной биологически активный ингредиент, представленный в FP18. Между тем, галловая кислота также является ингредиентом с самым высоким содержанием в FP; Его концентрация обычно составляет от 1% до 3%. El-Hussainy et al.19 показали, что галловая кислота может ограничивать повреждение сердца, улучшать липидный профиль и подавлять маркеры сердечного воспаления. Содержание кверцетина и бета-ситостерола ниже, но некоторые исследования доказали их влияние на снижение липидов. Кверцетин, как важный флавоноид, широко распространенный в растениях, обладает различными свойствами, такими как антиоксидантное, противовоспалительное и сердечно-сосудистое действие20. Lu et al.21 изучили, что сок, обогащенный кверцетином, может ослаблять уровни TC, LDL-C и HDL-C у здоровых людей с легкой гиперхолестеринемией. Что касается бета-ситостерина, клинические исследования показали, что растительный стерол может значительно предотвратить гиперхолестеринемию и сердечно-сосудистые заболевания22,23. Althwab et al.24доказали, что бета-ситостерол может улучшить липидный профиль и индекс атерогенной активности у крыс HFD. Можно видеть, что гиполипидемический эффект FP может быть связан с этими тремя ингредиентами.
Кроме того, было собрано 1,552 мишени, связанных с гиперлипидемией, из баз данных Genecards, OMIM и TTD. После сопоставления 134 мишеней, связанных с ФП, с мишенями, связанными с гиперлипидемией, 62 мишени были определены в качестве потенциальных мишеней для ФП против гиперлипидемии (рис. 2А). Все пересекающиеся мишени были нормализованы к их официальным символам, согласно базе данных UniProt. Впоследствии сеть PPI была построена STRING (рис. 2B) и Cytoscape (рис. 2C). Объединив оценки вычислительных методов, 10 лучших целей были ESR1, RELA, FOS, EGFR, HIF1A, AR, CCND1, IL6, MAPK8 и MYC. Подробности представлены на дополнительном рисунке 3. Все эти 62 мишени являются основой дальнейшего анализа, который интегрируется с результатами метабономики.
Пути GO и KEGG были выполнены с помощью анализа обогащения. Топ-15 путей по количеству мишеней были отобраны для анализа в соответствии с p-значением. Результаты обогащения GO показали, что биологические процессы и молекулярная функция FP против гиперлипидемии в основном связаны с экспрессией генов и связыванием с белками (рис. 2D). Обогащение KEGG доказало, что FP может вмешиваться в процесс липидного обмена и атеросклероза (рис. 2E), что означает, что FP снимает гиперлипидемию, влияя на липидный обмен.
Влияние ФП на уровень липидов в плазме крови и печеночный индекс
Чтобы проверить улучшенное влияние ФП на гиперлипидемию, сначала были измерены изменения ТС, ТГ, ХС-ЛПНП, ХС-ЛПВП и печеночного индекса (отношение массы печени к массе тела). По сравнению с группой НК у мышей в группе HFD наблюдалось значительное повышение уровней ТС в плазме (р < 0,001), ХС-ЛПНП (р < 0,001) и ТГ (р < 0,05), что указывает на то, что длительное вмешательство ВЧД может повышать уровень липидов и индуцировать гиперлипидемию (рис. 3).
После введения водной экспозиции ФП уровни ТК в FP_L и FP_H группах были достоверно снижены (р < 0,05) на 18,8% и 12,4% соответственно (рис. 3А). Уровни ХС-ЛПНП в FP_L и FP_H группах были достоверно снижены (p < 0,05) на 13,7% и 21,8% соответственно (рис. 3B). Что касается уровня ХС-ЛПВП, то FP_H группа была достоверно (p < 0,01) увеличена с 1,81 ± 0,08 ммоль/л до 2,65 ± 0,16 ммоль/л по сравнению с группой HFD (рис. 3C). Хотя уровень ТГ оставался незначительным после вмешательства ФП, он был снижен по сравнению с группой ВЧУ (рис. 3D). Недавние исследования показали, что индекс соотношения ХС-ЛПНП/ХС-ЛПВП является лучшим показателем, чем ХС-ЛПНП или ХС-ЛПВП в одиночку при прогнозировании сердечно-сосудистых заболеваний25,26. По сравнению с группой HFD соотношение ХС-ЛПНП/ХС-ЛПВП было значительно (p < 0,01) снижено на 46,3% в группе FP_H (рис. 3E), что означает, что вмешательство FP снижало уровень плохого холестерина и повышало уровень хорошего холестерина. Как основной орган жирового обмена, вес печени в определенной степени отражает накопление жира у мышей27. Через 12 недель печеночные индексы в группе FP_L и FP_H группе были достоверно снижены (p < 0,01) по сравнению с группой HFD (рис. 3F). Группа ПК также показала разную степень снижения этих показателей выше, демонстрируя, что FP имеет сходные эффекты со статинами, а защитный эффект показал зависимость доза-реакция.
