Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Netværksfarmakologi, forudsigelse og metabolomics: Validering af mekanismen for Fructus phyllanthi mod hyperlipidæmi

Published: April 7, 2023 doi: 10.3791/65071
Automatic Translation
*1,2,3, *1,2,3, *1,2,3, 1,2,3, 1,2,3, 1,2,3, 1,2,3, 2,3
1School of Health Preservation and Rehabilitation, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2State Administration of Traditional Chinese Medicine Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine, Regimen and Health, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 3Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine Regimen and Health of Sichuan Province
* These authors contributed equally

Summary

Denne protokol beskriver en integreret strategi for udforskning af de vigtigste mål og mekanismer for Fructus Phyllanthi mod hyperlipidæmi baseret på forudsigelse af netværksfarmakologi og metabolomics verifikation.

Abstract

Hyperlipidæmi er blevet en førende risikofaktor for hjerte-kar-sygdomme og leverskader på verdensplan. Fructus Phyllanthi (FP) er et effektivt lægemiddel mod hyperlipidæmi i traditionel kinesisk medicin (TCM) og indisk medicin teorier, men den potentielle mekanisme kræver yderligere udforskning. Denne forskning sigter mod at afsløre mekanismen for FP mod hyperlipidæmi baseret på en integreret strategi, der kombinerer netværksfarmakologisk forudsigelse med metabolomics-validering. En fedtfattig diæt (HFD)-induceret musemodel blev etableret ved at evaluere plasmalipidniveauerne, herunder total cholesterol (TC), triglycerid (TG), lipoproteinkolesterol med lav densitet (LDL-C) og lipoproteinkolesterol med høj densitet (HDL-C). Netværksfarmakologi blev anvendt til at finde ud af de aktive ingredienser i FP og potentielle mål mod hyperlipidæmi. Metabolomics af plasma og lever blev udført for at identificere differentielle metabolitter og deres tilsvarende veje blandt normalgruppen, modelgruppen og interventionsgruppen. Forholdet mellem netværksfarmakologi og metabolomics blev yderligere konstrueret for at opnå et omfattende overblik over FP-processen mod hyperlipidæmi. De opnåede nøglemålproteiner blev verificeret ved molekylær docking. Disse resultater afspejlede, at FP forbedrede plasmalipidniveauerne og leverskaden af hyperlipidæmi induceret af en HFD. Gallinsyre, quercetin og beta-sitosterol i FP blev demonstreret som de vigtigste aktive forbindelser. I alt 16 og seks potentielle differentielle metabolitter i henholdsvis plasma og lever viste sig at være involveret i de terapeutiske virkninger af FP mod hyperlipidæmi ved metabolomics. Yderligere, integrationsanalyse viste, at interventionseffekterne var forbundet med CYP1A1, AChE, og MGAM, samt justering af L-kynurenine, corticosteron, acetylcholin, og raffinose, hovedsageligt involverer tryptophan metabolisme vej. Molekylær docking sikrede, at ovennævnte ingredienser, der virker på hyperlipidæmi-relaterede proteinmål, spillede en nøglerolle i sænkning af lipider. Sammenfattende gav denne forskning en ny mulighed for forebyggelse og behandling af hyperlipidæmi.

Introduction

Hyperlipidæmi er en almindelig metabolisk sygdom med alvorlige konsekvenser for menneskers sundhed og er også den primære risikofaktor for hjerte-kar-sygdomme1. For nylig har der været en nedadgående aldersrelateret tendens til denne sygdom, og yngre mennesker er blevet mere modtagelige på grund af langvarig uregelmæssig livsstil og usunde spisevaner2. I klinikken er forskellige lægemidler blevet brugt til behandling af hyperlipidæmi. For eksempel er et af de mest almindeligt anvendte lægemidler til patienter med hyperlipidæmi og relaterede aterosklerotiske lidelser statiner. Imidlertid har langvarig brug af statiner bivirkninger, der ikke kan overses, hvilket fører til en dårlig prognose, såsom intolerance, behandlingsresistens og bivirkninger 3,4. Disse mangler er blevet yderligere smerter for hyperlipidæmi patienter. Derfor bør der foreslås nye behandlinger for stabil lipidsænkende effekt og færre bivirkninger.

Traditionel kinesisk medicin (TCM) har været meget udbredt til behandling af sygdomme på grund af sin gode effekt og få bivirkninger5. Fructus Phyllanthi (FP), den tørrede frugt af Phyllanthus emblica Linn. (populært kendt som amla bær eller indisk stikkelsbær), er en berømt medicin og mad homologt materiale af traditionelle kinesiske og indiske lægemidler 6,7. Denne medicin er blevet brugt til at rydde varme, afkøle blod og fremme fordøjelsen, som pr TCM teorier8. Moderne farmakologiske undersøgelser har vist, at FP er rig på bioaktive forbindelser såsom gallinsyrer, ellaginsyrer og quercetin9, som er ansvarlige for en række mangesidede biologiske egenskaber ved at fungere som en antioxidant, en antiinflammatorisk, leverbeskyttelse, en antihypolipidæmisk og så videre10. Nyere forskning har også vist, at FP effektivt kunne regulere blodlipiderne hos patienter med hyperlipidæmi. For eksempel har Variya et al.11 vist, at FP frugtsaft og dets vigtigste kemiske ingrediens i gallinsyre kan reducere plasmakolesterol og reducere olieinfiltration i leveren og aorta. Den terapeutiske effekt var relateret til FP's regulering ved at øge ekspressionen af peroxisomproliferatoraktiveret receptor-alfa og faldende hepatisk lipogen aktivitet. Men, den underliggende mekanisme af FP i forbedring af hyperlipidæmi bør undersøges yderligere, fordi dets bioaktive ingredienser er ret omfattende. Vi søgte at undersøge den potentielle mekanisme bag FP's terapeutiske effekt, som kan være gavnlig for den videre udvikling og anvendelse af dette lægemiddel.

I øjeblikket betragtes netværksfarmakologi som en holistisk og effektiv teknik til at studere den terapeutiske mekanisme for TCM. I stedet for at lede efter enkelte sygdomsfremkaldende gener og lægemidler, der udelukkende behandler et individuelt mål, konstrueres et komplet lægemiddel-ingredienser-gener-sygdomsnetværk for at finde multi-target-mekanismen for multiingredienslægemidlet med hensyn til deres omfattende behandling12. Denne teknik er især velegnet til TCM, da deres kemiske sammensætninger er massive. Desværre kan netværksfarmakologi kun bruges til at forudsige mål, der i teorien påvirkes af kemiske ingredienser. De endogene metabolitter i sygdomsmodellen bør observeres for at validere effektiviteten af netværksfarmakologi. Metabolomics-metoden, der opstår med udviklingen af systembiologi, er et vigtigt redskab til overvågning af ændringer i endogene metabolitter13. Ændringerne i metabolitter afspejler værtens steady state-ændringer, hvilket også er en vigtig indikator for at studere den interne mekanisme. Nogle forskere har med succes integreret netværksfarmakologi og metabolomics for at udforske interaktionsmekanismen mellem lægemidler og sygdomme14,15.

Denne artikel udforsker det mekanistiske grundlag for FP mod hyperlipidæmi ved at integrere netværksfarmakologi og metabolomics-teknikker. Netværksfarmakologi blev anvendt til at analysere forholdet mellem de vigtigste aktive ingredienser i FP og molekylære mål for hyperlipidæmi. Derefter blev metabolomics udført for at observere ændringen af endogene metabolitter i dyremodellen, hvilket kan forklare lægemidlets virkninger på metabolisk niveau. Sammenlignet med anvendelsen af netværksfarmakologi eller metabonomics alene gav denne integrerede analyse en mere specifik og omfattende forskningsmekanisme. Derudover blev den molekylære dockingstrategi brugt til at analysere interaktionen mellem aktive ingredienser og nøgleproteiner. Generelt kan denne integrerede tilgang kompensere for manglen på eksperimentel dokumentation for netværksfarmakologi og manglen på en endogen mekanisme for metabolomics-metoden og kan bruges til terapeutisk mekanismeanalyse af naturmedicin. Protokollens vigtigste skematiske rutediagram er vist i figur 1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle procedurer, der involverer håndtering af dyr, blev udført i overensstemmelse med Chengdu University of Traditional Chinese Medicine Guide for the Care and Use of Laboratory Animals og blev godkendt af den institutionelle etiske komité ved Chengdu University of Traditional Chinese Medicine (protokolnummer 2020-36). C57BL/6-hanmus (20 ± 2 g) blev anvendt til nærværende undersøgelse. Musene blev hentet fra en kommerciel kilde (se materialetabel).