Различные клинические исследования показали, что после приема экстракта или целого FP в течение некоторого времени уровни TC и LDL-C значительно снижались. Между тем, уровень ХС-ЛПВП был значительно повышен при длительном введении FP28,29. Намбияр иШетти 30 обнаружили, что сок FP может уменьшать окисленные липопротеины низкой плотности, что значительно снижает риск атеросклероза. Gopa et al.31 оценили гиполипидемический эффект ФП у пациентов с гиперлипидемией и сравнили его с симвастатином. Лечение ФП привело к значительному снижению ТС, ХС-ЛПНП и ТГ, а также к значительному повышению уровня ХС-ЛПВП, аналогичному уровню симвастатина. В этом исследовании FP и симвастатин также имели сходные терапевтические эффекты, а эффект снижения уровня ХС ЛПНП и восстанавливающее действие ФП на печень превосходили симвастатин.
Гистопатологическое наблюдение за печенью
Влияние FP на стеатоз печени у мышей HFD показано на рисунке 4. Патологические участки печени в группе НК экспрессировали регулярную морфологию гепатоцитов, четко очерченные границы клеток и отсутствие явных жировых вакуолей (рис. 4А, Б). Для сравнения, группа HFD имела жировые вакуоли разного размера вокруг кровеносных сосудов и демонстрировала очевидное повреждение печени, характеризующееся отеком клеток, жировой дегенерацией, потерей клеточных границ, клеточным сокращением и некрозом гепатоцитов (рис. 4C, D). Как показано на рисунке 4E, F, вмешательство FP может улучшить стеатоз печени, особенно в группе FP_L. По сравнению с группой HFD, группа FP_H (рис. 4G, H) и группа PC (рис. 4I, J) имели определенную степень восстановления структуры клеток печени, дегенерацию жира и уменьшение жировой вакуоли. Это означает, что вмешательство FP может защитить ткань печени от повреждения печени, вызванного HFD.
Профилирование метаболомики
Согласно уровню липидов в плазме крови и гистопатологическому наблюдению за печенью, высокие дозы ФП оказывали лучшее влияние на гиперлипидемию, чем низкие дозы ФП. Поэтому были выбраны группы NC, HFD и FP_H для анализа изменения уровня метаболизма. Общее количество ионных хроматограмм образцов КК было показано на дополнительном рисунке 4. Для обеспечения точности данных из всех образцов контроля качества были удалены признаки со значениями RSD >30%. PCA и ионные хроматограммы показали, что образцы контроля качества были стабильными во время процесса (дополнительный рисунок 5). Всего после предварительной обработки данных было определено 626 и 562 признаков в плазме и печени. Среди них 120 и 124 метаболита в плазме и печени соответственно были идентифицированы на основе базы данных KEGG. Анализ OPLS-DA был использован для изучения разделения между группами NC, HFD и FP_H. OPLS-DA показал, что одни и те же групповые образцы сгруппированы вместе, и разные групповые образцы хорошо различаются (рис. 5A, B). Эти результаты показали, что вмешательства HFD и FP вызывали очевидные метаболические изменения.
Для идентификации потенциальных дифференциальных метаболитов, которые способствовали метаболическому различению, были проведены дальнейшие анализы OPLS-DA и t-критерия NC по сравнению с HFD и HFD по сравнению с FP_H соответственно. Результаты OPLS-DA хорошо различались и показали значительные различия между различными группами моделей14 (дополнительный рисунок 6). На основе VIP (переменная, важная в проекции) >1 и p < 0,05, 32 метаболита в плазме показали дифференциацию между группой NC и HFD, а 72 метаболита показали дифференциацию между HFD и FP_H группой. В печени 38 метаболитов показали дифференциацию между группой NC и HFD, а 17 метаболитов показали дифференциацию между группой HFD и группой FP_H. Наконец, в общей сложности 16 и 6 метаболитов были идентифицированы как дифференциальные метаболиты у мышей, влияющих на FP, HFD в плазме и печени соответственно (дополнительный рисунок 7). Информация об этих метаболитах приведена в таблице 2.