1. Netværksfarmakologisk baseret forudsigelse

BEMÆRK: Netværksfarmakologien bruges til at forudsige de aktive ingredienser og deres vigtigste mål for FP mod hyperlipidæmi.

  1. Udvælgelse af aktive ingredienser og nøglemål
    1. Søg på nøgleordet "Phyllanthi Fructus" på det traditionelle kinesiske medicinsystems farmakologiske database (TCMSP; http://tcmspw.com/tcmsp.php) for at få listen over kandidataktive ingredienser og mål for FP.
      BEMÆRK: Normalt er kun ingredienser med oral biotilgængelighed (OB) ≥30% og lægemiddellignende (DL) værdier ≥0,18 i databasen inkluderet som aktive ingredienser.
    2. Søg på nøgleordet "hyperlipidæmi" i GeneCards-databasen (https://www.genecards.org/), Online Mendelian Inheritance in Man-databasen (OMIM; https://omim.org/) og den terapeutiske måldatabase (TTD; http://db.idrblab.net/ttd/) for at opnå de respektive kandidatmål for hyperlipidæmi. Download regnearkene med sygdomsmål. Slet de gentagne mål for at få listen over hyperlipidæmimål.
    3. Kopiér disse lister fra trin 1.1.1 og 1.1.2 til et nyt regneark. Brug funktionen "Data - Identificer dubletter" i værktøjslinjen for at få krydsmål. Importer skæringsmållisten til UniProtKB (http://www.uniprot.org/) for at standardisere gen- og proteinnavnene.
      BEMÆRK: Disse mål er relateret til både FP og hyperlipidæmi. Derfor, forudsige disse skæringsmål som målene for FP mod hyperlipidæmi.
  2. Opbygning af et protein-protein interaktionsnetværk
    1. Åbn STRING-databasen (https://string-db.org/) 11.5. Indsæt skæringsmållisten for FP mod hyperlipidæmi i dialogboksen "Liste over navne". Vælg Homo sapiens i "Organismer" og klik på SØG > FORTSÆT.
      BEMÆRK: Mennesker og mus har meget ens gener. Derfor udføres yderligere eksperimentel verifikation med mus.
    2. Når resultaterne er tilgængelige, skal du markere de skjulte frakoblede noder i netværket i "Avancerede indstillinger". Indstil den højeste tillid (0,900) til "minimum krævet interaktionsscore", og klik derefter på knappen UPDATE .
    3. Klik på Eksporter i titellinjen, og download den korte tabeltekst fra protein-protein-interaktionsnetværket (PPI) i PNG- og TSV-format.
  3. Opbygning af et netværk for lægemiddelkomponent-sygdomsmål
    1. Åbn Cytoscape 3.9.1 (se materialetabel). Importer filen i TSV-format i trin 1.2.3. Optimer farven, skrifttypen og siden af netværksnoderne gennem stillinjen i kontrolpanelet.
    2. Brug funktionen "Analysér netværk" til netværkstopologianalyse. Få hubgener af CytoHubba i Cytoscape. Etablere netværket for lægemiddel-ingrediens-mål-sygdom.
  4. GO- og KEGG-berigelsesanalyse
    1. Åbn DAVID Bioinformatics Resources (https://david.ncifcrf.gov/home.jsp). Klik på Start analyse , og indsæt mållisten i venstre dialogboks. Vælg OFFICIAL GENE SYMBOL i "Select Identifier". Vælg Homo sapiens i "Vælg arter". Marker genliste i "Listetype". Klik på Send liste.
    2. Når resultaterne er tilgængelige, skal du klikke på Analysér ovenstående genliste med et af DAVIDs værktøjer. Sæt kryds ved GOTERM_BP_DIRECT, GOTERM_CC_DIRECT GOTERM_MF_DIRECT i "Genontologi" til GO-funktionsberigelsesanalyse. Sæt kryds KEGG_Pathway i "Pathways" for KEGG pathway enrichment analyse.
    3. Klik på Funktionelt annotationsdiagram for at få vist resultaterne.
      BEMÆRK: Indstil den statistiske signifikanstærskel for berigelsesanalysen til p < 0,05.