Чтобы визуализировать различия в метаболитах между тремя группами, с помощью MetaboAnalyst 5.0 были построены тепловые карты. Все дифференциальные метаболиты в плазме и печени были изменены в группе HFD, и большинство из них были обращены вспять в группе FP, что указывает на то, что вмешательство FP может улучшить метаболическое расстройство (рис. 5C, D). Кроме того, дифференциальные метаболиты были импортированы в MetaboAnalyst 5.0 для изучения метаболических путей FP у мышей HFD. Основываясь на p < 0,05 и влиянии пути >0,10, метаболизм триптофана в плазме значительно влиял, и метаболитами, связанными с этим путем, были D-триптофан и L-кинуренин (рис. 5E). Jung et al.32 исследовали, что длительная гиперлипидемия может снизить уровень кинуренина в сыворотке крови. Метаболизм таурина и гипотаурина значительно повлиял на метаболизм таурина и гипотаурина, и родственным метаболитом был таурин (рис. 5F). Таурин является важной и необходимой аминокислотой в организме животных; Dong et al.33 изучили, что таурин может мягко уменьшить повреждение липидов крови и снизить риск атеросклероза, вызванного HFD. В этом исследовании вмешательство FP увеличило содержание L-кинуренина и таурина, что положительно связано со снижением уровня липидов, поддерживая эффективность FP против гиперлипидемии.
Комплексный анализ сетевой фармакологии и метаболомики
Комплексная стратегия сетевой фармакологии в сочетании с метаболомикой становится все более необходимой при изучении механизмов заболевания и стратегий вмешательства. Была установлена связь между сетевой фармакологией и метаболомикой с ограниченными доказательствами. Для получения комплексного представления о механизме ФП на фоне гиперлипидемии были построены сети взаимодействия, основанные на сетевой фармакологии и метаболомике. Дифференциальные метаболиты были импортированы в плагин MetScape в Cytoscape и соответствовали генам-концентраторам, идентифицированным в сетевой фармакологии, для сбора сетей соединений-реакций-ферментов-генов (рис. 6). Как показано в таблице 3, в метаболитах плазмы L-кинуренин и кортикостерон были связаны с CYP1A1, который может катализировать перекисное окисление липидов и индуцировать неалкогольную жировую болезнь печени34,35; Затронутыми путями были метаболизм триптофана и биосинтез стероидных гормонов соответственно. Ацетилхолин был связан с АХЭ и влиял на метаболизм глицерофосфолипидов. В метаболитах печени MGAM и рафиноза были связаны с метаболизмом галактозы. Несколько исследований показали, что потребление олигосахаридов семейства рафиноз может улучшить метаболические нарушения у мышейHFD 36.
Кроме того, была построена сеть ингредиентов-мишеней-метаболитов-путей (рис. 7). В ингредиентах кверцетин соединил большинство краев, что указывает на то, что кверцетин FP играет наиболее важную роль в снижении уровня липидов. Проведенный выше комплексный анализ выявил ключевые мишени, метаболиты и пути ФП против гиперлипидемии, что может стать основой для дальнейшего изучения терапевтического механизма и клинического применения этого препарата.
Молекулярный докинг
Для дальнейшего изучения возможности взаимодействия между выбранными ингредиентами и ключевыми мишенями был использован молекулярный докинг для анализа их взаимодействий лиганд-активных центров. Программное обеспечение AutoDock Vina (см. Таблицу материалов) использовалось для выполнения молекулярного стыковки, и первая поза стыковки была выведена в соответствии с рангом функции подсчета очков. Результаты стыковки показаны на рисунке 8.
В интегральном анализе CYP1A1, AChE и MGAM были связаны с дифференциальными метаболитами; Они построили мосты между мишенями и метаболитами. Дальнейший молекулярный докинг был выполнен для проверки связи между мишенью и ингредиентами. Результаты стыковки ингредиентов с CYP1A1 были следующими: галловая кислота образовала четыре водородные связи через аминокислотные остатки Asn-185, Tyr-187, Asn-219 и His-500 и образовала π-π взаимодействие укладки через аминокислотный остаток Tyr-187 (рис. 8A); кверцетин образовал три водородные связи через Asn-185, Asn-219 и His-500, гидрофобное взаимодействие и взаимодействие стекирования π-π через Tyr-187 (рис. 8B); бета-ситостерол образовал четыре водородные связи через Arg-362, Ser-363, Leu-365 и Arg-464 и гидрофобное взаимодействие через Glu-369 и Ile-439 (рис. 8C). Энергии связи составляли 5,3, 7,0 и 7,3 ккал/моль соответственно. При взаимодействии с АХЭ галловая кислота стабилизировалась водородными связями с Arg-237, Arg-238 и Arg-480 (рис. 8D); кверцетин стабилизировали водородными связями с Arg-237 и Phe-474, гидрофобным взаимодействием с Phe-157 и π-π стэковым взаимодействием с Tyr-478 (рис. 8E); бета-ситостерол стабилизировали гидрофобным взаимодействием с Phe-157, Val-244, Ile-248, Phe-474, Ala477 и TYR478 (рис. 8F). Энергии связи составляли 5,0, 6,5 и 8,0 ккал/- моль соответственно. При взаимодействии с MGAM галловая кислота стабилизировалась водородными связями с Ile-1716, Gly-1747 и Trp-1749 и гидрофобным взаимодействием с Tyr-1715 и Trp-1749 (рис. 8G); кверцетин стабилизировали водородными связями с Arg-1311, Thr-1726, Gln-1731 и Trp-1752, водородными связями с Arg-1730 и укладкой π-π с His-1727 (рис. 8H); бета-ситостерол стабилизировали гидрофобным взаимодействием с Pro-1159, Trp-1355, Phe-1427 и Phe-1560, Энергии связи составляли 5,9, 8,1 и 6,9 ккал/моль соответственно. Подробная информация о взаимодействиях и сродстве связывания представлена в таблице 4. Множественные сайты связывания и высокая энергия связывания объясняют высокое сродство между ингредиентами и белковыми мишенями, подтверждая, что эти ингредиенты играют роль снижения уровня липидов, воздействуя на мишени, связанные с гиперлипидемией.
Рисунок 1: Схематическая блок-схема интегрированной стратегии. Основные ингредиенты и гены были извлечены с помощью сетевой фармакологии (часть 1). Дифференциальные метаболиты ФП в отношении гиперлипидемии анализировали методом метаболомики плазмы и печени (часть 2). Ключевые мишени, метаболиты и пути были идентифицированы и связаны на основе комплексного анализа Части 1 и Части 2 (Часть 3). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Целевой скрининг, построение сети и анализ обогащения эффекта FP против гиперлипидемии. (A) Диаграмма Венна мишеней FP-гиперлипидемии. (B) Сеть потенциальных активных ингредиентов-мишеней-болезней: различные цветовые символы, как указано здесь: болезнь (красный), лекарство (синий), ингредиенты (зеленый) и мишени (желтый). (C) Сеть PPI по STRING. (D) Анализ пути обогащения GO. (E) Анализ пути обогащения KEGG. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Влияние FP на уровень липидов в плазме и печеночный индекс у мышей с гиперлипидемией, вызванной HFD (n = 6). а) Уровни ТС. b) Уровни ХС-ЛПНП. (C) Уровень ХС-ЛПВП. (D) Уровень ТГ. (E) Соотношение ХС-ЛПНП/ХС-ЛПВП. (F) Печеночные индексы*p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Статистически значимые различия оценивались с помощью одностороннего ANOVA с последующим тестом множественных сравнений Даннетта или постфактум-анализом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Влияние FP на ткань печени у мышей с гиперлипидемией, вызванной HFD (окрашивание H&E). (A,B) NC-группа, (C,D) группа HFD, (E,F) FP_L группа, (G,H) FP_H группа, (I,J) группа PC (n = 6). Масштабная линейка: (A, C, E = 200 мкм; B, D, F = 50 мкм). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Графики оценки OPLS-DA, тепловые карты и метаболические пути дифференциальных метаболитов. Графики оценки OPLS-DA FP на мышах HFD в плазме (А) и печени (В). Тепловые карты дифференциальных метаболитов в плазме (С) и печени (D). Метаболические пути дифференциальных метаболитов в плазме (Е) и печени (F). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Сети соединений-реакций-ферментов-генов ключевых метаболитов и мишеней. Узлы низкой степени были удалены. Красные шестиугольники, синие круги, круглые зеленые прямоугольники и серые ромбы представляют активные соединения, гены, белки и реакции соответственно. Ключевые мишени и метаболиты были увеличены. Пути с белым фоном значительно регулируются в плазме. Путь с серым фоном значительно регулируется в печени. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 7: Сеть ингредиентов-мишеней-метаболитов-путей. Чем темнее цвет, тем больше связанных краев, означающих, что узел важнее в этой сети. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 8: Диаграммы взаимодействия ингредиентов FP и ключевые мишени . (A) Галловая кислота, действующая на CYP1A1. (B) Кверцетин, действующий на CYP1A1. (C) Бета-ситостерол, действующий на CYP1A1. (D) Галловая кислота, действующая на AChE. (E) Кверцетин, действующий на AChE. (F) Бета-ситостеролинг действует на АХЭ. (G) Галловая кислота, действующая на MGAM. (H) Кверцетин, действующий на MGAM. (I) Бета-ситостерол, действующий на MGAM. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 9: Обзор результатов ФП на фоне гиперлипидемии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Таблица 1: Выбранные ингредиенты водного экстракта FP. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.
Таблица 2: Дифференциальные метаболиты между тремя группами. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.
Таблица 3: Информация об основных мишенях, метаболитах и путях развития. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.
Таблица 4: Сайты связывания и силы действия между ингредиентами FP и белками-мишенями. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.