2. Eksperimentelt design

  1. Det FP-vandige ekstraktpræparat
    BEMÆRK: FP behandles i laboratoriet hos professor Lina Xia ved Chengdu University of TCM8.
    1. Det tørrede pulver af FP (90 g) lægges i blød i 1 liter rent vand i en ren 2 L målekolbe. Brug ultralydsbehandling (i et 4 ° C vandbad, effekt: 250W, frekvens: 35 kHz) for at hjælpe med at opløse i 30 minutter. Opløsningen filtreres for at opnå ekstraktet med et dobbeltlags, 1 mm x 1 mm sterilt medicinsk gaze. Gentag ovenstående operation tre gange for at sikre fuldstændig opløsning af FP.
    2. Brug den roterende fordampningsmetode til yderligere koncentration. Indstil rotationshastigheden til 50 o / min med en temperatur på 60 ° C i 4 timer. Det vandige ekstrakt koncentreres til 100 ml.
    3. Del råekstraktet af FP (0,9 g / ml) jævnt i to dele (50 ml). Den ene del bruges som højdosis FP-væske (0,9 g / ml). Tilsæt 50 ml rent vand i en anden del, og betragt det som lavdosis FP-væske (0,45 g / ml). Brug høj- og lavdosis FP vandige opløsninger til administration. Opbevar væsken ved -20 °C indtil brug.
  2. Forberedelse af dyr
    1. Hus 50 C57BL/6-hanmus (20 ± 2 g) i et godt ventileret rum ved stuetemperatur med en 12 timers lys-mørk cyklus og fri adgang til mad og rent vand.
    2. Tildel musene tilfældigt til to grupper: fodre 10 mus med en normal kost og 40 mus med en fedtrig kost (se materialetabel) for at fremkalde hyperlipidæmi.
      BEMÆRK: Efter fodring i 8 uger blev musene screenet for yderligere lægemiddelintervention.
    3. I den 8. uge trækkes ca. 200 μL blod ud af hver musebane. Blodet centrifugeres i 10 minutter ved 5.733 x g ved 4 °C for at tage plasmaprøver. Bestem TC- og TG-niveauerne med kommercielt tilgængelige analysesæt (se materialetabel).
    4. Vælg seks mus med de mest normale lipidniveauer som gruppen uden behandlingskontrol (NC). Vælg 24 mus med et signifikant højere lipidniveau som fedtfattig diætgruppe, og opdel dem tilfældigt i fire grupper: fedtfattig diæt (HFD) gruppe, lavdosis FP (FP_L) gruppe, højdosis FP (FP_H) gruppe og positiv kontrol (PC) gruppe.
    5. Administrer gastrisk irrigation til FP_L og FP_H grupper med to doser FP (henholdsvis lav dosis, 4,5 g / kg og høj dosis, 9 g / kg); gastrisk irrigation til PC-gruppen med simvastatin tabletter (5 mg/kg; se materialetabel); og gastrisk vanding til NC- og HFD-grupperne med samme mængde fysiologisk saltvand en gang dagligt i 4 uger.
      BEMÆRK: I den aktuelle undersøgelse blev der anvendt vandige opløsninger af FP og simvastatin til behandling.
    6. I den 12. uge, efter anæstesi med 1% pentobarbitalnatrium (30 mg / kg), ofrer musene fra alle grupperne. Saml ~ 400 μL blodprøver fra hver musens orbitalvene.
      BEMÆRK: Stimuler musenes tæer og såler med pincet. Hvis der ikke er nogen reaktion, viser det tilstrækkelig anæstesi.
    7. Blodet centrifugeres i 10 minutter ved 5.733 x g ved 4 °C for at opnå plasmaprøver, og TC-, TG-, LDL-C- og HDL-C-niveauerne bestemmes med kommercielt tilgængelige analysesæt (se materialetabel). Få levervævsprøver16 og underkast dem histopatologisk analyse. Brug de resterende plasma- og leverprøver til metabolomics-analyse (trin 3).
      BEMÆRK: Alle prøver opbevares ved -80 °C indtil brug.
  3. Lever histopatologisk undersøgelse
    1. Fastgør frisk levervæv med 4% paraformaldehydopløsning i mere end 24 timer. Tag vævet ud af fikseringsmidlet og glat målvævene med en skalpel. Placer vævet og den tilsvarende etiket i dehydratoren.
    2. Dehydrering i en ethanolgradient: 75% alkohol i 4 timer, 85% alkohol i 2 timer, 90% alkohol i 2 timer, 95% alkohol i 1 time, absolut ethanol i 1 time, xylen i 30 min. Anbring vævskassetten i en vævsform i paraffinvoks i tre vaske, 30 min hver16.
    3. Sæt det voksgennemblødte væv i vævsindlejringen (se materialetabel). Før voksen størkner, skal du fjerne vævene fra dehydratoren, læg dem i den indlejrede kasse og fastgør den tilsvarende etiket.
    4. Afkøl voksblokkene i et frysebord på -20 °C, fjern dem fra den indlejrede ramme, og trim voksblokken.
    5. Skær de trimmede voksblokke i 3 μm tykke sektioner ved hjælp af et mikrotomt (se materialetabel). Flyd sektionerne i 40 ° C vand, fjern dem fra diasene og bages i en 60 ° C ovn. Efter bagning med vand og tør voks skal du tage det ud og opbevare det ved stuetemperatur.
    6. Sektionerne anbringes successivt i xylen I i 10 minutter, xylen II i 10 minutter, xylen III i 10 minutter, absolut ethanol I i 5 minutter, absolut ethanol II i 5 minutter, 75% alkohol i 5 minutter og vaskes i vand16.
    7. Plet sektionerne med hæmatoxylinfarvningsopløsning i 4 min, 1% saltsyrealkoholopløsning (75% alkohol) til differentiering, 1% ammoniakvandopløsning tilbage blå, og vask dem med vand.
    8. Plet sektionerne med eosinfarvningsopløsning i 2 minutter og vask dem med vand.
    9. Overhold sektionerne ved hjælp af et optisk mikroskop med en forstørrelse på 200x og 400x.
  4. Væskekromatografi-massespektrometri )LC-MS) analyse
    1. Identifikation af ingredienser i rammeprogrammet
      BEMÆRK: Analysen udføres ved hjælp af ultrahøjtydende væskekromatografi kombineret med hybrid quadrupol-orbitrap massespektrometri med høj opløsning (UPLC-Q-Orbirap HRMS, LC-MS; se materialetabel).
      1. Mål nøjagtigt 1 g tørret pulver af FP og kom det i en ren 50 ml målekolbe.
      2. Tilsæt 25 ml 70% methanol i målekolben og vej nøjagtigt. Brug ultralydsbehandling (i et 4 ° C vandbad, effekt: 250 W, frekvens: 35 kHz) i 30 minutter for at hjælpe opløsning. Vej nøjagtigt igen for præcist at bestemme tabet efter opløsning, og brug 70% methanol til at kompensere for tabet.
        BEMÆRK: Mål ikke volumen, da kolbens skala ikke er nøjagtig, især efter 4 °C vandbad.
      3. Ryst op for at blande helt. Brug en 0,22 μm mikroporøs membran til at filtrere.
    2. Forberedelse af plasmaprøver
      1. Der tilsættes nøjagtigt 100 μL plasma (trin 2.2.7) i et dobbelt volumen (200 μL) acetonitril i et 1,5 ml centrifugerør, og hvirvel det med en hvirvelvibrator i mindst 30 s. Følg denne procedure for alle eksempler.
      2. Alle prøver centrifugeres ved 17.200 x g i 10 minutter ved 4 °C. Supernatanterne overføres efter centrifugering til et nyt 1,5 ml centrifugeglas. Supernatanterne tørres under nitrogen. Der rekonstitueres med 200 μL ekstraktionsmiddel (acetonitril:vand = 4:1 [v/v]).
      3. Vortex den rekonstituerede opløsning i mindst 30 s og brug ultralydsbehandling i 10 minutter (i et 4 ° C vandbad, effekt: 250 W, frekvens: 35 kHz). Der centrifugeres ved 17.200 x g i 10 minutter ved 4 °C.
      4. Supernatanterne filtreres med 0,22 μm filtermembraner, og de opbevares ved 4 °C til analyse.
    3. Forberedelse af leverprøver
      1. 90 mg levervæv (trin 2.2.7) homogeniseres i 1 minut i iskoldt methanolvand (1:1, v/v, 1 ml) og centrifugeres ved 21.500 x g i 10 minutter ved 4 °C. Supernatanten overføres til 1,5 ml centrifugeglas. Følg denne procedure for alle eksempler.
      2. Efter samme fremgangsmåde ekstraheres bundfaldene igen, og supernatanterne samles i nye 1,5 ml centrifugeglas. Supernatanterne tørres under nitrogen. Der rekonstitueres med 300 μL ekstraktionsopløsningsmiddel (methanol:vand = 4:1 [v/v]).
      3. Vortex den rekonstituerede opløsning i mindst 30 s og brug ultralydsbehandling i 10 minutter (i et 4 ° C vandbad, effekt: 250 W, frekvens: 35 kHz). Der centrifugeres ved 17.200 x g i 15 minutter ved 4 °C.
      4. Supernatanterne filtreres med 0,22 μm filtermembraner, og de opbevares ved 4 °C til analyse.
        BEMÆRK: De samlede kvalitetskontrolprøver (QC) blev fremstillet ved at blande 10 μL alikvoter fra hver plasma- og leverprøve (en pr. Seks prøver).
    4. Analyseparametre for LC-MS
      BEMÆRK: Den mobile fase består af 0,1% myresyre (opløsningsmiddel A) og acetonitril (opløsningsmiddel B). Overfør disse opløsningsmidler til en ren glasflaske, og tilslut dem med LC-MS-systemet.
      1. Indstil gradientprogrammerne for plasmaprøver i LC-MS-systemets "indløbsfil" som følger: 1% B (0-1,5 min), 1%-60% B (1,5-13,0 min), 60%-99% B (13,0-20,0 min), vedligehold ved 99% B (20,0-25,0 min), 99%-1% B (25,0-25,1 min), og hold ved 1% B indtil 27 min.
      2. Autosamplerbetingelserne for plasmaprøverne indstilles i LC-MS-systemets "indløbsfil" som følger: injektionsvolumen, 2 μL; og strømningshastigheden, 0,3 ml / min, for hver analyse.
      3. Indstil gradientprogrammet for leverprøver i "indløbsfilen" i LC-MS-systemet som følger: 1% B (0-1 min), 1%-53% B (1-15 min), 53%-70% B (15-30 min), 70%-90% B (30-32 min), 90%-95% B (32-40 min), 95%-1% B (40-42 min), og hold ved 1% B indtil 45 min.
      4. Autosamplerbetingelserne for leverprøverne indstilles i LC-MS-systemets "indløbsfil" som følger: injektionsvolumen, 5 μL; og strømningshastigheden, 0,3 ml / min, for hver analyse.
      5. Indstil MS-detektionsbetingelserne for både plasma- og leverprøver i "MS tune-filen" i LC-MS-systemet. Udfør MS-erhvervelsen ved hjælp af både positive og negative ioniseringstilstande.
        BEMÆRK: De opvarmede elektrosprayioniseringsparametre er som følger: sprayspænding: 3,5 kV til positiv ionisering og 3,8 kV til negativ ionisering; kappegasstrøm: 55 arb; hjælpegasstrøm: 15 arb; sondevarmertemperatur: 300 °C; og kapillær temperatur: 350 °C.
      6. Importer de indsamlede rådata til Compound Discoverer-softwaren, og indstil metodeskabelonen efter producentens anvisninger (se Materialetabel).

3. Metabolomisk validering

BEMÆRK: De metabolomiske profileringsdata for plasma- og levermetabolitter importeres til Compound Discoverer-software for at udføre ekstraktion af metaboliske egenskaber ved at anvende en algoritme til ekstraktion af molekylære egenskaber. Indstil parametrene som følger: masseafvigelse, 5 x 10-6; masseområde, 100-1.500; tærskelværdi for signal/støjforhold (SNR), 3 og retentionstidsafvigelse, 0,05. Evaluer stabiliteten og repeterbarheden af metabolomics ved den relative standardafvigelse (RSD) af QC-topområder.

  1. Brug SIMCA-P-software (se materialetabel) til multivariat statistisk analyse af integralværdierne opnået fra LC-MS-fund. Brug ortogonal partiel mindste kvadraters diskriminantanalyse (OPLS-DA) til de middelcentrerede data og modellering af prøveklasser.
  2. Efter OPLS-DA-testen skal du overveje metabolitterne med integreret variabel betydning i projektionsværdierne (VIP) på >1 og en p-værdi på <0,05 fra Student's t-test som de potentielle differentielle metabolitter.
  3. Identificer de forstyrrede metabolitter og metaboliske veje ved åbne databasekilder, herunder Human Metabolome (HMDB; http://www.hmdb.ca/), Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG; https://www.kegg.jp/) og MetaboAnalyst5.0 (https://www.metaboanalyst.ca/).
  4. Visualiser resultatvisningerne fra MetaboAnalyst5.0 og 'Wu Kong'-platformen (https://www.omicsolution.com/wkomics/main/).