Дополнительный рисунок 1: Хроматограммы положительных и отрицательных ионов водного экстракта FP. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный рисунок 2: Сеть FP ингредиент-мишень-путь-болезнь от BATMAN-TCM. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный рисунок 3: Частотный анализ генов-концентраторов в сетевой фармакологии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный рисунок 4: Ионные хроматограммы образцов КК плазмы и печени. Репрезентативные положительные (А) и отрицательные (В) ионные хроматограммы образцов КК плазмы. Репрезентативные положительные (С) и отрицательные (D) ионные хроматограммы образцов КК печени. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный рисунок 5: Графики оценки PCA образцов контроля качества плазмы (A) и печени (B). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный рисунок 6: Графики оценки OPLS-DA образцов плазмы (A и B) и печени (C и D). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный рисунок 7: Диаграммы Венна дифференциальных метаболитов в образцах плазмы (А) и печени (В). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В последние годы уровень заболеваемости гиперлипидемией увеличивается, в основном из-за долгосрочных нездоровых привычек питания. ТКМ и ее химические ингредиенты обладают различной фармакологической активностью, которая была широко изучена в последние годы37,38. FP является своего рода фруктовым ресурсом, используемым как в качестве лекарства, так и в качестве пищи, и обладает важным потенциалом для лечения гиперлипидемии. Тем не менее, потенциальный терапевтический механизм FP против гиперлипидемии нуждается в дальнейшем изучении.
Сетевая фармакология оценивает полифармакологические эффекты лекарств на молекулярном уровне и прогнозирует взаимодействие натуральных продуктов и белков для определения основного механизма39. Первым шагом является выбор активных ингредиентов и ключевых мишеней препарата. В этом исследовании было обнаружено девять активных ингредиентов и 62 гена-концентратора. Для дальнейшего понимания молекулярного механизма ФП при гиперлипидемии на основе анализа сетевой фармакологии были установлены ИПП и сети ингредиент-мишень. Чтобы сузить круг ключевых ингредиентов и мишеней, BATMAN-TCM основала три ключевых ингредиента (галловая кислота, кверцетин и бета-ситостерин), связанных с гиперхолестеринемией и коронарным атеросклерозом. Все эти ингредиенты могут снижать уровень ХС-ЛПНП или повышать уровень ХС-ЛПВП, подтверждая специфическое влияние ФП на гиперлипидемию. Кроме того, согласно анализу обогащения KEGG, функция FP на гиперлипидемию связана с активностью липидного и атеросклерозного пути. Хотя этот метод слишком сильно зависит от базы данных и не имеет экспериментальной проверки, он имеет теоретическую ценность и дает идеи для последующих экспериментальных проверочных исследований.
Для дальнейшего экспериментального подтверждения мышей кормили диетой с добавками жиров в течение 8 недель, чтобы вызвать гиперлипидемию. Результаты показали, что уровни ТС, ХС-ЛПНП и ТГ в плазме были значительно повышены. Хотя уровень ХС-ЛПВП значительно снизился, отношение ХС-ЛПНП к ХС-ЛПВП значительно увеличилось. Гистопатологические наблюдения показали, что ткань печени мышей HFD была сильно повреждена, но значительного увеличения печеночного индекса не наблюдалось; Может случиться так, что изменения массы тела и висцерального веса занимают больше времени. Липидные и печеночные изменения адекватно показали влияние вмешательства ФП на гиперлипидемию. Тем не менее, внутренний механизм эффекта вмешательства все еще нуждается в дальнейшем изучении.
Метаболомика предоставляет список потенциальных метаболитов и связанных с ними путей, целью которых является изучение механизма метаболических заболеваний и действия терапевтических препаратов40. На результат метаболомики может влиять тип образца. Учитывая патогенетические особенности гиперлипидемии, для метабономического анализа в данном исследовании были отобраны образцы плазмы и печени. Согласно результатам OPLS-DA, метаболиты групп NC, HFD и FP_H были хорошо дискриминированы. Всего в плазме было обнаружено 16 дифференциальных метаболитов, а в печени - 6 дифференциальных метаболитов. В плазме было больше пораженных метаболитов, чем в печени, что доказывает, что кровь является основным местом метаболического нарушения, вызванного гиперлипидемией. Вмешательство FP может обратить вспять изменение этих метаболитов под влиянием HFD. Кроме того, эти дифференциальные метаболиты были импортированы в базу данных KEGG. Значимыми метаболическими путями дифференциальных метаболитов в плазме были метаболизм триптофана, а в печени - метаболизм таурина и гипотаурина. В этом исследовании вмешательство FP увеличило содержание L-кинуренина в метаболизме триптофана и содержание таурина в метаболизме таурина и гипотаурина, что означает, что FP может быть эффективным в благоприятной коррекции метаболических нарушений и гиперлипидемии. Метаболомный анализ показал, какие метаболиты были связаны с гиперлипидемией или вмешательством FP, и определил последующий механизм эффекта FP.
Объединив результат сетевой фармакологии с метаболомикой, были идентифицированы три ключевые мишени (CYP1A1, AChE и MGAM) в сетях соединений-реакций-ферментов-генов. Согласно анализу молекулярного стыковки, эти мишени показали высокое сродство с ингредиентами FP (галловой кислотой, кверцетином и бета-ситостерином). Четыре метаболита (L-кинуренин, кортикостерон, ацетилхолин и рафиноза) и четыре связанных пути (метаболизм триптофана, биосинтез стероидных гормонов, метаболизм глицерофосфолипидов и метаболизм галактозы) были идентифицированы как ключевые метаболиты и метаболические пути. Среди них кверцетин был связан с большинством мишеней, а метаболизм триптофана появился как в метабономике, так и в интегрированных результатах. Они играют наиболее существенную роль в терапевтическом эффекте ФП против гиперлипидемии. Результат молекулярного стыковки показал, что CYP1A1, AChE и MGAM обладают высоким сродством к ингредиентам. Приведенные выше результаты доказывают, что эти скрининговые мишени тесно связаны с терапевтическим эффектом ФП.
В настоящем исследовании галловая кислота, кверцетин и бета-ситостерол были идентифицированы как активные ингредиенты FP для антигиперлипидемии, а метаболизм триптофана является основным метаболическим путем терапии FP у мышей HFD. Обзор результата показан на рисунке 9. Это исследование предоставило данные и теоретическую поддержку для дальнейших исследований механизмов и заложило основу для клинического применения медицины FP. Это также доказало, что натуральная пища может быть перспективным вариантом с большими перспективами в клинической практике. Однако в этом исследовании все же есть некоторые недостатки. Терапевтическое влияние одного действующего вещества на гиперлипидемию не проверено. Кроме того, не изучен путь достижения ключевых целей; Он также нуждается в дальнейших систематических экспериментах в области молекулярной биологии для проверки точного механизма.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Все авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано Группой разработки продуктов и инноваций ТКМ «Сохранение здоровья и реабилитация» (2022C005) и Исследование трансграничной интеграции нового бизнеса «Сохранение здоровья и реабилитация +».
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 101-3B Oven | Luyue Instrument and Equipment Factory | \ | |
| 80312/80302 Glass Slide | Jiangsu Sitai Experimental Equipment Co., LTD | \ | |
| 80340-1630 Cover Slip | Jiangsu Sitai Experimental Equipment Co., LTD | \ | |
| AccucoreTM C18 (3 mm × 100 mm, 2. 6 μm) | Thermo Fisher Scientific | \ | |
| Acetonitrile | Fisher Chemical | A998 | Version 1.5.6 |
| ACQUITY UPLC HSS T3 Column (2.1 mm × 100 mm, 1.8 μm) | Thermo Fisher Scientific | \ | |
| Aethanol | Fisher Chemical | A995 | Version 3.0 |
| Ammonia Solution | Chengdu Cologne Chemicals Co., LTD | 1336-21-6 | Version 3.9.1 |
| AutoDockTools | Scripps Institution of Oceanography | \ | |
| BS-240VT Full-automatic Animal Biochemical Detection System | Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Co., Ltd. | \ | |
| Compound Discoverer | Thermo Fisher Scientific | \ | |
| Cytoscape | Cytoscape Consortium | \ | |
| DM500 Optical Microscope | Leica | \ | |
| DV215CD Electronic Balance | Ohaus Corporation ., Ltd | T15A63 | |
| Ethyl Alcohol | Chengdu Cologne Chemicals Co., LTD | 64-17-5 | |
| Formic Acid | Fisher Chemical | A118 | |
| HDL-C Assay Kit | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A112-1-1 | |
| Hematoxylin Staining Solution | Biosharp | BL700B | |
| High Fat Diet | ENSIWEIER | 202211091031 | |
| Hitachi CT15E/CT15RE Centrifuge | Hitachi., Ltd. | \ | |
| Homogenizer | Oulaibo Technology Co., Ltd | \ | |
| Hydrochloric Acid | Chengdu Cologne Chemicals Co., LTD | 7647-01-0 | |
| Image-forming System | LIOO | \ | |
| JB-L5 Freezer | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | \ | |
| JB-L5 Tissue Embedder | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | \ | |
| JK-5/6 Microtome | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | \ | |
| JT-12S Hydroextractor | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | \ | |
| KQ3200E Ultrasonic Cleaner | Kun Shan Ultrasonic Instruments Co., Ltd | \ | |
| LDL-C Assay Kit | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A113-1-1 | |
| Male C57BL/6 Mice | SBF Biotechnology Co., Ltd. | \ | Version 2.3.2 |
| Neutral Balsam | Shanghai Yiyang Instrument Co., Ltd | 10021190865934 | |
| Pure Water | Guangzhou Watson's Food & Beverage Co., Ltd | GB19298 | |
| PyMOL | DeLano Scientific LLC | \ | Version 14.1 |
| RE-3000 Rotary Evaporator | Yarong Biochemical Instrument Factory ., Ltd | \ | |
| RM2016 Pathological Microtome | Shanghai Leica Instruments Co., Ltd | \ | Version 26.0 |
| SIMCA-P | Umetrics AB | \ | |
| Simvastatin | Merck Sharp & Dohme., Ltd | 14202220051 | |
| SPSS | International Business Machines Corporation | \ | |
| TC Assay Kit | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A111-1-1 | |
| TG Assay Kit | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A110-1-1 | |
| UPLC-Q-Exactive Quadrupole Electrostatic Field Orbital Hydrazine High Resolution Mass Spectrometry | Thermo Fisher Scientific | \ | |
| Vortex Vibrator | Beijing PowerStar Technology Co., Ltd. | LC-Vortex-P1 | |
| Xylene | Chengdu Cologne Chemicals Co., LTD | 1330-20-7 |
References
- Nelson, R. H. Hyperlipidemia as a risk factor for cardiovascular disease. Primary Care: Clinics in Office Practice. 40 (1), 195-211 (2013).