4. Molekylær docking

  1. Download 3D-strukturen af de udvalgte FP-ingredienser fra henholdsvis TCMSP-databasen. Søg i ingrediensnavnene i søgefeltet 'Kemisk navn', og download de tilsvarende 3D-strukturfiler i mol2-format.
  2. Download krystalstrukturerne af de vigtigste mål fra AlphaFold Protein Structure Database (Alphafold DB;, https://alphafold.ebi.ac.uk/). Søg i målnavnene i søgefeltet, og download de tilsvarende krystalstrukturfiler i pdb-format.
  3. Importer ingredienser og målstrukturfil til AutoDockTools-software. Klik på Rediger > Slet vand for at slette vandmolekyler. Klik på Rediger > hydrogener > Tilføj for at tilføje hydrogener. Indstil ingredienserne som 'ligand' og udfør blinddocking ved at vælge hele målene som 'receptor'17.
  4. Indtast en værdi i boksen bag "center" og "size" for at justere det nyudviklede rum, hvilket gør det muligt fuldt ud at omfatte liganden og receptoren. Gem ligand- og receptorfilerne i pdbqt-format.
  5. Brug AutoDock Vina til at udføre molekylær docking. Indstil linjen "Receptor" til navnet på "receptor.pdbqt" og "Ligand" -bjælken til navnet på 'ligand.pdbqt'. Få den optimale placering for ligandbinding til receptoren. Registrer bindingsenergiværdien på den optimale position.
    BEMÆRK: Dockingprocessen blev beregnet af den genetiske algoritme14. Alle dockingkørselsindstillinger var standardværdier. Dockingrammer rangeres automatisk fra den højeste til den laveste bindingsenergi.
  6. Importer dockingfilerne til PILP (Protein-ligand Interaction Profiler' https://plip-tool.biotec.tu-dresden.de/plip-web/plip/index) for at få den visuelle systemmodel. Download modelfilerne i pse-format, og importer dem til PyMOL-software (se materialetabellen) for at konstruere yderligere visualisering.

5. Statistisk analyse

BEMÆRK: Brug SPSS statistisk software (se Tabel over materialer) til dataanalyse. Overvej værdien af p < 0,05 som statistisk signifikant.

  1. Værdierne udtrykkes som middel ± standardafvigelse (SD).
  2. Udfør en envejs ANOVA efterfulgt af post hoc mindst signifikant forskel (LSD), Dunnett (i tilfælde af lige varians) eller Dunnetts T3 (i tilfælde af ulige varians) for at teste statistisk signifikans blandt grupper.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Netværksfarmakologi
I alt 18 potentielle ingredienser i FP blev screenet i henhold til deres farmakokinetiske og farmakodynamiske egenskaber fra databasen og LC-MS-analysen (de samlede ionkromatogrammer er vist i supplerende figur 1). Gennem relevant litteratur er indholdet af gallinsyre meget højere end andre ingredienser og er effektivt til at sænke lipider 9,11. Derfor blev denne ingrediens også betragtet som en potentiel ingrediens. I alt er 19 ingredienser og 134 ingrediensrelaterede mål for FP blevet grundlagt. Alle 19 ingredienser er vist i tabel 1. For at vælge de mest repræsentative ingredienser til yderligere analyse blev disse ingredienser importeret til Bioinformatics Analysis Tool for Molecular mechANism of Traditional Chinese Medicine database (BATMAN-TCM; http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/). Ifølge ingrediens-mål-pathway-sygdomsnetværket blev nogle bioaktive ingredienser, såsom gallinsyre, quercetin og beta-sitosterol, identificeret som de vigtigste ingredienser i FP relateret til hyperkolesterolæmi og koronar aterosklerose (supplerende figur 2). Blandt disse er gallinsyre en af de mest undersøgte phenolsyrer; Det er den vigtigste bioaktive ingrediens, der præsenteres i FP18. I mellemtiden er gallinsyre også den ingrediens med det højeste indhold i FP; Dens koncentration er normalt 1% til 3%. El-Hussainy et al.19 har afsløret, at gallinsyre kan begrænse hjerteskade, forbedre lipidprofilen og nedregulere hjerteinflammatoriske markører. Indholdet af quercetin og beta-sitosterol er lavere, men nogle undersøgelser har vist deres virkning på sænkning af lipider. Quercetin, som et vigtigt flavonoid, der findes bredt i planter, har forskellige egenskaber, såsom antioxidant, antiinflammatoriske og kardiovaskulære beskyttelsesvirkninger20. Lu et al.21 har undersøgt, at den quercetinberigede juice kan dæmpe TC-, LDL-C- og HDL-C-niveauer hos raske personer med mild hyperkolesterolæmi. Hvad angår beta-sitosterol, har kliniske undersøgelser vist, at plantesterol signifikant kan forhindre hyperkolesterolæmi og hjerte-kar-sygdomme22,23. Althwab et al.24beviste, at beta-sitosterol kunne forbedre lipidprofil og atherogent indeks hos HFD-rotter. Det kan ses, at den lipidsænkende virkning af FP kan være relateret til disse tre ingredienser.

Derudover blev 1,552 mål for hyperlipidæmi-relaterede fra Genecards, OMIM, og TTD databaser indsamlet. Efter at have matchet de 134 FP-relaterede mål med de hyperlipidæmi-relaterede mål, blev 62 mål identificeret som potentielle mål for FP mod hyperlipidæmi (figur 2A). Alle de krydsede mål blev normaliseret til deres officielle symboler, ifølge UniProt-databasen. Derefter blev PPI-netværket konstrueret af STRING (figur 2B) og Cytoscape (figur 2C). Ved at kombinere resultaterne af beregningsmetoder var de 10 bedste mål ESR1, RELA, FOS, EGFR, HIF1A, AR, CCND1, IL6, MAPK8 og MYC. Detaljerne fremgår af supplerende figur 3. Alle disse 62 mål er grundlaget for yderligere analyse, som er integreret med resultaterne af metabonomics.

GO- og KEGG-veje blev udført ved berigelsesanalyse. De 15 bedste veje, i henhold til antallet af mål, blev udvalgt til analyse i henhold til p-værdien. GO-berigelsesresultaterne antydede, at de biologiske processer og den molekylære funktion af FP mod hyperlipidæmi hovedsageligt var relateret til genekspression og proteinbinding (figur 2D). KEGG-berigelsen viste, at FP kunne gribe ind i processen med lipidmetabolisme og aterosklerose (figur 2E), hvilket betyder, at FP lindrer hyperlipidæmi ved at påvirke lipidmetabolismen.

Effekten af FP på plasma lipidniveauer og leverindeks
For at teste den forbedrede effekt af FP på hyperlipidæmi blev ændringerne i TC, TG, LDL-C, HDL-C og leverindeks (forholdet mellem levervægt og kropsvægt) først målt. Sammenlignet med NC-gruppen viste mus i HFD-gruppen en signifikant stigning i plasmaniveauerne af TC (p < 0,001), LDL-C (p < 0,001) og TG (p < 0,05), hvilket indikerer, at langvarig HFD-intervention kan øge lipidniveauerne og inducere hyperlipidæmi (figur 3).

Efter administration af FP vandig ekstrakt blev niveauerne af TC i FP_L og FP_H grupper signifikant (p < 0,05) reduceret med henholdsvis 18,8% og 12,4% (figur 3A). Niveauerne af LDL-C i FP_L og FP_H grupper blev signifikant (p < 0,05) reduceret med henholdsvis 13,7% og 21,8% (figur 3B). Med hensyn til HDL-C-niveau steg FP_H-gruppen signifikant (p < 0,01) fra 1,81 ± 0,08 mmol / L til 2,65 ± 0,16 mmol / L sammenlignet med HFD-gruppen (figur 3C). Selv om TG-niveauet forblev ubetydeligt efter rammeprogrammets intervention, blev det reduceret sammenlignet med HFD-gruppen (figur 3D). Nylige undersøgelser har vist, at indekset for LDL-C / HDL-C-forholdet er et bedre indeks end LDL-C eller HDL-C alene til forudsigelse af hjerte-kar-sygdom25,26. Sammenlignet med HFD-gruppen blev LDL-C/HDL-C-forholdet signifikant (p < 0,01) reduceret med 46,3% i FP_H-gruppen (figur 3E), hvilket betyder, at FP-intervention reducerede dårligt kolesterol og øgede gode kolesterolniveauer. Som det vigtigste fedtstofskifteorgan afspejler levervægten fedtlagring hos mus til en vis grad27. Efter 12 uger blev leverindekserne i FP_L og FP_H gruppen signifikant reduceret (p < 0,01) sammenlignet med HFD-gruppen (figur 3F). PC-gruppen viste også forskellige grader af reduktion i disse indikatorer ovenfor, hvilket viste, at FP havde lignende virkninger som statiner, og den beskyttende virkning viste et dosis-respons-forhold.