- Mach, F., et al. 2019 ESC/EAS Guidelines for the management of dyslipidaemias: lipid modification to reduce cardiovascular risk: the Task Force for the management of dyslipidaemias of the European Society of Cardiology (ESC) and European Atherosclerosis Society (EAS). European Heart Journal. 41 (1), 111-188 (2020).
- Oesterle, A., Laufs, U., Liao, J. K. Pleiotropic effects of statins on the cardiovascular system. Circulation Research. 120 (1), 229-243 (2017).
- Last, A. R., Ference, J. D., Menzel, E. R. Hyperlipidemia: drugs for cardiovascular risk reduction in adults. American Family Physician. 95 (2), 78-87 (2017).
- Wu, S., et al. Recent advances of tanshinone in regulating autophagy for medicinal research. Front Pharmacol. 13, 1059360 (2022).
- Mirunalini, S., Krishnaveni, M. Therapeutic potential of Phyllanthus emblica (amla): the ayurvedic wonder. Journal of Basic and Clinical Physiology and Pharmacology. 21 (1), 93-105 (2010).
- Zhao, H. J., et al. Fructus phyllanthi tannin fraction induces apoptosis and inhibits migration and invasion of human lung squamous carcinoma cells in vitro via MAPK/MMP pathways. Acta Pharmacologica Sinica. 36 (6), 758-768 (2015).
- Yan, X., et al. Current advances on the phytochemical composition, pharmacologic effects, toxicology, and product development of Phyllanthi Fructus. Frontiers in Pharmacology. 13, 1017628 (2022).
- Yang, F., et al. Chemical constituents from the fruits of Phyllanthus emblica L. Biochemical Systematics and Ecology. 92, 104122 (2020).
- Wu, L., et al. Phytochemical analysis using UPLC-MSn combined with network pharmacology approaches to explore the biomarkers for the quality control of the anticancer tannin fraction of Phyllanthus emblica L. habitat in Nepal. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2021, 6623791 (2021).
- Variya, B. C., Bakrania, A. K., Chen, Y., Han, J., Patel, S. S. Suppression of abdominal fat and anti-hyperlipidemic potential of Emblica officinalis: Upregulation of PPARs and identification of active moiety. Biomedicine & Pharmacotherapy. 108, 1274-1281 (2018).
- Gertsch, J. Botanical drugs, synergy, and network pharmacology: forth and back to intelligent mixtures. Planta Medica. 77 (11), 1086-1098 (2011).
- Nicholson, J. K., Wilson, I. D. Understanding 'global' systems biology: metabonomics and the continuum of metabolism. Nature Reviews Drug Discovery. 2 (8), 668-676 (2003).
- Li, T., et al. Integrated metabolomics and network pharmacology to reveal the mechanisms of hydroxysafflor yellow A against acute traumatic brain injury. Computational and Structural Biotechnology Journal. 19, 1002-1013 (2021).
- Wang, F., et al. Network pharmacology combined with metabolomics to investigate the anti-hyperlipidemia mechanism of a novel combination. Journal of Functional Foods. 87, 104848 (2021).
- Adams, J. M., Jafar-Nejad, H. Determining bile duct density in the mouse liver. Journal of Visualized Experiments. (146), e59587 (2019).
- Wang, J. Y., et al. Use of viral entry assays and molecular docking analysis for the identification of antiviral candidates against coxsackievirus A16. Journal of Visualized Experiments. (149), e59920 (2019).
- Wu, L. F., Liang, W. Y., Zhang, L. Z. Determination of main components of Tibetan medicine Phyllanthus emblica L. World Science and Technology-Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica. 22 (8), 2857-2863 (2022).
- El-Hussainy, E. H. M., Hussein, A. M., Abdel-Aziz, A., El-Mehasseb, I. Effects of aluminum oxide (Al2O3) nanoparticles on ECG, myocardial inflammatory cytokines, redox state, and connexin 43 and lipid profile in rats: possible cardioprotective effect of gallic acid. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 94 (8), 868-878 (2016).