Forskellige kliniske undersøgelser viste, at efter at have taget enten ekstrakt eller hel FP i et stykke tid, blev TC- og LDL-C-niveauerne signifikant reduceret. I mellemtiden blev HDL-C-niveauet hævet bemærkelsesværdigt ved langvarig administration af RP28,29. Nambiar og Shetty30 fandt, at FP-juice kunne reducere oxiderede lipoproteiner med lav densitet, hvilket i høj grad reducerede risikoen for aterosklerose. Gopa et al.31 evaluerede den hypolipidemiske virkning af FP hos patienter med hyperlipidæmi og sammenlignede den med simvastatin. Behandling med FP resulterede i en betydelig reduktion i TC, LDL-C og TG og en signifikant stigning i HDL-C-niveauer, svarende til simvastatin. I denne forskning havde FP og simvastatin også lignende terapeutiske virkninger, og LDL-C-sænkende effekt og leverreparerende virkning af FP var bedre end simvastatin.

Lever histopatologisk observation
Effekten af FP på hepatisk steatose hos HFD-mus er vist i figur 4. De leverpatologiske sektioner i NC-gruppen udtrykte regelmæssig hepatocytmorfologi, klart definerede cellegrænser og ingen åbenlyse fedtvakuoler (figur 4A, B). Til sammenligning havde HFD-gruppen fedtvakuoler af forskellig størrelse omkring blodkarrene og viste åbenbar leverskade, som karakteriseret ved cellehævelse, fedtdegeneration, tab af cellulære grænser, cellulær sammentrækning og hepatocytnekrose (figur 4C, D). Som vist i figur 4E,F kan FP-intervention forbedre leversteatose, især i FP_L-gruppen. Sammenlignet med HFD-gruppen havde FP_H- (figur 4G,H) og PC-gruppen (figur 4I,J) en vis grad af genopretning af levercellestrukturen, fedtdegeneration og reduktion af fedtvakuol. Dette betyder, at FP-intervention kan beskytte levervæv mod HFD-induceret leverskade.

Profilering af metabolomics
Ifølge plasma lipidniveau og lever histopatologisk observation, høj dosis FP havde en bedre effekt på hyperlipidæmi end lavdosis FP. Derfor blev NC-, HFD- og FP_H-grupper valgt til at analysere deres ændring i metabolismeniveauet. De samlede ionkromatogrammer af QC-prøver blev vist i supplerende figur 4. For at sikre nøjagtigheden af dataene blev funktionerne med RSD-værdier >30% fjernet fra alle QC-prøverne. PCA og ionkromatogrammer afspejlede, at QC-prøver var stabile under processen (supplerende figur 5). I alt 626 og 562 funktioner i plasma og lever blev bestemt efter dataforbehandlingen. Blandt dem blev 120 og 124 metabolitter i henholdsvis plasma og lever identificeret baseret på KEGG-databasen. OPLS-DA-analyse blev brugt til at undersøge adskillelsen mellem NC-, HFD- og FP_H-grupperne. OPLS-DA viste, at de samme gruppeprøver grupperede sig sammen, og forskellige gruppeprøver skelnede godt (figur 5A, B). Disse resultater indikerede, at HFD- og FP-interventionerne forårsagede åbenlyse metaboliske variationer.

For at identificere de potentielle differentielle metabolitter, der bidrog til den metaboliske sondring, blev der udført yderligere OPLS-DA- og t-testanalyser af henholdsvis NC versus HFD og HFD versus FP_H. OPLS-DA-resultaterne skelnede godt og viste signifikante forskelle mellem forskellige grupper af modeller14 (supplerende figur 6). Baseret på VIP (variabel vigtig i projektion) >1 og p < 0,05 viste 32 metabolitter i plasma differentiering mellem NC- og HFD-gruppen, og 72 metabolitter viste differentiering mellem HFD- og FP_H-gruppen. I leveren viste 38 metabolitter differentiering mellem NC- og HFD-gruppen, og 17 metabolitter viste differentiering mellem HFD- og FP_H-gruppen. Endelig blev i alt 16 og 6 metabolitter identificeret som differentialmetabolitter i FP-påvirkede HFD-mus i henholdsvis plasma og lever (supplerende figur 7). Oplysningerne om disse metabolitter er vist i tabel 2.

For at visualisere variationen i metabolitter mellem de tre grupper blev varmekort plottet af MetaboAnalyst 5.0. Alle differentialmetabolitterne i plasma og lever blev ændret i HFD-gruppen, og de fleste af dem blev vendt i FP-gruppen, hvilket indikerer, at FP-intervention kan forbedre metabolisk lidelse (figur 5C, D). Desuden blev differentielle metabolitter importeret til MetaboAnalyst 5.0 for at udforske de metaboliske veje for FP i HFD-mus. Baseret på p < 0,05 og en vejpåvirkning >0,10 blev tryptophanmetabolismen påvirket signifikant i plasmaet, og metabolitterne relateret til denne vej var D-tryptophan og L-kynurenin (figur 5E). Jung et al.32 undersøgte, at langvarig hyperlipidæmi kan sænke serumniveauerne af kynurenin. Taurin og hypotaurin metabolisme blev påvirket signifikant i leveren, og den relaterede metabolitrelaterede var taurin (figur 5F). Taurin er en vigtig og nødvendig aminosyre i dyrekroppen; Dong et al.33 undersøgte, at taurin mildt kunne reducere beskadigelsen af blodlipider og sænke risikoen for aterosklerose forårsaget af HFD. I denne forskning øgede FP-intervention indholdet af L-kynurenin og taurin, hvilket er positivt relateret til reduktionen af lipidniveauer, hvilket understøtter effektiviteten af FP mod hyperlipidæmi.

Integreret analyse af netværksfarmakologi og metabolomics
En integreret strategi for netværksfarmakologi kombineret med metabolomics er blevet mere og mere uundværlig i studiet af sygdomsmekanismer og interventionsstrategier. Relevansen mellem netværksfarmakologi og metabolomics med begrænset evidens blev fastslået. For at opnå et omfattende overblik over mekanismen for FP mod hyperlipidæmi blev interaktionsnetværkene baseret på netværksfarmakologi og metabolomics konstrueret. Differentielle metabolitter blev importeret til MetScape-pluginet i Cytoscape og matchede hub-generne identificeret i netværksfarmakologi for at indsamle de sammensatte-reaktion-enzym-gennetværk (figur 6). Som vist i tabel 3 var L-kynurenin og corticosteron i plasmametabolitter relateret til CYP1A1, som kan katalysere lipidperoxidering og inducere ikke-alkoholisk fedtleversygdom34,35; De berørte veje var henholdsvis tryptophan metabolisme og steroidhormonbiosyntese. Acetylcholin var relateret til AChE og påvirket glycerophospholipid metabolisme. I levermetabolitter var MGAM og raffinose relateret til galactosemetabolisme. Flere undersøgelser har vist, at indtagelse af raffinose familie oligosaccharider kunne forbedre metaboliske lidelser i HFD mus36.

Endvidere er netværket af ingredienser-mål-metabolitter-veje blevet konstrueret (figur 7). I ingredienserne forbandt quercetin de fleste kanter, hvilket indikerer, at quercetin af FP spiller den vigtigste rolle i sænkning af lipider. Ovennævnte integrerede analyse afslørede de vigtigste mål, metabolitter og veje for FP mod hyperlipidæmi, som kunne danne grundlag for yderligere undersøgelser af dette lægemiddels terapeutiske mekanisme og kliniske anvendelse.

Molekylær docking
For yderligere at undersøge muligheden for interaktion mellem de udvalgte ingredienser og nøglemålene blev molekylær docking brugt til at analysere deres ligand-aktive stedinteraktioner. AutoDock Vina-software (se materialetabel) blev brugt til at udføre molekylær docking, og den første dockingstilling blev udsendt i henhold til rangen af scoringsfunktionen. Resultaterne af dockingen er vist i figur 8.

I den integrerede analyse var CYP1A1, AChE og MGAM relateret til differentielle metabolitter; De byggede broer mellem mål og metabolitter. Yderligere molekylær docking blev udført for at verificere forholdet mellem målet og ingredienserne. Resultaterne af ingrediensdocking med CYP1A1 var som følger: gallinsyre dannede fire hydrogenbindinger gennem aminosyreresterne Asn-185, Tyr-187, Asn-219 og His-500 og dannede π-π stablingsinteraktion gennem aminosyreresten Tyr-187 (figur 8A); quercetin dannede tre hydrogenbindinger gennem Asn-185, Asn-219 og His-500, hydrofob interaktion og π-π stablingsinteraktion gennem Tyr-187 (figur 8B); beta-sitosterol dannede fire hydrogenbindinger gennem Arg-362, Ser-363, Leu-365 og Arg-464 og hydrofob interaktion gennem Glu-369 og Ile-439 (figur 8C). Bindingsenergierne var henholdsvis 5,3, 7,0 og 7,3 kcal/-mol. I interaktionen med AChE blev gallinsyre stabiliseret af hydrogenbindinger med Arg-237, Arg-238 og Arg-480 (figur 8D); quercetin blev stabiliseret ved hydrogenbindinger med Arg-237 og Phe-474, ved hydrofob interaktion med Phe-157 og ved π-π stablingsinteraktion med Tyr-478 (figur 8E); beta-sitosterol blev stabiliseret ved hydrofob interaktion med Phe-157, Val-244, Ile-248, Phe-474, Ala477 og TYR478 (figur 8F). Bindingsenergierne var henholdsvis 5,0, 6,5 og 8,0 kcal/- mol. I interaktionen med MGAM blev gallinsyre stabiliseret af hydrogenbindinger med Ile-1716, Gly-1747 og Trp-1749 og ved hydrofob interaktion med Tyr-1715 og Trp-1749 (figur 8G); quercetin blev stabiliseret af hydrogenbindinger med Arg-1311, Thr-1726, Gln-1731 og Trp-1752, af hydrogenbindinger med Arg-1730 og ved π-π stabling med His-1727 (figur 8H); beta-sitosterol blev stabiliseret ved hydrofob interaktion med Pro-1159, Trp-1355, Phe-1427 og Phe-1560, Bindingsenergierne var henholdsvis 5,9, 8,1 og 6,9 kcal / mol. Detaljerede oplysninger om interaktioner og bindingsaffiniteter fremgår af tabel 4. Flere bindingssteder og høje bindingsenergier forklarer de høje affiniteter mellem ingredienser og proteinmål og verificerer, at disse ingredienser spiller rollen som sænkning af lipider ved at virke på hyperlipidæmi-relaterede mål.

Figure 1
Figur 1: Skematisk rutediagram over den integrerede strategi. Hubingredienser og gener blev ekstraheret ved netværksfarmakologi (del 1). Differentielle metabolitter af FP mod hyperlipidæmi blev analyseret af plasma- og levermetabolomics (del 2). Nøglemål, metabolitter og veje blev identificeret og forbundet baseret på en integreret analyse af del 1 og del 2 (del 3). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Målscreening, netværkskonstruktion og berigelsesanalyse af effekten af FP mod hyperlipidæmi. (A) Venn-diagram over FP-hyperlipidæmi mål. (B) Potentielt aktivt lægemiddel-ingredienser-mål-sygdomsnetværk: forskellige farvesymboler som nævnt her: sygdom (rød), lægemiddel (blå), ingredienser (grøn) og mål (gul). (C) PPI-netværk af STRING. D) analyse af GO-tilsætningsveje. E) analyse af KEGG-tilsætningsveje. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Effekten af FP på plasmalipidniveauer og leverindeks hos mus med HFD-induceret hyperlipidæmi (n = 6). a) Niveauer af TC. b) LDL-C-niveauer. C) HDL-C-niveau. D) TG-niveau. e) LDL-C/HDL-C-forholdet. (F) Leverindeks.*p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Statistisk signifikante forskelle blev evalueret ved hjælp af en envejs ANOVA efterfulgt af Dunnetts multiple sammenligningstest eller post hoc-analyse. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Effekten af FP på levervæv hos mus med HFD-induceret hyperlipidæmi (H&E-farvning). (A,B) NC-gruppe, (C,D) HFD-gruppe, (E,F) FP_L-gruppe, (G,H) FP_H-gruppe, (I,J) PC-gruppe (n = 6). Skalabjælke: (A,C,E = 200 μm; B,D,F = 50 μm). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: OPLS-DA-scoreplots, varmekort og metaboliske veje for differentielle metabolitter. OPLS-DA-scoreplottet af FP på HFD-mus i plasma (A) og lever (B). Varmekortene over differentielle metabolitter i plasma (C) og lever (D). De metaboliske veje for differentielle metabolitter i plasma (E) og lever (F). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 6
Figur 6: Forbindelser-reaktion-enzym-gennetværk af de vigtigste metabolitter og mål. Lavgradsnoder er blevet fjernet. De røde sekskanter, blå cirkler, runde grønne rektangler og grå diamanter repræsenterer henholdsvis de aktive forbindelser, gener, proteiner og reaktioner. De vigtigste mål og metabolitter blev forstørret. Vejene med den hvide baggrund er signifikant reguleret i plasmaet. Vejen med den grå baggrund er signifikant reguleret i leveren. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 7
Figur 7: Netværket af ingredienser-mål-metabolitter-veje. Jo mørkere farven er, desto mere er de tilsluttede kanter, der angiver knuden, vigtigere i dette netværk. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 8
Figur 8: Interaktionsdiagrammerne for FP-ingredienser og de vigtigste mål . (A) Gallinsyre, der virker på CYP1A1. B) Quercetin, der handler på CYP1A1. C) Beta-sitosterol, der virker på CYP1A1. (D) Gallinsyre, der virker på AChE. E) Quercetin, der handler på AChE. (F) Beta-sitosteroling handling på AChE. G) gallinsyre, der virker på MGAM. h) Quercetin på grundlag af MGAM. (I) Beta-sitosterol, der virker på MGAM. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 9
Figur 9: Oversigt over FP mod hyperlipidæmi resultat. Klik her for at se en større version af denne figur.

Tabel 1: De udvalgte ingredienser i FP vandig ekstrakt. Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 2: De forskellige metabolitter mellem de tre grupper. Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 3: Oplysninger om centrale mål, metabolitter og veje. Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 4: Bindingssteder og aktionskræfter mellem FP-ingredienser og målproteiner. Klik her for at downloade denne tabel.

Supplerende figur 1: De positive og negative ionkromatogrammer af FP-vandig ekstrakt. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 2: FP-netværket for ingrediens-mål-vej-sygdom fra BATMAN-TCM. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 3: Frekvensanalyse af hubgener i netværksfarmakologi. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 4: Ionkromatogrammer af plasma- og lever-QC-prøver. De repræsentative positive (A) og negative (B) ionkromatogrammer af QC-plasmaprøver. De repræsentative positive (C) og negative (D) ionkromatogrammer af lever-QC-prøver. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 5: PCA-scoreplottene for QC-prøver af plasma (A) og lever (B). Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 6: OPLS-DA-scoreplottene for plasmaprøver (A og B) og leverprøver (C og D). Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 7: Venn-diagrammer over differentialmetabolitterne i plasmaprøver (A) og leverprøver (B). Klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I de senere år har forekomsten af hyperlipidæmi været stigende, hovedsageligt på grund af langsigtede usunde spisevaner. TCM og dets kemiske ingredienser har forskellige farmakologiske aktiviteter, som er blevet bredt undersøgt i de senere år37,38. FP er en slags frugtressource, der anvendes både som medicin og mad, og har et vigtigt potentiale til behandling af hyperlipidæmi. Imidlertid kræver den potentielle terapeutiske mekanisme af FP mod hyperlipidæmi yderligere undersøgelse.

Netværksfarmakologi evaluerer lægemiddelpolyfarmakologiske virkninger på molekylært niveau og forudsiger interaktionen mellem naturlige produkter og proteiner for at bestemme hovedmekanismen39. Det første skridt er at vælge de aktive ingredienser og nøglemål for lægemidlet. I denne forskning blev der fundet ni aktive ingredienser og 62 hubgener. For yderligere at forstå den molekylære mekanisme af FP på hyperlipidæmi blev PPI og ingrediensmålnetværk etableret baseret på netværksfarmakologisk analyse. For at indsnævre omfanget af nøgleingredienser og mål er tre nøgleingredienser (gallinsyre, quercetin og beta-sitosterol) relateret til hyperkolesterolæmi og koronar aterosklerose blevet grundlagt af BATMAN-TCM. Alle disse ingredienser kunne reducere LDL-C niveauer eller øge HDL-C niveauer, validere de specifikke virkninger af FP på hyperlipidæmi. Desuden er FP's funktion på hyperlipidæmi ifølge KEGG-berigelsesanalyse relateret til aktiviteten af lipid- og aterosklerosevejen. Selvom denne metode afhænger for meget af databasen og mangler eksperimentel verifikation, har den teoretisk værdi og giver ideer til efterfølgende eksperimentel verifikationsforskning.