- Huang, W. Y., et al. Quercetin, hyper, and chlorogenic acid improve endothelial function by antioxidant, antiinflammatory, and ACE inhibitory effects. Journal of Food Science. 82 (5), 1239-1246 (2017).
- Lu, T. M., et al. Hypocholesterolemic efficacy of quercetin rich onion juice in healthy mild hypercholesterolemic adults: a pilot study. Plant Foods for Human Nutrition. 70 (4), 395-400 (2015).
- Witkowska, A. M., et al. Dietary plant sterols and phytosterol-enriched margarines and their relationship with cardiovascular disease among polish men and women: The WOBASZ II cross-sectional study. Nutrients. 14 (13), 2665 (2022).
- Turini, E., et al. Efficacy of plant sterol-enriched food for primary prevention and treatment of hypercholesterolemia: a systematic literature review. Foods. 11 (6), 839 (2022).
- Alamro, S. A., et al. Fermented camel milk enriched with plant sterols improves lipid profile and atherogenic index in rats fed high-fat and-cholesterol diets. Heliyon. , e10871 (2022).
- Gao, P., Wen, X., Ou, Q., Zhang, J. Which one of LDL-C/HDL-C ratio and non-HDL-C can better predict the severity of coronary artery disease in STEMI patients. BMC Cardiovascular Disorders. 22 (1), 318 (2022).
- Sun, T., et al. Predictive value of LDL/HDL ratio in coronary atherosclerotic heart disease. BMC Cardiovascular Disorders. 22 (1), 273 (2022).
- Maegawa, K., et al. Dietary raffinose ameliorates hepatic lipid accumulation induced by cholic acid via modulation of enterohepatic bile acid circulation in rats. British Journal of Nutrition. 127 (11), 1621-1630 (2022).
- Antony, B., Merina, B., Sheeba, V.
- Antony, B., Benny, M., Kaimal, T. N. B. A pilot clinical study to evaluate the effect of Emblica officinalis extract (Amlamax™) on markers of systemic inflammation and dyslipidemia. Indian Journal of Clinical Biochemistry. 23 (4), 378-381 (2008).
- Nambiar, S. S., Shetty, N. P. Phytochemical profiling and assessment of low-density lipoprotein oxidation, foam cell-preventing ability and antioxidant activity of commercial products of Emblica officinalis fruit. Journal of Food Biochemistry. 39 (3), 218-229 (2015).
- Gopa, B., Bhatt, J., Hemavathi, K. G. A comparative clinical study of hypolipidemic efficacy of Amla (Emblica officinalis) with 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme-A reductase inhibitor simvastatin. Indian Journal of Pharmacology. 44 (2), 238 (2012).
- Jung, T. W., et al. Administration of kynurenic acid reduces hyperlipidemia-induced inflammation and insulin resistance in skeletal muscle and adipocytes. Molecular and Cellular Endocrinology. , 518 (2020).
- Dong, Y., Li, X., Liu, Y., Gao, J., Tao, J. The molecular targets of taurine confer anti-hyperlipidemic effects. Life Sciences. 278, 119579 (2021).
- Huang, B., Bao, J., Cao, Y. R., Gao, H. F., Jin, Y. Cytochrome P450 1A1 (CYP1A1) catalyzes lipid peroxidation of oleic acid-induced HepG2 cells. Biochemistry. 83 (5), 595-602 (2018).
- Xia, H., et al. Alpha-naphthoflavone attenuates non-alcoholic fatty liver disease in oleic acid-treated HepG2 hepatocytes and in high fat diet-fed mice. Biomedicine & Pharmacotherapy. 118, 109287 (2019).
- Dai, Z., et al. Protective effects of α-galacto-oligosaccharides against a high-fat/western-style diet-induced metabolic abnormalities in mice. Food & Function. 10 (6), 3660-3670 (2019).
- Wang, X., et al. Salidroside, a phenyl ethanol glycoside from Rhodiola crenulata, orchestrates hypoxic mitochondrial dynamics homeostasis by stimulating Sirt1/p53/Drp1 signaling. J Ethnopharmacol. 293, 115278 (2022).
- Hou, Y., et al. Salidroside intensifies mitochondrial function of CoCl(2)-damaged HT22 cells by stimulating PI3K-AKT-MAPK signaling pathway. Phytomedicine. 109, 154568 (2023).
- Noor, F., et al. Network pharmacology approach for medicinal plants: review and assessment. Pharmaceuticals. 15 (5), 572 (2022).
- Li, X., et al. Role of potential bioactive metabolites from traditional Chinese medicine for type 2 diabetes mellitus: An overview. Front Pharmacol. 13, 1023713 (2022).