For yderligere eksperimentel validering blev mus fodret med en fedtsuppleret diæt i 8 uger for at fremkalde hyperlipidæmi. Resultaterne viste, at plasma TC-, LDL-C- og TG-niveauerne var signifikant forøget. Selvom niveauet af HDL-C faldt betydeligt, steg forholdet mellem LDL-C og HDL-C betydeligt. De histopatologiske observationer viste, at levervævet hos HFD-mus var alvorligt beskadiget, men der var ingen signifikant stigning i leverindekset; Det kan være, at ændringer i kropsvægt og visceral vægt tager længere tid. Lipiderne og leverændringerne viste tilstrækkeligt interventionseffekten af FP på hyperlipidæmi. Den interne mekanisme for interventionseffekten kræver dog stadig yderligere undersøgelse.

Metabolomics giver en liste over potentielle metabolitter og relaterede veje, der sigter mod at udforske mekanismen for metaboliske sygdomme og virkningen af terapeutiske lægemidler40. Resultatet af metabolomics kan påvirkes af typen af prøve. I betragtning af de patogene egenskaber ved hyperlipidæmi blev plasma- og leverprøver valgt til metabonomisk analyse i denne forskning. Ifølge OPLS-DA-resultater blev NC-, HFD- og FP_H-gruppernes metabolitter diskrimineret godt. I alt 16 differentialmetabolitter blev fundet i plasmaet, og 6 differentielle metabolitter blev fundet i leveren. Der var flere berørte metabolitter i plasma end i leveren, hvilket beviser, at blod er det vigtigste sted for metabolisk forstyrrelse induceret af hyperlipidæmi. FP-intervention kan vende ændringen af disse metabolitter under påvirkning af HFD. Desuden blev disse differentielle metabolitter importeret til KEGG-databasen. De signifikante metaboliske veje for differentielle metabolitter i plasma var tryptophanmetabolisme, og i leveren var taurin og hypotaurin metabolisme. I denne forskning, FP intervention øget indholdet af L-kynurenine af tryptophan metabolisme og taurin indhold af taurin og hypotaurin metabolisme, hvilket betyder, at FP kunne være effektiv til positivt justering af metaboliske lidelser og hyperlipidæmi. Metabolomics-analysen afslørede, hvilke metabolitter der var relateret til hyperlipidæmi eller FP-intervention, og bestemte nedstrømsmekanismen for FP-effekten.

Ved at kombinere resultatet af netværksfarmakologi med metabolomics blev tre nøglemål (CYP1A1, AChE og MGAM) identificeret i stof-reaktion-enzym-gennetværkene. Ifølge molekylær dockinganalyse viste disse mål høje affiniteter med FP-ingredienser (gallinsyre, quercetin og beta-sitosterol). Fire metabolitter (L-kynurenine, corticosteron, acetylcholin, og raffinose) og fire relaterede veje (tryptophan metabolisme, steroid hormon biosyntese, glycerophospholipid metabolisme, og galactose metabolisme) blev identificeret som de vigtigste metabolitter og metaboliske veje. Blandt disse var quercetin forbundet med de fleste mål, og tryptophanmetabolisme optrådte i både metabonomics og integrerede resultater. De spiller den mest afgørende rolle i den terapeutiske virkning af FP mod hyperlipidæmi. Molekylært dockingresultat viste, at CYP1A1, AChE og MGAM har høj affinitet med ingredienser. Ovenstående resultater viser, at disse screenede mål er tæt forbundet med den terapeutiske virkning af FP.

I den nuværende forskning, gallinsyre, quercetin, og beta-sitosterol blev identificeret som FP aktive ingredienser mod anti-hyperlipidæmi, og tryptophan metabolisme er den vigtigste metaboliske vej for FP terapi i HFD mus. Oversigten over resultatet er vist i figur 9. Denne forskning tilbød data og teoretisk støtte til yderligere undersøgelser af mekanismer og dannede grundlag for den kliniske anvendelse af FP-medicin. Det viste sig også, at naturlig mad kan være en lovende mulighed med store udsigter i klinisk praksis. Der er dog stadig nogle mangler i denne forskning. Den terapeutiske virkning af den aktive ingrediens alene på hyperlipidæmi er ikke blevet verificeret. Desuden er vejen for centrale mål ikke blevet undersøgt. Det har også brug for yderligere systematiske molekylærbiologiske eksperimenter for at verificere den nøjagtige mekanisme.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Alle forfattere erklærer, at de ikke har nogen interessekonflikt.

Acknowledgments

Denne forskning blev støttet af produktudviklings- og innovationsteamet for TCM Health Preservation and Rehabilitation (2022C005) og Research on New Business Cross-border Integration of "Health Preservation and Rehabilitation+".

Materials

Name Company Catalog Number Comments
101-3B Oven Luyue Instrument and Equipment Factory \
80312/80302 Glass Slide Jiangsu Sitai Experimental Equipment Co., LTD \
80340-1630 Cover Slip Jiangsu Sitai Experimental Equipment Co., LTD \
AccucoreTM C18 (3 mm × 100 mm, 2. 6 μm) Thermo Fisher Scientific \
Acetonitrile Fisher Chemical A998 Version 1.5.6
ACQUITY UPLC HSS T3 Column (2.1 mm × 100 mm, 1.8 μm) Thermo Fisher Scientific \
Aethanol Fisher Chemical A995 Version 3.0
Ammonia Solution Chengdu Cologne Chemicals Co., LTD 1336-21-6 Version 3.9.1
AutoDockTools Scripps Institution of Oceanography \
BS-240VT Full-automatic Animal Biochemical Detection System Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Co., Ltd. \
Compound Discoverer Thermo Fisher Scientific \
Cytoscape Cytoscape Consortium \
DM500 Optical Microscope Leica \
DV215CD Electronic Balance Ohaus Corporation ., Ltd T15A63
Ethyl Alcohol Chengdu Cologne Chemicals Co., LTD 64-17-5
Formic Acid Fisher Chemical A118
HDL-C Assay Kit Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute A112-1-1
Hematoxylin Staining Solution Biosharp BL700B
High Fat Diet ENSIWEIER 202211091031
Hitachi CT15E/CT15RE Centrifuge Hitachi., Ltd. \
Homogenizer Oulaibo Technology Co., Ltd \
Hydrochloric Acid Chengdu Cologne Chemicals Co., LTD 7647-01-0
Image-forming System LIOO \
JB-L5 Freezer Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd \
JB-L5 Tissue Embedder Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd \
JK-5/6 Microtome Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd \
JT-12S Hydroextractor Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd \
KQ3200E Ultrasonic Cleaner Kun Shan Ultrasonic Instruments Co., Ltd \
LDL-C Assay Kit Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute A113-1-1
Male C57BL/6 Mice  SBF Biotechnology Co., Ltd. \ Version 2.3.2
Neutral Balsam Shanghai Yiyang Instrument Co., Ltd 10021190865934
Pure Water Guangzhou Watson's Food & Beverage Co., Ltd GB19298
PyMOL DeLano Scientific LLC \ Version 14.1
RE-3000 Rotary Evaporator Yarong Biochemical Instrument Factory ., Ltd \
RM2016 Pathological Microtome Shanghai Leica Instruments Co., Ltd \ Version 26.0
SIMCA-P Umetrics AB \
Simvastatin Merck Sharp & Dohme., Ltd 14202220051
SPSS International Business Machines Corporation \
TC Assay Kit Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute A111-1-1
TG Assay Kit Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute A110-1-1
UPLC-Q-Exactive Quadrupole Electrostatic Field Orbital Hydrazine High Resolution Mass Spectrometry Thermo Fisher Scientific \
Vortex Vibrator Beijing PowerStar Technology Co., Ltd. LC-Vortex-P1
Xylene Chengdu Cologne Chemicals Co., LTD 1330-20-7

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nelson, R. H. Hyperlipidemia as a risk factor for cardiovascular disease. Primary Care: Clinics in Office Practice. 40 (1), 195-211 (2013).
  2. Mach, F., et al. 2019 ESC/EAS Guidelines for the management of dyslipidaemias: lipid modification to reduce cardiovascular risk: the Task Force for the management of dyslipidaemias of the European Society of Cardiology (ESC) and European Atherosclerosis Society (EAS). European Heart Journal. 41 (1), 111-188 (2020).
  3. Oesterle, A., Laufs, U., Liao, J. K. Pleiotropic effects of statins on the cardiovascular system. Circulation Research. 120 (1), 229-243 (2017).
  4. Last, A. R., Ference, J. D., Menzel, E. R. Hyperlipidemia: drugs for cardiovascular risk reduction in adults. American Family Physician. 95 (2), 78-87 (2017).
  5. Wu, S., et al. Recent advances of tanshinone in regulating autophagy for medicinal research. Front Pharmacol. 13, 1059360 (2022).
  6. Mirunalini, S., Krishnaveni, M. Therapeutic potential of Phyllanthus emblica (amla): the ayurvedic wonder. Journal of Basic and Clinical Physiology and Pharmacology. 21 (1), 93-105 (2010).
  7. Zhao, H. J., et al. Fructus phyllanthi tannin fraction induces apoptosis and inhibits migration and invasion of human lung squamous carcinoma cells in vitro via MAPK/MMP pathways. Acta Pharmacologica Sinica. 36 (6), 758-768 (2015).
  8. Yan, X., et al. Current advances on the phytochemical composition, pharmacologic effects, toxicology, and product development of Phyllanthi Fructus. Frontiers in Pharmacology. 13, 1017628 (2022).
  9. Yang, F., et al. Chemical constituents from the fruits of Phyllanthus emblica L. Biochemical Systematics and Ecology. 92, 104122 (2020).
  10. Wu, L., et al. Phytochemical analysis using UPLC-MSn combined with network pharmacology approaches to explore the biomarkers for the quality control of the anticancer tannin fraction of Phyllanthus emblica L. habitat in Nepal. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2021, 6623791 (2021).
  11. Variya, B. C., Bakrania, A. K., Chen, Y., Han, J., Patel, S. S. Suppression of abdominal fat and anti-hyperlipidemic potential of Emblica officinalis: Upregulation of PPARs and identification of active moiety. Biomedicine & Pharmacotherapy. 108, 1274-1281 (2018).
  12. Gertsch, J. Botanical drugs, synergy, and network pharmacology: forth and back to intelligent mixtures. Planta Medica. 77 (11), 1086-1098 (2011).
  13. Nicholson, J. K., Wilson, I. D. Understanding 'global' systems biology: metabonomics and the continuum of metabolism. Nature Reviews Drug Discovery. 2 (8), 668-676 (2003).
  14. Li, T., et al. Integrated metabolomics and network pharmacology to reveal the mechanisms of hydroxysafflor yellow A against acute traumatic brain injury. Computational and Structural Biotechnology Journal. 19, 1002-1013 (2021).
  15. Wang, F., et al. Network pharmacology combined with metabolomics to investigate the anti-hyperlipidemia mechanism of a novel combination. Journal of Functional Foods. 87, 104848 (2021).
  16. Adams, J. M., Jafar-Nejad, H. Determining bile duct density in the mouse liver. Journal of Visualized Experiments. (146), e59587 (2019).
  17. Wang, J. Y., et al. Use of viral entry assays and molecular docking analysis for the identification of antiviral candidates against coxsackievirus A16. Journal of Visualized Experiments. (149), e59920 (2019).
  18. Wu, L. F., Liang, W. Y., Zhang, L. Z. Determination of main components of Tibetan medicine Phyllanthus emblica L. World Science and Technology-Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica. 22 (8), 2857-2863 (2022).
  19. El-Hussainy, E. H. M., Hussein, A. M., Abdel-Aziz, A., El-Mehasseb, I. Effects of aluminum oxide (Al2O3) nanoparticles on ECG, myocardial inflammatory cytokines, redox state, and connexin 43 and lipid profile in rats: possible cardioprotective effect of gallic acid. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 94 (8), 868-878 (2016).
  20. Huang, W. Y., et al. Quercetin, hyper, and chlorogenic acid improve endothelial function by antioxidant, antiinflammatory, and ACE inhibitory effects. Journal of Food Science. 82 (5), 1239-1246 (2017).
  21. Lu, T. M., et al. Hypocholesterolemic efficacy of quercetin rich onion juice in healthy mild hypercholesterolemic adults: a pilot study. Plant Foods for Human Nutrition. 70 (4), 395-400 (2015).
  22. Witkowska, A. M., et al. Dietary plant sterols and phytosterol-enriched margarines and their relationship with cardiovascular disease among polish men and women: The WOBASZ II cross-sectional study. Nutrients. 14 (13), 2665 (2022).
  23. Turini, E., et al. Efficacy of plant sterol-enriched food for primary prevention and treatment of hypercholesterolemia: a systematic literature review. Foods. 11 (6), 839 (2022).
  24. Alamro, S. A., et al. Fermented camel milk enriched with plant sterols improves lipid profile and atherogenic index in rats fed high-fat and-cholesterol diets. Heliyon. , e10871 (2022).
  25. Gao, P., Wen, X., Ou, Q., Zhang, J. Which one of LDL-C/HDL-C ratio and non-HDL-C can better predict the severity of coronary artery disease in STEMI patients. BMC Cardiovascular Disorders. 22 (1), 318 (2022).
  26. Sun, T., et al. Predictive value of LDL/HDL ratio in coronary atherosclerotic heart disease. BMC Cardiovascular Disorders. 22 (1), 273 (2022).
  27. Maegawa, K., et al. Dietary raffinose ameliorates hepatic lipid accumulation induced by cholic acid via modulation of enterohepatic bile acid circulation in rats. British Journal of Nutrition. 127 (11), 1621-1630 (2022).
  28. Antony, B., Merina, B., Sheeba, V. AmlamaxTM in the management of dyslipidemia in humans. Indian Journal of Pharmaceutical Sciences. 70 (4), 504 (2008).
  29. Antony, B., Benny, M., Kaimal, T. N. B. A pilot clinical study to evaluate the effect of Emblica officinalis extract (Amlamax™) on markers of systemic inflammation and dyslipidemia. Indian Journal of Clinical Biochemistry. 23 (4), 378-381 (2008).
  30. Nambiar, S. S., Shetty, N. P. Phytochemical profiling and assessment of low-density lipoprotein oxidation, foam cell-preventing ability and antioxidant activity of commercial products of Emblica officinalis fruit. Journal of Food Biochemistry. 39 (3), 218-229 (2015).
  31. Gopa, B., Bhatt, J., Hemavathi, K. G. A comparative clinical study of hypolipidemic efficacy of Amla (Emblica officinalis) with 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme-A reductase inhibitor simvastatin. Indian Journal of Pharmacology. 44 (2), 238 (2012).
  32. Jung, T. W., et al. Administration of kynurenic acid reduces hyperlipidemia-induced inflammation and insulin resistance in skeletal muscle and adipocytes. Molecular and Cellular Endocrinology. , 518 (2020).
  33. Dong, Y., Li, X., Liu, Y., Gao, J., Tao, J. The molecular targets of taurine confer anti-hyperlipidemic effects. Life Sciences. 278, 119579 (2021).
  34. Huang, B., Bao, J., Cao, Y. R., Gao, H. F., Jin, Y. Cytochrome P450 1A1 (CYP1A1) catalyzes lipid peroxidation of oleic acid-induced HepG2 cells. Biochemistry. 83 (5), 595-602 (2018).
  35. Xia, H., et al. Alpha-naphthoflavone attenuates non-alcoholic fatty liver disease in oleic acid-treated HepG2 hepatocytes and in high fat diet-fed mice. Biomedicine & Pharmacotherapy. 118, 109287 (2019).
  36. Dai, Z., et al. Protective effects of α-galacto-oligosaccharides against a high-fat/western-style diet-induced metabolic abnormalities in mice. Food & Function. 10 (6), 3660-3670 (2019).
  37. Wang, X., et al. Salidroside, a phenyl ethanol glycoside from Rhodiola crenulata, orchestrates hypoxic mitochondrial dynamics homeostasis by stimulating Sirt1/p53/Drp1 signaling. J Ethnopharmacol. 293, 115278 (2022).
  38. Hou, Y., et al. Salidroside intensifies mitochondrial function of CoCl(2)-damaged HT22 cells by stimulating PI3K-AKT-MAPK signaling pathway. Phytomedicine. 109, 154568 (2023).
  39. Noor, F., et al. Network pharmacology approach for medicinal plants: review and assessment. Pharmaceuticals. 15 (5), 572 (2022).
  40. Li, X., et al. Role of potential bioactive metabolites from traditional Chinese medicine for type 2 diabetes mellitus: An overview. Front Pharmacol. 13, 1023713 (2022).

Tags

Tilbagetrækning nummer 194
Netværksfarmakologi, forudsigelse og metabolomics: Validering af mekanismen for Fructus phyllanthi mod hyperlipidæmi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zeng, B., Qi, L., Wu, S., Liu, N.,… More

Zeng, B., Qi, L., Wu, S., Liu, N., Wang, J., Nie, K., Xia, L., Yu, S. Network Pharmacology Prediction and Metabolomics Validation of the Mechanism of Fructus Phyllanthi against Hyperlipidemia. J. Vis. Exp. (194), e65071, doi:10.3791/65071 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter